ОПУХОЛЕВАЯ ВАКЦИНА, СОДЕРЖАЩАЯ АЛЛОГЕННЫЕ ИЛИ КСЕНОГЕННЫЕ ОПУХОЛЕВЫЕ КЛЕТКИ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/00 A61P35/00 

Область изобретения

Данное изобретение относится к лечению опухолей. В частности, это изобретение относится к иммуноопосредованному лечению опухолей.

Уровень техники

Иммунная система состоит из двух ветвей, которые, хотя и различаются скоростью и специфичностью, связаны между собой сложным образом, создавая быстрый и направленный ответ и против эндогенных, и против экзогенных факторов [16,21]. Врожденная иммунная система обеспечивает немедленную защиту организма от физических, химических и микробиологических факторов [16,21]. Она включает нейтрофилы, моноциты, макрофаги, систему комплемента, цитокины и белки острой фазы [16,21]. Несмотря на отсутствие антигенной специфичности врожденная иммунная система способна отличать свои белки от несвоих, чужеродных, белков [16,21]. Приобретенный иммунитет, в свою очередь, включает В- и Т-лимфоциты и является высокоспецифичным антигеннаправленным ответом [16,21]. Преимуществом приобретенного иммунитета является возможность развития иммунной памяти, наличие которой приводит к более сильному и более быстрому ответу при последующей стимуляции [8,9].

Особой чертой приобретенного (специфического) иммунитета является вовлечение в направленный иммунный ответ Т- и В-лимфоцитов, несущих антигенспецифические рецепторы [16,21]. Большинство Т-клеточных эффекторов составляют Т-хелперные клетки, имеющие CD4 рецепторы, и Т-цитотоксические клетки, имеющие CD8 рецепторы [16,21]. Т-хелперы взаимодействуют с молекулами МНС 2 класса и отвечают за координирование иммунного ответа, узнавание чужеродных антигенов, активацию различных частей иммунной системы и В-клеток. Т-цитотоксические клетки взаимодействуют с рецепторами МНС 1 класса и играют роль в развитии иммунного ответа против экзогенных патогенов [16,21].

Главный комплекс гистосовместимости (МНС, Major Histocompatibility Complex) является генетической областью, которая кодирует белки, играющие существенную роль в регулировании и коррекции иммунного ответа [10,16]. Генные продукты МНС делятся на две различные группы в зависимости от их структуры и биологических свойств - МНС 1 класса и МНС 2 класса [10,16]. Рецепторы МНС 1 класса имеются на всех ядерных клетках [10,16]. Они представляют собой эндогенно синтезированные белки, которые тесно связаны с распознаванием собственных антигенов. Рецепторы МНС 2 класса были найдены только на тех клетках, которые участвуют в иммунном ответе, и представляют собой экзогенные белки, такие как продуценты бактерий [10,16]. Классически считалось, что в отторжение опухоли вовлечены МНС 1 класса, но позже выяснилось, что в этом процессе играют роль МНС 2 класса.

Многообразие антигенов, связывающихся молекулами МНС 1 класса, основано на трех основных и взаимосвязанных принципах. Во-первых, МНС 1 класса имеют способность связывать белки со многими различными последовательностями [2,16]. Эти комплексы антигена с молекулой МНС 1 класса могут быть распознаны цитотоксическими Т-лимфоцитами (CD8), что в итоге приводит к разрушению любой клетки, несущей подобный чужеродный белок [10,16]. Во-вторых, каждый организм экспрессирует большое количество различных генов МНС 1 класса [10,16]. Наконец, показан полиморфизм молекул МНС с большим количеством аллелей в каждом локусе [10,16,23]. У человека молекулы МНС 1 класса представлены несколькими локусами, названными системой лейкоцитарных антигенов (HLA, Human Leukocyte Antigen). Это локусы HLA-A, -В и -С, наиболее полиморфным из которых является HLA-B [16,23]. Перечисленные факторы подразумевают высокую степень индивидуальной специфичности и необходимость в регуляторе, который бы проявил селективное давление на клеточный иммунитет.

Эта высокая степень специфичности и доминирующее селективное давление используются в трансплантации органов и тканей от индивидуума к индивидууму [23]. Отторжение трансплантированной ткани менее вероятно у однояйцевых близнецов и генетически близких членов семьи, так как у них есть схожие локусы HLA [16]. Это объясняется тем, что гены МНС 1 экспрессируются кодоминантно и в большинстве случаев наследуются целиком и без рекомбинации [16,23]. Поэтому у индивидуумов с гомозиготным генотипом, таких как однояйцевые близнецы, и сингенных крыс теоретически возможна передача мозговой опухоли реципиенту от его/ее гомозиготного донора. Еще более важным является то, что реципиент может отторгнуть мозговые опухолевые клетки, полученные от гетерозиготного донора, на основании специфического направленного иммунного ответа.

Как уже было сказано раньше, рецепторы МНС 1 класса являются поверхностными гликопротеинами большинства клеток, играющих значительную роль в иммунном ответе. Молекулы МНС 1 класса связывают белки-антигены и взаимодействуют с НК-клетками и клетками CD8 [5,16,25]. Эти белки-антигены являются продуктами деградации эндогенных белков опухолевых клеток или клеток, зараженных вирусами [5,16,25]. Процессинг антигена представляет собой сложный механизм, состоящий из нескольких этапов. Дефект какого-либо из этапов может привести к нарушению экспрессии комплекса антигена и МНС 1 класса, в результате чего антиген не распознается Т-лимфоцитами и не разрушается [12]. Частыми механизмами, посредством которых антиген избегает разрушения CD8 клеткой, являются потеря комплекса МНС 1 или нарушение его регуляции [12]. Интуитивно можно предположить, что эта «самостоятельная потеря» [17] маркера может привести к усилению распознавания МК-клетками, которые ингибируются при взаимодействии с МНС 1 и стимулируются клетками с пониженной экспрессией HLA-2/HA [18]. Даже при полностью функционирующей иммунной системе опухоль может избегать распознавания, используя стратегию ускользания [12]. Хотя стратегия ускользания изучена слабо, экспериментально выявлено и описано несколько механизмов, соответственно которым опухоль избегает распознавания иммунной системой. Эти механизмы колеблются от мутаций в HLA гаплотипе или его потери до неспособности ответа на интерфероны [12]. Таким образом, было показано, что в то время, как изменение или потеря рецепторов МНС 1 класса связана с возникновением различных опухолей, представление молекул МНС 1 участвует в развитии резистенции к раку.

Примером противоопухолевого эффекта молекул МНС 1 может служить иммунологический надзор над целостностью митохондриальной ДНК. В одном исследовании была показана роль молекул МНС 1, заключающаяся в устранении клеток, несущих митохондриальные мутации [13]. Клетки глиомы человека несут многочисленные мутации и в митохондриальной ДНК, и в митохондриальном комплексе [7]. В соответствии с этими данными можно предположить, что глиомы подобного гистологического типа/класса будут нести похожие мутации в своих ДНК и будут иметь похожие ненормальные поверхностные белки, связанные и с молекулами МНС 1 класса, и с клеточной мембраной. Наоборот, интактная иммунная система также может допускать развитие и прогрессирование опухолей.

Было показано, что прогрессия некоторых раковых состояний связана с экспрессией опухолеспецифичных антигенов и сопутствующим иммунным ответом [15]. Поэтому эффективное отторжение опухоли и развитие иммунитета не могут быть достигнуты исключительно самовакцинацией. Но несмотря на эти барьеры имеются доказательства того, что иммунная система может быть использована для борьбы с раком. В то время как и разрегулированная, и нормально функционирующая иммунная система борется с иммунным отторжением рака, известны случаи спонтанного отторжения злокачественных опухолей [19,26]. Была предложена интересная идея о том, что аутоиммунные болезни могут улучшать прогноз пациентов со злокачественными опухолями [6,19]. У этих пациентов выявлена значительная гомология большинства специфических IgG и с человеческими, и с микробными белками [14]. Это ведет к гипотезе, что молекулярная мимикрия может инициировать рассмативаемый противоопухолевый аутоиммунитет. Исследования, связанные с этим, показали долгосрочную ремиссию злокачественных опухолей головного мозга после внутричерепной инфекции у четырех пациентов [4] и улучшение выживаемости больных раком с микробной инфекцией [20,22]. Это приводит к вопросу, может ли аутоиммунитет, вызванный молекулярной мимикрией, использоваться для лечения опухоли. Был отмечен важный факт существования значительной гомологии между человеческими белками и белками других видов [24]. Дальнейшие эксперименты показали, что ксеногенный антиген от эндотелиальных клеток может нарушить иммунную толерантность к аутологичным ангиогенным эндотелиальным клеткам [20]. Благодаря этому можно предположить, что аутотолерантность к опухолям может быть нарушена через перекрестную реактивность с гомологичным чужеродным антигеном.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение основано на осознании того факта, что если у двух или более гетерозиготных индивидуумов имеется одинаковый рак/опухоль одинакового или подобного гистологического класса, то трансплантация опухолевых/раковых тканей/клеток от одного индивидуума (или индивидуумов) другому (или другим) не только вызовет отторжение трансплантированной ткани/опухоли, но также увеличит иммунологическую настороженность по отношению к пептидам, которые являются общими для этих опухолей/раковых образований и других опухолей, содержащих сходные пептиды. Поэтому аллогенные опухоли могут быть использованы для вакцинации против уже имеющейся опухоли, уменьшения ее размера или ее устранения и формирования длительной памяти. Эта методика приведет не только к окончательному отторжению первичной опухоли, но также к формированию длительной иммунологической памяти, предохраняющей организм от возможного повторного развития этой опухоли.

Согласно первому аспекту изобретения композиция для лечения или предотвращения опухоли включает:

(1) аллогенные или ксеногенные клетки опухоли и

(2) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Аллогенные или ксеногенные клетки могут быть получены от одного или нескольких аллогенных или сингенных индивидуумов. Они представляют собой либо целые клетки, либо лизат клеток. Композиция может также включать лизат сингенных клеток.

Согласно второму аспекту изобретения применяют аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки в изготовлении лекарства для лечения опухоли у пациента.

Кроме того, лекарство также может включать лизат сингенных клеток. Аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки могут быть в виде целых клеток или в виде лизата.

Настоящее изобретение не только лечит опухоли, но и имеет преимущество, заключающееся в том, что иммунная система способна эффективно воздействовать на опухоль, избегая проблем, связанных с введением/воздействием обычных химиопрепаратов. У химиотерапии есть много нежелательных побочных эффектов, включая облысение, тошноту, диарею, анемию и увеличенный риск инфекции, которых можно избежать, используя терапию, предложенную в изобретении.

Описание графических материалов

Изобретение описано со ссылками на соответствующие рисунки.

Фиг.1 является схемой эксперимента на крысах линии Sprague Dawley. Крысы были разделены на две группы: те, которые получают сингенную клеточную линию (С6, SD-A), и те, которые получают аллогенную клеточную линию (9L, SD-B). Сингенная ветвь исследования была разделена на две группы: контрольную (5 крыс, SD-A1) и опытную (4 крысы, SD-A2). На 27 день были убиты 4 SD-A1 крысы. В это же время оставшаяся крыса SD-A1 (крыса 9) была переведена на протокол опыта. Все SD крысы, которым изначально вводили аллогенные клетки ветви 9L (SD-B), получили в боковую область инъекции сингенной клеточной линии С6 (100000 клеток), а десять дней спустя дополнительную дозу в 500000 клеток С6.

Фиг.2 является схемой эксперимента на крысах линии Fisher 344. Крысы были разделены на две группы: те, которые получают сингенную клеточную линию 9L (Fisher А), и те, которые получают аллогенную клеточную линию С6 (Fisher В). Крысы сингенной группы (Fisher А) были разделены на контрольную группу (Fisher А-1) и опытную группу (Fisher A-2). Крысам Fisher A-1 вводились сингенные клетки RG2, 9L или только среда. Крысы Fisher A-2 подвергались воздействию аллогенными клетками, аллогенными клетками и лизатом клеток, лизатом сингенных клеток и ксеногенными клетками либо только ксеногенными клетками. Крысам Fisher В первоначально вводились аллогенные клетки С6. Впоследствии они получили в боковую область инъекции сингенных клеток 9L (100000 клеток), а десять дней спустя дополнительную дозу в 500000 клеток.

Фиг.3 представляет собой график, показывающий развитие/прогрессию опухоли у 9 крыс линии SD с подкожно имплантированной сингенной опухолью (С6). Крысы были помещены или в контрольную, или в опытную группу, как описывалось выше. Опухолевая прогрессия оценивалась путем измерения объема опухоли (мм³). Крысы под номерами 1, 2, 3 и 4 не получали никакого воздействия после имплантации опухоли С6. Крысам под номерами 5, 6, 7 и 8 вводились аллогенные летки 9L и лизаты сингенных клеток С6. Крыса номер 9 была включена в опытную группу крыс 5-8 после того, как у нее сформировалась очень большая опухоль.

Фиг.4 представляет собой график, показывающий развитие/прогрессию опухоли у крыс линии Fisher 344 с подкожно имплантированной сингенной опухолью (9L). Контрольным крысам (Fisher A-1) были введены сингенные клетки RG2 (Крыса 1), сингенные клетки 9L (Крыса 2) или только среда (Крыса 3). У крысы 1, получившей двойную дозу клеток, сформировалась чрезвычайно большая опухоль. Опытные крысы (Fisher A-2) получили только аллогенные клетки С6 (Крыса 4), аллогенные клетки С6 и лизат (Крыса 5), лизат сингенных клеток 9L, ксеногенных клеток U87 и клеток LN229 (Крыса 6), только ксеногенные клетки U87 и LN229 (Крыса 7). Крысе 8 был введен только лизат сингенных клеткок 9L. Опухолевая прогрессия оценивалась путем измерения объема опухоли (мм³).

На Фиг.5 показаны срезы опухолей, взятых у крыс контрольной группы А и опытной группы В (Fisher 344). Срезы были сделаны толщиной 7 мкм и окрашены антителами к рецептору CD4 согласно вышеописанному протоколу. Стрелки указывают расположение клеток, положительно окрасившихся на поверхностный маркер CD4. Увеличение и контрольных (А), и наблюдаемых (В) образцов составляет 40 раз.

На Фиг.6 показаны срезы опухолей, взятых у крыс контрольной группы А и опытной группы В (Fisher 344). Срезы были сделаны толщиной 7 мкм и окрашены антителами к рецептору CD8 согласно вышеописанному протоколу. Стрелки указывают расположение клеток, положительно окрасившихся на поверхностный маркер CD8. Увеличение и контрольных (А), и наблюдаемых (В) образцов составляет 40 раз.

На Фиг.7 показаны срезы опухолей, взятых у крыс контрольной группы А и опытной группы В (Fisher 344). Срезы были сделаны толщиной 7 мкм и окрашены антителами к В-лимфоцитам (CD20) согласно вышеописанному протоколу. Стрелки указывают расположение клеток, положительно окрасившихся на поверхностный маркер CD20 (Фиг.5b). Увеличение и контрольных (А), и наблюдаемых (В) образцов составляет 40 раз.

На Фиг.8 показаны срезы опухолей, взятых у крыс контрольной группы А и опытной группы В (Fisher 344). Срезы были сделаны толщиной 7 мкм и окрашены антителами к макрофагам (CD68) согласно вышеописанному протоколу. Стрелки указывают расположение клеток, положительно окрасившихся на поверхностный маркер CD68. Увеличение и контрольных (А), и наблюдаемых (В) образцов составляет 40 раз.

На Фиг.9 показаны срезы опухолей, взятых у крыс контрольной группы А и опытной группы В (Fisher 344). Срезы были сделаны толщиной 7 мкм и окрашены антителами к маркеру дендритных клеток (DRC, Dendritic cell marker) согласно вышеописанному протоколу. Стрелки указывают расположение клеток, положительно окрасившихся на поверхностный маркер DRC. Увеличение и контрольных (А), и наблюдаемых (В) образцов составляет 40 раз.

Подробное описание изобретения

В настоящем изобретении используются аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки и сингенные клетки для увеличения настороженности иммунной системы пациента, для лечения опухоли. Опухолевые клетки, используемые для вакцин в этом изобретении, имеют такие же пептиды, как и рак/опухоль того же гистологического класса, но другие молекулы МНС 1.

Вакцины производятся из целых аллогенных или ксеногенных опухолевых клеток или из лизатов аллогенных или ксеногенных опухолевых клеток. Дополнительно вакцина может включать лизат одной или более сингенных клеток.

Предпочтительно, если аллогенные или ксеногенные клетки являются опухолевыми клетками такого же (или подобного) гистологического класса, как и клетки опухоли пациента. Соответственно, если у пациента имеется глиобластома головного мозга, то вакцина будет изготовлена из аллогенных или ксеногенных клеток глиобластомы головного мозга. Таким образом, пептиды, находящиеся в клетках, будут такими же и увеличат вероятность того, что возникающий иммунный ответ будет соответствующим.

Вакцинные композиции обычно будут включать аллогенные или ксеногенные клетки/лизаты, полученные от двух или более гетерозиготных индивидуумов. Предпочтительно, чтобы вакцинные композиции готовились с использованием аллогенных или ксеногенных клеток/лизатов, полученных по меньшей мере от трех гетерозиготных индивидуумов.

Термин "аллогенный" относится к клеткам, взятым от различных индивидуумов одного вида.

Термин "ксеногенный" означает, что продукт получен от организма другого вида.

Термин "сингенный" относится к генетически идентичным особям одного вида. Например, у однояйцевых близнецов клетки и ткани являются сингенными.

В описании рака/опухоли упоминается определение "такой же или подобный гистологический класс". Специалист поймет, что здесь говорится о раковых образованиях одинакового типа и с одинаковым уровнем дифференцировки. Градация может быть определена по методу Elston-Ellis (Simpson et al., J. Clin. Oncol., 2000, 18 2059-2069).

Термины "рак" и "опухоль" используются взаимозаменяемо.

Настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективное количество аллогенных или ксеногенных опухолевых клеток и, возможно, фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества.

Фармацевтические композиции могут применяться у человека или животных в медицине или ветеринарии. Типичной составляющей является фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. Приемлемые вспомогательные вещества для терапевтического использования хорошо известны в фармацевтике и описаны, например, в Справочнике по фармацевтическим наукам Ремингтона (Remington's Pharmaceutical Sciences), Mack Publishing Co. (под ред A.R.Gennaro, 1985). Выбор фармацевтического вспомогательного вещества может быть сделан в зависимости от намеченного пути введения и стандартов фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут содержать в качестве вспомогательного вещества или вдобавок к вспомогательному веществу любое подходящее связывающее вещество(вещества), смазывающее вещество(вещества), суспендирующий, пленкообразующий, солюбилизирующий агент(ы). Понятие "вспомогательное вещество" включает также разбавители и носители.

В фармацевтическую композицию могут быть введены консерванты, стабилизаторы и красители. Примерами консервантов служат бензоат натрия, сорбиновая кислота и сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты. Также могут использоваться антиоксиданты и суспендирующие агенты.

В зависимости от различных систем доставки лекарства могут быть различные требования к его составу/композиции.

В подходящих случаях фармацевтические композиций могут вводиться парентерально путем инъекции, например внутривенной, внутримышечной или подкожной. Для парентерального введения лучше всего использовать композиции в форме стерильного водного раствора, в который можно включать другие вещества, например достаточно солей или моносахаров, чтобы сделать раствор изотоническим крови.

Вакцина может быть изготовлена из композиции, предложенной в этом изобретении.

Специалистам в этой области известен принцип приготовления вакцин, содержащих в качестве активных компонентов иммуногенные клетки. Как правило, такие вакцины готовят в форме для инъекций: либо в виде жидких растворов, либо в виде суспензий; также могут быть приготовлены твердые формы, пригодные для растворения или суспендирования в жидкости перед инъекцией. Возможно также приготовление эмульсий и липосом с инкапсулированными в них клетками. Активные иммуногенные компоненты часто смешиваются с вспомогательными веществами, которые являются фармацевтически приемлемыми и совместимыми с активными компонентами. Подходящими вспомогательными веществами могут являться вода, раствор соли, декстроза, глицерин, этанол и т.п. или их комбинация.

Кроме того, при желании вакцина может содержать незначительное количество дополнительных вспомогательных веществ, таких как увлажняющие или эмульгирующие агенты, pH-буферные вещества и/или адъюванты, которые увеличивают эффективность вакцины. Примерами адъювантов, которые могут быть эффективны, могут служить гидроокись алюминия, N-ацетил-мурамил-L-треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-L-аланил-D-изоглутамин (CGP 11637, известный как nor-MDP), N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглутамин-L-аланин-2-(1'-2'-дипальмитил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)-этиламин (CGP I9835A, называемый МТР-РЕ) и RIBI, содержащий три компонента, выделяемые из бактерий: монофосфорил липид А, димиколат трегалозы и цитоскелет (MPL+TDM+CWS) в 2% эмульсии сквалена и Tween 80. Данным списком не исчерпывается количество возможных для использования адъювантов.

Другими примерами адъювантов и других агентов могут служить гидроокись алюминия, фосфат алюминия, сульфат калия и аллюминия (алюмокалиевые квасцы), сульфат бериллия, кварц, каолин, уголь, водно-масляные эмульси, масляно-водные эмульсии, мурамил-дипептид, бактериальный эндотоксин, липид X, микроорганизмы Corynebactenum parvum (Propionobactenum acnes), Bordetella pertussis, полирибонуклеотиды, альгинат натрия, ланолин, лизолецитин, витамин А, сапонин, липосомы, левамизол, ДЭАЭ-декстран (DEAE-dextran, Diethylaminoethyl-Dextran), блок-сополимеры или другие синтетические адъюванты. Такие адъюванты коммерчески доступны, могут быть получены из различных источников, например адъювант Merck Adjuvant 65 (Merck and Company, Inc, Rahway, N.J.) или неполный и полный адъюванты Фрейнда (Freund's Adjuvant, Difco Laboratories, Detroit, Michigan).

Как правило, используются такие адъюванты, как Amphigen (масляно-водные), Alhydrogel (гидроокись алюминия) или их смесь. Для применения у человека одобрена только гидроокись алюминия.

Пропорции иммуногенного фактора и адъюванта могут варьировать в широком диапазоне, пока оба они присутствуют в эффективном количестве. Например, гидроокись алюминия может присутствовать в вакцинной композиции в количестве, составляющем около 0,5% (основание А12O3). Для удобства вакцины сформированы таким образом, чтобы содержать конечную концентрацию иммуногена в диапазоне 0,2-200 мг/мл, предпочтительно 5-50 мг/мл, наиболее предпочтительно 15 мг/мл.

Обычно вакцины вводят парентерально, с помощью инъекции, например подкожно или внутримышечно.

Как правило, врач определяет ту дозировку, которая будет наиболее подходящей для конкретного индивидуума, и она изменяется в зависимости от возраста, веса и реакции пациента. Данные ниже дозировки являются примерами для среднего случая. Конечно, возможны отдельные случаи, когда будет использоваться более высокая или более низкая дозировка.

Количество каждого компонента будет ясно специалисту. Подходящими являются следующие количества:

а) 1×10⁶ (±0,5×10⁶) аллогенных клеток опухоли с различными молекулами МНС 1, обработанными динитрофенилом (DNP).

б) 2×10⁶ (±1×10⁶) аутологичных опухолевых клеток, облученных и обработанных DNP.

в) 2×10⁶ (±1×10⁶) лизата клеток аутологичных (сингенных) опухолей.

д) 1×10⁶ (±0,5×10⁶) лизата клеток аллогенных опухолей.

Далее изобретение будет описано со ссылками на сопровождающие рисунки.

Пример

Клеточные линии и клеточные культуры:

В этом эксперименте использовались крысиные (9L, С6, RG2) и человеческие (U87, LN229) клеточные линии глиомы. Все линии были получены из American Type Tissue Collection (ATTC) и выращены в среде Игла-МЕМ (Dulbecco's Modified Eagles Medium, DMEM) (GIBCO, Grand Island, NY) с добавлением 10% термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), 5% пенициллин-стрептомицина и буфера Hepes путем инкубации в условиях абсолютной влажности с 5% содержанием CO₂ при температуре 37°C.

Приготовление лизата:

Клетки в количестве 1,0×10⁵ поместили в пробирку с культивационной средой объемом 5 мл и центрифугировали в течение 5 мин при скорости 2,5×10³ оборотов в минуту. Супернатант удалили, а в пробирку добавили 150 мкл стерильной дистиллированной воды. Кпеточно-водный раствор тщательно перемешали, перенесли в эппендорф объемом 1 мл и центрифугировали в течение 10 минут при скорости 1,0×10⁴ оборотов в минуту. Супернатант не удалили и весь этот раствор использовали для инъекций клеточного лизата.

Антитела и иммуногистохимия:

Из образцов опухоли, взятых у крыс Fisher 344 и замороженных в смеси для заливки и замораживания срезов (ОТС, Optimal Cutting Temperature Compound), на криостате были приготовлены срезы толщиной 7 мкм. Эти срезы были высушены, зафиксированы ацетоном и тщательно отмыты фосфатно-солевым буфером (PBS, Phosphate Buffered Saline) в течение 1-2 минут. Блокировка была произведена с помощью иммунной сыворотки от образцов, от которых были взяты вторые антитела. Предметные стекла были полностью отмыты и затем снова окрашены первичными антителами к CD4, CD57 (Nora Castro Lab Ltd, Burlingame, CA), CD8, дендритным ретикулярным клеткам (DRC) (Dako Corporation, Carpentaria, CA), CD20, CD68 (Ventana, Tucson, AZ). Затем предметные стекла снова отмыли и внесли вторичные биотинилированные антитела. Их снова ополоснули и поместили в раствор, состоящий из 1 части 3% раствора перекиси водорода и 9 частей 1% раствора азида натрия в PBS. Предметные стекла ополоснули и на 30-40 минут добавили авидин-биотиновый комплекс (ABC, avidin-biotin complex). Затем отмыли их с PBS, проявили тетрахлоридом диаминобензидина и контрастно окрасили. Фотографии всех стекол были сделаны с помощью световой микроскопии.

Анализ роста опухоли:

Все опухоли были найдены при визуальном осмотре и пальпации. После этого область вокруг опухоли была дополнительно обнажена при бритье электрической бритвой. Во время инъекции размеры опухоли были измерены в миллиметрах с помощью циркуля Верньера. Измерения были проведены в краниокаудальном (длина), верхненижнем (высота) и медиалатеральном (ширина) размерах. Объем опухоли был вычислен как половина произведения длины, ширины и высоты.

Исследования in vivo:

Все исследования на животных были одобрены Комитетом по охране и использованию животных (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC) Университета Южной Калифорнии. Все крысы содержались в непатогенной окружающей среде. Для эксперимента авторы использовали крыс линий Sprague Dawtey и Fisher 344, приобретенных у компании Harlan (Индианаполис, Индиана). Все крысы были самцами в возрасте 4-6 недель. Для создания моделей подкожной опухоли клетки линий С6 и 9L были собраны только с помощью DMEM, чтобы вымыть их из контейнеров для перевозки клеточной культуры. Затем были приготовлены шприцы, содержащие 100000-150000 клеток, суспендированных в 150 мкл.

Крысы Sprague Dawley (SD) были разделены на две группы (Фиг.1). В группе SD-A (9 крыс) была имплантирована С6 глиома, сингенная клеточной линии глиомы для крыс SD. Крысам SD-B (3 крысы) были введены 9L аллогенные клетки. Как только у крыс группы А развилась пальпаторно ощутимая боковая опухоль, они были разделены на две группы. SD-A1 (контрольная группа - 5 крыс) не получали инъекций. SD-A2 (опытная группа - 4 крысы) получали инъекцию комбинацей аллогенных 9L клеток, аллогенного 9L и сингенного С6 лизата. На 27 день 4 из 5 крыс группы SD-A1 были убиты. В это же время одна из крыс контрольной группы, крыса номер 9, была переведена на тот же протокол исследования, что и крысы SD-A2. Комбинация аллогенных клеток, сингенных и аллогенных лизатов использовалась для усиления иммунного ответа У крыс SD-B, у которых опухоль так и не сформировалась, была исследована иммунологическая память. Им ввели 100000 сингенных клеток С6, а 10 дней спустя еще 500000 клеток С6, а затем проверили их на формирование боковой опухоли.

Крысы линии Fisher также были разделены на две группы (Фиг.2). Крысам линии Fisher-A (8 крыс) были имплантированы сингенные клетки 9L. Крысам линии Fisher-B (3 крысы) были инъецированы аллогенные клетки линии С6. Как только у крыс Fisher-A развилась пальпаторно ощутимая боковая опухоль, они были далее поделены на две группы. Fisher A-1 (контрольная группа - 3 крысы) получали инъекции сингенных 9L клеток, сингенных RG2 клеток или только среды. Fisher A-2 (опытная группа - 5 крыс) получали комбинацию аллогенных клеток С6, лизата аллогенных С6 или ксеногенных U87 и LN229 клеток (см. Фиг.2). У крыс Fisher-B, у которых первоначально сформировались опухоли и впоследствии были отторгнуты, исследовали иммунологическую память путем введения им смеси сингенных 9L клеток и лизата и проверили на наличие опухолевого роста.

Забор подкожной ткани:

Все экспериментальные животные были умерщвлены путем введения смертельной дозы фенобарбитала. Все опухоли были выделены и иссечены в стерильных условиях, разрезаны на 4 части и сохранены при температуре -80°C. Все срезы опухоли были сделаны толщиной 7 мкм и иммуногистохимически окрашены.

Результаты

В большинстве исследований, посвященных глиобластоме, используются модели на малых лабораторных животных. Наиболее часто используемыми иммунокомпетентными моделями животных являются две различные линии крыс: Sprague Dawley и Fisher 344 [1]. Клеточная линия С6 является сингенной для крыс SD, а линии 9L и RG2 сингенными для Fisher 344 rats [1,11].

Трем крысам Fisher были введены клетки линии С6 (Fisher В). Хотя у них действительно сформировались ограниченные опухоли, впоследствии в течение сорока дней они были отторгнуты. Подобная процедура проводилась в опыте над тремя крысами SD с клеточной линией 9L (SD-B). У всех крыс SD произошло отторжение 9L опухоли без видимого или пальпаторно ощутимого роста опухоли. Всем крысам SD-A были введены инъекцией клетки линии С6. В течение десяти дней у всех них развились видимые опухоли. В этот момент пять крыс были сохранены в качестве контрольной группы (SD-A1), в то время как оставшиеся четыре крысы были перемещены в опытную группу (SD-A2). На 27-й день были убиты крысы 1-4 и предпринята попытка "спасти" крысу 9. В это время крыса 9 вошла в опытную группу и начала получать те же самые инъекции, что и крысы группы SD-A2.

Авторы проанализировали опухолевый рост и ответ на воздействие у девяти крыс SD-A (Фиг.3). В опытной группе SD-A2 (крысы 5-8) разным крысам давали различные комбинации аллогенных и сингенных лизатов, а также клеток. Например, через пять дней у крысы номер 5 была выявлена пальпаторно ощутимая боковая опухоль, после чего ей произвели в противоположную боковую область одну инъекцию, содержащую аллогенный 9L лизат (50000), сингенный С6 лизат (50000) и 9L аллогенные клетки (50000). Через пять дней после инъекции опухоль разрешилась. У крыс 6, 7, 8 (крысы SD-A2) видимые опухоли были выявлены через 18 дней после инъекции. В этот момент все они получили инъекцию с лизатом 50000 аллогенных клеток 9L плюс лизат 50000 сингенных С6 клеток и 50000 9L аллогенных клеток. Эти инъекции были повторены на 23 и 28 день. Крысе 6 производилось дополнительное введение на 33 день, через 15 дней после начала опыта. Крысы не опытной группы (SD-A1, крысы 1-4) были убиты на 27-й день после инъекции из-за размера опухоли. По сравнению с имевшейся у нелеченных крыс (крысы 1-4) опухолевой прогрессией у крыс 5, 6, 7, 8 (SD-A2) имело место полное разрешение опухолей. Крыса номер девять в начале эксперимента находилась не в опытной группе, а затем в опытной, в период после того, как были убиты крысы 1-4. Крыса 9 каждые четыре дня получала инъекции с лизатом аллогенных 9L (50000) плюс лизат сингенных С6 клеток (50000) и 9L аллогенными клетками (50000) и была убита для гистологического исследования на 55-й день, когда размер опухоли составлял 11% от размера в начале периода «спасения».

Двадцать дней спустя «леченым» SD крысам без измеримой опухоли были повторно введены сингенные опухолевые клетки той же самой линии С6, которая была причиной первоначальной опухоли. В противоположную заднюю боковую область было введено 100000 клеток сначала и в пять раз больше (500000 клеток) спустя десять дней. Каждые три дня крысы проверялись на наличие любого визуального или пальпаторного признака опухолевого роста. В течение 160 дней развития опухоли у крыс SD не наблюдалось.

На Фиг.4 показан опухолевый рост и ответ на воздействие у восьми крыс Fisher (Fisher-A), которым вводились 9L клетки. Крысам 1, 2 и 3 (Fisher A-1) на 20 день в противоположную боковую область произвели инъекции с сингенными клетками RG2 (100000 клеток; крыса 1) и 9L (100000 клеток, крыса 2) или только со средой (крыса 3). Никакого уменьшения размера опухоли не наблюдалось, а RG2, по-видимому, даже имели у крысы 1 синергистический эффект. У всех крыс 4-8 (Fisher А-2), которым инъецировали аллогенные С6 клетки/аллогенный С6 лизат, сингенный 9L лизат или ксеногенные клетки U87 и LN229, как оказалось, произошло сокращение размера опухоли.

Все крысы Fisher 344 были убиты на 40 день, когда у них развилась свисающая стопа и они стали неспособны к перемещению. Опухоли от каждой из этих крыс были выделены, и из них приготовлены срезы для окрашивания. Авторы нашли, что в обработанных нами опухолях находится значительно большее число CD4, CD8, В-лимфоцитов (CD20), макрофагов (CD68), и дендритных клеток, чем в контрольных опухолях (Фиг.3-7).

Чтобы определить роль иммунологической памяти, авторы проверяли, будут ли крысы SD и Fisher 344, которым первоначально инъецировали аллогенную клеточную линию, в состоянии принять сингенную клеточную линию. Крысам Fisher 344, которые отторгли С6 (Fisher В) через 40 дней, были повторно введены сингенные 9L клетки. Крысам SD (SD-B), которые вначале отторгли 9L клеточную линию, были введены клетки С6. Все инъекции были сделаны в противоположную от первичной инъекции боковую область и содержали 500000 клеток. У крыс SD не развилась ни визуально, ни пальпаторно ощутимая опухоль. У крыс Fisher в месте инъекции появилось небольшое новообразование (<1 см × <1 см × 1 см). Это новообразование было заметно только при пальпации, прогрессивно уменьшалось и стало полностью не обнаружимо на 10 день. У крыс обеих линий до 150 дня развития опухоли не наблюдалось.

Эти результаты позволяют предположить, что повторное подкожное введение аллогенных (или ксеногенных) клеток, лизатов аллогенных и сингенных клеток приводит к сокращению размера опухоли, увеличивая иммунологическую настороженность.

Все публикации, упомянутые в описании, включены в него путем ссылки ни них.

Ссылки

1. Beutler AS, Banck MS, Wedekind D et al.: Tumour gene therapy made easy allogeneic major histocompatibility complex in the С6 rat glioma model. Hum Gene Ther 10.95-101. 1999.

2. Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B, et al.: Structure of the human class 1 histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature 329 506-512, 1987.

3. Boudreau CR, Yang I, Liau LM: Gliomas: advances in molecular analysis and characterization. Surg Neurol 64 286-294; discussion 294, 2005.

4. Bowles АР. Jr., Perkins F: Long-term remission of malignant brain tumours after intracranial infection a report of four cases. Neurosurgery 44 636-642: discussion 642-633, 1999.

5. Budd RC: Activation-induced cell death. Curr Opin Immunol 13: 356-362, 2001.

6. Bystryn JC, Rigel D, Friedman RJ, et al.: Prognostic Significance of hypopigmentation in malignant melanoma. Arch Dermatol 123: 1053-1055, 1987.

7. DeHaan С, Habibi-Nazhad В, Yan F, et al.: Mutation in mitochondnal complex IND6 subunit is associated with defective response to hypoxia in human glioma cells. Mol Cancer 3:19, 2004.

8. Delves PJ, Roitt IM: The immune system. First of two parts. N Engl J Med 343: 37-49, 2000.

9. Delves PJ, Roitt IM: The immune system. Second of two parts. N Engs J Med 343: 108-117, 2000.

10. Duquesnoy Ri, Trucco M: Genetic basis of cell surface polymorphisms encoded by the major histocompatibility complex in humans. CS Rev Immunol 8: 103-145,1988.

11. Ehtesham M, Kabos P, Gutierrez MA, et al. Intratumoural dendritic cell vaccination elicits potent tumouncidal immunity against malignant glioma in rats. J Immunother 26:107-116, 2003.

12. Garcia-Lora A, Afgarra 1 Garrido F: MHC class I antigens, immune surveillance, and tumour immune escape. J Cell Physiol 195: 346-355, 2003.

13. GuY Wang С, Roifman CM, et al. Role of MHC class I m immune surveillance of mitochondnal DNA integrity. J Immunol 170:3603-3607, 2003.

14. Hansen MH, Ostenstad В, Sioud M. Antigen-specific IgG antibodies in stage IV long-time survival breast cancer patients. Mol Med 7:230-239, 2001.

15. Jager D. Jager F, Knuth A: immune responses to tumour antigens: implications for antigen specific immunotherapy of cancer. J Clin Pathol 54:669-674, 2001.

16. Janeway C, National Center for Biotechnology Information (US): Immunobiology S the immune system in health and disease, ed 5th. New York: Garland Pub. 2001.

17. Ljunggren HG, Karre K: In search of the missing self: MHC molecules and NK cell recognition. Immunol Today 11: 237-244, 1990.

18. Moretta A, Bottino С, Vitale M, et al.: Receptors for HLA class-l molecules in human natural killer cells, Annu Rev Immunol 14 619-648, 1996.

19. Palo J, Duchesne J. Wikstrom J: Malignant diseases among patients with multiple sclerosis. J Neurol 216:217-222, 1977.

20. Papachristou DN, Fortner JG: Effect of postoperative wound infection on the course of stage II melanoma. Cancer 43:1106-1111, 1979.

21. Parkin J, Cohen B: An overview of the immune system. Lancet 357: 1777-1789, 2001.

22. Pizzo PA, Commers J, Cotton D, et al.: Approaching the controversies in antibacterial management of cancer patients. Am J Med 76:436-449, 1984.

23. Shiina T, Inoko H, Kulski JK: An update of the HLA genomic region, focus information and disease associations: 2004. Tissue Antigens 64:631-649, 2004.

24. Sioud M: How does autoimmunity cause tumour regression? A potential mechanism involving cross-reaction through epitope mimicry. Mol Med 8:115-119, 2002.

25. Vigouroux 5, Yvon F, Biagi F, et al.: Antigen-induced regulatory T cells. Blood 104: 26-33, 2004.

26. Von Mensdorff-PouiHy 5, Gourevitch MM, Kenemans P. et al.: Humoral immune response to polymorphic epithelial mucin (MUC-1) in patients with benign and malignant breast tumours. Eur J Cancer 32A: 1325-1331, 1996.

Настоящее изобретение предлагает композицию для лечения опухолей, включающую: (1) аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки; (2) лизат сингенной опухолевой клетки и (3) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, где аллогенные или ксеногенные клетки являются опухолевыми клетками такого же или подобного гистологического класса, как и клетки опухоли пациента. Изобретение дает возможность подбора вида опухолевых клеток/ткани для трансплантации опухолевых/раковых тканей/клеток одного индивидуума другому, позволяет избежать отторжения трансплантированной ткани/опухоли, а также способствует увеличению иммунологической настороженности по отношению к пептидам, являющимся общими для этих опухолей/раковых образований и других опухолей, имеющих схожие пептиды. 3 н. и 5 з.п. ф-лы 1 пр., 9 ил.

1. Композиция для лечения или предотвращения опухоли у пациента, содержащая
(i) аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки;
(ii) лизат сингенной опухолевой клетки, и
(iii) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество,
где аллогенные или ксеногенные клетки являются опухолевыми клетками такого же или подобного гистологического класса, как и клетки опухоли пациента.

2. Композиция по п.1, дополнительно содержащая лизат аллогенной или ксеногенной клетки.

3. Композиция по п.1, где клетки (i) представляют собой клетки, полученные из мозга.

4. Композиция по п.3, где сингенные клетки являются клетками, полученными из мозга.

5. Композиция по любому из пп.1-4, где аллогенные или ксеногенные клетки получены из опухолей двух или более гетерозиготных индивидуумов.

6. Применение (i) аллогенных или ксеногенных опухолевых клеток и (ii) лизата сингенной клетки в изготовлении лекарства для лечения глиобластомы у пациента, где аллогенные или ксеногенные клетки являются опухолевыми клетками такого же или подобного гистологического класса, как и клетки опухоли пациента.

7. Применение по п.6, где аллогенные или ксеногенные опухолевые клетки получены из опухолей двух или более гетерозиготных индивидуумов.

8. Способ лечения или предотвращения глиобластомы, включающий введение пациенту композиции, как определено в любом из пп.1-5.