СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ СОЛИДНЫХ ОПУХОЛЕЙ И ИХ ОТДАЛЕННЫХ МЕТАСТАЗОВ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/49 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к исследованию биологических жидкостей физическими и химическими методами, и может быть использовано в клинической лабораторной практике для диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов, а также мониторинга лечения онкологических заболеваний.

Одной из характерных особенностей течения большинства злокачественных опухолей является отсутствие или крайняя скудость симптоматики на ранних стадиях заболевания. Но именно в начальном периоде заболевания, когда размеры опухоли минимальны и нет распространения опухолевого процесса на другие органы, лечебные мероприятия наиболее эффективны. Известно, что основными причинами запущенности онкологических заболеваний являются в 48% наблюдений скрытое течение болезни, в 22% - несвоевременное обращение больного к врачу, в 30% - врачебные ошибки и длительное обследование больного (Комаров И.Г., Комов Д.В., Подвязников С.О. Общие принципы диагностики опухолей/ Под ред. чл.-корр. Поддубной И.В. - М.: МЕДпресс-информ, 2009. - С.43-56). Отсутствие патогномоничной только для злокачественного роста симптоматики делает проблему выявления пациентов на ранних стадиях заболевания одной из основных в онкологии.

Известен способ диагностики злокачественных солидных опухолей, включающий гистологическое исследование ткани, взятой в ходе выполнения оперативного вмешательства или биопсийного материала.

Гистологическое исследование позволяет верифицировать характер патологического процесса перед началом лечения, определяет целесообразность и объем хирургического вмешательства, позволяет уточнить необходимость последующего проведения консервативных методов терапии.

Однако возможности известного способа ограничены. Часть заключений при установлении предоперационного диагноза является неинформативной (14,5%) или сомнительной (7%) вследствие неправильного получения материала - не из опухоли, а из окружающих тканей вблизи опухолевого узла, наличия в биоптате только некротических масс, подслизистого роста опухоли, в случаях неинвазивного рака или сомнительной инвазии (Ошибки в клинической онкологии: рук-во для врачей // Под ред. В.И.Чиссова, А.Х.Трахтенберга. - М: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - С.133-167). Расхождение результатов предоперационной биопсии и окончательного заключения в определении гистологической формы новообразования отмечается в 13,5% случаев (многокомпонентность опухоли, анаплазированный рак без признаков какой-либо дифференцировки, необычная локализация опухоли, технические трудности). Окончательное категоричное заключение невозможно сделать примерно в 2% наблюдений. Последнее часто связано с предоперационным лечением, которое сопровождается значительным патоморфозом. Следует отметить, что проведение гистологического анализа материала требует достаточно длительного времени, необходимого для приготовления и обработки гистологического среза.

За прототип предлагаемого способа выбран известный способ диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов, включающий исследование сыворотки (плазмы) крови (Pamies RJ, Crawford DR: Tumor Markers. An Update. The medical clinics of North America. 80 (1): 185-199, 1996), основанный на исследовании сыворотки (плазмы) крови методом иммунохимии с последующей оценкой количества изучаемого маркера на приборе.

Известный способ выполняют следующим образом.

0,5 мл сыворотки (плазмы) крови добавляют к антигену, меченному ферментной меткой, в результате чего происходит связывание определяемого (немеченого) и меченого антигена с ограниченным количеством антител. Количество включившегося в состав иммунных комплексов меченого антигена обратно пропорционально количеству немеченого антигена в пробе. Являясь по своей природе мощными химическими катализаторами, ферменты эффективно осуществляют выработку легко выявляемого вещества, что делает возможным определение фермента в весьма малых концентрациях. По превращению субстрата ферментом можно судить о количестве вступившего во взаимодействие комплекса антиген-антитело. Диагностика злокачественного перерождения осуществляется при значениях одного из онкомаркеров выше определенного уровня, причем выше некоторых значений - наличие отдаленных метастазов. Метастазирование может быть обнаружено при помощи опухолевых маркеров за 2-6 месяцев и более до клинической манифестации заболевания (Клиническая оценка результатов лабораторных исследований / Г.И.Назаренко, А.А.Кишкун // 2-е изд., стереотипное. - М.: Медицина, 2006. - С.338-48). Так, для выявления злокачественных новообразований простаты используют простатспецифический антиген (ПСА, раковый антиген предстательной железы) - гликопротеид, физиологический экскреторный продукт простаты, функционирующий как сериновая протеаза для уменьшения вязкости спермы. Уровень ПСА выше 4.0 нг/мл обнаруживается примерно у 80-90% больных раком. Для рака характерны уровни 10-20 нг/мл при прорастании капсулы, более 40 нг/мл при наличии метастазов и прироста уровня в динамике.

Однако данный известный способ имеет ряд недостатков. Для его осуществления требуется наличие специфического дорогостоящего оборудования и реактивов. Различные нарушения функции печени и почек могут вызвать ложное повышение уровня онкомаркеров. Так, для простатспецифического антигена ложно-высокие уровни (в 50 раз выше!) могут временно выявляться после пальпации простаты, урологических манипуляций, острой задержки мочи в течение 1-6 дней, поэтому кровь берут либо до манипуляций, либо через неделю после таковых. Курение способствует повышению маркера до 10 нг/мл даже при отсутствии опухоли. Также имеет место зависимость содержания некоторых онкомаркеров от возраста обследуемого, что снижает чувствительность метода. Помимо этого, для некоторых видов злокачественных новообразований не существует специфичных онкомаркеров (рак почки).

Задачами предлагаемого способа изобретения являются:

- увеличение чувствительности метода диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов;

- расширение специфичности метода диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов;

- сокращение себестоимости производимой диагностики для осуществления скринингового обследования населения.

Поставленная задача решается тем, что в известном способе диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов, включающем исследование сыворотки (плазмы) крови, сыворотку (плазму) крови исследуют методом клиновидной дегидратации, при этом каплю сыворотки (плазмы) крови высушивают на горизонтально расположенном предметном стекле при комнатной температуре в течение 18-24 часов и изучают полученный структурный макропортрет, при этом при наличии в центральной зоне аморфных образований или кристаллов в виде зерен, а также микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин, выходящих в промежуточную зону, и/или наличие в промежуточной и/или краевой зонах у-образных трещин диагностируют злокачественное солидное новообразование, при наличии в промежуточной и/или краевой зонах параллельных микротрещин в виде гребня диагностируют наличие отдаленных метастазов злокачественного солидного новообразования.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию «новизна», т.к. в процессе проведения патентно-информационных исследований не выявлены источники патентной или научно-технической информации, которые бы порочили новизну изобретения.

Предлагаемое изобретение отвечает критерию изобретения «изобретательский уровень», так как проведенные ПИИ не выявили технических решений с существенными признаками предлагаемого способа.

Известен метод клиновидной дегидратации, который был разработан С.Н.Шатохиной и В.Н.Шабалиным (В.Н.Шабалин, С.Н.Шатохина. Аутогенные ритмы и самоорганизация биологических жидкостей. // Бюл. эксперим. биологии и медицины, 1996. - №10. - С.364-371) для оценки структуры биологических жидкостей. Принцип метода заключается в анализе системной организации биожидкости после перевода ее в твердую фазу при испарении воды. Получаемая при этом сухая пленка капли биологической жидкости (фация), являясь «тонким срезом неклеточной ткани», дает возможность:

- переводить информацию молекулярного уровня на макроуровень, доступный для наблюдения и дальнейшего изучения;

- выявлять патологический процесс на самой ранней стадии биохимических нарушений, т.е. задолго до клинических проявлений заболевания;

- регистрировать этапы течения патологического процесса в различные периоды наблюдений (суточный, месячный, годовой и т.д., объективно устанавливая при этом фазы обострения, ремиссии, реакции на лечение, тенденцию к обратному развитию опухоли).

В статье С.Н.Шатохина, В.Н.Шабалин «Маркеры злокачественного роста в морфологической картине биологических жидкостей человека» (Вопросы онкологии 2010, т.56, №3, С.293-300) целью исследования авторов являлись: поиск маркеров злокачественного роста в морфологической картине сыворотки крови и мочи больных со злокачественными новообразования различной локализации и степени злокачественности и разработка динамического контроля за маркерами малигнизации у лиц с доброкачественными опухолями и предраковыми состояниями. При этом были выявлены параспецифические и специфические маркеры. Параспецифические маркеры определялись авторами статьи с помощью метода клиновидной дегидратации, специфические маркеры с помощью метода краевой дегидратации. К параспецифическим маркерам авторы отнесли морфологические признаки, которые указывали на уровень хронической эндогенной интоксикации и степень снижения иммунологической реактивности. К специфическим маркерам отнесены структурные элементы морфологической картины при дегидратации в закрытой системе аналитической ячейки, которые формировались только в плазме крови больных с подтвержденным диагнозом злокачественного новообразования.

Известный способ краевой дегидратации выполняют следующим образом.

0,02 мл плазмы крови дегидратируется при влажности 55-60% в аналитических ячейках окон 2-5 ТК4 в течение 7-10 дней. При структурировании в процессе медленного испарения воды в аналитической ячейке происходит образование кристаллов. Диагностика степени риска злокачественного роста осуществляется при микроскопии в поляризованном свете при увеличении ×100-×630 в ходе исследования анизотропных кристаллов. Выявляют наличие полей с крупными и мелкими сферолитами; определяют локализацию мелких сферолитов по отношению к крупным. При выявлении мелких сферолитов, окружающих крупный сферолит, говорят о маркере предрасположенности к злокачественному росту. Маркер высокой предрасположенности к злокачественному росту представляет собой мелкий сферолит, внедренный в структуру крупного сферолита. Маркер начальной стадии злокачественного роста - мелкий сферолит, локализующийся в центре крупного, при этом структура крупного сферолита является грубо деформированной вплоть до почти полного разрушения. Маркеры метастазирования - отпочковывание мелких сферолитов от дегенеративно-измененного крупного и узловая сеть в структуре крупного. К сожалению, авторы-основоположники метода клиновидной дегидратации считают невозможным ее применения для диагностики злокачественных новообразований.

Метод краевой дегидратации имеет и ряд недостатков. Для его осуществления требуется достаточно длительное время, а также наличие специфического оборудования - поляризационный микроскоп. Кроме того, известный способ обладает недостаточной специфичностью, так как отдельные специфические признаки обнаружены не только у больных с поставленным диагнозом онкология, но и в группе больных без онкозаболеваний.

Предлагаемое изобретение обеспечивает при использовании следующий технический эффект.

Изобретение поясняется следующим иллюстрационным материалом.

1. Рис.1. Изображение части фации плазмы крови больного И. (диагноз: рак гортани, T2N0M0). Наблюдаются у-образные трещины (ув. ×50).

2. Рис.2. Изображение части фации плазмы крови больного Г. (диагноз: рак левой почки, T3N2M+). Наблюдаются параллельные трещины в виде гребня (ув. ×50).

3. Рис.3. Изображение части фации плазмы крови больного М. (диагноз: рак мочевого пузыря, T2N0M0). Наблюдается сочетание черных прямых трещин и трещин в виде черной сети (ув. ×50).

4. Рис.4. Изображение части фации плазмы крови больного О. (диагноз: рак легкого, T1N0M0). Наблюдаются кристаллы в центральной части фации в виде зерен (ув. ×200).

5. Рис.5. Изображение части фации плазмы крови больной Т. (диагноз: рак молочной железы, T1N0M0). Наблюдается аморфная центральная зона (ув. ×200).

В ходе разработки предлагаемого изобретения, включающего исследование сыворотки (плазмы) крови методом клиновидной дегидратации, экспериментальным путем была доказана необходимость и достаточность следующих признаков: при наличии в центральной зоне аморфных образований или кристаллов в виде зерен, а также микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин, выходящих в промежуточную зону, и/или наличие в промежуточной и/или краевой зонах у-образных трещин диагностируют злокачественное солидное новообразование, при наличии в промежуточной и/или краевой зонах параллельных микротрещин в виде гребня диагностируют наличие отдаленных метастазов.

Исследованы и проанализированы образцы крови 64 онкологических больных в возрасте 38-64 лет с гистологически доказанным диагнозом злокачественного новообразования. В соответствии с гистологической классификацией опухолей (Ю.Ю.Андреева, Л.Э.Завалишина, Г.А.Франк Классификация эпителиальных опухолей мочевого пузыря. Архив патологии 5. 2006. С.46-53, М.А.Пальцев, Н.М.Пальцев Патологическая анатомия, т.1., М.: Медицина. 2001. С.278-285) онкологические больные были подразделены на три группы: с железистым раком (аденокарциномы - рак молочной железы (6), рак простаты (4)), с переходноклеточным раком (рак мочевого пузыря или мочевыводящих путей (14), рак почки (12)), плоскоклеточные (рак гортани (25), рак трахеи (1), рак легкого (2)).

Все пациенты впервые поступили в стационар и ранее не подвергались какому-либо противоопухолевому лечению. Для сравнения были исследованы и проанализированы образцы сыворотки крови больных сахарным диабетом (12 человек: 29-72 года) и острой респираторной вирусной инфекцией (10 человек: 22-35 лет). Контрольной группой служили образцы крови 10 практически здоровых лиц (27-56 лет).

В настоящее время приняты критерии Международной TNM-классификации злокачественных опухолей, определенные редакцией шестого издания (2002). TNM-классификация, принятая для описания анатомической распространенности опухоли, оперирует тремя основными категориями: Т (tumor) - характеризует распространенность первичной опухоли, N (nodus) - отражает состояние регионарных лимфатических узлов, М (metastasis) - указывает на наличие или отсутствие отдаленных метастазов.

Опухоли всех больных со злокачественными новообразованиями были описаны в соответствии с Международной TNM-классификацией на основе проведенного постоперационного гистологического исследования. Был осуществлен корреляционный анализ выявленных признаков фации, указывающих на наличие злокачественного новообразования, с тремя основными категориями TNM, а также с видом опухоли по ее гистологической классификации. Не было выявлено достоверной зависимости вида наблюдаемых патологических особенностей фации от гистологического типа опухоли, однако была обнаружена достоверная положительная корреляционная связь наличия отдаленных метастазов (М) с выявлением параллельных трещин в виде гребней в краевой и промежуточной зонах фации плазмы крови (см. таблицу 1).

Таблица 1 Коэффициенты корреляции между наличием патологических особенностей фации плазмы крови, выявляемых при злокачественных новообразованиях, и параметрами опухоли по Международной TNM-классификацией, а также ее типом в соответствии с гистологическим исследованием (корреляционная матрица по Пирсону) Особенности фации плазмы крови
Параметры опухоли у-трещины гребни черные прямые + черная сеть трещины в центре аморфные включения в центре кристаллы в виде зерен в центре Т -0,018 0,253 -0,423* -0,216 0,490* N -0,098 0,122 -0,331 -0,009 0,128 М -0,524* 0,492* -0,545* -0,324 0,372 Вид опухоли -0,364 0,277 0,141 -0,108 -0,041 * - статистически достоверный коэффициент корреляции (r≥0,4, уровень значимости p<0,05)

Таким образом, предлагаемый способ диагностики позволяет проводить скрининг-обследование населения и выявлять пациентов с подозрением на наличие онкологической патологии с тем, чтобы в дальнейшем провести им более дорогостоящее обследование. Способ не требует на выполнение много времени, дорогостоящих реактивов и оборудования, доступен для выполнения в каждой клинической лаборатории больницы.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

Кровь центрифугируют в течение 10 минут при 1000 об/мин. На предметное стекло, предварительно обработанное, расположенное строго горизонтально, наносят каплю сыворотки (плазмы) объемом 0,01 мл (10 мкл), при этом диаметр капли составляет около 5 мм. Делают 6 поворотов для проверки достоверности и взаимной идентичности фации. Высушивание проводят при температуре 20-25°С и относительной влажности 65-70% вдали от нагревательных приборов и прямых солнечных лучей при минимальной подвижности окружающего воздуха. В процессе высыхания капля должна быть неподвижна. Вид и структуру дегидратированной капли оценивают с помощью микроскопа в отраженном свете при увеличении 10×8. Описание картины фации представляют в виде таблицы. Каплю подразделяют на три зоны, в каждой из которых оценивают количество, расположение, форму и размер структур. Анализ данных проводят с учетом количественных и качественных признаков. Статистическая обработка полученных результатов осуществлялась с применением пакета программ STATISTICA 6.0. Для онкологической патологии характерна совокупность следующих диагностических особенностей:

- при наличии в центральной зоне аморфных образований или кристаллов в виде зерен, а также микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин, выходящих в промежуточную зону, и/или при наличие в промежуточной и/или краевой зонах у-образных трещин диагностируют злокачественное солидное новообразование,

- при наличии в промежуточной и/или краевой зонах параллельных микротрещин в виде гребня диагностируют наличие отдаленных метастазов.

Примеры конкретного исполнения даны в виде выписок из истории болезни

Пример 1. Пациент И., 61 год, поступил в клинику с диагнозом рак надсвязочного отдела гортани, T2N0M0, плоскоклеточный вариант. Диагноз подтвержден результатами последующего анализа послеоперационного материала. При поступлении периферические регионарные лимфоузлы не увеличены. Клинико-инструментальных данных за наличие отдаленных метастазов не выявлено. До начала противоопухолевого лечения пациенту И. предложенным способом проведен анализ плазмы крови. Обнаружены кристаллы в виде зерен в центральной зоне фации и у-образные трещины при отсутствии параллельных трещин в виде гребня в краевой и промежуточных зонах фации. Диагностирован злокачественный онкологический процесс без наличия отдаленных метастазов, что соответствует данным клинико-инструментального обследования.

Пример 2. Пациент Г. поступил в клинику с диагнозом рак левой почки. Предложенным способом проведен анализ плазмы крови пациента Г. Обнаружены кристаллы в виде зерен в центральной зоне фации и параллельные трещины в виде гребня в промежуточной зоне. Диагностирован злокачественный онкологический процесс с наличием отдаленных метастазов. На основании гистологического исследования опухоли после проведения операции диагностирован светлоклеточный гипернефроидный рак почки с инфильтративным ростом в лоханку и капсулу с метастазами в лимфоузлах. На основании данных клинико-инструментального обследования и с учетом результатов гистологии установлена стадия заболевания pT3N2M+.

Пример 3. Пациент М. поступил в клинику с диагнозом рак мочевого пузыря, T2NXM0. Предложенным выше способом проведен анализ плазмы крови пациента М. Обнаружены аморфные образования в центральной зоне фации и сочетание микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин. Диагностирован злокачественный онкологический процесс без наличия отдаленных метастазов. По результатам клинико-инструментального исследования данных за наличие отдаленных метастазов также не выявлено.

На основании гистологического исследования послеоперационного материала дано заключение о наличии инфильтрирующей уретереальной карциномы мочевого пузыря высокой степени анаплазии G3 категории high-grade с очаговым характером инвазии на 2/3 мышечного слоя стенки мочевого пузыря и сохраненной гистоархитектоникой простаты. Очаговая железисто-стромальная гиперплазия. В лимфоузлах метастазы не обнаружены. Патологоанатомическая стадия заболевания не изменена: T2N0M0.

Пример 4. Предложенным способом проведен анализ плазмы крови пациента О. Наблюдаются кристаллы в центральной части фации в виде зерен и наличие сочетания черных прямых трещин и трещин в виде черной сети. Диагностирован злокачественный онкологический процесс без наличия отдаленных метастазов. На основании гистологического и клинико-инструментального исследований дано заключение о наличии рака легкого без метастазов: T1N0M0.

Пример 5. Предложенным способом проведен анализ плазмы крови больной Т. Наблюдаются аморфные образования в центральной зоне и у-образные трещины в краевой и промежуточных зонах фации. Диагностирован злокачественный онкологический процесс без наличия отдаленных метастазов. На основании гистологического и клинико-инструментального исследований дано заключение о наличии рака молочной железы без метастазов: T1N0M0.

Данное изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов. Для этого сыворотку (плазму) крови исследуют методом клиновидной дегидратации и изучают полученный структурный макропортрет. При наличии в центральной зоне аморфных образований или кристаллов в виде зерен, а также микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин, выходящих в промежуточную зону, и/или наличии в промежуточной и/или краевой зонах у-образных трещин диагностируют злокачественное солидное новообразование. При наличии в промежуточной и/или краевой зонах параллельных микротрещин в виде гребня диагностируют наличие отдаленных метастазов злокачественного солидного новообразования. 5 пр., 5 ил., 1 табл.

Способ диагностики злокачественных солидных опухолей и их отдаленных метастазов, включающий исследование сыворотки крови, отличающийся тем, что сыворотку крови исследуют методом клиновидной дегидратации и изучают полученный структурный макропортрет, при этом при наличии в центральной зоне аморфных образований или кристаллов в виде зерен, а также микротрещин в виде черной сети и черных прямых трещин, выходящих в промежуточную зону, и/или наличие в промежуточной и/или краевой зонах у-образных трещин диагностируют злокачественное солидное новообразование, при наличии в промежуточной и/или краевой зонах параллельных микротрещин в виде гребня диагностируют наличие отдаленных метастазов злокачественного солидного новообразования.