СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРИМЕНИМОСТИ СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ ЗАБОЛЕВАНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ МОДИФИКАЦИЙ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ Российский патент 2023 года по МПК G01N33/68 A61K39/00 A61P35/00 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам прогнозирования того, включают ли пептиды или полипептиды, содержащие специфичные для заболевания аминокислотные модификации, в частности, опухолеассоциированные неоантигены, эпитопы, в частности, опухолеассоциированные неоэпитопы, которые являются применимыми для иммунотерапии, такой как вакцинация. Способы по изобретению могут применяться, в частности, для обеспечения вакцин, которые являются специфичными к опухоли пациента, и, тем самым в контексте персонализированных противораковых вакцин.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Эволюция иммунной системы привела к появлению у позвоночных высокоэффективной сети на основе двух типов защиты: врожденного и адаптивного иммунитета. В отличие от эволюционно древней системы врожденного иммунитета, которая опирается на инвариантные рецепторы, распознающие общие молекулярные паттерны, ассоциированные с патогенами, адаптивный иммунитет основан на высокоспецифических антигенных рецепторах на В-клетках (В-лимфоциты) и Т-клетках (Т-лимфоциты) и клональной селекции. В то время как В-клетки повышают гуморальные иммунные ответы путем секреции антител, Т-клетки опосредуют клеточные иммунные ответы, приводящие к разрушению узнаваемых клеток.

Т-клетки играют центральную роль в опосредованном клетками иммунитете у людей и животных. Распознавание и связывание конкретного антигена опосредовано Т-клеточными рецепторами, экспрессирующимися на поверхности Т-клеток. Т-клеточный рецептор (англ. Т cell receptor (TCR)) Т-клетки способен взаимодействовать с иммуногенными пептидами (эпитопами), связанными с молекулами главного комплекса гистосовместимости (англ. major histocompatibility complex (MHC)) и презентированными на поверхности клеток-мишеней. Специфичное связывание TCR запускает сигнальный каскад внутри Т-клетки, приводящий к пролиферации и дифференцировке в зрелую эффекторную Т-клетку. Чтобы иметь возможность взаимодействовать с множеством различных антигенов, Т-клеточные рецепторы должны обладать большим разнообразием.

Антигенспецифичная иммунотерапия, имеющая своей целью повышение или индукцию специфических иммунных ответов у пациентов, успешно применяется при лечении инфекционных или злокачественных заболеваний. Идентификация возрастающего числа патоген- и опухолеспецифических антигенов привела к появлению большой коллекции подходящих мишеней для иммунотерапии. Клетки, презентирующие иммуногенные пептиды (эпитопы), полученные из таких антигенов, могут быть подвергнуты специфическому направленному воздействию с помощью активной или пассивной стратегии иммунизации. Активная иммунизация содействует индукции и экспансии антигенспецифичных Т-клеток у пациентов, которые способны специфически распознавать и уничтожать больные клетки. Напротив, пассивная иммунизация основана на адоптивном переносе Т-клеток, которые были размножены и необязательно генетически сконструированы in vitro (адоптивная Т-клеточная терапия; англ. ACT).

Противоопухолевые вакцины направлены на индуцирование специфичных к опухоли эндогенных ответов посредством активной иммунизации. Для противоопухолевой вакцинации могут использоваться различные антигенные форматы, включающие цельные злокачественные клетки, белки, пептиды или иммунизирующие векторы, такие как РНК-, ДНК- или вирусные векторы, которые могут применяться непосредственно in vivo или in vitro путем стимуляции дендритных клеток (англ. dendritic cells (DC)) с последующим переносом пациенту.

Соматические мутации при онкологическом заболевании являются идеальными мишенями для подходов с использованием терапевтических вакцин (Castle, J.С. et al. Cancer Res. 72, 1081-1091 (2012); Schumacher, Т.N. & Schreiber, R.D. Science 348, 69-74 (2015); О. et al. Clin. Cancer Res. 22, 1885-1896 (2016)). Они могут быть процессированы в пептиды, презентированные на поверхности опухолевых клеток и распознаваемые Т-клетками как неоэпитопы. Неоэпитопы освобождены от центральной иммунной толерантности и отсутствуют в здоровых тканях, таким образом, сочетая потенциально сильную иммуногенность с более низкой вероятностью аутоиммунитета. Новые данные указывают на то, что благоприятные клинические результаты клинических иммунотерапии, таких как блокада контрольных точек (Rizvi, N.A. et al. Science 348, 124-128 (2015); Snyder, A. et al. N. Engl. J. Med. 371, 2189-2199 (2014); Van Allen, E.M. et al. Science 350, 207-211 (2015); Le, D.Т. et al. N. Engl. J. Med. 372, 2509-2520 (2015); Mcgranahan, N. et al. Science 351, 1463-1469 (2016)) и адоптивная Т-клеточная терапия (Tran, E. et al. Science 344, 641-645 (2014); Robbins, P.F. et al. Nat. Med. 19, 747-752 (2013); Tran, E. et al. N. Engl. J. Med. 375, 2255-2262 (2016)), ассоциированы с распознаванием иммунной системой неоэпитопов. На моделях опухолей у мышей было продемонстрировано, что существенная часть мутанома (то есть совокупности соматических мутаций, идентифицированных секвенированием следующего поколения) является иммуногенной и что данные неоэпитопы предпочтительно распознаются CD4⁺ Т-клетками. Вакцины, состоящие из неоэпитопов, спрогнозированных in silico из данных мутанома, показали сильную противоопухолевую активность и индуцировали полное отторжение установившихся, агрессивно растущих опухолей у мышей (Kreiter S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)). Аналогичным образом, полагают, что неоэпитопы МНС класса I, идентифицированные в моделях опухолей у мышей с помощью экзомного и транскриптомного анализа, отдельно или в сочетании с масс-спектрометрией, представляют собой подходящие вакцинные мишени и антигены отторжения опухоли (Yadav, M. et al. Nature 515, 572-576 (2014); Gubin, M.M. et al. Nature 515, 577-581 (2014)). В целом, данные исследования вызвали энтузиазм в отношении неоэпитопных вакцин (Carreno, В.M. et al. Science 348, 803 808 (2015); Bobisse, S., Foukas, P.G., Coukos, G. & Harari, A. Ann. Transl. Med. 4, 262 (2016); Katsnelson, A. Nat. Med. 22, 122-124 (2016); Delamarre, L., Mellman, I. & Yadav, M. Science 348,760-1 (2015)).

При онкологическом заболевании человека подавляющее большинство опухолевых мутаций являются уникальными для отдельного пациента, и поэтому необходимы персонализированные стратегии лечения. Для каждого пациента его личный профиль опухолевых мутаций должен определяться посредством глубокого секвенирования с тем, чтобы получить информацию для производства индивидуально подобранной вакцины по требованию.

В настоящем описании авторы сообщают о применении такой персонализированной иммунотерапии у пациентов с меланомой III и IV стадии. Авторы создали способ, соответствующий руководствам по клинической разработке, который включает секвенирование следующего поколения для комплексной идентификации индивидуальных мутаций из обычных биопсий опухолей, компьютерное предсказывание потенциально релевантных неоэпитопов HLA I и II классов, а также разработку и изготовление полинеоэпитопной РНК-вакцины, уникальной для каждого пациента. Подходящие пациенты начинали с общей противоопухолевой вакцины, состоящей из NY-ESO-1 и тирозиназной РНК, до выпуска своей персонализированной РНК-вакцины. В общей сложности, 13 пациентов завершили лечение, которое, как было показано, было выполнимым, безопасным и хорошо переносимым. Уровень иммуногенности был удивительно высоким. 60% неоэпитопов были специфически распознаны индуцированными вакциной Т-клетками. Каждый пациент прореагировал по меньшей мере на три из десяти отдельных неоантигенов, и был мобилизован широкий и разнообразный репертуар TCR. В период времени от двух до четырех недель после начала вакцинации частоты неоэпитоп-специфических Т-клеток в крови варьировали от низких величин, требующих обнаружения in vitro экспансии, до высокого однозначного значения процентного показателя. Выраженные инфильтраты с индуцированными вакциной неоэпитоп-реактивными Т-клетками и неоэпитоп-специфической гибелью аутологичных опухолевых клеток были показаны у двух пациентов с метастазами меланомы, резецированными после вакцинации.

Клиническая оценка кумулятивных рецидивирующих метастатических событий у всех пациентов показала очень значительное снижение при вакцинации неоэпитопной РНК по сравнению с предыдущей историей болезни пациентов, что привело к очень благоприятному клиническому исходу с устойчивой выживаемостью без прогрессирования заболевания. Один пациент с множественными метастазами, которого лечили неоэпитопной вакциной в кратчайшие сроки из-за быстрого прогрессирования опухоли, почти мгновенно отреагировал на последующую блокаду PD-1 и показал полный ответ. Прямая регрессия опухоли, связанная с неоэпитопной вакциной, была подтверждена у двух пациентов. Один из данных пациентов имел полный ответ на прогрессирующий метастаз и продолжающийся устойчивый контроль заболевания в течение 26 месяцев. Второй пациент показал объективный опухолевый ответ, но, несмотря на присутствие полиспецифических, полностью функциональных неоантиген-реактивных Т-клеток, имел поздний рецидив.

Определение подходящих эпитопов для иммунотерапии остается проблемой. Таким образом, существует необходимость в модели для прогнозирования того, будет ли эпитоп, конкретно, неоэпитоп, применим в иммунотерапии.

Субтипирование неоэпитоп-специфических ответов не только подтвердило предыдущие данные авторов о высокой частоте опосредованного CD4⁺ Т-клетками распознавания иммуногенных неоэпитопов (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015)), но также показало ответы CD8⁺ Т-клеток против четверти неоэпитопов, используемых для вакцин. Доминирование CD4⁺ ответов против мутаций может быть объяснено низкой специфичностью молекулы HLA класса II относительно состава и длины пептидного лиганда, тогда как высокоспецифичная молекула HLA класса I связывает ограниченный набор пептидов, характеризующихся узким распределением по длине (Arnold, PY et al. J. Immunol. 169, 739-49 (2002)). Около двух третей наблюдаемых CTL-ответов было направлено против мутаций, которые одновременно распознавались CD4⁺ Т-клетками, реагирующими против другого положения соответствующего неоэпитопа. Поскольку 50% всех неоэпитопов, включенных в вакцину, показали CD4⁺ Т-клеточный ответ, наблюдаемая связь, скорее всего, не является чистым совпадением CD4⁺ и CD8 иммунных ответов против неоэпитопов. Известно, что CTL-эпитопы, которые ковалентно связаны с вспомогательными эпитопами, являются более иммуногенными (Shirai, M. et al. J. Immunol. 152, 549 556 (1994)). Мутации, несущие неоэпитопы HLA класса I и класса II, обеспечивают механически благоприятные условия для инициирования CTL, поскольку CD4⁺ Т-клетки распознают свой лиганд на DC, которая перекрестно презентирует CD8⁺ Т-клеточный неоэпитоп, и обеспечивают помощь родственных Т-клеток CD40L-опосредованной активацией DC (Schoenberger, SP, Toes, RE, van der Voort, El, Offringa, R. & Melief, CJ Nature 393, 480-3 (1998)). В связи с этим, авторы также обнаружили, что одна и та же мутация может приводить к появлению неоэпитопов, презентируемых на различных рестрикционных элементах HLA класса I и распознаваемых независимыми CD8⁺ Т-клетками (Фиг. 3b). Аналогично, авторы обнаружили, что один и тот же комплекс эпитоп/рестрикционный элемент распознается неоэпитоп-специфическими Т-клетками с различными TCR клонотипами. Данные факты свидетельствуют о том, что с помощью неоэпитопной вакцинации может быть рекрутирован неожиданно широкий репертуар специфичных к мутациям Т-клеток, и что каждая отдельная мутация использует разнообразие специфичностей Т-клеток.

Таким образом, результаты, представленные в данном документе, показывают, что определение подходящих персонализированных неоэпитопных вакцин, в частности, персонализированных неоэпитопных РНК вакцин может приводить к расширению репертуара неоантиген-специфичных Т-клеток у онкопациентов, обеспечивая эффективное нацеливание на их мутаном.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Аспект изобретения относится к способу оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или являются ли они, при презентации в контексте молекул МНС, предпочтительно молекул МНС различных классов, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС.

В одном варианте осуществления молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II, и/или Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ включает определение того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы.

В одном варианте осуществления различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы. В одном варианте осуществления реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или являются ли они, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

В одном варианте осуществления различные молекулы МНС одного класса представляют собой различные молекулы МНС класса I и/или различные Т-клетки, рестриктированные по одному классу МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС, в отношении различных Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ включает определение одного или более из следующего:

(i) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или являются ли они, при презентации в контексте молекул МНС, предпочтительно молекул МНС различных классов, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС,

(ii) определение того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, и/или

(iii) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или являются ли они, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

В одном варианте осуществления молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II и/или Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии. В одном варианте осуществления различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы. В одном варианте осуществления реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии. В одном варианте осуществления различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I и/или различные Т-клетки, ограниченные одним классом МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, причем способ включает стадии:

(i) идентификации пептидов и/или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый пептид и/или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или являются ли они, при презентации в контексте молекул МНС, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной модификации аминокислоты, идентифицированной на стадии (i).

В одном варианте осуществления молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II и/или Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект настоящего изобретения относится к способу выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, причем способ включает стадии:

(i) идентификации пептидов и/или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый пептид и/или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

В одном варианте осуществления различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы. В одном варианте осуществления реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, причем способ включает стадии:

(i) идентификации пептидов и/или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый пептид и/или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или являются ли они, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

В одном варианте осуществления различные молекулы МНС одного класса представляют собой различные молекулы МНС класса I и/или различные Т-клетки, ограниченные одним классом МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

Другой аспект изобретения относится к способу выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, причем способ включает стадии:

(i) идентификации пептидов и/или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый пептид и/или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения одного или более из следующего:

(1) определение того, одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, презентируются в контексте молекул МНС различных классов и/или являются ли они, при презентации в контексте молекул МНС, предпочтительно молекул МНС различных классов, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС,

(2) определение того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, и/или

(3) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или являются ли они, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

В одном варианте осуществления молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II и/или Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии. В одном варианте осуществления различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы. В одном варианте осуществления реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии. В одном варианте осуществления различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I и/или различные Т-клетки, ограниченные одним классом МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки. В одном варианте осуществления презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и/или реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС, в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

В одном варианте осуществления различные аминокислотные модификации, протестированные на стадии (ii), присутствуют в одинаковых и/или в различных пептидах или полипептидах. В одном варианте осуществления способ по изобретению включает сравнение оценок, полученных для различных аминокислотных модификаций, протестированных на стадии (ii).

В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения специфичная для заболевания аминокислотная модификация(и) происходит (происходят) вследствие специфичной для заболевания соматической мутации(й). В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения заболевание представляет собой рак и иммунотерапия представляет собой противораковую иммунотерапию. В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения иммунотерапия включает введение одного или более из следующего:

(i) пептида или полипептида, экспрессированного в больных клетках, причем пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию,

(ii) пептида или полипептида, содержащего фрагмент пептида или полипептида по (i), причем фрагмент содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(iii) нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид или полипептид по (i) или (ii). В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения способ по изобретению применим при создании вакцины.

Другой аспект изобретения относится к способу получения вакцины, включающему стадии:

(i) идентификации одной или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии с помощью любого из способов по изобретению,

(ii) обеспечения вакцины, включающей одно или несколько из следующего:

(1) пептид или полипептид, экспрессированный в больных клетках; причем пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии,

(2) пептид или полипептид, содержащий фрагмент пептида или полипептида по (i), причем фрагмент содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии, и

(3) нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или полипептид по (i) или (ii).

В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения фрагмент представляет собой МНС-связывающий пептид или потенциальный МНС-связывающий пептид или может быть процессирован, чтобы обеспечить МНС-связывающий пептид или потенциальный МНС-связывающий пептид (например, прогноз связывания МНС указывает на то, что фрагмент будет связываться с МНС).

Другой аспект изобретения относится к вакцине, полученной в соответствии со способом по изобретению. Вакцина, обеспеченная согласно изобретению, может содержать фармацевтически приемлемый носитель и необязательно может содержать один или более адъювантов, стабилизаторов и т.д. Вакцина может быть в виде терапевтической или профилактической вакцины.

В одном варианте осуществления всех аспектов настоящего изобретения указание применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации для иммунотерапии указывает на то, что пептид или полипептид, экспрессированный в больной клетке, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, или пептид или полипептид, содержащий его фрагмент, такой как эпитоп или вакцинная последовательность, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при введении (необязательно в формате кодирующей нуклеиновой кислоты), будет индуцировать иммунный ответ.

В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения аминокислотные модификации в пептидах или полипептидах идентифицируются путем идентификации несинонимичных мутаций в одной или более кодирующих областях. В одном варианте осуществления аминокислотные модификации идентифицируются путем частичного или полного секвенирования генома или транскриптома одной или более клеток, таких как одна или более раковых клеток и, необязательно, одной или более незлокачественных клеток, и выявления мутаций в одной или более кодирующих областях. В одном варианте осуществления указанные мутации являются соматическими мутациями. В одном варианте осуществления указанные мутации являются онкомутациями.

В одном варианте осуществления всех аспектов изобретения, в частности, чтобы обеспечить персонализированную вакцину для пациента, такого как онкопациента, модификация(и) присутствует у указанного пациента, и способы по изобретению выполняются для указанного пациента.

Другой аспект изобретения относится к способу индукции иммунного ответа у пациента, включающему введение пациенту вакцины, обеспеченной согласно изобретению.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения пациента, включающему следующие стадии:

(a) обеспечение вакцины с помощью способов по изобретению; и

(b) введение вакцины пациенту.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения пациента, включающему введение вакцины, как описано в данном документе, пациенту.

В одном варианте осуществления пациент является онкопациентом и вакцина представляет собой противоопухолевую вакцину, такую как вакцина, введение которой обеспечивает опухолеспецифические неоэпитопы.

В дополнительных аспектах изобретение обеспечивает вакцину, как описано в данном документе, для применения в способах лечения, описанных в данном документе, в частности, для применения в лечении или профилактике онкологического заболевания.

Описанные в данном документе способы лечения онкологического заболевания могут сочетаться с хирургической резекцией и/или облучением и/или традиционной химиотерапией.

Изобретение также относится к следующему:

1. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов.

2. Способ по пункту 1, в котором молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II.

3. Способ по пункту 1 или 2, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

4. Способ по любому из пунктов 1-3, дополнительно включающий определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС.

5. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие модифицированную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекулы МНС, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам мне.

6. Способ по пункту 4 или 5, в котором Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки.

7. Способ по любому из пунктов 4-6, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

8. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, обладает ли фрагмент полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивностью в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы.

9. Способ по пункту 8, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

10. Способ по пункту 8 или 9, в котором реактивность Т-клеток в отношении фрагмента полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

11. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса.

12. Способ по пункту 11, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

13. Способ по пункту 11 или 12, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

14. Способ по любому из пунктов 11-13, дополнительно включающий определение того, обладают ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивностью в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

15. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ содержит определение того, обладают ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивностью в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

16. Способ по пункту 14 или 15, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

17. Способ по любому из пунктов 14-16, в котором различные Т-клетки, рестриктированные по одному классу МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки.

18. Способ по любому из пунктов 14-17, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса с различными Т клетками, рестриктированными по одному классу МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

19. Способ прогнозирования того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для иммунотерапии, причем способ включает определение одного или более из следующего:

(i) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов,

(ii) определение того, обладают ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, реактивностью в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС,

(iii) определение того, обладает ли фрагмент полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивностью в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы,

(iv) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса, и

(v) определение того, обладают ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивностью в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

20. Способ по пункту 19, включающий определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов, и, при презентации в контексте молекул МНС, являются ли реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС.

21. Способ по пункту 19 или 20, включающий определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса, и, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, являются ли реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

22. Способ по любому из пунктов 19-21, в котором молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II.

23. Способ по любому из пунктов 19-22, в котором Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки.

24. Способ по любому из пунктов 19-23, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

25. Способ по любому из пунктов 19-24, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

26. Способ по любому из пунктов 19-25, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

27. Способ по любому из пунктов 19-26, в котором реактивность Т-клеток в отношении фрагмента полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

28. Способ по любому из пунктов 19-27, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

29. Способ по любому из пунктов 19-28, в котором различные Т-клетки, рестриктированные по одному классу МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки.

30. Способ по любому из пунктов 19-29, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

31. Способ по любому из пунктов 19-30, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса с различными Т клетками, рестриктированными по одному классу МНС, указывают на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

32. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

33. Способ по пункту 32, в котором молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II.

34. Способ по пункту 32 или 33, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

35. Способ по любому из пунктов 32-34, в котором стадия (ii) дополнительно включает определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, реактивными в отношении различных Т-клеток, рестриктированных различными классами МНС.

36. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, реактивными в отношении различных Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

37. Способ по пункту 35 или 36, в котором Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки.

38. Способ по любому из пунктов 35-37, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

39. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, обладает ли фрагмент полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивностью в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

40. Способ по пункту 39, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

41. Способ по пункту 39 или 40, в котором реактивность Т-клеток в отношении фрагмента полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

42. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

43. Способ по пункту 42, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

44. Способ по пункту 42 или 43, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

45. Способ по любому из пунктов 42-44, в котором стадия (ii) дополнительно включает определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении различных Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

46. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении различных Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

47. Способ по пункту 46, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

48. Способ по любому из пунктов 45-47, в котором различные Т-клетки, ограниченные одним классом МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки.

49. Способ по любому из пунктов 45-48, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса с различными Т клетками, рестриктированными по одному классу МНС, указывают на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

50. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по применимости в иммунотерапии, включающий стадии:

(i) идентификации полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения одного или более из следующего:

(1) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов,

(2) определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС,

(3) определение того, обладает ли фрагмент полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивностью в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы,

(4) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса, и

(5) определение того, являются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС, и (iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

51. Способ по пункту 50, в котором стадия (ii) включает определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов, и, при презентации в контексте молекул МНС, являются ли реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС.

52. Способ по пункту 50 или 51, в котором стадия (ii) включает определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС одного класса и, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, являются ли реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по одному классу МНС.

53. Способ по любому из пунктов 50-52, в котором молекулы МНС различных классов представляют собой молекулы МНС класса I и молекулы МНС класса II.

54. Способ по любому из пунктов 50-53, в котором Т-клетки, рестриктированные по различным классам МНС, представляют собой CD4+ и CD8+ Т-клетки.

55. Способ по любому из пунктов 50-54, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС различных классов указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

56. Способ по любому из пунктов 50-55, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

57. Способ по любому из пунктов 50-56, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

58. Способ по любому из пунктов 50-57, в котором реактивность Т-клеток в отношении фрагмента полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

59. Способ по любому из пунктов 50-58, в котором различные молекулы МНС одного и того же класса представляют собой различные молекулы МНС класса I.

60. Способ по любому из пунктов 50-59, в котором различные Т-клетки, ограниченные одним классом МНС, представляют собой различные CD8+ Т-клетки.

61. Способ по любому из пунктов 50-60, в котором презентация одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию в контексте различных молекул МНС одного класса, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

62. Способ по любому из пунктов 50-61, в котором реактивность Т-клеток в отношении одинаковых или различных фрагментов полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса с различными Т клетками, рестриктированными по одному классу МНС, указывают на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии.

63. Способ по любому из пунктов 32-62, в котором аминокислотные модификации, протестированные на стадии (ii), присутствуют в одном и том же полипептиде.

64. Способ по любому из пунктов 32-63, в котором аминокислотные модификации, протестированные на стадии (ii), присутствуют в различных полипептидах.

65. Способ по любому из пунктов 32-64, который включает сравнение баллов, полученных для различных аминокислотных модификаций, протестированных на стадии (ii).

66. Способ по любому из пунктов 1-65, в котором специфичная для заболевания аминокислотная(ые) модификация(и) происходит (происходят) вследствие специфичной для заболевания соматической мутации(й).

67. Способ по любому из пунктов 1-66, в котором заболевание представляет собой рак и иммунотерапия представляет собой противораковую иммунотерапию.

68. Способ по любому из пунктов 1-67, в котором иммунотерапия включает введение одного или более из следующего:

(i) полипептида, экспрессированного в больных клетках, причем полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию,

(ii) полипептида, содержащего фрагмент полипептида по (i), причем фрагмент содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(iii) нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид по (i) или (ii).

69. Способ по любому из пунктов 1-68, который применим при обеспечении вакцины.

70. Способ получения вакцины, включающий стадии:

(i) идентификации одной или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии, способом по любому из пунктов 1-69,

(ii) обеспечения вакцины, включающей одно или несколько из следующего:

(1) полипептид, экспрессированный в больных клетках, причем полипептид содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии,

(2) полипептид, содержащий фрагмент полипептида по (i), причем фрагмент содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для иммунотерапии, и

(3) нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид по (i) или (ii).

71. Способ по любому из пунктов 1-70, в котором фрагмент представляет собой МНС-связывающий пептид или потенциальный МНС-связывающий пептид или может быть процессирован для получения МНС-связывающего пептида или потенциального МНС-связывающего пептида.

72. Вакцина, изготовленная согласно способу по любому из пунктов 69-71.

73. Способ лечения рака, причем указанный способ включает введение иммуногенной композиции, содержащей полипептид, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, идентифицированную согласно способу по любому из пунктов 1-68, или нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.

74. Способ по пункту 73, в котором указанная иммуногенная композиция представляет собой вакцину.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания и формулы изобретения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя настоящее изобретение будет описано подробно ниже, следует принять к сведению, что данное изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методологией, протоколами и реактивами, поскольку они могут меняться. Также следует принять к сведению, что использованная здесь терминология необходима только для целей описания конкретных вариантов осуществления, и не предназначена для ограничения объема настоящего изобретения, который будет ограничен только прилагаемой формулой изобретения. Если иное не указано, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычными специалистами в данной области техники.

Далее будут описаны элементы настоящего изобретения. Данные элементы перечислены с конкретными вариантами осуществления, однако следует понимать, что они могут объединяться любым способом и в любом количестве с созданием дополнительных вариантов осуществления. По-разному описанные примеры и предпочтительные варианты осуществления не следует рассматривать как ограничения настоящего изобретения, они предназначены исключительно для ясного описания вариантов осуществления. Следует понимать, что данное описание поддерживает и охватывает варианты осуществления, которые объединяют ясно описанные варианты осуществления с любым количеством раскрытых и/или предпочтительных элементов. Кроме того, любые перестановки и комбинации всех описанных элементов в данной заявке следует рассматривать как раскрытые описанием настоящей заявки до тех пор, пока из контекста не следует иное.

Предпочтительно, термины, используемые в данном документе, определяются согласно описанию в «A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)», H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Switzerland.

При осуществлении настоящего изобретения будут использоваться, если не указано иное, обычные методы биохимии, клеточной биологии, иммунологии и технологии рекомбинантных ДНК, которые объяснены в публикациях, принадлежащих к данной области техники (см., например. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).

Во всем этом описании и в формуле изобретения ниже, если контекст не требует иного, слово «включает» и вариации, такие как «содержит» или «содержащий» будут подразумевать включение заявленных установленного компонента, числа или стадии, или группы компонентов, чисел или стадий, но не исключение любого другого компонента, числа или стадии, или группы компонентов, чисел или стадий, хотя в некоторых вариантах осуществления такой другой компонент, число или стадия, или группа компонентов, чисел или стадий могут быть исключены, т.е. объект изобретения состоит из включения установленного компонента, числа или стадии, или группы компонентов, чисел или стадий. Подразумевается, что термины в единственном числе в контексте описания изобретения (особенно в контексте формулы изобретения) охватывают как форму единственного числа, так и множественного числа до тех пор, пока в данном документе не указано иное или до тех пор пока нет очевидного противоречия контексту. Перечисление интервалов в данном документе предназначено всего лишь для того, чтобы служить в качестве способа сокращения индивидуального обозначения для каждого отдельного значения, попадающего в интервал. До тех пор, пока в данном документе не указано иное, каждое индивидуальное значение включено в описание, как если бы оно было индивидуально перечислено в данном документе.

Все способы, описанные в данном документе, могут осуществляться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или если иное очевидно не следует из контекста. Использование любого из примеров и всех примеров, или типичного выражения (например, «такой как»), представленное в данном документе, предназначено всего лишь для лучшей иллюстрации изобретения и не ограничивает объем изобретения, заявленного иным способом. Никакая формулировка в описании не должна толковаться в качестве обозначения любого не заявленного элемента, существенного для практического применения изобретения.

Несколько документов цитируются по всему тексту данного описания. Каждый из документов, процитированных в данном документе (включая все патенты, патентные заявки, научные публикации, описания производителя, инструкции, и т.д.), процитированные либо выше, либо ниже по тексту, включены таким образом ссылкой в полном объеме. Ничто в данном документе не должно быть истолковано как признание того, что изобретение не имеет право на изменение даты на более раннюю дату по отношению к противопоставленному документу вследствие более раннего создания настоящего изобретения.

Настоящее изобретение предусматривает иммунотерапию заболеваний, в частности, онкологических заболеваний, с использованием белка или фрагмента белка, присутствующего в больных клетках, в качестве метки для больных клеток и нацеливания на них. В частности, на больные клетки можно воздействовать путем нацеливания на фрагмент белка, презентированный на поверхности больных клеток в контексте МНС. В частности, настоящее изобретение направлено на определение специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептидах или полипептидах, экспрессированных в больных клетках, причем данные модификации находятся во фрагментах пептидов или полипептидов, подходящих для иммунотерапии. Такие фрагменты, содержащие одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, представляют собой или содержат неоэпитопы, подходящие для иммунотерапии, в частности, для вызывания эффективного клеточного иммунного ответа против больных клеток, экспрессирующих пептиды или полипептиды, содержащие специфичные для заболевания аминокислотные модификации и фрагменты пептидов или полипептидов. Как только подходящий фрагмент, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, был идентифицирован, данный фрагмент (необязательно как часть более крупного полипептида) или нуклеиновую кислоту, кодирующую фрагмент (необязательно как часть более крупного полипептида), можно использовать в качестве вакцины для того, чтобы усиливать или индуцировать иммунный ответ против клеток, экспрессирующих модифицированный пептид или полипептид, из которых получен фрагмент, в частности, путем индукции и/или активации соответствующих эффекторных клеток, таких как Т-клетки, которые распознают клетки, экспрессирующие модифицированный пептид или полипептид, при презентации в контексте МНС.

Согласно изобретению, пептид или полипептид, который содержит одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций и который экспрессируется в больных клетках, также называется «неоантиген» в данном описании. Кроме того, согласно изобретению, фрагмент неоантигена, который содержит одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, распознается иммунной системой, например, которая распознается Т-клеткой, в частности, при презентации в контексте молекул МНС, и которая предпочтительно была определена способами по изобретению как применимая для иммунотерапии (необязательно, как часть более крупного полипептида, например, как часть неоантигена или искусственного пептида или полипептида, например, как часть мультиэпитопного полипептида, включающего, например, два или более неоэпитопов, которые были определены способами по изобретению как применимые для иммунотерапии), также называется в данном документе «неоэпитопом».

Согласно изобретению, специфичная для заболевания аминокислотная модификация предпочтительно обусловлена одной или более специфичными для заболевания соматическими мутациями. В одном особенно предпочтительном варианте осуществления специфичная для заболевания аминокислотная модификация представляет собой онкоспецифичную аминокислотную модификацию, и специфичная для заболевания соматическая мутация представляет собой онкоспецифичную соматическую мутацию. Таким образом, согласно настоящему изобретению, вакцина предпочтительно имеет специфичные для заболевания аминокислотные модификации/специфичные для заболевания соматические мутации пациента, и предпочтительно при введении обеспечивает один или более основанных на мутациях неоэпитопов. Таким образом, вакцина может содержать пептид или полипептид, содержащий один или более основанных на мутациях неоэпитопов, или нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный пептид или полипептид. В одном варианте осуществления специфичные для заболевания аминокислотные модификации идентифицируют путем идентификации специфичных для заболевания соматических мутаций, например, путем секвенирования геномной ДНК и/или РНК больной ткани или одной или более больных клеток.

Согласно настоящему изобретению, термин «пептид» относится к веществам, включающим две или более, предпочтительно 3 или более, предпочтительно 4 или более, предпочтительно 6 или более, предпочтительно 8 или более, предпочтительно 10 или более, предпочтительно 13 или более, предпочтительно 16 или более, предпочтительно 21 или более и до предпочтительно 8, 10, 20, 30, 40 или 50, в частности, 100 аминокислот, ковалентно связанных пептидными связями. Термин «полипептид» или «белок» относится к крупным пептидам, предпочтительно к пептидам более чем со 100 аминокислотными остатками, но, в целом, термины «пептид», «полипептид» и «белок» являются синонимами и используются в данном документе взаимозаменяемо.

Согласно изобретению, термин «специфичная для заболевания аминокислотная модификация» относится к аминокислотной модификации, которая присутствует в аминокислотной последовательности пептида или полипептида больной клетки, но отсутствует в аминокислотной последовательности пептида или полипептида соответствующей нормальной, то есть небольной клетки.

Согласно изобретению, термин «опухолеспецифичная аминокислотная модификация» или «онкоспецифичная аминокислотная модификация» относится к аминокислотной модификации, которая присутствует в аминокислотной последовательности пептида или полипептида из опухолевой или раковой клетки, но отсутствует в аминокислотной последовательности пептида или полипептида соответствующей нормальной, то есть неопухолевой или незлокачественной клетки.

Согласно изобретению, термин «модификация» по отношению к пептидам, полипептидам или белкам относится к изменению последовательности в пептиде, полипептиде или белке по сравнению с родительской последовательностью, такой как последовательность пептида, полипептида или белка дикого типа. Термин включает варианты вставки аминокислот, варианты добавления аминокислот, варианты удаления аминокислот и варианты замены аминокислот, предпочтительно варианты замены аминокислот. Все данные изменения последовательности согласно изобретению могут потенциально создавать новые эпитопы.

Варианты вставок аминокислот включают вставки одной или двух или более аминокислот в конкретной аминокислотной последовательности.

Варианты добавлений аминокислот включают амино- и/или карбокси-концевые слияния одной или более аминокислот, например, 1, 2, 3, 4 или 5 или более аминокислот.

Варианты делеций аминокислот характеризуются удалением одной или более аминокислот из последовательности, например, удалением 1, 2, 3, 4 или 5 или более аминокислот.

Варианты замещений аминокислот характеризуются по меньшей мере одним остатком в последовательности, подлежащим удалению, и другим остатком, вставленным на его место.

Согласно изобретению, специфичная для заболевания аминокислотная модификация или пептидный или полипептидный фрагмент, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, такую как эпитопная или вакцинная последовательность, могут быть получены из пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию.

Термин «происходит» означает согласно изобретению, что конкретный объект, такой как конкретная аминокислотная последовательность, присутствует в объекте, из которого он получен. В случае аминокислотных последовательностей, особенно конкретных областей последовательностей, «происходит», в частности, означает, что соответствующая аминокислотная последовательность получена из аминокислотной последовательности, в которой она присутствует.

Согласно изобретению, пептиды или полипептиды, описанные в данном документе, предпочтительно содержат одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций. В одном варианте осуществления такие одна или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций локализованы в эпитопах или потенциальных эпитопах пептида или полипептида. Таким образом, предпочтительные пептиды или полипептиды, описанные в данном документе, представляют собой неоантигены, предпочтительно содержащие один или более неоэпитопов. Подобным образом, предпочтительный пептидный или полипептидный фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой фрагмент пептида или полипептида, содержащий одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, причем одна или более специфических для болезни аминокислотных модификаций расположены внутри фрагмента. Таким образом, предпочтительный пептид или полипептидный фрагмент, описанный в данном документе, представляет собой неоэпитоп.

Согласно изобретению, термин «специфичная для заболевания мутация» относится к соматической мутации, которая присутствует в нуклеиновой кислоте в больной клетке, но отсутствует в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, т.е. небольной, клетки.

Согласно изобретению, термин «опухолеспецифичная мутация» или «онкоспецифичная мутация» относится к соматической мутации, которая присутствует в нуклеиновой кислоте опухолевой или раковой клетки, но отсутствует в нуклеиновой кислоте соответствующей нормальной, т.е. неопухолевой или незлокачественной клетки. Термины «опухолеспецифичная мутация» и «опухолевая мутация» и термины «онкоспецифичная мутация» и «онкомутация» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термин «иммунный ответ» относится к реакции иммунной системы. Термин «иммунный ответ» включает врожденный иммунный ответ и адаптивный иммунный ответ. Предпочтительно, иммунный ответ связан с активацией иммунных клеток и, более предпочтительно, связан с клеточным иммунным ответом.

Предпочтительно, чтобы иммунный ответ, индуцированный композициями, описанными в данном документе, включал стадии активации антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки и/или макрофаги, презентации антигена или его фрагмента указанными антигенпрезентирующими клетками и активации цитотоксических Т-клеток благодаря данной презентации.

«Индукция иммунного ответа» может означать, что до индукции не было никакого иммунного ответа, но это также может означать, что перед индукцией имелся определенный уровень иммунного ответа, и после индукции указанный иммунный ответ усиливался. Таким образом, «индукция иммунного ответа» также включает «усиление иммунного ответа». Предпочтительно, после индукции иммунного ответа у субъекта указанный субъект защищен от развития заболевания, такого как злокачественное заболевание, или путем индукции иммунного ответа улучшается состояние заболевания улучшается. Например, иммунный ответ против антигена, экспрессируемого опухолью, может быть индуцирован у пациента, имеющего онкологическое заболевание, или у субъекта с риском развития онкологического заболевания. Индукция иммунного ответа в данном случае может означать, что патологическое состояние субъекта улучшается, что у субъекта не разовьются метастазы или что у субъекта с риском развития онкологического заболевания не развивается онкологическое заболевание.

Термины «клеточный иммунный ответ» и «клеточный ответ» или аналогичные термины относятся к иммунному ответу, направленному на клетки, характеризующиеся презентацией антигена с помощью молекул МНС класса I или класса II, включающей Т-клетки или Т-лимфоциты, которые действуют либо как «хелперы», либо как «киллеры». Хелперные Т-клетки (также обозначаемые CD4⁺ Т-клетками) играют центральную роль путем регуляции иммунного ответа, и киллерные клетки (также называемые цитотоксическими Т-клетками, цитолитическими Т-клетками, CD8⁺ Т-клетками или CTL) убивают больные клетки, такие как опухолевые клетки, предотвращая продуцирование большего количества больных клеток. В предпочтительных вариантах осуществления настоящее изобретение включает стимуляцию противоопухолевого CTL-ответа против больных клеток, экспрессирующих один или несколько антигенов, ассоциированных с заболеванием, и предпочтительно презентирующих такие антигены, ассоциированные с заболеванием, с помощью молекул МНС класса I, в частности, противоопухолевого CTL-ответа против опухолевых клеток, экспрессирующих один или несколько антигенов, экспрессированных опухолью, и предпочтительно презентирующих такие антигены, экспрессированные опухолью, с помощью МНС класса I.

Согласно настоящему изобретению, термин «антиген» или «иммуноген» охватывает любую субстанцию, предпочтительно, пептид или полипептид, которая является мишенью иммунного ответа и/или которая будет вызывать иммунный ответ. Конкретно, «антиген» относится к любой субстанции, которая специфически реагирует с антителами или Т-лимфоцитами (Т-клетками). В одном варианте осуществления термин «антиген» включает молекулу, которая содержит по меньшей мере один эпитоп, такой как Т-клеточный эпитоп. Предпочтительно, антиген в контексте настоящего изобретения представляет собой молекулу, которая, необязательно после процессирования, индуцирует иммунную реакцию, которая предпочтительно специфична по отношению к антигену или клеткам, экспрессирующим антиген. В контексте вариантов осуществления настоящего изобретения антиген предпочтительно презентируется клеткой, предпочтительно антигенпрезентирующей клеткой, в контексте молекул МНС, что приводит в результате к иммунной реакции против антигена или клеток, экспрессирующих антиген.

Термин «ассоциированный с заболеванием антиген» используется в самом широком смысле для обозначения любого антигена, ассоциированного с заболеванием. В одном варианте осуществления ассоциированный с заболеванием антиген представляет собой молекулу, которая содержит один или более эпитопов, которые будут стимулировать иммунную систему хозяина для осуществления клеточного иммунного ответа против больных клеток. Поэтому ассоциированный с заболеванием антиген может быть использован в терапевтических целях. Ассоциированные с заболеванием антигены могут быть связаны с онкологическим заболеванием, обычно опухолями.

Согласно изобретению, термин «неоантиген» относится к пептиду или полипептиду, включающему одну или более аминокислотных модификаций по сравнению с родительским пептидом или полипептидом. Так, например, неоантиген может представлять собой опухолеассоциированный неоантиген, причем термин «опухолеассоциированный неоантиген» включает пептид или полипептид, включающий аминокислотные модификации, обусловленные опухолеспецифическими мутациями.

Термин «эпитоп» относится к антигенной детерминанте в молекуле, такой как антиген, то есть к его части или фрагменту антигена, который распознается иммунной системой, например, которая распознается Т-клеткой, конкретно, при презентации в контексте молекул МНС. Эпитоп пептида или полипептида предпочтительно включает непрерывный или прерывистый участок указанного пептида или полипептида и предпочтительно имеет длину от 5 до 100 аминокислот, предпочтительно от 5 до 50, более предпочтительно от 8 до 30, наиболее предпочтительно от 10 до 25 аминокислот, например, эпитоп может иметь длину предпочтительно 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, или 25 аминокислот. В одном варианте осуществления эпитоп может связываться с молекулами МНС, такими как молекулы МНС на поверхности клетки и, необязательно, может распознаваться Т-клеточным рецептором, таким как Т-клеточный рецептор на поверхности Т-клеток. Таким образом, в одном варианте осуществления эпитоп представляет собой «МНС-связывающий пептид» и, более предпочтительно, «Т-клеточный эпитоп».

Термин «главный комплекс гистосовместимости» и аббревиатура «МНС» включает молекулы МНС класса I и МНС класса II и относится к комплексу генов, который присутствует у всех позвоночных. Белки или молекулы МНС важны для передачи сигналов между лимфоцитами и антигенпрезентирующими клетками или больными клетками в иммунных реакциях, где белки или молекулы МНС связываются с пептидами и презентируют их для распознавания Т-клеточными рецепторами. Белки, кодируемые МНС, экспрессируются на поверхности клеток и представляют Т-клеткам как свои собственные антигены (пептидные фрагменты из самой клетки), так и чужеродные антигены (например, фрагменты проникших микроорганизмов).

Область МНС делится на три подгруппы: класс I, класс II и класс III. Белки МНС класса I содержат α-цепь и β2-микроглобулин (не является частью МНС, кодируемого хромосомой 15). Они презентируют антигенные фрагменты цитотоксическим Т-клеткам. На большинстве клеток иммунной системы, особенно на антигенпрезентирующих клетках, белки МНС класса II содержат α- и β-цепи и они презентируют антигенные фрагменты Т-хелперным клеткам. Область МНС класса III кодирует другие иммунные компоненты, такие как компоненты комплемента и некоторые компоненты, которые кодируют цитокины.

МНС является как полигенным (имеется несколько генов МНС класса I и МНС класса II), так и полиморфным (имеется несколько аллелей каждого гена).

Используемый в данном документе термин «гаплотип» относится к аллелям МНС, обнаруженным в одной хромосоме, и к кодируемым ими белкам. Гаплотип также может относиться к аллелю, присутствующему в любом локусе внутри МНС. Каждый класс МНС представлен несколькими локусами: например, HLA-A (человеческий лейкоцитарный антиген-А), HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLA-K, HLA-L, HLA-P и HLA-V для класса I и HLA-DRA, HLA-DRB1-9, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DMA, HLA-DMB, HLA-DOA и HLA-DOB для класса II. Термины «аллель HLA» и «аллель МНС» используются в данном документе взаимозаменяемо.

МНС проявляют крайний полиморфизм: в человеческой популяции в каждом генетическом локусе имеется большое количество гаплотипов, включающих различные аллели. Различные полиморфные аллели МНС, как класса I, так и класса II, имеют различные пептидные специфичности: каждый аллель кодирует белки, которые связывают пептиды, проявляющие определенные паттерны последовательности.

В одном предпочтительном осуществлении всех аспектов изобретения молекула МНС представляет собой молекулу HLA.

При использовании в настоящем описании сказано, что пептид или эпитоп «презентируется в контексте молекулы МНС», если пептид или эпитоп связывается с молекулой МНС. Такое связывание может быть обнаружено с помощью любого анализа, известного в данной области техники. Термин «МНС-связывающий пептид» относится к пептиду, который связывается с молекулой МНС класса I и/или МНС класса II. В случае комплексов МНС класса I/пептид, связывающие пептиды, как правило, имеют длину 8-10 аминокислот, хотя могут быть эффективными и более длинные или более короткие пептиды. В случае комплексов молекулы МНС класса II/пептид связывающие пептиды, как правило, имеют длину 10-25 аминокислот, а конкретнее, 13-18 аминокислот, хотя могут быть эффективными и более длинные или более короткие пептиды В одном предпочтительном осуществлении всех аспектов изобретения молекула МНС представляет собой молекулу HLA.

Если пептид или эпитоп является частью более крупного компонента, содержащего дополнительные последовательности, например, вакцинной последовательности или полипептида, и должен быть презентирован после процессирования, в частности, после расщепления, то данный пептид или эпитоп, полученный обработкой, имеет длину, подходящую для связывания с молекулой МНС. Предпочтительно, последовательность пептида или эпитопа, который должен быть презентирован после процессирования, получена из аминокислотной последовательности антигена или полипептида, используемого для вакцинации, то есть его последовательность по существу соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена или полипептида.

Таким образом, МНС-связывающий пептид в одном варианте осуществления содержит последовательность, которая по существу соответствует и предпочтительно полностью идентична фрагменту антигена.

Используемый в данном документе термин «неоэпитоп» включает эпитоп, который отсутствует в эталоне, таком как нормальная небольная (например, незлокачественная) или клетка зародышевой линии, но который обнаруживается в больных клетках (например, злокачественных клетках). В частности, к этому относятся ситуации, когда в нормальной небольной или клетке зародышевой линии обнаруживается соответствующий эпитоп, однако благодаря одной или нескольким мутаций в больной клетке последовательность эпитопа изменяется, приводя в результате к появлению неоэпитопа.

Используемый в данном документе термин «Т-клеточный эпитоп» относится к пептиду, который связывается с молекулой МНС в конфигурации, распознаваемой Т-клеточным рецептором. Обычно Т-клеточные эпитопы представлены на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Т-клеточный эпитоп согласно изобретению предпочтительно относится к части или фрагменту антигена, который способен стимулировать иммунный ответ, предпочтительно клеточный ответ против данного антигена или клеток, характеризующихся экспрессией данного антигена и, предпочтительно, презентацией данного антигена, таких как больные клетки, в частности, раковые клетки. Предпочтительно, Т-клеточный эпитоп способен стимулировать клеточный ответ против клетки, характеризующейся презентацией антигена с МНС класса I, и предпочтительно способен стимулировать антиген-респонсивный цитотоксический Т-лимфоцит (CTL).

В одном варианте осуществления вакцина согласно настоящему изобретению обеспечивает один или более неоэпитопов, подходящих для вакцинации целевого организма. Специалист в данной области техники знает, что один из принципов иммунобиологии и вакцинации основан на том факте, что иммунопротективная реакция на заболевание возникает при иммунизации организма вакциной, которая иммунологически релевантна в отношении заболевания, подлежащего лечению. Согласно настоящему изобретению, антиген предпочтительно представляет собой аутоантиген.

Термин «иммуногенность» относится к относительной эффективности для индукции иммунного ответа, который предпочтительно связан с терапевтическим лечением, таким как лечение против онкозаболеваний. Используемый в данном документе термин «иммуногенный» относится к свойству обладать иммуногенностью. Например, термин «иммуногенная модификация» при использовании в контексте пептида, полипептида или белка относится к эффективности указанного пептида, полипептида или белка по отношению к индукции иммунного ответа, который вызывается и/или направлен против указанной модификации. Предпочтительно немодифицированный пептид, полипептид или белок не индуцирует иммунный ответ, индуцирует другой иммунный ответ или индуцирует другой уровень, предпочтительно более низкий уровень, иммунного ответа.

Согласно изобретению, термин «иммуногенность» или «иммуногенный» предпочтительно относится к относительной эффективности индукции биологически значимого иммунного ответа, в частности, иммунного ответа, который применим для вакцинации. Таким образом, в одном предпочтительном варианте осуществления аминокислотная модификация или модифицированный пептид является иммуногенным, если он индуцирует иммунный ответ против целевой модификации у субъекта, причем данный иммунный ответ может быть полезным для терапевтических или профилактических целей.

Используемый в данном документе термин «оценка применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации для иммунотерапии» или «прогнозирование того, применима ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация для иммунотерапии» относится к прогнозу, будет ли специфичная для заболевания аминокислотная модификация, в частности, антиген, который включает специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, или фрагмент антигена, включающий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, такой как фрагмент антигена, содержащий один или более эпитопов, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в частности, один или более Т-клеточных эпитопов, применима для индукции иммунного ответа или нацеливания иммунного ответа. Термин «специфичная для заболевания аминокислотная модификация, которая, как спрогнозировано, будет применима для иммунотерапии», или подобные термины относится к тому факту, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация, в частности, антиген, который включает специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, или фрагмент антигена, который включает специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, такой как фрагмент антигена, содержащий один или более эпитопов, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в частности, один или более Т-клеточных эпитопов, как спрогнозировано, будет применима для индукции иммунного ответа или нацеливания на иммунный ответ. Если спрогнозировано, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для иммунотерапии, например, антиген, который включает специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, или фрагмент антигена, который включает специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, такой как фрагмент антигена, содержащий один или более эпитопов, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в частности, один или более Т-клеточных эпитопов, могут быть использованы для вакцинации или конструирования вакцины, как описано в данном документе.

Согласно настоящему изобретению, эпитоп, такой как Т-клеточный эпитоп, может присутствовать в вакцине как часть более крупного компонента, такого как вакцинная последовательность и/или полипептид, содержащий более одного эпитопа. Презентированный пептид или эпитоп получают после соответствующего процессирования. Также эпитопы могут быть модифицированы по одному или нескольким остаткам, которые не являются необходимыми для связывания с МНС или для распознавания TCR. Такие модифицированные эпитопы можно считать иммунологически эквивалентными. Предпочтительно эпитоп, при презентации в контексте МНС и распознавании Т-клеточным рецептором, обладает способностью индуцировать в присутствии соответствующих костимулирующих сигналов, клональную экспансию Т-клетки, несущей Т-клеточный рецептор, специфический распознающей пептид/МНС-комплекс. Предпочтительно, эпитоп содержит аминокислотную последовательность, по существу соответствующую аминокислотной последовательности фрагмента антигена. Предпочтительно, указанный антигенный фрагмент представляет собой презентированный пептид МНС класса I и/или класса II.

«Процессирование антигена» или «процессирование» относится к деградации пептида, полипептида или белка в продукты процессирования, которые представляют собой фрагменты указанного пептида, полипептида или белка (например, деградация полипептида в пептиды) и к ассоциации одного или нескольких из таких фрагментов (например, посредством связывания) с молекулами МНС для презентации клетками, предпочтительно антигенпрезентирующими клетками, специфическим Т-клеткам.

«Антигенпрезентирующие клетки» (англ. Antigen presenting cells (АРС)) представляют собой клетки, которые презентируют пептидные фрагменты белковых антигенов в ассоциации с молекулами МНС на своей клеточной поверхности. Некоторые АРС могут активировать антигенспецифические Т-клетки.

Специализированные антигенпрезентирующие клетки очень эффективны при интернализации антигена или посредством фагоцитоза, или посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, и последующем представлении фрагмента антигена, связанного с молекулой МНС класса II, на своей мембране. Т-клетка распознает и взаимодействует с комплексом антиген-молекула МНС класса II на мембране антигенпрезентирующей клетки. Затем антигенпрезентирующей клеткой вырабатывается дополнительный костимулирующий сигнал, приводящий к активации Т-клетки. Экспрессия костимулирующих молекул представляет собой характерную черту специализированных антигенпрезентирующих клеток.

Основные типы специализированных антигенпрезентирующих клеток представляют собой дендритные клетки, которые обладают широким спектром антигенной презентации и, вероятно, являются наиболее важными антигенпрезентирующими клетками, макрофаги, В-клетки и определенные активированные эпителиальные клетки. Дендритные клетки (англ. Dendritic cells, DC)) представляют собой популяции лейкоцитов, которые презентируют захваченные в периферических тканях антигены Т-клеткам посредством обоих антигенпрезентирующих путей, с помощью молекул МНС класса II и I. Хорошо известно, что дендритные клетки являются мощными индукторами иммунных ответов, и активация данных клеток является критической стадией для индукции противоопухолевого иммунитета. Дендритные клетки стандартно классифицируют как «незрелые» и «зрелые» клетки, что может использоваться в качестве простого пути различения двух хорошо охарактеризованных фенотипов. Однако такая номенклатура не должна подразумевать исключения всех возможных промежуточных стадий дифференцировки. Незрелые дендритные клетки характеризуются как антигенпрезентирующие клетки с высокой способностью поглощения и процессирования антигена, которая коррелирует с высокой экспрессией рецептора Fcγ и маннозного рецептора. Зрелый фенотип, как правило, характеризуется более низкой экспрессией данных маркеров, но при этом высокой экспрессией молекул клеточной поверхности, ответственных за активацию Т-клеток, таких как МНС класса I и класса II, молекул адгезии (например, CD54 и CD11) и костимулирующих молекул (например, CD40, CD80, CD86 и 4-1 ВВ). Созревание дендритных клеток обозначается как статус активации дендритной клетки, при котором такие антигенпрезентирующие дендритные клетки приводят к стимуляции Т-клеток, в то время как презентация незрелыми дендритными клетками приводит к устойчивости. Созревание дендритных клеток прежде всего вызвано биомолекулами с микробными свойствами, детектируемыми с помощью рецепторов врожденного иммунитета (бактериальная ДНК, вирусная РНК, эндотоксин и т.д), провоспалительных цитокинов (TNF, IL-1, IFNs), лигированием CD40 на поверхности дендритных клеток с помощью CD40L и веществами, высвобождаемыми из клеток в состоянии клеточной смерти под действием стресса. Дендритные клетки могут быть получены культивированием клеток костного мозга in vitro с цитокинами, такими как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) и фактор некроза опухоли альфа.

Неспециализированные антигенпрезентирующие клетки не экспрессируют конститутивно белки МНС класса II, требуемые для взаимодействия с наивными Т-клетками; они экспрессируются только при стимуляции неспециализированных антигенпрезентирующих клеток с помощью определенных цитокинов, таких как IFNγ.

Под «клеткой, характеризующейся презентацией антигена» или «клеткой, презентирующей антиген» или под аналогичными выражениями понимают клетку, такую как больная клетка, например, злокачественная клетка или антигенпрезентирующая клетка, презентирующую антиген или фрагмент, выделенный из указанного антигена, например, путем процессирования антигена, в контексте молекул МНС, конкретно, молекул МНС класса I. Аналогично, термин «заболевание, характеризующееся презентацией антигена» обозначает заболевание, в которое вовлечены клетки, характеризующиеся презентацией антигена, в частности, с помощью молекул МНС класса I. На презентацию антигена клеткой может влиять трансфекция клетки нуклеиновой кислотой, такой как РНК, кодирующей антиген.

Под «фрагментом антигена, который презентируется» или аналогичными выражениями понимают, что фрагмент может презентироваться с помощью молекул МНС класса I или класса II, предпочтительно МНС класса I, например, при добавлении непосредственно к антигенпрезентирующим клеткам. В одном варианте осуществления фрагмент представляет собой фрагмент, который в природной среде презентируется клетками, экспрессирующими антиген.

«Клетка-мишень» будет обозначать клетку, которая является мишенью для иммунного ответа, такого как клеточный иммунный ответ. Клетки-мишени включают клетки, которые презентируют антиген, то есть пептидный фрагмент, выделенный из антигена, и включают любую нежелательную клетку, такую как раковая клетка. В предпочтительных вариантах осуществления клетка-мишень представляет собой клетку, экспрессирующую антиген, как описано в данном документе, и предпочтительно, презентирующую указанный антиген с помощью молекулы МНС класса I.

Термин «участок» относится к части. По отношению к конкретной структуре, такой как аминокислотная последовательность или белок, термин его «участок» может означать непрерывную или дискретную часть указанной структуры. Предпочтительно, участок аминокислотной последовательности включает по меньшей мере 1%, по меньшей мере 5%, по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, предпочтительно по меньшей мере 40%, предпочтительно по меньшей мере 50%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере 80% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 90% аминокислот указанной аминокислотной последовательности. Предпочтительно, если участок представляет собой дискретную часть, то указанная прерывистая фракция состоит из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более частей структуры, причем каждая часть представляет собой непрерывный элемент структуры. Например, дискретная часть аминокислотной последовательности может состоять из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 или более, предпочтительно, не более чем из 4 частей указанной аминокислотной последовательности, где каждая часть предпочтительно включает по меньшей мере 5 непрерывно расположенных аминокислот, по меньшей мере 10 непрерывно расположенных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 20 непрерывно расположенных аминокислот, предпочтительно по меньшей мере 30 непрерывно расположенных аминокислот аминокислотной последовательности.

Термины «часть» и «фрагмент» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к непрерывному элементу. Например, часть структуры, такой как аминокислотная последовательность или белок, относится к непрерывному элементу указанной структуры. Участок, часть или фрагмент структуры предпочтительно включает одно или несколько функциональных свойств указанной структуры. Например, участок, часть или фрагмент эпитопа, пептида или белка предпочтительно является иммунологически эквивалентным эпитопу, пептиду или белку, из которого он выделен. В контексте настоящего изобретения «часть» структуры, такой как аминокислотная последовательность, предпочтительно включает, предпочтительно состоит из по меньшей мере 10%, по меньшей мере 20%, по меньшей мере 30%, по меньшей мере 40%, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% цельной структуры или аминокислотной последовательности.

Термин «эффекторная клетка», «иммунная эффекторная клетка» или «иммунореактивная клетка» в контексте настоящего изобретения относится к клетке, которая выполняет эффекторные функции в процессе иммунной реакции. «Иммунореактивная клетка» предпочтительно способна связываться с антигеном или с клеткой, характеризующейся презентацией антигена или его пептидного фрагмента (например, Т-клеточного эпитопа) и опосредует иммунный ответ. Например, такие клетки секретируют цитокины и/или хемокины, секретируют антитела, распознают опухолевые клетки и необязательно уничтожают клетки. Например, иммунореактивные клетки включают Т-клетки (цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, опухоль-инфильтрирующие Т-клетки), В-клетки, природные клетки-киллеры, нейтрофилы, макрофаги и дендритные клетки. Предпочтительно, в контексте настоящего изобретения иммунореактивные клетки представляют собой Т-клетки, предпочтительно CD4⁺ и/или CD8⁺ Т-клетки.

Предпочтительно, «иммунореактивная клетка» распознает антиген или его пептидный фрагмент с некоторой степенью специфичности, конкретно, если он презентируется в контексте молекул МНС, например, на поверхности антигенпрезентирующих клеток или больных клеток, таких как злокачественные клетки. Предпочтительно, указанное распознавание дает возможность клетке, которая распознает антиген или его пептидный фрагмент, быть респонсивной или реактивной. Если клетка представляет собой хелперную Т-клетку (CD4⁺ Т-клетка), несущую рецепторы, которые распознают антиген или его пептидный фрагмент в контексте молекул МНС класса II, такая респонсивность или реактивность может включать высвобождение цитокинов и/или активацию CD8⁺ лимфоцитов (CTL) и/или В-клеток. Если клетка представляет собой CTL, то такая респонсивность или реактивность может включать уничтожение клеток, презентированных в контексте молекул МНС класса I, то есть клеток, отличающихся презентацией антигена с использованием молекул МНС класса I, например, посредством апоптоза или перфорин-опосредованного клеточного лизиса. Согласно изобретению, респонсивность CTL может включать длительное выделение кальция, клеточное деление, респонсивность CTL может включать длительное выделение кальция, клеточное деление, продуцирование цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, положительную регуляцию маркеров активации, таких как CD44 и CD69, и специфическое цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток мишеней. Респонсивность CTL также может быть определена с использованием искусственного репортера, который точно выявляет респонсивность CTL. Такие CTL, которые распознают антиген или антигенный фрагмент и являются респонсивными или реактивными, также обозначаются в данном документе как «антиген-респонсивные CTL». Если клетка представляет собой В-клетку, такая респонсивность может включать высвобождение иммуноглобулинов.

Термины «Т-клетка» и «Т-лимфоцит» используются взаимозаменяемо в данном документе и включают Т-хелперные клетки (CD4+ Т-клетки) и цитотоксические Т-клетки (CTL, CD8+ Т-клетки), которые включают цитолитические Т-клетки.

Т-клетки принадлежат к группе белых кровяных клеток, известных как лимфоциты, и играют центральную роль в клеточно-опосредованном иммунитете. Они могут отличаться от других типов лимфоцитов, таких как В-клетки и природные клетки-киллеры, присутствием специального рецептора на их клеточной поверхности, называемого Т-клеточным рецептором (TCR). Тимус является принципиальным органом, отвечающим за созревание Т-клеток. Было обнаружено несколько различных подгрупп Т-клеток, каждая с различной функцией.

Т-хелперы помогают другим белым кровяным клеткам в иммунологических процессах, включая созревание В-клеток в плазматические клетки и активацию цитотоксических Т-клеток и макрофагов. Данные клетки также известны как CD4+ Т-клетки, так как они экспрессируют белок CD4 на своей поверхности. Хелперные Т-клетки становятся активированными, когда им презентируются пептидные антигены молекулами МНС класса II, которые экспрессируются на поверхности антигенпрезентирующих клеток (АРС). После активации они быстро делятся и секретируют небольшие белки, называемые цитокинами, которые регулируют или способствуют активному иммунному ответу.

Цитотоксические Т-клетки разрушают инфицированные вирусами клетки и опухолевые клетки, и также вовлечены в отторжение трансплантата. Данные клетки также известны как CD8+ Т-клетки, так как они экспрессируют гликопротеин CD8 на своей поверхности. Данные клетки распознают свои мишени путем связывания с антигеном, ассоциированным с молекулой МНС класса I, которая присутствует на поверхности почти каждой клетки организма.

Большинство Т-клеток имеют Т-клеточный рецептор (TCR), существующий в виде комплекса нескольких белков. Фактически Т-клеточный рецептор состоит из двух отдельных пептидных цепей, которые образуются из независимых генов Т-клеточного рецептора альфа и бета (TCRα и TCRβ) и называются α- и β-TCR-цепями. γδ Т-клетки (гамма-дельта-Т-клетки) представляют небольшую подгруппу Т-клеток, на поверхности которых находятся отличающиеся Т-клеточные рецепторы (TCR). При этом, в γδ Т-клетках TCR образуется из одной γ-цепи и одной δ-цепи. Данная группа Т-клеток обычно гораздо меньше (2% от общего числа Т-клеток), чем αβ Т-клетки.

Первый сигнал в активации Т-клеток обеспечивается путем связывания Т-клеточного рецептора с коротким пептидом, презентированным в контексте МНС на другой клетке. Такое связывание гарантирует, что активируется только Т-клетка с TCR, специфичным к данному пептиду. Клетка-партнер обычно представляет собой антигенпрезентирующую клетку, например, специализированную антигенпрезентирующую клетку, как правило, дендритную клетку в случае наивных ответов, хотя В-клетки и макрофаги могут быть важными АРС.

Согласно настоящему изобретению, молекула способна связываться с мишенью, если она имеет достаточную аффинность к указанной определенной мишени, и связывается с указанной определенной мишенью в стандартных анализах. «Аффинность» или «аффинность связывания» часто измеряют с помощью равновесной константы диссоциации (K_D). Молекула не способна (по существу) к связыванию с мишенью, если она не обладает достаточной аффинностью к указанной мишени, и не связывается существенно с указанной мишенью в стандартных анализах.

Цитотоксические Т-лимфоциты могут образовываться in vivo включением антигена или его пептидного фрагмента в антигенпрезентирующие клетки in vivo. Антиген или его пептидный фрагмент могут быть представлены как в виде белка, так и в виде ДНК (например, внутри вектора) или в виде РНК. Антиген может процессироваться с получением пептида-партнера для молекулы МНС, в то время как его фрагмент может презентироваться без необходимости дополнительного процессирования. Последнее происходит, в частности, если они связываются с молекулами МНС. В целом, возможно введение пациенту с помощью внутрикожной инъекции. Однако инъекция может также проводиться по внутриузловому пути в лимфатический узел (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303). Полученные в результате клетки презентируют представляющий интерес комплекс и распознаются аутологичными цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые затем размножаются.

Специфичная активация CD4+ или CD8+ Т-клеток может детектироваться различными путями. Способы детекции специфичной Т-клеточной активации включают детекцию пролиферации Т-клеток, выработки цитокинов (например, лимфокинов, таких как IFNγ) или цитолитической активности. Для CD4+ Т-клеток предпочтительным способом детекции специфичной Т-клеточной активации является детекция пролиферации Т-клеток. Для CD8+ Т-клеток предпочтительным способом детекции специфичной Т-клеточной активации является детекция генерации цитолитической активности. В частности, внутриклеточное окрашивание цитокина или ELISPOT может использоваться для обнаружения цитокинов, вырабатываемых как CD4+, так и CD8+ Т-клетками, например, с помощью способов, описанных в настоящей заявке.

Обычно, в анализе ELISPOT поверхности мембраны покрывают захватывающим антителом, которое связывает специфический эпитоп анализируемого цитокина. Когда клетки активируются, они выделяют цитокин, который захватывается непосредственно на поверхности мембраны иммобилизованным антителом. Таким образом, цитокин «захватывается» в области, непосредственно окружающей секретирующую клетку. Последующие стадии детекции визуализируют иммобилизованный цитокин как «иммуноспот», который является по существу секреторным следом активированной клетки. Способ ELISPOT-анализа, таким образом, позволяет оценить количество и/или частоту Т-клеток, которые вырабатывают данный цитокин (например, IFNγ) в ответ на специфический антигенный стимул. Количество пятен может выражаться как средние значения, полученные из повторов, и может сравниваться с отрицательными контролями (например, нестимулированными клетками). Ответ может быть определен как положительный, если наблюдается минимальное количество пятен в пересчете на определенное количество клеток и/или количество пятен превышает определенный уровень по сравнению с отрицательным контролем. Например, ответ может быть определен как положительный, если имеется минимум пять пятен на 1×10³ клеток, 1×10⁴ клеток или 1×10⁵ клеток и/или если число пятен превышает соответствующий отрицательный контроль более чем в 2, 3, 4 раза, 5 раз, или даже больше.

Термин «иммунологически эквивалентный» означает, что иммунологически эквивалентная молекула, такая как иммунологически эквивалентная аминокислотная последовательность демонстрирует такие же или по существу такие же иммунологические свойства и/или оказывает такие же или по существу такие же иммунологические эффекты, например, в отношении типа иммунологического эффекта, такого как индукция гуморального и/или клеточного иммунного ответа, силы и/или продолжительности индуцированной иммунной реакции или специфичности индуцированной иммунной реакции. В контексте настоящего изобретения термин «иммунологически эквивалентный» предпочтительно используется в отношении иммунологических эффектов или свойств пептида или полипептида, используемого для иммунизации. Например, аминокислотная последовательность является иммунологически эквивалентной референсной аминокислотной последовательности, если указанная аминокислотная последовательность при экспонировании иммунной системе субъекта индуцирует иммунную реакцию, обладающую специфичностью реакции с референсной аминокислотной последовательностью.

Термин «иммунные эффекторные функции» в контексте настоящего изобретения включает любые функции, опосредованные компонентами иммунной системы, что приводит в результате, например, к уничтожению опухолевых клеток или к ингибированию опухолевого роста и/или ингибированию развития опухоли, включая ингибирование распространения опухоли и метастазирования. Предпочтительно, иммунные эффекторные функции в контексте настоящего изобретения представляют собой эффекторные функции, опосредованные Т-клетками. Такие функции включают в случае хелперной Т-клетки (CD4⁺ Т-клетка) распознавание антигена или антигенного фрагмента в контексте молекул МНС класса II с помощью Т-клеточных рецепторов, высвобождение цитокинов и/или активацию CD8⁺ лимфоцитов (CTL) и/или В-клеток, и, в случае CTL, распознавание антигена или антигенного фрагмента в контексте молекул МНС класса I с помощью Т-клеточных рецепторов, уничтожение клеток, презентированных в контексте молекул МНС класса I, т.е. клеток, характеризующихся презентацией антигена с помощью молекулы МНС класса I, например, посредством апопотоза или перфорин-опосредованного клеточного лизиса, продуцирование цитокинов, таких как IFN-γ и TNF-α, и специфичное цитолитическое уничтожение антиген-экспрессирующих клеток-мишеней.

В общем случае, согласно изобретению, специфичные для заболевания аминокислотные модификации и фрагменты пептидов или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, где данные фрагменты содержат одну или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, оцениваются с точки зрения их применимости в иммунотерапии. Один или более фрагментов с спрогнозированной применимостью для иммунотерапии может быть использован для предоставления вакцины, содержащей, например, пептид или полипептид, из которого получены один или более фрагментов, или один или более пептидных фрагментов пептида или полипептида, в частности, один или более (потенциальных) МНС-связывающих пептидов пептида или полипептида. Вакцина может также включать нуклеиновую кислоту, такую как РНК, кодирующую пептид или полипептид, из которого получены один или более фрагментов, или один или более пептидных фрагментов пептида или полипептида, в частности, один или более (потенциальных) МНС-связывающих пептидов пептида или полипептида.

Согласно изобретению, термин «оценка» относится к результату, обычно выражаемому численно, теста или анализа, включающего, например, анализы для измерения презентации полипептидных фрагментов на молекулах МНС или анализы для измерения реактивности Т-клеток в отношении полипептидных фрагментов на молекулах МНС. Такие термины, как «лучший результат» или «результат лучше», относятся к лучшему результату или наилучшему результату теста или анализа.

Степень презентации полипептидов и реактивности Т-клеток можно определить, используя любые способы, известные в данной области техники. Презентация пептидов может быть определена, например, с использованием хорошо известных способов прогнозирования и экспериментальных способов. Например, был разработан ряд биохимических анализов для определения аффинности МНС-пептид. Классическим способом является конкурентный анализ, в котором обычно радиоактивно меченный эталонный пептид связывается с МНС. Анализы реактивности Т-клеток могут быть также использованы для определения связывания пептида с МНС. Реактивность Т-клеток можно оценивать, как описано в данном документе, например, с помощью иммунологических анализов, включая фермент-связанные иммуносорбентные анализы (ELISPOT) или анализы секреции цитокинов (CSA).

Согласно изобретению, специфичные для заболевания аминокислотные модификации могут оцениваться в соответствии с предсказанной способностью пептидных или полипептидных эпитопов, содержащих по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию (1) презентироваться в контексте молекул МНС различных классов и/или реагировать с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, (2) реагировать с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, и/или (3) презентироваться в контексте различных молекул МНС одного класса и/или реагировать с Т-клетками, рестриктированными по одному классу МНС, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса. В общем, чем большему числу параметров (1)-(3) удовлетворяет специфичная для заболевания аминокислотная модификация или пептидный или полипептидный эпитоп, содержащий по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, тем выше оценка специфичной для заболевания аминокислотной модификации.

Такие термины, как «прогнозировать», «спрогнозировать» или «прогноз», относятся к определению вероятности, например, того, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, применима для иммунотерапии. Специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, идентифицируется как применимая для иммунотерапии, если одинаковые или различные фрагменты полипептида (данные фрагменты содержат специфичную для заболевания аминокислотную модификацию) презентируются в контексте молекул МНС различных классов, если одинаковые или различные фрагменты полипептида реагируют с Т-клетками, рестриктированными по различным классам МНС, или если происходит и то, и другое. Альтернативно или дополнительно, специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, идентифицируется как применимая для иммунотерапии, если фрагмент полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реагирует с Т-клетками, имеющими различные Т-клеточные рецепторы. Альтернативно или дополнительно, специфичная для заболевания аминокислотная модификация в полипептиде, экспрессированном в больной клетке, идентифицируется как применимая для иммунотерапии, если одинаковые или различные фрагменты полипептида (данные фрагменты содержат специфичную для заболевания аминокислотную модификацию) презентируются в контексте различных молекул МНС одного класса, если одинаковые или различные фрагменты полипептида, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, реагируют с различными Т-клетками, рестриктированными по одному классу МНС, или если происходит и то, и другое.

Презентация фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС может быть установлена, например, с использованием любого способа прогнозирования связывания пептид : МНС и/или путем экспериментального определения связывания фрагмента с молекулами МНС.

Реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в отношении Т-клеток при презентации в контексте молекул МНС может быть установлена, например, экспериментально.

В одном варианте осуществления оценку обычно проводят в отношении молекул МНС и/или Т-клеток, обнаруженных у пациента, имеющего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию. Соответственно, настоящее изобретение также может включать определение МНС и/или Т-клеточного репертуара пациента.

Термин «различные фрагменты пептида или полипептида, включающего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию» в одном варианте осуществления относится к пептидам, содержащим или состоящим из различных фрагментов модифицированного пептида или полипептида, причем указанные различные фрагменты содержат одинаковую модификацию(и), присутствующую в пептиде или полипептиде, но различаются по длине и/или положению модификации(й). Если пептид или полипептид имеет модификацию в положении х, то два или более фрагмента указанного пептида или полипептида, каждый из которых содержит различное окно (сегмент) последовательности указанного пептида или полипептида, охватывающее указанное положение х, считаются различными фрагментами пептида или полипептида, содержащими специфичную для заболевания аминокислотную модификацию.

Термин «различные аминокислотные модификации» относится к различным аминокислотным модификациям одинаковых и/или различных пептидов или полипептидов.

Предпочтительно, согласно настоящему изобретению, «фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию», имеет соответствующую длину для связывания МНС.

Аминокислотные модификации, применимость которых для иммунотерапии должна быть оценена согласно настоящему изобретению, или которые должны быть выбраны и/или ранжированы по применимости в иммунотерапии согласно изобретению, предпочтительно, появляются в результате мутаций в нуклеиновой кислоте клетки, такой как больная клетка, в частности, раковая или опухолевая клетка пациента. Такие мутации могут быть идентифицированы известными способами секвенирования. Соответственно, способы по настоящему изобретению могут быть выполнены для пациента, такого как онкопациент, чтобы обеспечить специфичную для пациента вакцину, такую как противораковая вакцина.

В одном варианте осуществления мутации представляют собой опухолеспецифические соматические мутации в образце опухоли онкопациента, которые могут быть определены путем идентификации различий в последовательностях между геномом, экзомом и/или транскриптомом опухолевого образца и геномом, экзомом и/или транскриптомом неопухолевого образца.

Согласно изобретению, опухолевый образец относится к любому образцу, такому как образец, взятый из организма, выделенный из тканей пациента, содержащий или ожидаемо содержащий опухолевые или раковые клетки. Образец, взятый из организма, может представлять собой любой образец ткани, такой как кровь, образец ткани, полученный из первичной опухоли или из опухолевых метастазов, или любой другой образец, содержащий опухолевые или раковые клетки. Предпочтительно, образец организма представляет собой кровь, а опухолеспецифические соматические мутации или различия в последовательностях определяют в одной или в нескольких циркулирующих опухолевых клетках (circulating tumor cells (СТС)), содержащихся в крови. В другом варианте осуществления опухолевый образец относится к одной или нескольким выделенным опухолевым или раковым клеткам, таким как циркулирующие опухолевые клетки (СТС), или к образцу, содержащему одну или несколько выделенных опухолевых или раковых клеток, таких как циркулирующие опухолевые клетки (СТС).

Неопухолевый образец относится к любому образцу, такому как образец из организма, который выделен из тканей пациента или другого индивидуума, который предпочтительно того же вида, что и пациент, предпочтительно из здорового индивидуума, не содержащего или ожидаемо не содержащего опухолевых или раковых клеток. Образец из организма может представлять собой любой образец ткани, такой как кровь, или образец из нетуморогенной ткани.

Изобретение может включать определение сигнатуры мутаций злокачественных опухолей у пациента. Термин «сигнатура мутаций злокачественных опухолей» может относиться ко всем мутациям злокачественных опухолей, присутствующим в одной или в нескольких раковых клетках пациента, или может относиться только к части мутаций злокачественных опухолей, присутствующих в одной или в нескольких раковых клетках пациента. Соответственно, настоящее изобретение может включать идентификацию всех опухолеспецифических мутаций, присутствующих в одной или в нескольких раковых клетках пациента, или может включать идентификацию только части опухолеспецифических мутаций, присутствующих в одной или в нескольких раковых клетках пациента. Как правило, способ по изобретению обеспечивает идентификацию ряда мутаций, которые дают достаточное количество модификаций или модифицированных пептидов или полипептидов, которые должны быть включены в способах по настоящему изобретению.

Предпочтительно, мутации, идентифицированные согласно настоящему изобретению, представляют собой несинонимичные мутации, предпочтительно, несинонимичные мутации пептидов или полипептидов, экспрессированных в опухолевой или раковой клетке.

В одном варианте осуществления опухолеспецифические соматические мутации или различия в последовательности определяются в геноме, предпочтительно, во всем геноме опухолевого образца. Таким образом, изобретение может включать идентификацию сигнатуры опухолевых мутаций генома, предпочтительно всего генома одной или нескольких раковых клеток. В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций в опухолевом образце онкопациента включает идентификацию полного геномного профиля опухолевых мутаций.

В одном варианте осуществления опухолеспецифические соматические мутации или различия в последовательности определяются в экзоме, предпочтительно, во всем экзоме опухолевого образца. Таким образом, изобретение может включать идентификацию сигнатуры опухолевых мутаций экзома, предпочтительно, всего экзома одной или нескольких раковых клеток. В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций в опухолевом образце онкопациента включает идентификацию полного экзомного профиля опухолевых мутаций.

В одном варианте осуществления опухолеспецифические соматические мутации или различия в последовательности определяются в транскриптоме, предпочтительно во всем транскриптоме опухолевого образца. Таким образом, изобретение может включать идентификацию сигнатуры опухолевых мутаций транскриптома, предпочтительно, всего транскриптома одной или нескольких раковых клеток. В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций в опухолевом образце онкопациента включает идентификацию полного транскриптомного профиля опухолевых мутаций.

В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций или идентификации различий в последовательностях включает секвенирование генома из одной клетки (single cell sequencing) для одной или нескольких раковых клеток, предпочтительно, из 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или даже более. Таким образом, изобретение может включать идентификацию сигнатуры опухолевых мутаций указанной одной или нескольких раковых клеток. В одном варианте осуществления раковые клетки представляют собой циркулирующие опухолевые клетки. Раковые клетки, такие как циркулирующие опухолевые клетки, могут быть выделены перед секвенированием генома из одной клетки.

В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций или идентификации различий в последовательностях включает применение секвенирования следующего поколения (NGS).

В одном варианте осуществления стадия идентификации опухолеспецифических соматических мутаций или идентификации различий в последовательностях включает секвенирование геномной ДНК и/или РНК опухолевого образца.

Для обнаружения опухолеспецифических соматических мутаций или различий в последовательностях, информацию о последовательностях, полученную из опухолевого образца, предпочтительно сравнивают с эталонной, таким как информация о последовательностях, полученная в результате секвенирования нуклеиновой кислоты, такой как ДНК или РНК нормальных незлокачественных клеток, таких как клетки зародышевой линии, которые могут быть получены из пациента или другого индивидуума. В одном варианте осуществления нормальную геномную ДНК зародышевой линии получают из мононуклеарных клеток периферической крови (peripheral blood mononuclear cells (PBMC)).

Термин «геном» относится к общему количеству генетической информации в хромосомах организма или клетки.

Термин «экзом» относится к части генома организма, образованной экзонами, которые представляют собой кодирующие участки экспрессирующихся генов. Экзом обеспечивает генетический "чертеж", используемый для синтеза белков и других функциональных генных продуктов. Он является наиболее функционально релевантной частью генома, и, таким образом, наиболее вероятно вносит вклад в фенотип организма. По оценкам, экзом человеческого генома составляет 1,5% суммарного генома (Ng, PC et al, PLoS Gen., 4 (8): 1-15, 2008).

Термин «транскриптом» относится к набору всех молекул РНК, включающих мРНК, рРНК, тРНК и другие некодирующие РНК, вырабатываемые в одной клетке или в популяции клеток. В контексте настоящего изобретения транскриптом обозначает набор всех молекул РНК, выработанных в одной клетке, в популяции клеток, предпочтительно в популяции раковых клеток, или во всех клеток данного индивидуума в определенный момент времени.

«Нуклеиновая кислота» согласно изобретению предпочтительно представляет собой дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) или рибонуклеиновую кислоту (РНК), более предпочтительно, РНК, наиболее предпочтительно, in vitro транскрибированную РНК (IVT РНК) или синтетическую РНК. Нуклеиновые кислоты включают согласно изобретению геномную ДНК, кДНК, мРНК, рекомбинантно продуцируемые и химически синтезированные молекулы. Согласно изобретению, нуклеиновая кислота может присутствовать в виде одноцепочечной или двухцепочечной и линейно или ковалентно циклически замкнутой молекулы. Согласно настоящему изобретению, нуклеиновая кислота может быть выделенной. Термин «выделенная нуклеиновая кислота» означает согласно изобретению, что нуклеиновая кислота (i) была амплифицирована in vitro, например, посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР), (ii) была получена рекомбинантно путем клонирования, (iii) была очищена, например, путем расщепления и разделения с помощью гель-электрофореза, или (iv) была синтезирована, например, с помощью химического синтеза. Нуклеиновая кислота может применяться для введения внутрь, т.е. для трансфекции клеток, конкретно, в форме РНК, которая может быть получена путем in vitro транскрипции с ДНК-матрицы. Кроме того, РНК может быть модифицирована перед применением с помощью стабилизирующих последовательностей, кэппирования и полиаденилирования.

Термин «генетический материал» относится к выделенной нуклеиновой кислоте, либо к ДНК, либо к РНК, к участку двойной спирали, к участку хромосомы или к цельному геному организма или клетки, конкретно к экзому или транскриптому.

Термин «мутация» относится к изменению или различию в последовательности нуклеиновой кислоты (нуклеотидной замене, вставке или делеции) по сравнению с эталоном. «Соматическая мутация» может происходить в любой из клеток организма, за исключением зародышевых клеток (спермий и яйцеклетка) и, таким образом, не передается к потомству. Данные изменения могут (но не всегда) вызывать злокачественное новообразование или другие заболевания. Предпочтительно, мутация представляет собой несинонимичную мутацию. Термин «несинонимичная мутация» относится к мутации, предпочтительно, к нуклеотидной замене, которая приводит в результате к аминокислотной замене, такой как аминокислотная замена в продукте трансляции.

Согласно настоящему изобретению термин «мутация» включает точечные мутации, вставки-делеции, сшивки, хромотрипсис и РНК-редактирующие мутации

Согласно изобретению, термин «вставка-делеция» описывает особый класс мутаций, определенный как мутация, приводящая в результате к колокализованным вставке и делеции и к приобретению или к потере нуклеотидов. В кодирующих участках генома, если длина вставки-делеции не кратна 3, они ведут к получению мутации со сдвигом рамки считывания. Вставки-делеции могут противопоставляться точечной мутации; в случае, где вставка-делеция вставляет и удаляет нуклеотиды из последовательности, точечная мутация является формой замены, которая заменяет один нуклеотид на другой.

Сшивки могут приводить к образованию гибридных генов, образованных из двух ранее отдельных генов. Они могут происходить в результате транслокации, интерстициальной делеции или инверсии сегмента хромосомы. Часто сшитые гены представляют собой онкогены. Онкогенные сшитые гены могут приводить к получению генного продукта с новой или отличной функцией от функции двух партнеров по сшивке. В ином случае, протоонкоген сшивается с сильным промотором и посредством этого включается онкогенная функция путем положительной регуляции, вызванной сильным промотором из 5'-области партнера по сшивке. Получение онкогенных сшитых транскриптов также может быть вызвано транс-сплайсингом или событиями неправильного прочтения.

Согласно настоящему изобретению, термин «хромотрипсис» относится к генетическому явлению, в ходе которого специфические области генома раскалываются и затем сшиваются вместе в процессе одного разрушительного события.

Согласно настоящему изобретению, термин «редактировать РНК» или «редактирование РНК» относится к молекулярным процессам, в которых информационное содержание в молекуле РНК изменяется посредством химического изменения в составе оснований. РНК-редактирование включает нуклеозидные модификации, такие как дезаминирования цитидина (С) до уридина (U) и аденозина (А) до инозина (I), а также не матричные нуклеотидные добавления и вставки. РНК-редактирование в мРНК эффективно изменяет аминокислотную последовательность кодируемого белка, так что он отличается от спрогнозированного с помощью последовательности геномной ДНК.

Термин «сигнатура мутаций злокачественных опухолей» относится к мутациям, которые присутствуют в раковых клетках по сравнению с нераковыми эталонными клетками.

Согласно изобретению, «эталон» может использоваться для корреляции и сравнения результатов, полученных из опухолевого образца. Как правило, «эталон» может быть получен на основе одного или нескольких нормальных образцов, в частности, образцов, которые не подвержены опухолевому заболеванию, или получены из пациента или из одного или нескольких индивидуумов, предпочтительно, здоровых индивидуумов, в частности, индивидуумов того же вида. «Эталон» может быть определен эмпирически путем тестирования достаточно большого количества нормальных образцов.

Согласно изобретению, может использоваться любой подходящий способ секвенирования для определения мутаций, предпочтительными являются технологии Секвенирования Следующего Поколения (Next Generation Sequencing (NGS)). Способы Секвенирования Третьего Поколения могут заменить технологию NGS в будущем для повышения скорости стадии секвенирования способа. С целью прояснения: термины «Секвенирование Следующего Поколения» или «NGS» в контексте настоящего изобретения означают все новые высокопроизводительные технологии секвенирования, которые в отличие от «стандартной» методологии секвенирования, известной как способ Сэнгера, считывают нуклеиново-кислотные матрицы случайным образом параллельно по всему геному путем разбивки цельного генома на короткие участки. Такие NGS-технологии (также известные как технологии массово-параллельного секвенирования) могут предоставлять информацию о последовательности нуклеиновых кислот полного генома, экзома, транскриптома (все транскрибирующиеся последовательности генома) или метилома (все метилированные последовательности генома) в очень короткие сроки, например, в течение 1-2 недель, предпочтительно в течение 1-7 дней или наиболее предпочтительно в течение менее чем 24 часов, и в принципе позволяют осуществлять способы секвенирования отдельной клетки. Множество NGS платформ, которые коммерчески доступны или которые упоминаются в научной литературе, может использоваться в контексте настоящего изобретения, например, те, которые подробно описаны в Zhang et al. 2011: The impact of next-generation sequencing on genomics. J. Genet Genomics 38 (3), 95-109; или в Voelkerding et at. 2009: Next generation sequencing: From basic research to diagnostics. Clinical chemistry 55, 641-658. Неограничивающими примерами таких NGS-технологий/платформ являются

1) Технология секвенирование-путем-синтеза (sequencing-by-synthesis), известная как пиросеквенирование, выполняемое, например, в GS-FLX 454 Genome Sequencer™, компании, ассоциированной с Roche 454 Life Sciences (Branford, Connecticut), впервые описана в Ronaghi et at. 1998: A sequencing method based on real-time pyrophosphate". Science 281 (5375), 363-365. Данная технология использует эмульсионную ПЦР, в которой шарики, связывающие одноцепочечную ДНК, инкапсулируются посредством интенсивного встряхивания в водные мицеллы, содержащие ПЦР-реагенты, окруженные маслом для амплификации с помощью эмульсионной ПЦР. В процессе пиросеквенирования свет, испускаемый молекулами фосфата при присоединении нуклеотидов, записывается по мере того, как полимераза синтезирует ДНК-цепь.

2) Способы секвенирование-путем-синтеза, разработанные фирмой «Solexa» (теперь часть Illumina Inc., San Diego, California), которые базируются на обратимых красителях-терминаторах, и реализуемые, например, в «Illumina/Solexa Genome Analyzer™» и в «Illumina HiSeq 2000 Genome Analyzer™». В данной технологии все четыре нуклеотида добавляются одновременно к кластерам фрагментов с гибридизованными олигонуклеотидными праймерами в каналы проточных ячеек, совместно с ДНК-полимеразой. Мостиковая амплификация обеспечивает рост кластеризованных цепочек с помощью всех четырех флуоресцентно меченых нуклеотидов для секвенирования.

3) Способы секвенирование-путем-лигирования (Sequencing-by-ligation), например, выполняемые на платформе «SOLid™» «Applied Biosystems» (теперь «Life Technologies Corporation», Carlsbad, California). В данной технологии пул всех возможных олигонуклеотидов фиксированной длины метят согласно отсеквенированному положению. Олигонуклеотиды отжигаются и лигируются; предпочтительное лигирование с помощью ДНК-лигазы для парных последовательностей приводит в результате к получению сигнала, информативного в отношении нуклеотида в данном положении. Перед секвенированием ДНК амплифицируется с помощью эмульсионной ПЦР. Полученные шарики, каждый из которых содержит только копии одной ДНК-молекулы, располагаются на предметном стекле. В качестве второго примера, платформа «Polonator™ G.007» от «Dover Systems» (Salem, New Hampshire) также применяет способ секвенирование-путем-лигированиея, используя случайно организованную на основе использования шариков эмульсионную ПЦР для амплификации ДНК-фрагментов для параллельного секвенирования.

4) Технологии секвенирования одиночных молекул, такие как, например, применяемые в системе «PacBio RS» от «Pacific Biosciences)) (Menlo Park, California) или в «HeliScope™» на платформе «Helicos Biosciences» (Cambridge, Massachusetts). Отличная характеристика данной технологии заключается в ее способности секвенировать одиночные молекул ДНК или РНК без амплификации, что определяется как секвенирование одиночных молекул ДНК в реальном времени (Single-Molecule Real Time, SMRT). Например, «HeliScope» использует высокочувствительную систему детекции флуоресценции для прямой детекции каждого нуклеотида по мере его синтеза. Аналогичный способ на основе резонансного переноса энергии флуоресценции (FRET) был разработан в Visigen Biotechnology (Хьюстон, Техас). Другие технологии секвенирования одиночных молекул на основе флуоресценции поставляются U.S. Genomics («GeneEngine™») и Genovoxx («AnyGene™2).

5) Нанотехнологии для секвенирования одиночных молекул, в которых используются различные наноструктуры, например, расположенные на чипе для отслеживания движения полимеразной молекулы по одиночной цепи в процессе репликации. Неограничивающими примерами способов на основе нанотехнологии являются платформа «GridON™» от Oxford Nanopore Technologies (Oxford, UK), платформы секвенирования нано-пор с вспомогательной гибридизацией («HANS™»), разработанные Nabsys (Providence, Rhode Island), и запатентованная платформа ДНК-секвенирования на основе лигазы с использованием технологии ДНК-наношариков (DNA nanoball) (DNB), называемая комбинаторным лигированием зонд-якорь («cPAL™»).

6) Технологии секвенирования одиночных молекул на основе электронной микроскопии, например, разработанные «LightSpeed Genomics» (Sunnyvale, California) и «Halcyon Molecular» (Redwood City, California).

7) Ионное полупроводниковое секвенирование, которое основано на детекции ионов водорода, которые высвобождаются во время полимеризации ДНК. Например, «Ion Torrent Systems» (San Francisco, California) использует чип высокой плотности из микро-обработанных лунок для осуществления данного биохимического процесса массово-параллельным путем. Каждая лунка содержит ДНК-матрицу, отличную от других. Дно лунок представляет собой ионочувствительный слой, и еще ниже находится запатентованный ионный сенсор.

Предпочтительно, препараты ДНК и РНК служат исходным материалом для NGS. Такие нуклеиновые кислоты легко могут быть получены из образцов, таких как биологический материал, например, из свежих, быстрозамороженных или погруженных в парафин фиксированных формалином (англ. Formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE)) опухолевых тканей, или из с в еже выделенных клеток, или из СТС, которые присутствуют в периферической крови пациентов. Нормальная не подверженная мутациям геномная ДНК или РНК может быть выделена из нормальной соматической ткани, однако клетки зародышевой линии являются предпочтительными в контексте настоящего изобретения. Зародышевую ДНК или РНК выделяют из мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) пациентов с негематологическими злокачественными опухолями. Хотя нуклеиновые кислоты, выделенные из FFPE-тканей или из свежевыделенных одиночных клеток, высоко фрагментированы, они подходят для NGS-применений.

Несколько NGS-способов, предназначенных для секвенирования экзомов, описаны в литературе (для обзора см., например, Teer and Mullikin 2010: Human Mol Genet 19 (2), R145-51), каждый из которых может использоваться совместно с настоящим изобретением. Многие из данных способов (описанных, например, как захват генома, разделение генома, обогащение генома и т.д.) используют способы гибридизации и включают способы на основе использования чипа (например, Hodges et al. 2007: Nat. Genet. 39, 1522-1527) и способы гибридизации в растворе (например, Choi et al. 2009: Proc. Natl. Acad. Sci USA 106, 19096-19101). Коммерческие наборы для приготовления образца ДНК и последующего захвата экзома также доступны: например, Illumina Inc. (San Diego, California) предлагает «TruSeq™ DNA Sample Preparation Kit» и «Exome Enrichment Kit TruSeq™ Exome Enrichment Kit».

С целью уменьшения количества ложноположительных результатов при детекции опухолеспецифических соматических мутаций или различий в последовательности при сравнении, например, последовательности опухолевого образца с последовательностью эталонного образца, такого как последовательность образца зародышевой линии, предпочтительно определять последовательность в дубликатах одного или обоих из данных типов образцов. Таким образом, предпочтительно, что последовательность эталонного образца, такая как последовательность образца зародышевой линии, определяется два раза, три раза или более. В ином случае или дополнительно, последовательность опухолевого образца определяется два раза, три раза или более. Также возможно определение последовательности эталонного образца, такой как последовательность образца зародышевой линии и/или последовательности опухолевого образца более чем один раз посредством определения, по меньшей мере, единожды последовательности геномной ДНК и определения, по меньшей мере, единожды последовательности РНК указанного эталонного образца и/или указанного опухолевого образца. Например, путем определения вариаций между репликами эталонного образца, такого как образец зародышевой линии, может быть определена частота ложно положительных (FDR) соматических мутаций в виде статистической величины. Технические повторы образца должны давать идентичные результаты, и любая детектируемая мутация в данном сравнении «сам против себя» является ложноположительной. Конкретно, для определения частоты ложноположительных результатов для детекции соматических мутаций в опухолевом образце относительно эталонного образца, может использоваться технический повтор эталонного образца в качестве эталона для оценки количества ложноположительных результатов. Кроме того, различные связанные с качеством показатели (например, перекрывание или качество SNP) могут быть объединены в единую бальную оценку качества с использованием способа машинного обучения. Для данной соматической вариации могут быть подсчитаны все остальные вариации с превышением бальной оценки качества, что дает возможность упорядочивания всех вариаций в наборе данных.

В контексте настоящего изобретения термин «РНК» относится к молекуле, которая содержит, по меньшей мере, один рибонуклеотидный остаток и предпочтительно полностью или по существу состоит из рибонуклеотидных остатков. «Рибонуклеотид» относится к нуклеотиду, содержащему гидроксильную группу в 2'-положении β-D-рибофуранозильной группы. Термин «РНК» включает двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК, изолированную РНК, такую как частично или полностью очищенная РНК, фактически чистую РНК, синтетическую РНК и рекомбинантно полученную РНК, такую как модифицированная РНК, которая отличается от природной РНК вставкой, делецией, заменой и/или изменением одного или нескольких нуклеотидов. Такие изменения могут включать вставку не нуклеотидного материала, как например на конце(ах) РНК или внутри, например, к одному или нескольким нуклеотидам РНК. Нуклеотиды молекул РНК также могут включать нестандартные нуклеотиды, такие как синтетические нуклеотиды или химически синтезированные нуклеотиды или дезоксинуклеотиды. Такие измененные РНК могут обозначаться как аналоги или аналоги природных РНК.

Согласно настоящему изобретению термин «РНК» включает и предпочтительно относится к «мРНК». Термин «мРНК» означает «матричную РНК» и относится к «транскрипту», который генерируется с использованием ДНК-матрицы и кодирует пептид или полипептид. Как правило, мРНК включает 5'-UTR, кодирующую белок область, 3'-UTR и, необязательно, поли(А) хвост. мРНК обладает только ограниченным периодом полужизни в клетках и in vitro. В контексте настоящего изобретения мРНК может быть получена in vitro транскрипцией ДНК-матрицы. Методология in vitro транскрипции известна специалистам. Например, существует множество коммерчески доступных наборов реактивов для in vitro транскрипции.

Согласно изобретению, стабильность и эффективность трансляции РНК может, если необходимо, быть модифицирована. Например, РНК может быть стабилизирована и ее трансляция увеличивается с помощью одной или нескольких модификаций, обладающих стабилизирующим эффектом и/или повышением эффективности трансляции РНК. Такие модификации описаны, например, в РСТ/ЕР2006/009448, включенном в данный документ посредством ссылки. С целью повышения экспрессии РНК, используемой согласно настоящему изобретению, она может быть модифицирована внутри кодирующей области, т.е. последовательности, кодирующей экспрессируемый пептид или белок, предпочтительно без изменения последовательности экспрессируемого пептида или белка, так чтобы повысить GC-содержание для увеличения стабильности мРНК и для осуществления оптимизации кодонов и, таким образом, для усиления трансляции в клетках.

Термин «модификация» в контексте РНК, используемой в настоящем изобретении, включает модификацию РНК, которая в норме не присутствует в указанной РНК.

В одном варианте осуществления изобретения РНК, используемая согласно изобретению, не содержит некэпированные 5'-трифосфаты. Удаление таких некэпированных 5'-трифосфатов может быть достигнуто путем обработки РНК с помощью фосфатазы.

РНК по изобретению может иметь модифицированные рибонуклеотиды с целью повышения ее стабильности и/или уменьшения цитотоксичности. Например, в одном варианте осуществления в РНК, используемой согласно изобретению, 5-метилцитидин частично или полностью замещен, предпочтительно полностью, на цитидин. В ином случае или дополнительно, в одном варианте осуществления в РНК, используемой согласно изобретению, псевдоуридин частично или полностью замещен, предпочтительно полностью, уридином.

В одном варианте осуществления термин «модификация» относится к обеспечению РНК 5'-кэп или аналогом 5'-кэп. Термин «5'-кэп» относится к кэпирующей структуре, обнаруженной на 5'-конце молекулы мРНК, и, как правило, состоит из гуанозин-нуклеотида, связанного с мРНК посредством необычной 5'-5' трифосфатной связи. В одном варианте осуществления данный гуанозин метилирован в 7-положении. Термин «стандартный 5'-кэп» относится к природной группе РНК 5'-кэп, предпочтительно к группе кэп 7-метилгуанозина (m7G). В контексте настоящего изобретения термин «5'-кэп» включает аналог 5'-кэп, который напоминает структуру кэп РНК и который модифицирован так, что он обладает способностью стабилизировать РНК и/или усиливать трансляцию РНК при присоединении к ней, предпочтительно in vivo и/или в клетке.

Получение РНК, содержащие 5'-кэп или аналог 5'-кэп, может быть достигнуто с помощью in vitro транскрипции ДНК-матрицы в присутствии указанной 5'-кэп или аналога 5'-кэп, где указанная 5'-кэп котранскрипционно включается в образованную цепь РНК, или РНК может быть получена, например, с помощью in vitro транскрипции, а 5'-кэп может быть присоединен к РНК посттранскрипционно с использованием кэппирующих ферментов, например, кэппирующих ферментов вируса коровьей оспы.

РНК может включать дополнительные модификации. Например, дополнительная модификация РНК, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой удлинение или укорачивание природного поли(А) хвоста или изменение 5'- или 3'-нетранслируемых областей (UTR), как например, введение UTR, который не связан с кодирующей областью указанной РНК, например, вставка или замена имеющейся 3'-UTR на одну или несколько, предпочтительно две копии 3'-UTR, выделенных из гена глобина, такого как альфа2-глобин, альфа 1-глобин, бета-глобин, предпочтительно, бета-глобин, более предпочтительно, человеческий бета-глобин.

РНК, содержащая открытую поли-А последовательность, транслируется более эффективно, чем РНК, содержащая скрытую поли-А последовательность. Термин «поли(А) хвост» или «поли-А последовательность» относится к последовательности остатков аденила (А), которые, как правило, локализованы на 3'-конце молекулы РНК, и «открытая поли-А последовательность» означает, что поли-А последовательность на 3'-конце молекулы РНК, содержащая А поли-А-последовательности, за которой не следуют нуклеотиды, отличные от А, локализованные на 3'-конце, т.е. ниже поли-А-последовательности. Кроме того, длинная поли-А-последовательность с около 120 пар оснований приводит к получению оптимальной стабильности транскрипта и эффективности трансляции РНК.

Таким образом, с целью повышения стабильности и/или экспрессии РНК, используемой согласно изобретению, она может быть модифицирована так, чтобы присутствовать совместно с поли-А-последовательностью, предпочтительно, имеющей длину от 10 до 500 остатков аденозина, более предпочтительно, от 30 до 300, еще более предпочтительно от 65 до 200 и особенно от 100 до 150 остатков аденозина. В особенно предпочтительном варианте осуществления поли-А-последовательность имеет длину приблизительно 120 остатков аденозина. Для дополнительного повышения стабильности и/или экспрессии РНК, используемой согласно изобретению, поли-А-последовательность может быть открытой.

Термин «стабильность» РНК относится к «периоду полужизни» РНК. «Период полужизни» относится к периоду времени, который необходим для потери половины активности, количества или количества молекул. В контексте настоящего изобретения период полужизни РНК является показателем стабильности указанной РНК. Период полужизни РНК может влиять на «продолжительность экспрессии» РНК. Может ожидаться, что РНК, имеющая продолжительный период полужизни, будет экспрессироваться в течение длительного периода времени.

Конечно, если согласно изобретению целесообразно уменьшить стабильность и/или эффективность трансляции РНК, то возможна модификация РНК, которая воспрепятствует функции элементов, которые, как описано выше, повышают стабильность и/или эффективность трансляции РНК.

Термин «экспрессия» используется согласно изобретению в его наиболее широком значении и включает продуцирование РНК и/или пептидов или белков, например, с помощью транскрипции и/или трансляции. По отношению к РНК, термин «экспрессия» или «трансляция» относится конкретно к продуцированию пептидов или полипептидов. Также он включает частичную экспрессию нуклеиновых кислот. Кроме того, экспрессия может быть транзиторной или стабильной.

В контексте настоящего изобретения термин «транскрипция» относится к процессу, в котором генетический код последовательности ДНК транскрибируется в РНК. Затем РНК может транслироваться в белок. Согласно настоящему изобретению термин «транскрипция» включает «in vitro транскрипцию», где термин «in vitro транскрипция» относится к процессу, в котором РНК, конкретно мРНК синтезируется in vitro в бесклеточной системе, предпочтительно с использованием соответствующих клеточных экстрактов. Предпочтительно, клонирующие векторы применяются для генерирования транскриптов. Данные клонирующие векторы, как правило, спроектированы как транскрипционные векторы и согласно изобретением охвачены термином «вектор». Согласно настоящему изобретению, РНК, используемая в настоящем изобретении, предпочтительно является in vitro транскрибированной РНК (IVT-PHK) и может быть получена с помощью in vitro транскрипции соответствующей ДНК-матрицы. Промотор для контроля транскрипции может представлять собой любой промотор для любой РНК-полимеразы. Конкретные примеры РНК-полимераз представляют собой Т7, Т3, и SP6 РНК-полимеразы. Предпочтительно, in vitro транскрипция согласно изобретению контролируется Т7- или SP6-промотором. ДНК-матрица для in vitro транскрипции может быть получена путем клонирования нуклеиновой кислоты, конкретно, кДНК и путем введения в соответствующий вектор для in vitro транскрипции. кДНК может быть получена путем обратной транскрипции РНК.

Термин «трансляция» согласно изобретению относится к процессу в рибосоме клетки, с помощью которой цепь матричной РНК направляет сборку последовательности аминокислот с получением пептида или полипептида.

Последовательности контроля экспрессии или регуляторные последовательности, которые согласно изобретению могут быть функционально связаны с нуклеиновой кислотой, могут быть гомологичными или гетерологичными по отношению к нуклеиновой кислоте. Кодирующая последовательность и регуляторная последовательность связаны вместе «функционально», если они связаны вместе ковалентно, так что транскрипция или трансляция кодирующей последовательности находится под контролем или влиянием регуляторной последовательности. Если кодирующая последовательность транслируется в функциональный белок с функциональной связью регуляторной последовательности с кодирующей последовательностью, то индукция регуляторной последовательности приводит к транскрипции кодирующей последовательности, не вызывая при этом сдвига рамки считывания в кодирующей последовательности или неспособности транслироваться в целевой пептид, полипептид или белок.

Термин «последовательность, контролирующая экспрессию» или «регуляторная последовательность» включает согласно изобретению промоторы, последовательности связывания с рибосомой и другие элементы контроля, которые контролируют транскрипцию нуклеиновой кислоты или трансляцию полученной РНК. В одном варианте осуществления изобретения могут контролироваться регуляторные последовательности. Точная структура регуляторных последовательностей может варьировать в зависимости от вида или в зависимости от типа клеток, но, как правило, включает 5'-нетранслируемые и 5'- и 3'-нетранслируемые последовательности, которые вовлечены в инициирование транскрипции или трансляции, такие как ТАТА-бокс, кэппирующие последовательности, СААТ-последовательность и так далее. Конкретно, 5'-нетранслируемые регуляторные последовательности включают промоторную область, которая включает последовательность контроля транскрипции функционально связанного гена. Регуляторные последовательности также могут включать энхансерные последовательности или вышележащие активаторные последовательности.

Предпочтительно, согласно изобретению, если РНК, экспрессирующаяся в клетке, может вводиться в указанную клетку. В одном варианте осуществления способов по изобретению РНК, которую вводят в клетку, получают с помощью in vitro транскрипции соответствующей ДНК-матрицы.

Согласно изобретению, такие термины, как «РНК, способная экспрессироваться» и «кодирующая РНК» используются взаимозаменяемо в данном документе и по отношению к конкретному пептиду или полипептиду означают, что РНК, если она присутствует в соответствующей среде, предпочтительно внутри клетки, может экспрессироваться с получением указанного пептида или полипептида. Предпочтительно, РНК, которая, согласно изобретению, способна взаимодействовать с клеточным аппаратом трансляции с получением пептида или полипептида, способна экспрессироваться.

Термины такие, как «перенос», «введение» или «трансфекция» используются в данном документе взаимозаменяемо и относятся к введению нуклеиновых кислот, конкретно экзогенных или гетерологичных нуклеиновых кислот, в частности, РНК в клетку. Согласно настоящему изобретению клетка может образовывать часть органа, ткани и/или организма. Согласно настоящему изобретению введение нуклеиновой кислоты достигается как с использованием «голой» нуклеиновой кислоты, так и в комбинации с реагентом введения. Предпочтительно, введение нуклеиновых кислот происходит в форме «голых» нуклеиновых кислот. Предпочтительно, РНК вводят в комбинации со стабилизирующими веществами, такими как ингибиторы РНК-азы. Настоящее изобретение также рассматривает повторное введение нуклеиновых кислот в клетки для возможности экспрессии в течение продолжительных периодов времени.

Клетки могут трансфецироваться с помощью любых носителей, которые могут ассоциироваться с РНК, например, путем образования комплексов с РНК или образуя везикулы, в которые заключена или инкапсулирована РНК, приводя в результате к повышенной стабильности РНК по сравнению с «голой» РНК. Носители, используемые согласно изобретению, включают, например, липид-содержащие носители, такие как катионные липиды, липосомы, в частности, катионные липосомы, и мицеллы и наночастицы. Катионные липиды могут образовывать комплексы с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Согласно изобретению может использоваться любой катионный липид.

Предпочтительно, введение РНК, которая кодирует пептид или полипептид, в клетку, конкретно в клетку, присутствующую in vivo, приводит к экспрессии указанного пептида или полипептида в клетке. В конкретных вариантах осуществления предпочтительно направление нуклеиновых кислот в конкретные клетки. В таких вариантах осуществления, носитель, который применяется для введения нуклеиновой кислоты в клетку (например, ретровирус или липосома), экспонирует направляющую молекулу. Например, молекула, такая как антитело, которое специфично к поверхностному мембранному белку на клетке-мишени, или лиганд к рецептору на клетке-мишени может быть включена в носитель нуклеиновой кислоты или может быть связана с ним. В случае, когда нуклеиновая кислота вводится с помощью липосомы, белки, которые связываются с поверхностным мембранным белком, который ассоциирован с эндоцитозом, могут быть включены в липосомный состав с целью возможности направления и/или поглощения. Такие белки охватывают капсидные белки или их фрагменты, которые специфичны к конкретному типу клеток, антитела к белкам, которые интернализуются, белки, которые имеют внутриклеточную локализацию и т.д.

Термин «клетка» или «клетка-хозяин» предпочтительно представляет собой интактную клетку, т.е. с интактной мембраной, которая не высвобождала свои обычные внутриклеточные компоненты, такие как ферменты, органеллы или генетический материал. Интактная клетка предпочтительно представляет собой жизнеспособную клетку, т.е. живую клетку, способную осуществлять свои обычные метаболические функции. Предпочтительно, указанный термин относится согласно изобретению с любой клетке, которая может быть трансформирована или трансфецирована с использованием экзогенной нуклеиновой кислоты. Термин «клетка» включает согласно изобретению прокариотические клетки (например, E. coli) или эукариотические клетки (например, дендритные клетки, В-клетки, клетки СНО, клетки COS, клетки K562, клетки HEK293, клетки HELA, дрожжевые клетки, и клетки насекомых). Экзогенная нуклеиновая кислота может быть обнаружена внутри клетки (i) в свободно диспергированном состоянии, как таковом, (ii) включенной в рекомбинантный вектор, или (iii) интегрированной в геном клетки-хозяина или в митохондриальную ДНК. Особенно предпочтительны клетки млекопитающих, такие как клетки человека, мышей, хомяков, свиней, коз и приматов. Клетки могут быть выделены из большого количества типов ткани и включают первичные клетки и клеточные линии. Специфические примеры включают кератиноциты, лейкоциты периферической крови, стволовые клетки костного мозга и эмбриональные стволовые клетки. В следующих вариантах осуществления клетка представляет собой антигенпрезентирующую клетку, в частности, дендритную клетку, моноцит или макрофаг.

Клетка, которая включает молекулу нуклеиновой кислоты, предпочтительно экспрессирует пептид или полипептид, кодируемый нуклеиновой кислотой.

Термин «клональная экспансия» относится к процессу, в котором умножается количество соответствующего компонента. В контексте настоящего изобретения термин предпочтительно используется в контексте иммунологического ответа, в котором лимфоциты стимулируются антигеном, пролиферируют, и специфический лимфоцит, распознающий указанный антиген, умножается. Предпочтительно, если клональная экспансия приводит к дифференцировке лимфоцитов.

Такие термины как «снижение» или «ингибирование» относятся к способности вызывать общее уменьшение уровня, предпочтительно на 5% или более, 10% или более, 20% или более, более предпочтительно, на 50% или более, и наиболее предпочтительно на 75% или более. Термин «ингибирует» или ему подобные выражения включает полное или по существу полное ингибирование, т.е. снижение до ноля или по существу до ноля.

Термины, такие как «увеличение», «усиление», «стимулирование» или «пролонгация» предпочтительно относятся к увеличению, усилению, стимулированию или пролонгации, по меньшей мере на около 10%, предпочтительно, по меньшей мере на 20%, предпочтительно, по меньшей мере на 30%, предпочтительно, по меньшей мере на 40%, предпочтительно, по меньшей мере на 50%, предпочтительно, по меньшей мере на 80%, предпочтительно, по меньшей мере на 100%, предпочтительно, по меньшей мере на 200% и конкретно, по меньшей мере на 300%. Данные термины также могут относиться к увеличению, усилению, стимуляции или пролонгации от ноля или неизмеряемого или недетектируемого уровня до уровня более чем ноль или до уровня, который измеряется или детектируется.

Настоящее изобретение обеспечивает способы идентификации аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, являются применимыми в иммунотерапии. Аминокислотные модификации присутствуют в пептидах или полипептидах, экспрессированных в больных клетках пациента. Термин «пептид или полипептид, экспрессированный в больных клетках пациента» не обязательно означает, что экспрессия пептида или полипептида была проверена экспериментально. Скорее, данное означает, что открытая рамка считывания, кодирующая пептид или полипептид, присутствует в больных клетках пациента и, таким образом, существует вероятность того, что пептид или полипептид будет экспрессироваться в больных клетках пациента.

Аминокислотные модификации, спрогнозированные как применимые в иммунотерапиие могут быть использованы для разработки вакцины. Конкретно, вакцина может содержать пептид или полипептид, экспрессированный больной клеткой и содержащий аминокислотные модификации, предсказанные как применимые для иммунотерапии способом по настоящему изобретению, или нуклеиновую кислоту, такую как РНК, кодирующая указанный пептид или полипептид. Альтернативно или дополнительно, вакцина может содержать вакцинный пептид или полипептид, содержащий фрагмент указанного пептида или полипептида, экспрессированного больной клеткой, причем указанный фрагмент содержит аминокислотную модификацию, спрогнозированную как применимую для иммунотерапии способом по настоящему изобретению, или нуклеиновую кислоту, такую как РНК, кодирующая указанный вакцинный пептид или полипептид.

Если способы по изобретению показывают, что фрагмент пептида или полипептида, включающий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, (1) презентируется в контексте МНС молекул различных классов и/или, при презентации в контексте молекул МНС, является реактивным в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, (2) при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС является реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, и/или (3) презентируется в контексте различных молекул МНС одного класса, и/или, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, является реактивным в отношении различных Т-клеток, рестриктированных одним классом МНС, то вакцинный пептид или полипептид предпочтительно содержит, по меньшей мере, последовательность пептида или полипептида, включающую указанный фрагмент или более длинную последовательность, то есть вакцинную последовательность.

Если способы по изобретению показывают, что различные фрагменты пептида или полипептида, включающие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, (1) презентируются в контексте молекул МНС различных классов и/или, при презентации в контексте молекул МНС, являются реактивными в отношении Т-клеток, рестриктированных по различным классам МНС, и/или (2) презентируются в контексте различных молекул МНС одного класса, и/или, при презентации в контексте различных молекул МНС одного класса, являются реактивными по отношению к различным Т-клеткам, рестриктированным по одному классу МНС, то вакцинный пептид или полипептид предпочтительно содержит, по меньшей мере, последовательность пептида или полипептида, включающую указанные фрагменты, или более длинную последовательность, то есть вакцинную последовательность.

Согласно изобретению, термин «вакцина» относится к фармацевтическому препарату (фармацевтической композиции) или к продукту, который при введении индуцирует иммунный ответ, конкретно клеточный иммунный ответ, который распознает и атакует патоген или больную клетку, такую как раковая клетка. Вакцина может использоваться для предотвращения или лечения заболевания. Термин «персонализированная противоопухолевая вакцина» или «индивидуальная противоопухолевая вакцина» касается конкретного онкопациента и означает, что противоопухолевая вакцина адаптирована для нужд или особых обстоятельств индивидуального онкопациента.

В одном варианте осуществления вакцина, предоставленная согласно изобретению, может содержать пептид или полипептид, содержащий одну или более аминокислотных модификаций или один или более модифицированных пептидов, которые, согласно прогнозам, могут применяться в иммунотерапии способами по изобретению, или нуклеиновую кислоту, предпочтительно РНК, кодирующую указанный пептид или полипептид.

Противоопухолевые вакцины, обеспеченные согласно изобретению, при введении пациенту предпочтительно обеспечивают один или более Т-клеточных эпитопов, подходящих для стимулирования, инициирования и/или экспансии Т-клеток, специфичных для больных клеток пациента, таких как опухоль пациента. Т-клетки предпочтительно направлены против клеток, экспрессирующих антигены, из которых получены Т-клеточные эпитопы. Вакцины, описанные в данном документе, предпочтительно способны индуцировать или стимулировать клеточный ответ, предпочтительно цитотоксическую активность Т-клеток, против злокачественного новообразования, характеризующегося презентацией одного или нескольких опухоль-ассоциированных неоантигенов, с помощью молекул МНС класса I. Вакцина, направленная против опухолеспецифических мутаций, будет специфичной для опухоли пациента.

Вакцина, обеспеченная согласно изобретению, относится к вакцине, которая при введении пациенту предпочтительно обеспечивает один или более Т-клеточных эпитопов, например, 2 или более, 5 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более, 25 или больше, 30 или более и предпочтительно до 60, до 55, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 Т-клеточных эпитопов, включающих аминокислотные модификации или модифицированные пептиды, предсказанные как иммуногенные способами по изобретению. Такие Т-клеточные эпитопы также обозначаются в данном документе «неоэпитопами». Презентация данных эпитопов клетками пациента, в частности, антигенпрезентирующими клетками, предпочтительно приводит в результате к направленному воздействию Т-клеток на эпитопы, когда они связаны с МНС и, таким образом, на опухоль пациента, предпочтительно, первичную опухоль, а также на опухолевые метастазы, экспрессирующие антигены, из которых выделены Т-клеточные эпитопы и презентирующие одинаковые эпитопы на поверхности опухолевых клеток.

Способы по изобретению могут включать дополнительную стадию определения применимости идентифицированных аминокислотных модификаций или модифицированных пептидов для противоопухолевой вакцинации. Таким образом, дополнительные стадии могут включать одну или несколько из следующих: (i) оценку того, локализованы ли модификации в известных или прогнозируемых МНС-презентированных эпитопах, (ii) in vitro и/или in silico тестирование того, локализованы ли модификации в МНС-презентированных эпитопах, например, тестирование того, являются ли модификации частью пептидных последовательностей, которые процессируются и/или представлены в виде МНС-презентированных эпитопов, и (iii) in vitro тестирование того, способны ли рассматриваемые модифицированные эпитопы, конкретно присутствующие в виде их природной последовательности, например, будучи фланкированными аминокислотными последовательностями, которые также фланкируют указанные эпитопы в природном пептиде или полипептиде, и при экспрессии в антигенпрезентирующих клетках стимулировать Т-клетки, такие как Т-клетки пациента, обладающие нужной специфичностью. Каждая из таких фланкирующих последовательностей может включать 3 или более, 5 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более и предпочтительно до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать последовательность эпитопа с N-конца и/или с С-конца.

Модифицированные пептиды, определенные согласно изобретению, могут быть ранжированы по их применимости в качестве эпитопов для противоопухолевой вакцинации. Таким образом, в одном аспекте изобретение включает ручной или компьютерный аналитический процесс, в котором анализируются идентифицированные модифицированные пептиды и отбираются по их применимости к использованию в соответствующей вакцине, которая должна быть получена. В предпочтительном варианте осуществления указанный аналитический процесс представляет собой процесс на основе вычислительного алгоритма. Предпочтительно, указанный аналитический процесс включает определение и/или ранжирование эпитопов в соответствии с прогнозом их способности быть иммуногенными.

Неоэпитопы, идентифицированные согласно изобретению и обеспечиваемые вакциной по изобретению, предпочтительно присутствуют в форме полипептида, включающего указанные неоэпитопы, такие как полипептидный полипептид или нуклеиновая кислота, конкретно, РНК, кодирующая указанный полипептид. Кроме того, неоэпитопы могут присутствовать в полипептиде в форме вакцинной последовательности, то есть присутствовать в виде их природной последовательности, например, будучи фланкированными аминокислотными последовательностями, которые также фланкируют указанные эпитопы в природных белках. Каждая из таких фланкирующих последовательностей может включать 5 или более аминокислот, 10 или более, 15 или более, 20 или более и, предпочтительно, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот и может фланкировать эпитопные последовательности с N-конца и/или с С-конца. Таким образом, вакцинная последовательность может включать 20 или более, 25 или более, 30 или более, 35 или более, 40 или более, и предпочтительно, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот. В одном варианте осуществления неоэпитопы и/или вакцинные последовательности располагаются в полипептиде голова к хвосту.

В одном варианте осуществления неоэпитопы и/или вакцинные последовательности разделены линкерами, конкретно, нейтральными линкерами. Термин «линкер» согласно изобретению относится к пептиду, добавляемому между двумя пептидными доменами, такими как эпитопы или вакцинные последовательности для связывания указанных пептидных доменов. Нет никакого конкретного ограничения, касающегося линкерной последовательности. Однако предпочтительно, что линкерная последовательность снижает стерические затруднения между двумя пептидными доменами, хорошо транслируется и поддерживает или дает возможность процессирования эпитопов. Кроме того, линкер не должен обладать последовательностями иммуногенных элементов, или обладает ими в небольшом количестве. Линкеры, предпочтительно, не должны создавать неэндогенных неоэпитопов типа тех, которые образуются в области тесного контакта между соседними неоэпитопами, которые могут вызывать нежелательные иммунные реакции. Таким образом, полиэпитопная вакцина предпочтительно содержит линкерные последовательности, которые способны уменьшить количество нежелательных МНС-связывающих эпитопов из мест соединения. Hoyt et al. (EMBO J. 25(8), 1720-9, 2006) и Zhang et al. (J. Biol. Chem., 279(10), 8635-41, 2004) продемонстрировали, что глицин-богатые последовательности способствуют протеасомному процессированию и, таким образом, использование глицин-богатых линкерных последовательностей минимизирует количество линкер-содержащих пептидов, которые могут процессироваться протеасомой. Кроме того, согласно наблюдениям, глицин ингибирует сильное связывание со связывающими бороздками МНС. (Abastado et al., J. Immunol. 151(7), 3569-75, 1993). Schlessinger et al. (Proteins, 61(1), 115-26, 2005) обнаружили, что аминокислоты глицин и серии, включенные в аминокислотную последовательность, приводят в результате к получению более гибкого белка, который более эффективно транслируется и процессируется протеасомой, что дает лучший доступ к кодируемым неоэпитопам. Каждый из линкеров может включать 3 или более, 6 или более, 10 или более, 15 или более, 20 или более, и предпочтительно, до 50, до 45, до 40, до 35 или до 30 аминокислот. Предпочтительно, линкер обогащен аминокислотами глицином и/или серином. Предпочтительно, по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 90%, или, по меньшей мере 95% аминокислот линкера представляют собой глицин и/или серии. В одном варианте осуществления линкер по существу состоит из аминокислот глицина и/или серина. В одном варианте осуществления линкер включает аминокислотную последовательность (GGS)_a(GSS)_b(GGG)_c(SSG)_d(GSG)_e, где а, b, с, d и е независимо представляют собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, или 20 и где a+b+c+d+e отличаются от 0 и предпочтительно составляют 2 или более, 3 или более, 4 или более или 5 или более. В одном варианте осуществления линкер включает последовательность, описанную в данном документе, включающую линкерные последовательности, описанные в примерах, такие как последовательность GGSGGGGSG.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления полипептид, включающий один или более неоэпитопов, таких как полипептидный полипептид по настоящему изобретению, вводят пациенту в форме нуклеиновой кислоты, предпочтительно, РНК, такой как in vitro транскрибированная или синтетическая РНК, которая может экспрессироваться в клетках пациента, таких как антигенпрезентирующие клетки с получением полипептида. Настоящее изобретение также предусматривает введение одного или нескольких мультиэпитопных полипептидов, которые для целей настоящего изобретения включены с использованием термина «полиэпитопный полипептид», предпочтительно в форме РНК, такой как in vitro транскрибированная или синтетическая РНК, которая может экспрессироваться в клетках пациента, таких как антигенпрезентирующие клетки, с получением одного или нескольких полипептидов. В случае введения более чем одного мультиэпитопного полипептида неоэпитопы, которые представлены с помощью различных мультиэпитопных полипептидов, могут быть различными или частично перекрываться. После того как полипептид по изобретению появляется в клетках пациента, таких как антигенпрезентирующие клетки, полипептид по изобретению процессируется с получением неоэпитопов, идентифицированных согласно изобретению. Введение вакцины, обеспеченной согласно изобретению, предпочительно обеспечивает эпитопы, презентируемые с помощью молекул МНС класса I, которые способны вызывать ответ CD8+ Т-клеток против клеток, экспрессирующих антигены, из которых выделены МНС-презентиро ванные эпитопы. Введение вакцины, предоставленной согласно изобретению, может также обеспечивать эпитопы, презентируемые с помощью молекул МНС класса II, которые способны вызывать ответ CD4+ Т-клеток против клеток, экспрессирующих антигены, из которых выделены МНС-презентированные эпитопы. Кроме того, введение вакцины, обеспеченной согласно изобретению, может обеспечивать один или несколько неоэпитопов (включая известные неоэпитопы и неоэпитопы, идентифицированные по изобретению), а также один или несколько эпитопов, не содержащих опухолеспецифических соматических мутаций, но экспрессирующихся опухолевыми клетками и предпочтительно индуцирующими иммунный ответ против опухолевых клеток, предпочтительно опухолеспецифический иммунный ответ.

Вакцина, предоставленная согласно изобретению, может представлять собой рекомбинантную вакцину.

Термин «рекомбинантный» в контексте настоящего изобретения означает «сделанный с применением генетической инженерии». Предпочтительно, «рекомбинантный компонент», такой как рекомбинантный полипептид в контексте настоящего изобретения не является природным и предпочтительно является результатом объединения компонентов, таких как аминокислотные последовательности и последовательности нуклеиновой кислоты, которые не объединены в природе. Например, рекомбинантный полипептид в контексте настоящего изобретения может содержать несколько аминокислотных последовательностей, таких как неоэпитопы или вакцинные последовательности, выделенные из различных белков или различных частей одного белка, сшитые вместе, например, посредством пептидных связей или подходящих линкеров.

Термин «природный» при использовании в данном документе обозначает тот факт, что объект может быть обнаружен в естественной среде. Например, пептид или нуклеиновая кислота, которые присутствуют в организме (включая вирусы) и могут быть выделены из источника в естественной среде и которые не были специально модифицированы человеком в лаборатории, являются природными.

Средства и композиции, описанные в данном документе, могут использоваться для лечения объекта, имеющего заболевание, например, заболевание, характеризующееся присутствием больных клеток, экспрессирующих антиген и презентирующих антигенный пептид. Особенно предпочтительные заболевания включают злокачественные новообразования. Средства и композиции, описанные в данном документе, также могут использоваться для иммунизации или вакцинации для предотвращения заболевания, описанного в данном документе.

Термин «заболевание» относится к патологическому состоянию, которое влияет на организм человека. Заболевание часто понимается как медицинское состояние, связанное с конкретными симптомами и признаками. Заболевание может быть вызвано факторами, происходящими из внешнего источника, такими как инфекционные заболевания, или оно может быть вызвано внутренними дисфункциями, такими как аутоиммунные заболевания. У людей «заболевание» часто используется более широко для обозначения любого состояния, которое вызывает боль, дисфункцию, дистресс, социальные проблемы или смерть для пострадавшего человека, или аналогичные проблемы для тех, кто находится в контакте с человеком. В данном более широком смысле оно иногда включает травмы, инвалидность, расстройства, синдромы, инфекции, отдельные симптомы, отклоняющееся поведение и нетипичные изменения структуры и функции, в то время как в других контекстах и для других целей их можно считать различимыми категориями. Заболевания, как правило, поражают людей не только физически, но и эмоционально, так как заражение и жизнь со многими заболеваниями могут изменить взгляд на жизнь и личность человека.

Термин «нормальный» относится к здоровому состоянию или к состояниям здорового субъекта или ткани, то есть к непатологическим состояниям, где «здоровый» предпочтительно означает незлокачественный.

Термин «заболевание, ассоциированное с антигеном» или «заболевание, связанное с антигеном» относится к любому заболеванию, которое затрагивает антиген, например, заболеванию, которое характеризуется наличием антигена или клеток, экспрессирующих антиген. Заболевание с участием антигена может быть злокачественным заболеванием или просто раком. Как указанно выше, антиген может быть антигеном, ассоциированным с заболеванием, таким как опухолеассоциированный антиген.

«Заболевание, включающее клетки, экспрессирующие антиген» означает согласно изобретению, что детектируется экспрессия антигена в клетках больной ткани или органа. Экспрессия в клетках больной ткани или органа может повышаться по сравнению со здоровой тканью или органом. Повышение относится к повышению по меньшей мере на 10%, конкретно, по меньшей мере на 20%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 100%, по меньшей мере на 200%, по меньшей мере на 500%, по меньшей мере на 1000%, по меньшей мере на 10000% или даже более. В одном варианте осуществления экспрессия обнаружена только в больной ткани, в то время как экспрессия в здоровой ткани репрессирована. Согласно изобретению, заболевания, включающие или ассоциированные с клетками, экспрессирующими антиген, включают злокачественные новообразования.

Термины «злокачественное новообразование» или «злокачественное заболевание» относятся или описывают физиологическое состояние индивидуума, которое обычно характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры злокачественных заболеваний включают, но не ограничиваются ими, карциному, лимфому, бластому, саркому и лейкоз. Более конкретно, примеры таких злокачественных заболеваний включают рак костей, рак крови, рак легких, рак печени, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак толстой кишки, рак молочной железы, рак простаты, рак матки, рак половых и репродуктивных органов, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягких тканей, рак мочевого пузыря, рак почки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (ЦНС), нейроэктодермальный рак, опухоли позвоночника, глиому, менингиому и аденому гипофиза. Термин «злокачественное заболевание» согласно изобретению также включает опухолевые метастазы.

Согласно настоящему изобретению термин «опухоль» или «опухолевое заболевание» относится к аномальному росту клеток (называемых неопластическими клетками, туморогенными клетками или опухолевыми клетками), предпочтительно образующих опухоль или поражение. Термином «опухолевая клетка» обозначают аномальную клетку, которая растет быстрой неконтролируемой клеточной пролиферацией и продолжает расти после стимулов, которые инициировали прекращение нового роста. Опухоли демонстрируют частичную или полную потерю структурной организации и функциональной координации с нормальной тканью, и обычно образуют отдельную массу ткани, которая может быть доброкачественной, предзлокачественной или злокачественной.

Для целей настоящего изобретения термины «злокачественное заболевание» и «злокачественное новообразование» используются взаимозаменяемо с терминами «опухоль» и «опухолевая болезнь».

Под «метастазированием» понимают распространение опухолевых клеток из места своего происхождения в другую часть организма. Образование метастазов представляет собой очень сложный процесс и зависит от отделения злокачественных опухолевых клеток от первичной опухоли, инвазии через внеклеточный матрикс, проникновения через эндотелиальную базальную мембрану для входа в брюшную полость и в сосуды, и затем после осуществления транспортировки кровотоком, от инфильтрации органов-мишеней. Наконец, рост новой опухоли, т.е. вторичной опухоли или метастатической опухоли в месте-мишени зависит от ангиогенеза. Метастазирование опухоли часто происходит даже после удаления первичной опухоли, так как опухолевые клетки или компоненты могут оставаться и развивать метастатический потенциал. В одном варианте осуществления термин «метастазирование» согласно изобретению относится к «отдаленному метастазированию», которое относится к метастазированию, которое отдалено от первичной опухоли и региональной системы лимфатических узлов.

Клетки вторичной метастатической опухоли имеют сходство с клетками исходной опухоли. Это означает, что если рак яичника метастазирует в печень, то вторичная опухоль будет состоять из аномальных клеток яичника, а не из аномальных клеток печени. Следовательно, опухоль в печени называют метастазирующим раком яичников, а не раком печени.

Термин «циркулирующие опухолевые клетки» или «СТС» относится к которые открепляются от первичной опухоли или от опухолевых метастазов и циркулируют в кровотоке. СТС могут составлять посевной материал для последующего роста дополнительных опухолей (метастаз) в различных тканях. Циркулирующие опухолевые клетки обнаруживаются с частотой порядка 1-10 СТС на 1 мл цельной крови пациентов с метастазирующим заболеванием. Для выделения СТС были разработаны исследовательские методы. В данной области техники описано несколько исследовательских методов для выделения СТС, например, способы, которые используют тот факт, что эпителиальные клетки обычно экспрессируют белок клеточной адгезии ЕрСАМ, который отсутствует в нормальных клетках крови. Захват на основе иммуномагнитных микросфер включает в себя обработку образцов крови с помощью антитела к ЕрСАМ, которое конъюгировано с магнитными частицами, с последующим разделением связанных клеток в магнитном поле. Выделенные клетки затем окрашивают с антителом к другому эпителиальному маркеру, цитокератину, а также к обычному лейкоцитарному маркеру CD45, так чтобы отличить редкие СТС от контаминирующих лейкоцитов. Такой трудоемкий и полуавтоматизированный способ идентифицирует СТС со средним выходом приблизительно 1 СТС/мл и чистотой 0,1% (Allard et al., 2004: Clin Cancer Res 10, 6897-6904). Второй метод выделения СТС использует микрофлюидное устройство захвата СТС, которое включает течение цельной крови через камеру с 80000 встроенных микростолбиков, которые становятся функциональными из-за покрытия антителом к ЕрСАМ. Затем СТС окрашивают вторичными антителами либо против цитокератина, либо против тканеспецифичных маркеров, таких как PSA при раке предстательной железы или HER2 при раке молочной железы, и визуализируют с помощью автоматизированного сканирования микростолбиков на множестве панелей вдоль трехмерных координат. СТС-чипы способны идентифицировать цитокератин-положительные циркулирующие опухолевые клетки у пациентов со средним выходом 50 клеток/мл и чистотой в интервале от 1 до 80% (Nagrath et al., 2007: Nature 450, 1235-1239). Другая возможность выделения СТС представляет собой использование теста «CellSearch™Circulating Tumor Cell» (СТС) от «Veridex, LLC» (Raritan, NJ), который захватывает, идентифицирует и считает СТС в пробирке крови. Система «CellSearch™» представляет собой методологию, одобренную Управлением по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами США (PDA), для подсчета СТС в цельной крови, который основан на комбинировании иммуномагнитного мечения и автоматизированной цифровой микроскопии. Существуют другие способы для выделения СТС, описанные в научной литературе, каждый из которых может использоваться совместно с настоящим изобретением.

Возврат или рецидив происходит, когда человек снова подвергается воздействию состояния, которому он подвергался в прошлом. Например, если пациент страдал от опухолевого заболевания, получил успешное лечение указанного заболевания, и у него снова развилось указанное заболевание, то данное указанное вновь развившееся заболевание может рассматриваться как возврат или рецидив. Однако, согласно изобретению, возврат или рецидив опухолевого заболевания необязательно может происходить в месте исходного опухолевого заболевания. Таким образом, например, если пациент страдал от опухоли яичников и получил успешное лечение, то возврат или рецидив может представлять собой появление опухоли в месте, отличном от яичников. Возврат или рецидив опухоли также включает ситуации, где опухоль появляется в месте, отличном от места исходной опухоли, а также в месте исходной опухоли. Предпочтительно, исходная опухоль, для которой пациент получил лечение, представляет собой первичную опухоль, а опухоль в месте, отличном от места исходной опухоли, представляет собой вторичную или метастатическую опухоль.

Термин «иммунотерапия» относится к лечению заболевания или состояния путем индуцирования, усиления или подавления иммунного ответа. Иммунотерапия, предназначенная для выявления или усиления иммунного ответа, классифицируется как активационная иммунотерапия, тогда как иммунотерапия, которая уменьшает или подавляет иммунный ответ, классифицируется как супрессивная иммунотерапия. Термин «иммунотерапия» включает иммунизацию антигеном или вакцинацию антигеном, или иммунизацию опухоли или вакцинацию опухоли. Термин «иммунотерапия» также относится к манипулированию иммунными реакциями, так что неадекватные иммунные реакции модулируются в более подходящие с помощью аутоиммунных заболеваний, таких как ревматический артрит, аллергия, диабет или рассеянный склероз.

Термины «иммунизация» или «вакцинация» описывают процесс введения антигена индивидууму с целью индукции иммунного ответа, например, по терапевтическим или профилактическим причинам.

Термин «терапевтическое лечение» или просто «лечение» относится к любому лечению, которое улучшает состояние здоровья и/или продлевает (увеличивает) продолжительность жизни индивидуума. Указанное лечение может устранить заболевание у индивидуума, остановить или замедлить развитие заболевания у индивидуума, ингибировать или замедлить развитие заболевания у индивидуума, уменьшить частоту или тяжесть симптомов у индивидуума и/или уменьшить рецидив у человека, который в настоящее время имеет или ранее имел заболевание.

Термин «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» относится к любому лечению, которое предназначено для предотвращения возникновения заболевания у индивидуума. Термины «профилактическое лечение» или «превентивное лечение» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Термины «защищает», «предотвращает», «профилактический», «превентивный» или «защитный» относятся к предотвращению и/или лечению возникновения и/или распространения заболевания, например опухоли, у индивидуума. Например, профилактическое введение иммунотерапии, например, путем введения в композицию, описанную в данном документе, может защитить индивидуума от развития опухоли. Например, терапевтическое введение иммунотерапии, например, композиции по изобретению, может остановить развитие болезни, например, приводить к ингибированию прогресса/роста опухоли. Ингибирование включает замедление прогресса/роста опухоли, в частности, нарушение прогрессии опухоли, которое предпочтительно приводит к устранению опухоли. Терапевтическое введение иммунотерапии может защитить индивидуума, например, от распространения или метастазирования существующих опухолей.

Термин «индивидуум» или «субъект» относится к позвоночным животным, в особенности, к млекопитающим. Например, млекопитающие в контексте настоящего изобретения представляют собой людей, приматов, отличных от человека, домашних животных, таких как собаки, кошки, овцы, крупный рогатый скот, козы, свиньи, лошади и т.д., лабораторных животных, таких как мыши, крысы, кролики, морские свинки и т.д., а также животных в неволе, таких как животные зоопарков. Термин «субъект» также относится к позвоночным животным, не относящимся к млекопитающим, таким как птицы (в частности, одомашненные птицы, такие как курица, утки, гуси, индейки) и к рыбе (в частности, выращиваемой на ферме рыбе, например лососе или соме). Термин «животное» при использовании в данном документе включает людей. Предпочтительно термин «пациент» относится к больному человеку.

Средства, описанные в данном документе, могут быть введены в форме любой подходящей фармацевтической композиции. Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, содержащему терапевтически эффективное средство или его соль, предпочтительно вместе с фармацевтическими наполнителями, такими как буферы, консерванты и модификаторы тоничности. Указанная фармацевтическая композиция применима для лечения, предотвращения или уменьшения тяжести заболевания или расстройства путем введения указанной фармацевтической композиции индивидууму. Фармацевтическая композиция также известна в данной области техники как фармацевтический препарат. Фармацевтическую композицию можно вводить локально или системно.

Термин «системное введение» относится к введению терапевтически эффективного средства, так что средство широко распространяется в организме человека в значительных количествах и развивает биологический эффект. Согласно настоящему изобретению предпочтительно, чтобы введение осуществлялось парентеральным введением.

Термин «парентеральное введение» относится к введению терапевтически эффективного средства, таким образом, что средство не проходит через кишечник. Термин «парентеральное введение» включает внутривенное введение, подкожное введение, внутрикожное введение или внутриартериальное введение, но не ограничивается ими.

В одном особенно предпочтительном варианте осуществления композицию согласно настоящему изобретению вводят в мышечную ткань, такую как скелетные мышцы. Таким образом, внутримышечное введение, такое как внутримышечная инъекция, является предпочтительным путем введения.

Введение может быть достигнуто различными способами. В одном варианте осуществления композицию согласно настоящему изобретению вводят путем инъекции. В предпочтительном варианте осуществления инъекция осуществляется через иглу. В качестве альтернативы можно использовать безыгольную инъекцию.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать по меньшей мере один адъювант. Термин «адъювант» относится к соединениям, которые при введении совместно с антигеном или антигенным пептидом индивидууму удлиняют или усиливают или ускоряют иммунный ответ. Предполагается, что адъюванты проявляют свою биологическую активность согласно одному или нескольким механизмам, включая увеличение поверхности антигена, продление удержания антигена в организме, замедление высвобождения антигена, нацеливание антигена на макрофаги, увеличение поглощения антигена, усиление процессирования антигена, стимуляцию высвобождения цитокинов, стимуляцию и активацию иммунных клеток, таких как В-клетки, макрофаги, дендритные клетки, Т-клетки и неспецифическую активацию иммунных клеток. Адъюванты включают гетерологичную группу соединений, таких как масляные эмульсии (например, адъюванты Фрейнда), минеральные соединения (такие как квасцы), бактериальные продукты (такие как токсин Bordetella pertussis) или иммуностимулирующие комплексы. Примеры адъювантов включают сапонины, неполные адъюванты Фрейнда, полные адъюванты Фрейнда, токоферол или квасцы, но не ограничиваются ими.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению обычно применяется в «фармацевтически эффективном количестве» и в «фармацевтически приемлемом препарате».

Термин «фармацевтически эффективное количество» относится к количеству, которое достигает желаемой реакции или желаемого эффекта отдельно или вместе с дополнительными дозами. В случае лечения конкретного заболевания желаемая реакция предпочтительно относится к ингибированию течения заболевания. Ингибирование включает в себя замедление прогресса заболевания и, в частности, прекращение или реверсию прогресса заболевания. Желаемой реакцией при лечении заболевания также может быть задержка начала или предотвращение начала указанного заболевания или указанного состояния. Эффективное количество композиций, описанных в данном документе, будет зависеть от состояния, подлежащего лечению, серьезности заболевания, индивидуальных параметров пациента, включая возраст, физиологическое состояние, размер и массу, продолжительность лечения, тип сопровождающейся терапии (если имеется), конкретный путь введения и подобные факторы. Соответственно, дозы, вводимые композициями, описанными в данном документе, могут зависеть от множества таких параметров. В случае, когда реакция пациента недостаточна при исходной дозе, могут использоваться более высокие дозы (или эффективно более высокие дозы, полученные с помощью другого более точно локализованного пути введения).

Термин «фармацевтически приемлемый» относится к нетоксичности материала, который не взаимодействует с действием активного компонента фармацевтической композиции.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут содержать соли, буферы, консерванты, носители и, необязательно, другие терапевтические средства. Предпочтительно, фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей и/или наполнителей.

Термин «наполнитель» предназначен для обозначения всех веществ в фармацевтической композиции, которые не являются активными ингредиентами, таких как связующие вещества, смазывающие вещества, загустители, поверхностно-активные вещества, консерванты, эмульгаторы, буферы, ароматизаторы или красители.

Термин «разбавитель» относится к разбавителю и/или разжижающему средству. Более того, термин «разбавитель» включает любую одну или более жидких или твердых суспензий и/или смесительных сред.

Термин «носитель» относится к одному или нескольким совместимым твердым или жидким наполнителям или разбавителям, которые подходят для введения человеку. Термин «носитель» относится к природному или синтетическому органическому или неорганическому компоненту, который объединяют с активным компонентом, чтобы облегчить нанесение активного компонента. Предпочтительно, компоненты носителя представляют собой стерильные жидкости, такие как вода или масла, включая те, которые получены из минерального масла, животных или растений, такие как арахисовое масло, масло соевых бобов, кунжутное масло, подсолнечное масло и т.д. Солевые растворы и водная декстроза и растворы глицерина могут быть использованы в качестве водных соединений-носителей.

Фармацевтически приемлемые носители или разбавители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R Gennaro edit. 1985). Примеры подходящих носителей включают, например, карбонат магния, стеарат магния, тальк, сахар, лактозу, пектин, декстрин, крахмал, желатин, трагакант, метилцеллюлозу, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, легкоплавкий воск, масло какао и тому подобное. Примеры подходящих разбавителей включают этанол, глицерин и воду.

Фармацевтические носители, наполнители или разбавители могут быть выбраны с учетом предполагаемого пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут включать в качестве или в дополнение к носителю(-ям), эксципиенту(-ам) или разбавителю(-ям) любое подходящее связующее(ие), смазывающее вещество(а), суспендирующее(ие) средство(а), покрывающее средство(а) и/или солюбилизирующее средство(а). Примеры подходящих связующих включают крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза, безводная лактоза, сыпучая лактоза, бета-лактоза, кукурузные подсластители, натуральные и синтетические смолы, такие как смола акации, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлозу и полиэтиленгликоль. Примеры подходящих смазывающих веществ включают олеат натрия, стеарат натрия, стеарат магния, бензоат натрия, ацетат натрия, хлорид натрия и тому подобное. Консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы могут быть включены в фармацевтическую композицию. Примеры консервантов включают бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Антиоксиданты и суспендирующие средства также могут быть использованы.

В одном варианте осуществления композиция представляет собой водную композицию. Водная композиция может необязательно содержать растворенные вещества, например соли. В одном варианте осуществления композиция находится в форме лиофилизированной композиции. Лиофилизированная композиция может быть получена лиофилизацией соответствующей водной композиции.

Средства и композиции, предоставленные в данном документе, могут использоваться индивидуально или совместно с другими терапевтическими схемами, такими как хирургическая операция, облучение, химиотерапия и/или трансплантация костного мозга (аутологичная, сингенная, аллогенная или чужеродная).

Настоящее изобретение подробно описано и иллюстрируется фигурами и примерами, которые используются только в целях иллюстрации и не предназначены для ограничения. Благодаря описанию и примерам, дополнительные варианты осуществления, которые также включены в изобретение, доступны для квалифицированного специалиста.

ФИГУРЫ

Фигура 1. Типичные случаи индукции чистого CD4⁺ или двойного CD4^+/CD8⁺ Т-клеточного ответа против неоэпитопа. а, Обогащенные пред- и поствакцинальные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры пациента Р19, стимулированные пентатопными РНК пациента, считывали в сравнении с аутологичными DC, нагруженными OLP, охватывающими мутированный неоэпитоп в белке ST5 (супрессор онкогенности 5). b-с, Обогащенные пред- и поствакцинальные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры пациента Р19, стимулированные пациент-специфичной пентатопной РНК, считывали в IFNγ-ELISpot в сравнении с аутологичными DC, нагруженными OLP, охватывающими мутированный неоэпитоп в белке UTP6 (small subunit processome component), с, CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры подвергались контролю качества после стимуляции на чистоту способом проточной цитометрии.

Фигура 2. Специфичность NARFL-E62K-специфичных TCR, клонированных из CD8⁺ Т-клеток пациента Р01. CD8⁺ Т-клетки, трансфицированные TCR #1, #5, #7 или #9, направленными против мутации в белке NARFL (Nuclear Prelamin A Recognition Factor Like), тестировали с помощью IFNg-ELISpot для распознавания клеток K562, трансфицированных HLA-A*3101 и импульсно обработанных отдельными 15-мерными пептидами, включающими либо мутированную последовательность, либо последовательность дикого типа.

Фигура 3. Контроль заболевания у пациентов с меланомой с высоким риском рецидива при вакцинации РНК-неоэпитопом. а, РНК, кодирующие TCR-α/β-цепи TCR#8, клонированные из одиночных TIL, трансфицировали в CD8⁺ Т-клетки, полученные от здоровых доноров, и тестировали на клетках К562, экспрессирующих две из молекул HLA класса I пациента, импульсно обработанных RETSAT-P546S OLP. b, Изображение лежащей в основе презентации неоэпитопа на двух HLA-аллелях. Мутация подчеркнута (см. также фигуру 4)

Фигура 4. Индукция CD8⁺ Т-клеточных ответов против двух различных HLA-рестриктированных Т-клеточных эпитопов, генерируемых одной и той же мутацией, а, Тестирование IFN-γELISpot-анализом поствакцинальных CD8⁺ Т-клеток пациента Р17 на аутологичных DC, нагруженных отдельными P17-RETSAT-P546S OLP. b. Детекция мультимерным окрашиванием CD8⁺ Т-клеток, распознающих HSCVMASLR, HLA А*6801-рестриктированный минимальный эпитоп с наилучшим прогнозом, в P17-RETSAT-P546 (кодируется OLP 3 и 4) в поствакцинальных клетках TIL от пациента Р17. с) Специфичность двух HLA В*3701-рестриктированных RETSAT-P546S-TCR, полученных из клеток TIL пациента Р17, распознающих OLP 1 и 2.

Фигура 5: Предсуществующие иммунные ответы против неоэпитопов, опосредованные как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клетками.

А, Обогащенные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры пациента Р01 стимулировали пулом OLP и считывали в IFNγ-ELISpot в сравнении с аутологичными DC, нагруженными пулом OLP, охватывающих мишень 001_107. Мишень 001_107 не была вакцинирована. В, CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры (IVS) подвергались контролю качества после стимуляции на чистоту способом проточной цитометрии. С, Обогащенные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры пациента Р06 стимулировали пулом OLP и считывали в IFNγ-ELISpot в сравнении с аутологичными DC, нагруженными пулом OLP, охватывающих мишень 006_003. Мишень 006_003 не была вакцинирована. D, CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеточные культуры подвергались контролю качества после стимуляции на чистоту способом проточной цитометрии.

ПРИМЕРЫ

Способы и способы, используемые в данном документе, описаны в данном документе или выполнены известным способом и, как описано, например, в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Все способы, включая использование наборов и реагентов, выполняются в соответствии с информацией производителей, если не указано иное.

Пример 1. Материалы и способы.

Дизайн исследования

Основными целями данного многоцентрового исследования I фазы (NCT02035956) было оценить безопасность вакцины и антигенспецифических иммунных ответов, вызванных вакциной.

Исследование проводилось в соответствии с Хельсинкской декларацией и Руководством по надлежащей клинической практике, и с одобрением институциональной контрольной комиссии или независимого этического комитета каждого участвующего места и компетентных регулирующих органов. Все пациенты дали письменное информированное согласие.

Приемлемые пациенты были ≥18 лет, имели стадию IIIA-С или IV злокачественной меланомы (классификация меланомы AJCC 2009) с полной ремиссией, частичной ремиссией или стабильным заболеванием на любой стадии лечения. Пациенты с метастазами имели право принять участие, если они могли лечиться с активным соединением до доступности их индивидуальной вакцины. Пациенты должны были иметь адекватные гематологическую функцию и функцию задействованного органа. Ключевыми критериями исключения были клинически значимые аутоиммунные заболевания, ВИЧ, HBV, HCV и острые инфекции EBV или CMV и метастазы в мозг. Регулярное лечение составляло восемь инъекций в течение 43 дней; продолжение лечения было оставлено на усмотрение исследователей. РНК-пентатопы разводили в 1,0 мг/мл раствора Рингера (Rotexmedica или BAG Healthcare) и вводили в отдельные паховые лимфатические узлы. 10 пациентам вводили по 500 мкг и трем пациентам вводили по 1000 мкг на курс лечения, чтобы исследовать два различных диапазона доз.

Ключевые оценки исследования

Лейкаферезы для тестирования иммуногенности выполняли до первой (посещение врача 12, обозначаемое «до вакцинации») и после 8-й инъекции вакцины (посещение врача 20; обозначаемое «после вакцинации»).

Визуализацию грудной клетки, живота, головного мозга с помощью компьютерной томографии (СТ) и МРТ проводили в начале исследования (посещение врача 1), до вакцинации (посещение врача 12), на 90-й день (посещение врача 21) и в конце продолжения лечения (посещение врача 26) в соответствии с руководящими принципами локальной визуализации и RECIST версии 1.1 и руководящими принципами иммунозависимых критериев ответа на иммунотерапию (irRC) (Wolchok, J.D. et al. Clin. Cancer Res. 15, 7412-20 (2009)). Безопасность характеризовали в соответствии с СТСАЕ v4.03 от класса 1 до класса 5.

Представленные в данном документе данные основаны на предварительном промежуточном анализе с датой отсечения данных в ноябре 2016 года.

Материал пациента

Фиксированная формалином и погруженная в парафин (англ. Formalin-fixed and paraffin-embedded (FFPE)) или свежезамороженная опухолевая ткань была получена при обычных диагностических резекциях, и содержание опухоли оценивалось в срезах, окрашенных Н&Е.

Свежие образцы опухолей использовали для приготовления опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TIL) и линий первичных опухолевых клеток.

TIL выращивали из небольших кусочков свежей опухолевой ткани, культивируемой в среде X-Vivo 15 (Lonza) с 2% человеческого сывороточного альбумина (CSL-Behring) и 6000 ед/мл IL-2 (Proleukin S, Novartis) в течение двух недель, как опубликовано ранее (Dudley, ME, Wunderlich, JR, Shelton, ТЕ, Even, J. & Rosenberg, SAJ Immunother. 26, 332-42). После этого TIL экспандировали в течение двух недель, используя облученные аллогенные РВМС в качестве питающих клеток в присутствии 30 нг/мл анти-СО3 IgG2a (клон OKT3, eBiosciences) и 300 Ед/мл IL-2 (Proleukin S, Novartis).

Для получения клеточных линий меланомы, полученных от пациента, свежие фрагменты опухолевой ткани культивировали в среде RPMI1640 (Life Technologies) с добавлением 15% FCS (Biochrome AG).

РВМС, полученные для иммунного мониторинга или в качестве исходного материала для производственного процесса, выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) из лейкоцитных слоев здоровых доноров или из образцов периферической крови пациентов с меланомой. Незрелые DC (DC) генерировали, как описано ранее (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)).

Секвенирование следующего поколения

ДНК экстрагировали из трех с толщиной 10 мкм секций FFPE опухолевой ткани в трех повторах с использованием модифицированной версии набора «QIAamp DNA FFPE Tissue kit» от Qiagen. Экстракцию РНК из секций FFPE-образцов опухолевой ткани выполняли в двух повторах с использованием «RNeasy FFPE kit» от Qiagen. Для экстрации ДНК и РНК из свежезамороженных образцов опухолей или клеток были использованы наборы «DNeasy Blood and Tissue kit» и «RNeasy Mini Kit» от Qiagen, соответственно.

Экстрагированные нуклеиновые кислоты были использованы для создания различных библиотек. Библиотеки для РНК-секвенирования были подготовлены в двух повторах из РНК, полученной из FFPE-образцов опухолей или клеточных линий с использованием набора «TruSeq RNA Sample Prep kit V2» от Illumina и при введении 1 мкг общей РНК. ДНК-библиотеки на основе захвата экзома конструировались в двух повторах с использованием от 1 до 3 мкг FFPE-опухолевой ДНК и соответствующей РВМС ДНК с использованием «SureSelect XT V4 Human All Exon» от Agilent.

Библиотеки NGS для секвенирования целого генома (whole genome sequencing (WGS)) MZ-GaBa-018 и соответствующих РВМС готовили путем фрагментации 100 нг геномной ДНК в общем объеме 15 мкл с использованием micro TUBE-15 (Covaris Ltd) до средней длины фрагмента приблизительно в 160 пар нуклеотидов. Библиотека была подготовлена с NEB's NEBNext^® Ultra^™ DNA Library Prep Kit для Illumina^® при введении 25 нг фрагментированной гДНК.

Для секвенирования следующего поколения (NGS) библиотеки разводили до 2 нМ или 10 нМ и кластеризовали при 10 пМ, используя набор «Illumina TruSeq РЕ Cluster v3-cBot-HS». Каждую библиотеку на основе захвата экзома секвенировали отдельно в одной дорожке, в то время как повторы РНК-библиотеки секвенировали как дуплексы в одной дорожке. Все библиотеки секвенировали со спаренными концами в 50 пар нуклеотидов на платформе Illumina HiSeq 2500 с использованием двух наборов «TruSeq SBS Kit v3-HS 50 cycles» от Illumina. Клеточная линия MZ-ГАМК-018 и соответствующие библиотеки РВМС WGS распределяли по 4 дорожкам каждая и секвенировали со спаренными концами в 100 пар нуклеотидов на той же платформе, используя набор «TruSeq SBS Kit v3-HS 200 cycles» от Illumina.

Биоинформатика и обнаружение мутаций

Все стадии анализа данных, связанных с мутаномами, для одного пациента координировались программным конвейером, реализованным на языке программирования Python. Для библиотек ДНК требовалось минимум 150×10⁶ ридов со спаренными концами в 50 пар нуклеотидов, и для библиотек РНК требовалось минимум 75×10⁶ ридов со спаренными концами в 50 пар нуклеотидов.

Для выявления мутаций риды ДНК выравнивали по референсному геному hg19 с помощью программного обеспечения Burrows-Wheeler Aligner (BWA) (Li, H. & Durbin, R. Bioinformatics 25, 1754-1760 (2009)). Полученные в двух повторах опухолевые экзомы и соответствующие нормальные образцы были проанализированы на однонуклеотидные вариации. Локусы с предполагаемыми гомозиготными генотипами в нормальных образцах идентифицировали и отфильтровывали для сохранения высоко достоверных коллов для однонуклеотидных вариаций. Оставшиеся сайты дополнительно проверяли на наличие возможного гомозиготного или гетерозиготного мутационного события. Подозрительные сайты отфильтровывали для удаления потенциальных ложноположительных. Повторы включали путем тестирования как суммы повторов, так и повторов отдельно. Окончательный список однонуклеотидных вариаций состоял из гомозиготных сайтов с высокой достоверностью в нормальных образцах и гетерозиготных или гомозиготных мутационных событий с высокой достоверностью в опухолевых образцах. Геномные координаты идентифицированных вариаций сравнивали с координатами известных из базы данных Университета Калифорнии в Санта-Крузе (UCSC, University of California Santa Cruz) с тем, чтобы связать вариации с генами, транскриптами, потенциальными изменениями аминокислотной последовательности и значениями экспрессии, полученными при РНК-секвенировании.

В случае РНК-секвенирования риды РНК сопоставляли с референсными геномом и транскриптомом hg19 с помощью программного обеспечения «Bowtie» (Langmead В., Trapnell С., Pop, М. & Salzberg, SL Genome Biol. 10, R25 (2009)) и экспрессию гена определяли путем сравнения с координатами известных из базы данных UCSC транскриптов генов и координатами экзонов с последующей нормализацией на количество прочтений на килобазу на картированные риды (reads per kilobase per million mapped reads, RPKM) (Mortazavi, A. et al. Nat. Methods 5, 1-8 (2008)).

Приоритезация и отбор неоэпитопов

Из идентифицированных однонуклеотидных вариаций, до 46 предсказываемых вариаций были отобраны с помощью эволюционной процедуры: а) Удаление несмысловых вариаций и фильтрация по ненулевой экспрессии экзонов и транскриптов; с последующей сортировкой сначала по экспрессии экзонов, а затем по оценке прогнозирования связывания HLA класса I с использованием алгоритма стабильной сортировки и селекции до 46 вариантов (Р01-Р04). b) Удаление несмысловых вариаций и фильтрация по ненулевой экспрессии экзонов и транскриптов и ненулевой частоте вариаций в данных РНК-секвенирования; с последующей сортировкой сначала по экспрессии экзонов, а затем по оценке прогнозирования связывания HLA класса I с использованием алгоритма стабильной сортировки и отбора до 23 целевых пептидных последовательностей; с последующей сортировкой оставшихся целевых пептидных последовательностей сначала по оценке прогнозирования связывания HLA класса I, а затем путем экспрессии экзонов с использованием алгоритма стабильной сортировки и селекции до 23 дополнительных целевых пептидных последовательностей; обе стадии отбора не позволили получить более 46 выбранных вариаций (Р05-Р07, Р09-Р12) и с) Удаление несмысловых вариаций и фильтрация по ненулевой экспрессии экзонов и транскриптов и ненулевой частоте вариаций в данных РНК-секвенирования; с последующей сортировкой сначала по экспрессии экзонов, а затем по оценке прогнозирования связывания HLA класса II с использованием алгоритма стабильной сортировки и отбора до 20 целевых пептидных последовательностей с экспрессией гена ≥10 RPKM; с последующей сортировкой оставшихся целевых пептидных последовательностей сначала по экспрессии, а затем по оценке прогнозирования связывания HLA класса I с использованием алгоритма стабильной сортировки и селекции до 20 дополнительных целевых пептидных последовательностей; с последующей сортировкой оставшихся целевых пептидных последовательностей сначала по оценке прогнозирования связывания HLA класса I, а затем по экспрессии экзонов с использованием алгоритма стабильной сортировки и заполнения до 46 выбранных вариантов (Р17, Р19). Для окончательного отбора до десяти мутантных целевых пептидов на пациента требовалось решение комиссии по отбору мишеней, которая оценивала пептиды-мишени на основе прогнозирований связывания молекул МНС I и МНС II, экспрессии генов и частоты вариантных аллелей.

Аффинность связывания HLA была предсказана в рекомендованном Immune Epitope Database (IEDB) для Т-клеток режиме использования инструментов прогнозирования IEDB (Kim, Y. et al. Nucleic Acids Res. 40, W525-30 (2012)) (версии 2.5) с использованием 8-11-меров, содержащих все вариации, для HLA-A/B или 15-меров для оценок связывания HLA-DRB/DQB. Из всех спрогнозированных для одной вариации лучшая консенсусная оценка была связана с соответствующими вариациями.

На основании полученных данных был выбран короткий список однонуклеотидных вариаций для подтверждения с помощью секвенирования по Сэнгеру.

Подтверждающее секвенирование по Сэнгеру

Для конструирования праймеров геномные последовательности, фланкирующие сайты мутаций, извлекали из эталонного генома и использовали в качестве входных данных для программного обеспечения primer3 (Untergasser, A. et al. Nucleic Acids Res. 40, e115 (2012); Koressaar, T. & Remm, M. Bioinformatics 23, 1289-91 (2007)). Пары выходных праймеров выравнивали с эталонным геномом с использованием программы Blast (Kent, W.J. Genome Res. 12, 656-64 (2002)). Пары праймеров с выравниванием по локусам вне мишени удаляли, а оставшуюся оптимальную пару праймеров возвращали для каждого входного сайта.

Секвенирование по Сэнгеру проводили путем амплификации каждого выбранного мутированного локуса из опухолевой ткани и ДНК РВМС с помощью ПЦР (15 минут при 95°С для начальной активации, затем 35 циклов по 30 с при 94°С для денатурации, 30 с при 60°С для отжига, 30 с при 72°С для удлинения и 6 мин при 72°С для окончательного удлинения). Каждый продукт ПЦР подвергали контролю качества с использованием устройства QIAxcel (Qiagen) и очищали с помощью ExoI/AP treatment или MinElute PCR Purification Kit (Qiagen®). Секвенирование по Сэнгеру было выполнено с помощью Eurofins/MWG Ebersberg, Germany.

Изготовление in vitro транскрибированной РНК

Изготовление производили в соответствии с правилами GMP (надлежащей производственной практики). Фрагменты синтетической ДНК, кодирующие пять предполагаемых неоэпитопов, клонировали в исходный вектор, содержащий sec- и MITD-домены (Kreiter, S. et al. J. Immunol. 180, 309-318 (2008)) для оптимизированной доставки к путям HLA класса I и II и элементы каркасной последовательности для улучшения стабильности РНК и эффективности трансляции (Holtkamp, S. et al. Blood 108, 4009-17 (2006)). ДНК линеаризовали, спектрофотометрически количественно, и подвергали in vitro транскрипции с Т7 РНК-полимеразой, как описано ранее (Grudzien-Nogalska, Е. et al. Methods Mol. Biol. 969, 55-72 (2013)), в присутствии 7,5 мМ ATP, СТР, UTP, GTP и 3 мМ кэп-аналога бета-S-ACA (D1) (Kuhn, AN et al. Gene Ther. 17, 961-971 (2010)) в условиях чистого помещения. РНК очищали с использованием магнитных частиц (Berensmeier, S. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73, 495-504 (2006)), и целостность оценивали гель-электрофорезом и микрофлюидным капиллярным электрофорезом (Experion, Biorad). Дополнительные анализы включали определение концентрации, внешнего вида, рН, осмоляльности, активности, уровня эндотоксинов и стерильности.

In vitro стимуляция РВМС

CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки выделяли из криоконсервированных РВМС с использованием микрошариков (Miltenyi Biotec). РВМС, истощенные по CD4 или CD8, оставляли на ночь. РВМС, истощенные по CD4 или CD8, подвергали электропорации с РНК, кодирующей специфические для пациента мутированные мишени, eGFP, последовательности Influenza matrix protein 1 (M1) или Tetanus p2/p16 (положительный контроль), оставляли на 3 часа при 37°С и облучали при 15 Gy. CD4^+/CD8⁺ Т-клетки и электропорированные и облученные антигенпрезентирующие клетки затем объединяли при соотношении эффектора и мишени 2:1. Через один день добавляли свежую культуральную среду, содержащую десять ед/мл IL-2 (Proleukin S, Novartis) и пять нг/мл IL-15 (Peprotech). IL-2 пополняли через семь дней после создания культур. После 11 дней стимуляции клетки анализировали с помощью проточной цитометрии и использовали в анализах ELISpot.

ELISpot

Многоэкранные фильтровальные планшеты (Merck Millipore), предварительно покрытые антителами, специфическими к IFNγ (Mabtech), промывали PBS и блокировали Х-Vivo 15 (Lonza), содержащей 2% человеческий сывороточный альбумин (CSL-Behring) в течение 1-5 часов. 0,5-3×10⁵ эффекторных клеток/лунку стимулировали в течение 16-20 ч (40 ч для TIL) аутологичными DC, электропорированными с РНК или нагруженными пептидами, клеточными линиями меланомы, или трансфицированными HLA класса I или II клетками К562. Для анализа ex vivo Т-клеточных реакций, криоконсервированные РВМС подвергали ELISpot после периода покоя от 2 до 5 часов при температуре 37°С. Все тесты были выполнены в двух или трех повторах и включали положительные контрольные анализы (Staphyloccocus Enterotoxin В (Sigma Aldrich)) и клетки от контрольного донора с известной реактивностью. Пятна визуализировали конъюгированным с биотином анти-IFNγ-антителом (Mabtech) с последующей инкубацией с ExtrAvidin-Alkaline Phosphatase (Sigma-Aldrich) и субстратом BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). Планшеты сканировали с помощью CTL's ImmunoSpot® Series S five Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02-9038) и анализировали с помощью программного обеспечения ImmunoCapture v6.3. Количество точек суммировали как медианные значения для каждого трехкратного повтора. Т-клеточные ответы, стимулированные мутированной РНК или пептидами, сравнивали с контрольными клетками-мишенями, электропорированными РНК (Luciferase), или незагруженными клетками-мишенями, соответственно. Ответ определяли как положительный, с минимумом из пяти пятен на 1×10⁵ клеток в условиях ex vivo или 25 пятнами на пять ×10⁴ клеток в post-IVS условиях, а также количество пятен, которое более чем вдвое превышало соответствующий контроль.

Мультимерное окрашивание и анализ данных

Специфические для мутации CD8⁺ Т-клетки идентифицировали с использованием декстрамеров (Immudex), несущих эпитопы длиной девять или десять аминокислот из иммуногенных мутаций. Клетки сначала окрашивали мультимерами, после чего проводили окрашивание маркеров клеточной поверхности (CD28 CD28.8, CD197 150503, CD45RA HI100, CD3 UCHT1, CD16 3G8, CD14, МФР9, CD19 SJ25C1, CD27 L128, CD279 ЕН12, CD8RPA-T8 все BD и CD4 OKT4 Biolegend) и окрашивание для определения жизнеспособности клеток (живых/мертвых клеток) (DAPI BD). Окрашенные клетки затем получали на BD LSR Fortessa SORP. Синглетные, живые, мультимер-позитивные события были идентифицированы в CD3 (или CD8) позитивных, CD4/CD14/CD16/CD19 негативных или CD3 (или CD8) позитивных/CD4 негативных событиях. Специфичность декстрамеров HLA-A*0201 для пациент-специфичных неоэпитопов демонстрируется отсутствием окрашивания доноров крови HLA-A*0201⁺.

Внутриклеточное окрашивание цитокинов

Аутологичные DC, электропорированные с РНК, кодирующей одиночные неоэпитопы, добавляли в соотношении 10:1 Е:Т и культивировали в течение около 16 часов при 37°С в присутствии Brefeldin А и Monensin. Клетки окрашивали на жизнеспособность (fixable viability dye eFluor506, eBioscience) с последующим окрашиванием на поверхностные маркеры (CD8SK1 BD, CD4OKT4, Biolegend). После пермеабилизации проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов (IL-2 MQ1-17H12, IFNγ В27 все BD и TNFα Mab11 Biolegend) и образцы собирали на BD FACS Canto II (Becton Dickinson).

Сортировка одиночных клеток

Сортировку одиночных антигенспецифических Т-клеток проводили после 11 дней антигенспецифической экспансии РВМС, очищенных CD8⁺ или CD4⁺ Т-клеток или TIL. Перед сортировкой 2×10⁶ экспандированных Т-клеток повторно стимулировали 2×10⁵ аутологичными DC, трансфицированными IVT РНК, кодирующей соответствующий неоантиген или контрольный антиген. Через период времени от 16 до 20 часов клетки собирали и обрабатывали конъюгированными с флуорохромом антителами, направленными против CD14, CD19, CD3, CD8, CD4, CD137, CD134 (все от BD Biosciences), и IFNγ, используя набор для анализа секреции IFNγ (Miltenyi Biotec). Сортировку одиночных неоантигенспецифических Т-клеток проводили на проточном цитометре Bria FACS Aria (BD Biosciences). Одну двойную положительную клетку (IFNγ/CD8, CD137/CD8, IFNγ/CD4 или CD134/CD4) на лунку собирали в 96-луночный планшет с V-дном (Greiner Bio-One), содержащий клетки-носители 3T3-L1, центрифугировали и хранили при температуре от -65 до -85°С.

Клонирование неоэпитоп-специфических TCR

Клонирование генов TCR из одиночных Т-клеток проводили, как описано ранее (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)). Вкратце, суммарную РНК, экстрагированную с помощью набора Micro RNeasy (Qiagen), использовали для синтеза кДНК с переключением матрицы с помощью RevertAid Н-обратной транскриптазы (Thermo Fisher) с последующей преамплификацией с использованием ДНК-полимеразы PfuUltra Hotstart (Agilent). Аликвоты полученных в результате кДНК использовали для Vα-/Vβ ген-специфических мультиплексных ПЦР. Продукты анализировали на капиллярной системе электрофореза (Qiagen). Образцы с полосами от 430 до 470 п.н. фракционировали по размеру на агарозных гелях, и полосы вырезали и очищали с использованием набора для экстракции геля (Qiagen). Очищенные фрагменты секвенировали и соответствующие соединения V(D)J анализировали с использованием инструмента IMGT/V-Quest (Brochet X., Lefranc, М.-Р. & Giudicelli, V. Nucleic Acids Res. 36, W503-8 (2008)). ДНК новых и продуктивно перестроенных соответствующих TCR-цепей подвергали NotI-расщеплению и клонировали в векторы pST1, содержащие соответствующие каркасные цепи для in vitro транскрипции полных TCR-α/β-цепей (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)).

TCR-α/β глубокое секвенирование проводили с общей РНК из РВМС с использованием набора ТКС-Typer kit (BioNTech Diagnostics). Полученные библиотеки ДНК секвенировали на секвенаторе Illumina MiSeq с использованием способа с парными концами 2×300 п.н. Данные секвенирования анализировали с помощью программного обеспечения Typer Toolbox. Общее количество прочтений TCR на образец варьировалось от 1,1×10⁶ до 1,5×10⁶.

QRT-ПЦР

РНК и кДНК генерировали с помощью набора ExpressArt FFPE Clear RNAready kit (AmpTec) и набора реагентов PrimeScript™ RT Reagent Kit с помощью gDNA Eraser (Takara Bio Inc.), соответственно. qRT-ПЦР проводили с использованием BioMark™ HD system (Fluidigm^®) или 96-Well Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System. Пробы и анализы были подготовлены и проанализированы в соответствии с «Fast Gene Expression Analysis» из FFPE-выделенной РНК с использованием Quantitative SYBR® Green Real-Time PCR или TaqMan^® Gene Expression Assays на BioMark™ или «BioMark™ HD System Fluidigm^® Advanced Development Protocol 28». 96.96 Gene Expression Dynamic Array IFC загружали с использованием IFC Controller HX.

Иммуногистохимия

После депарафинирования FFPE-срезов размером от 3 до 4 мкм предметные стекла подвергали извлечению антигена путем кипячения в десяти мМ лимонной кислоте с добавлением 0,05% Твин-20 (рН 6,0) при 120°С в течение десяти минут, затем охлаждали (при помощи 0,3% Н₂О₂; 15 мин) и блокировали 10% козьей сывороткой в PBS (30 мин) при комнатной температуре.

Срезы инкубировали в течение ночи при температуре от 2 до 8°С с 0,2 мкм г/мл античеловеческого CD3 (F7.2.38; Dako), 0,2 мкг/мл анти-человеческого CD8 (С8/144В; Dako), 1 мкг/мл анти-человеческого FoxP3 (236А/Е7; Abcam), 1:200 анти-PD-L1 (13684; Cell Signaling Technologies) или 1:2500 анти-Beta-2-микроглобулина (D8P1H; Cell Signaling Technologies) в блокирующем буфере. Связывание антител визуализировали с помощью вторичных антител, меченных пероксидазой хрена (BrightVision HRP, Immunologic), вместе с красным раствором субстрата-хромогена (VectorRed; Vector Labs). Опухолевые клетки окрашивали 1 мкг/мл Melan-A-специфичного антитела (А103, Dako).

Срезы затем контрастно окрашивали гематоксилином Mayer (Carl Roth GmbH) и подвергали оценке с помощью компьютерного анализа (Definiens Developer).

Для анализа сканировали слайды (Axio.Scan; Zeiss) и вручную предварительно определенные опухолевые участки, участки нормальных тканей и некротические участки количественно определяли с помощью компьютерной программы анализа изображений (Developer, Definiens). Количество CD3, CD8 и FoxP3 TIL определяли в участках, классифицированных как опухолевая ткань.

Клонирование HLA-антигенов

HLA-антигены были синтезированы обслуживающей компанией (Eurofins Genomics) в соответствии с результатами HLA-типирования высокого разрешения. Последовательности HLA-DQA амплифицировали из донор-специфичной кДНК с помощью 2,5 U Pfu-полимеразы с использованием праймеров DQA1_s (PHO-GCC АСС ATG АТС СТА AAC AAA GCT CTG MTG С) и DQA1_as (TAT GCG АТС GCT САС AAK GGC CCY TGG TGT CTG). Антигены HLA клонировали в соответствующим образом переваренные IVT векторы (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)).

Перенос РНК в клетки

РНК добавляли к клеткам, суспендированным в среде Х-VIVO 15 (Lonza) в предварительно охлажденной 4-мм стерильной кювете для электропорации (Bio-Rad). Электропорацию проводили с помощью системы электропорации ВТХ ЕСМ 830 square wave (Т-клетки: 500 В / 3 мс / 1 импульс; iDC: 300 В / 12 мс / 1 импульс; основные РВМС: 400 В / 6 мс / 1 импульс; MZ-GaBa-018: 225 В / 3 мс / 2 импульса; K562: 200 В / восемь мс / 3 импульса).

Пептиды

Использовали синтетические 15-мерные пептиды с 11-аминокислотными перекрываниями, охватывающие 27-мерные неоантигенные последовательности (4 OLP на неоантиген) или контрольные антигены (HIV-gag, ТРТЕ), обозначаемые как перекрывающийся пептидный пул (OLP), или от восьми до 11-мерные эпитопы. Все синтетические пептиды были приобретены у JPT Peptide Technologies GmbH и растворены в AquaDest. (Aqua В. Braun, BRAUN Melsungen) с 10% ДМСО до конечной концентрации 3 мМ.

Проточный цитометрический анализ

Экспрессию клеточной поверхности трансфицированных генов TCR анализировали проточной цитометрией с использованием РЕ- или FITC-конъюгированных анти-TCR-антител против соответствующего семейства вариабельных областей или константной области TCR-β цепи (Beckman Coulter) и FITC- или АРС-меченных анти-CD8/-CD4⁺ антител (BD Biosciences). HLA-антигены антигенпрезентирующих клеток, использованные для оценки функции TCR-трансфицированных Т-клеток, определяли окрашиванием FITC-меченными HLA класс II-специфическими (Beckman Coulter) и РЕ-меченными HLA-класс I-специфическими антителами (BD Biosciences). Проточный цитометрический анализ проводили на аналитическом проточном цитометре BD FACSCanto™ II (BD Biosciences). Полученные данные были проанализированы с использованием десятой версии программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

Анализ цитотоксичности

Анализ цитотоксичности на основе люциферазы проводили, как описано ранее (Omokoko, Т.A. et al. J. Immunol. Res. 2016, 9540975 (2016)). 1×10⁴ клеток-мишеней, трансфицированных либо только люциферазной РНК, либо в сочетании с В2М РНК, совместно культивировали с мутационно-специфичными эффекторными Т-клетками (либо OKT3-активированные TCR-трансфицированные CD8⁺ Т-клетки, либо CD4^+/CD8⁺ IVS Т-клетки) в течение от 19 до 25 часов. Добавляли реакционную смесь, содержащую D-люциферин (BD Biosciences; конечная концентрация 1,2 мг/мл). Через час люминесценцию измеряли с использованием считывателя Tecan Infinite М200 (Tecan). Гибель клеток рассчитывали путем измерения снижения общей активности люциферазы. Жизнеспособные клетки измеряли с помощью люцифераза-опосредованного окисления люциферина. Удельную гибель рассчитывали по следующей формуле:

Анализ апоптоза

Для анализа активации апоптоза каспазой 3/7 (IncuCyte) 1×10⁴ клеток меланомы и 20×10⁴ эффекторных Т-клеток высевали на лунку в 96-луночные планшеты Corning в течение 24 часов. Реагент каспазу 3/7 добавляли в разведении 1:1000 5 мМ исходного раствора (Essen Bioscience), каждое условие в трех повторах. Клетки визуализировали при 10-кратном увеличении в системе визуализации IncuCyte Zoom Live-content (Essen Bioscience) при 37°С, 5% CO₂. Изображения получали каждый час в течение 24 часов, четыре изображения/лунку. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для анализа IncuCyte для выявления и количественного определения зеленых (апоптотических) клеток/изображений. Средние значения количества зеленых объектов с SD в каждый момент времени были представлены в виде графика с использованием программного обеспечения GraphPad Prism.

Пример 2: Клиническая целесообразность и благоприятный уровень безопасности персонализированной РНК-вакцинации с неоэпитопами

Ранее авторы описали связанные с персонализацией процедуры разработки и получения РНК-вакцин, кодирующих множественные соматические мутации (далее «неоэпитопная РНК-вакцина»), начиная от комплексного картирования опухолевых мутаций до производства и выпуска индивидуальной вакцинной композиции (Kreiter, S. et al. Nature 520, 692-696 (2015); Vormehr, M. et al. J. Immunol. Res. 2015, 6 (2015); Kranz, L.M. et al. Nature 534, 396-401 (2016). Данные процедуры были доработаны до стандартизированного процесса, соответствующего нормативным требованиям.

Экспрессированные несинонимичные мутации пациентов с меланомой стадии III и IV были идентифицированы с помощью экзомного и РНК-секвенирования нуклеиновых кислот из обычных замороженных или фиксированных формалином, погруженных в парафин (FFPE) опухолевых биопсий и из клеток крови в качестве источника ДНК здоровой ткани. Два независимых принципа были применены для ранжирования мутаций. Один использовал спрогнозированное высокоаффинное связывание с молекулами HLA класса II пациента в сочетании с высокими уровнями экспрессии РНК, кодирующей мутацию. Другой был основан на предсказанном связывании молекул HLA класса I. Частоты мутированных аллелей и относительные значения транскрипции служили дополнительными дифференциаторами для определения приоритетности мутаций с сопоставимой спрогнозированной аффинностью связывания HLA.

Приоритетные опухолеспецифические соматические мутации были подтверждены секвенированием по Сэнгеру.

Десять мутаций были отобраны для каждого пациента (для пациента Р09 только пять) и сконструированы в две синтетические РНК, каждая из которых кодирует пять 27-мерных пептидов, представляющих одну из мутаций (пентатопные РНК). Высокочистая РНК была получена в соответствии с технологическим процессом Good Manufacturing Practice (GMP) с вероятностью успеха 100%. Среднее общее время изготовления РНК-вакцины составляло 68 дней (от 49 до 102 дней). В соответствии с нормативными требованиями, касающимися первого применения препарата у человека и стадии исследования, каждая изготовленная персонализированная вакцина прошла обширное аналитическое тестирование, в результате чего общее среднее время было продлено до 103 дней (от 89 до 160 дней) от селекции мутаций до выпуска вакцины.

Пациентам с NY-ESO-1- и/или тирозиназа-положительной меланомой была предложена РНК-вакцина, кодирующая данные два опухолеассоциированных общих аутоантигена (ТАА), чтобы преодолеть временной интервал до выпуска их неоэпитопной РНК-вакцины. Восемь доз индивидуальной РНК-вакцины чрескожно вводили инъекцией в лимфатические узлы под ультразвуковым контролем. После этого были взяты образцы поствакцинальной крови для определения иммуногенности. Неоэпитопная вакцинация была продолжена по усмотрению исследователя.

Двадцать пациентов были отобраны для участия в клиническом исследовании, 16 из которых были признаны приемлемыми в соответствии с критериями включения и исключения, и были включены в исследование. Два пациента отозвали свое согласие, и один пациент не смог начать исследуемое лечение из-за недавно диагностированных, быстро прогрессирующих метастазов в мозг. Таким образом, в общей сложности, тринадцать пациентов получили неоэпитопную РНК-вакцину, у девяти пациентов предшествовала мостиковая ТАА РНК-вакцина.

Все пациенты успешно завершили лечение, получив до 20 доз неоэпитопной РНК-вакцины. Число мутаций, выявленных на одного пациента (диапазон от 69 до 1440), находилось в ожидаемом диапазоне для меланомы (Lawrence, М. S. et al. Nature 499, 214-8 (2013); Vormehr, M. et al. Curr. Opin. Immunol. 39, 14-22 (2016)). Десять пациентов имели наиболее распространенные при меланоме движущие (driver) мутации в генах BRAF или HRAS/NRAS (Hodis, Е. et al. Cell 150, 251-263 (2012)). В профилях мутаций преобладали переходы цитозина в тимин (ОТ), типичные для меланомы, вызванной ультрафиолетом (Pleasance, Е.D. et al. Nature 463, 191-196 (2009)).

В целом, лечение хорошо переносилось всеми пациентами. Из 18 зарегистрированных серьезных неблагоприятных явлений (англ. serious adverse events (SAE)) четыре SAE у двух пациентов были вызваны неоэпитопной вакциной, но не имели отношения к исследуемому препарату. Неблагоприятные явления (англ. adverse events (АЕ)), возникающие при лечении неоэпитопной вакциной, были в основном 1 или 2 степени. АЕ 4 или 5 степени отсутствовали. Связанные с лекарственным препаратом АЕ не кластеризовались по классам системных органов. Данные о клинической безопасности и результатах будут подробно представлены в другом месте.

Пример 3: Индукция полиспецифического Т-клеточного иммунитета с помощью неоэпитопной РНК-вакцинации

Чтобы измерить иммуногенность каждого из 125 неоэпитопов, вводимых в данном исследовании индивидуально, авторы проанализировали высокообогащенные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки из проб крови до и после вакцинации. Иммуногенность оценивали с помощью IFNγ ELISpot против аутологичных дендритных клеток (DC), трансфицированных либо РНК, кодирующей одну последовательность из 27 аминокислот (аа), включающую мутацию в центральном положении, либо DC, загруженных 15-мерными перекрывающимися пептидами (англ. overlapping peptides (OLP)), охватывающими соответствующую последовательность. Обе проверки на иммуногенность дали очень согласованные результаты.

В целом, 60% неоэпитопов оказались иммуногенными. Каждый вакцинированный пациент ответил по меньшей мере на три отдельных неоэпитопа. Против одной трети иммуногенных неоэпитопов имелись предсуществующие Т-клетки, которые дополнительно экспандировали при вакцинации. Ответы против почти 70% неоэпитопов не были обнаружены до вакцинации и были вызваны de novo.

Большинство неоэпитопов распознавались исключительно CD4⁺ Т-клетками, и меньшая доля распознавалась только CD8⁺ Т-клетками. Около четверти иммуногенных неоэпитопов было двойными реактивными в отношении как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клеток. Перекрестное загрязнение CD4⁺ и CD8⁺ Т-клеток можно было исключить экспериментально (Фиг. 1с). Подробная характеристика ответов 15-мерных OLP показала, что CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки распознают слегка различные части неоэпитопа (Фиг. 1а, b). Иммуногенные неоэпитопы были равномерно распределены по пяти позициям пентатопной РНК, что подтверждает пригодность формата поли-неоэпитопа.

Чтобы оценить, распознают ли Т-клетки, индуцированные неоэпитопом, немутантный аналог, авторы протестировали DC, импульсно обработанные либо с РНК, либо с OLP, представляющими эпитопы дикого типа или мутированные эпитопы, с помощью ELISpot. Для подавляющего большинства ответов, индуцированных неоэпитопной РНК-вакциной, реактивность против соответствующего эпитопа дикого типа либо не обнаруживалась, либо находилась на более низком уровне. Около четверти ответов показали реактивность с эпитопом дикого типа выше фонового с помощью анализов ELISpot. Вполне возможно, что 13-аминокислотная последовательность дикого типа раздвигает N- и С-концы точечной мутации и может презентироваться на молекулах HLA-класса I и HLA-класса II, что приводит к появлению Т-клеток, реактивных по отношению к эпитопу дикого типа. Однако ожидается, что сильная экспансия аутореактивных Т-клеток будет ингибироваться центральными механизмами толерантности. Поэтому авторы охарактеризовали Т-клеточные ответы против вакцинных мишеней (Р04-С7-E258K, P09-MAN1A2-E323D, P05-FAM135-A479S), которые показали значительное распознавание клеток DC с РНК дикого типа, более подробно. Способность реагировать с эпитопом дикого типа не была подтверждена для Р04-С7-E258K тестированием DC, нагруженных OLP. Для P09-MAN1A2-E323D, авторы наблюдали распознавание как мутантных эпитопов, так и эпитопов дикого типа для пептидов, охватывающих от 9 до 23 аминокислот из 27-мера, тогда как для пептидов, охватывающих от 5 до 19 аминокислот, распознавалась только мутантная версия. Данный факт подразумевает, что перекрестно-реактивные иммунные ответы могут содержать Т-клетки, распознающие исключительно мутированный эпитоп, что может обеспечивать опухолевый контроль. Во всех случаях авторы обнаружили, что аутологичные DC, несмотря на эндогенную экспрессию соответствующего гена дикого типа, не распознавались соответствующими Т-клетками, за исключением биологически значимого распознавания немутантных генных продуктов.

Пример 4. Быстрая и эффективная экспансия неоэпитоп-специфичных Т-клеток с фенотипами центральной и эффекторной памяти при вакцинации

Около пятой части иммуногенных неоэпитопов в данном исследовании вызывали очень высокие ответы. Данные Т-клетки были обнаружены путем тестирования образцов крови ex vivo без предварительной стимуляции in vitro. У пациентов, вакцинированных неоэпитопами и общим ТАА, Т-клеточные ответы против неоэпитопов были сильнее.

Чтобы изучить распознавание Т-клеток на молекулярном уровне, авторы клонировали неоэпитоп-специфичные Т-клеточные рецепторы (TCR) из поствакцинальных Т-клеточных культур выбранных пациентов. Одиночные неоэпитоп-специфичные CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетки сортировали способом проточной цитометрии и подвергали секвенированию TCR на основе ОТ-ПЦР (Simon, P. et al. Cancer Immunol. Res. 2, 1230-44 (2014)). Клонированные альфа- и бета-цепи TCR in vitro транскрибировали в РНК и совместно трансфицировали в Т-клетки для проверки специфичности неоантигена и HL А-рестрикции.

У пациента Р01 авторы идентифицировали четыре TCR, все из которых были составлены из различных клонотипов TCR альфа/бета (Таблица 1).

Все четыре TCR распознавали иммуно-доминантный неоэпитоп NARFL-E62K, полученный из ядерного фактора распознавания преламина А-подобного гена на HLA А*3101, но не на немутантном эпитопе (Фиг. 2).

Пациент Р02 имел два HLA В*3906-рестриктированных TCR, распознающих PPFIA4-S709N, неоэпитоп, полученный из гена липрина альфа 4, и два TCR с HLA DRB1*0401-рестриктированным распознаванием мутантного неоэпитопа HPN-G71R гепсина, которые различались в отношении перекрестной реактивности дикого типа.

TCR-β последовательности данных TCR были прослежены в данных глубокого секвенирования TCR, полученных из клеток периферической крови пациентов перед вакцинацией (посещения врача V1, V12) и после вакцинации (посещение врача V20). Соответствующие TCR-бета-клонотипы не были обнаружены в предвакцинальных, но присутствовали в большом количестве в поствакцинальных образцах крови.

Изучение ответов неоэпитопов нескольких пациентов с помощью ex vivo МНС-мультимерного анализа выявило быстрое размножение циркулирующих CD8⁺ Т-клеток в течение от 2 до 4 недель после начала неоэпитопной вакцинации вплоть до высоких однозначных значений процентных показателей. Неоэпитоп-специфичные CD8⁺ Т-клетки содержали субпопуляцию со слабым положительным фенотипом памяти по отношению к PD-1. В некоторых ответах на неоэпитоп преобладали Т-клетки центральной памяти, в других ответах на неоэпитоп преобладали эффекторные Т-клетки памяти. После стимуляции с DC, загруженными неоэпитопами, CD8⁺ Т-клетки демонстрировали типичную картину цитотоксических цитокинов с сопутствующей экспрессией IFNγ и TNFα.

Пример 5: Контроль заболевания у пациентов с меланомой с высоким риском рецидива с помощью персонализированной неоэпитопной РНК-вакцинации

Большинство из 13 исследуемых пациентов недавно перенесли рецидив заболевания, и у всех был высокий риск рецидива. Сравнение документированных рецидивов меланомы у всех пациентов до и после неоэпитопной РНК-вакцинации выявило очень значительное уменьшение продолжительных кумулятивных рецидивирующих метастатических событий (р<0,0001), что выражается в удивительно длительном выживании без прогрессирования в данной группе пациентов с высоким риском. Восемь пациентов не имели измеримых повреждений в начале неоэпитопной вакцинации. Все 8 пациентов имели сильный иммунный ответ на вакцинные неоэпитопы и оставались без рецидивов в течение всего периода наблюдения (от 12 до 23 месяцев) до тех пор, пока данные не были отключены. Кинетика и активность иммунных ответов варьировали; многие развивались в течение первых 3-4 недель после вакцинации. Остальные пять пациентов испытывали прогрессирование опухоли после включения в исследование и получали стандартное лечение до применения вакцины. Все пять пациентов имели измеримое заболевание, когда их персонализированная вакцина стала доступной. Протекание их заболевания при неоэпитопной вакцинации развивалось следующим образом:

Пациент Р02 имел несколько измеримых метастазов в висцеральных и лимфатических узлах при включении в исследование и лечился ингибитором BRAF, при котором заболевание прогрессировало медленно. Лечение ингибитором BRAF было продолжено после начала неоэпитопной вакцинации. Р02 имел CD4⁺ Т-клеточные ответы против шести из десяти вакцинных неоэпитопов и испытывал смешанный ответ с уменьшением метастазов в лимфатических узлах, стабильным висцеральным метастазированием, прогрессирующим поражением грудного отдела и новыми измеримыми метастатическими поражениями. После лучевой терапии и резекции прогрессирующих и новых поражений пациент отказался от дальнейшего лечения и скончался через 12 месяцев после последнего посещения.

Неоэпитопная вакцинация пациента Р03 была отложена сразу после включения в исследование из-за рецидива заболевания с несколькими новыми метастазами в лимфатических узлах корней легких и почках. Местная лучевая терапия и лечение анти-CTLA-4 не дали результатов. Метастазирование в почку продолжало быстро прогрессировать и было удалено. После этого началась вакцинация неоэпитопной РНК, которая привела к Т-клеточным ответам против трех неоэпитопов, два из которых были распознаны CD8⁺ Т-клетками, а один распознан CD4⁺ и CD8⁺ Т-клетками. Метастазы в лимфатические узлы корней легких, прогрессирующие до вакцинации, полностью исчезли в течение последующих 12 месяцев, что было определено с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). Пациент завершил лечение в общей сложности 18 инъекциями вакцины и оставался без рецидивов в течение 26 месяцев без дальнейшего лечения.

У пациента Р17 после включения в исследование был диагностирован метастаз в подмышечном лимфатическом узле, который оставался стабильным и был резецирован после четырех инъекций вакцины с неоэпитопной РНК и использовался для генерации инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TIL) и клеточной линии аутологичной меланомы (MZ-I-017). Пациент продолжил вакцинацию еще 14 инъекций. Примечательно, что реактивные Т-клетки против всех десяти неоэпитопов вакцины были обнаружены в РВМС пациента Р17. Неоэпитоп-специфичные Т-клетки также были обнаружены в опухоль-инфильтрирующих лимфоцитах. Реактивность была особенно высокой в отношении мутированных эпитопов гуанилатсвязывающего белка (GBP1-P86F) и ретинолсатуразы (RETSAT-P546S). В неоэпитопе RETSAT-P546S авторы идентифицировали рестриктированный минимальный эпитоп HLA-A*6801 (HSCVMASLR) и подтвердили присутствие CD8⁺ Т-клеток против данного эпитопа в TIL путем HLA-мультимерного окрашивания.

Авторы стимулировали TIL с помощью аутологичных RETSAT-P546S РНК-трансфицированных DC и клонировали соответствующие TCR. Т-клетки, трансфицированные RETSAT-P546S-специфичным TCR#8, идентифицированным клонированием одиночной клетки, эффективно уничтожали клеточную линию аутологичной меланомы MZ-I-017, но не аутологичные АРС. Данный факт подтвердил не только экспрессию, процессирование и презентацию неоэпитопа опухолевыми клетками, но и его эффективное распознавание на опухолевых клетках индуцированными вакциной цитотоксическими Т-клетками. Удивительно, что дополнительная характеризация TCR#8 показала, что HLA-B*3701 (а не HLA-A*6801) рестриктирует распознавание неоэпитопа, который отличается от первоначально определенного минимального эпитопа (Фиг. 3а, b, Фиг. 4). Данный факт демонстрирует, что у одного и того же пациента одиночная мутация может одновременно запускать CD8⁺ Т-клеточные ответы против различных комплексов пептид/HLA (Фиг. 3b).

Пациент Р07 имел серию рецидивов и прогрессирующих кожных и висцеральных метастазов в начале вакцинации неоэпитопной РНК. Р07 развил сильный Т-клеточный ответ против шести неоантигенов, пять из которых были измеримы ex vivo. Поскольку продолжение прогрессирования заболевания было зафиксировано на первом изображении, неоэпитопную вакцинацию прекратили. Р07 был зачислен в сострадательную анти-PD-1 (пембролизумаб) программу. Пациент испытал быструю регрессию всех меланомных поражений, уменьшение размеров поражений-мишеней на 80% в течение двух месяцев и в конечном итоге полный ответ при продолжающейся блокаде PD-1. Индуцированные вакциной Т-клетки сохранялись при анти-PD-1 лечении с высокой частотой до 9 месяцев после окончания вакцинации.

Пример 6: Предсуществующие иммунные ответы против неоэпитопов, опосредованные как CD4⁺, так и CD8⁺ Т-клетками

Материал пациента

РВМС, полученные для тестирования иммуногенности, выделяли центрифугированием в градиенте плотности Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) из образцов периферической крови или лейкаферезных образцов пациентов с меланомой. Избыток материала из NCT02035956 был использован для крупномасштабного тестирования иммуногенности. Дизайн исследования описан на странице 80.

Выбор неоэпитопов

Процесс секвенирования следующего поколения подробно описан на стр. 81. Для широкомасштабного тестирования иммуногенности было выбрано до ста неоэпитопов с использованием непредвзятого подхода, чтобы охватить несколько признаков, таких как прогнозирования связывания и целевые уровни экспрессии.

In vitro стимуляция CD4 и CD8 Т-клеток

В нулевой день моноциты выделяли из криоконсервированных РВМС с использованием микрошариков (Miltenyi Biotech) и дифференцировали в быстрые дендритные клетки (fDC), добавляя цитокиновый коктейль, содержащий IL-4/GM-CSF и IL-6/IL-1β/TNFα/PGE2. Через два дня CD4+ и CD8+ Т-клетки выделяли из криоконсервированных РВМС с использованием микрошариков (Miltenyi Biotech). Для in vitro стимуляции CD4+ Т-клетки и fDC, нагруженные пулом перекрывающихся пептидов (OLP), объединяли при соотношении эффектор:мишень 10:1, тогда как CD8+ Т-клетки и РВМС, нагруженные пулом OLP и истощенные по CD4, объединяли при соотношении эффектор:мишень 1:10. Через один день добавляли свежую среду, содержащую 10 ед/мл IL-2 (Proleukin S, Novartis) и 5 нг/мл IL-15 (Peprotech). IL-2 пополняли через семь дней после создания культур. После 11 дней in vitro культивирования клетки анализировали проточной цитометрией и использовали в качестве эффекторных клеток в анализах IFNγ ELISpot.

IFNγ ELIspot

Незрелые дендритные клетки (iDC) использовали в качестве мишеней для анализа IFNγ ELIspot. Моноциты выделяли из криоконсервированных РВМС с использованием микрошариков (Milteniy Biotech) и дифференцировали в незрелые дендритные клетки (iDC) в присутствии IL-4 и GM-CSF.

Многоэкранные фильтровальные планшеты (Merck Millipore), предварительно покрытые антителами, специфичными к IFNγ (Mabtech), блокировали Х-VIVO 15 (Lonza), содержащим 2% человеческий сывороточный альбумин (CSL Behring), в течение от 1 до 5 часов. Для CD4+ Т-клеток 0,5×10⁵ эффекторных клеток/лунку повторно стимулировали аутологичными iDC, нагруженными OLP, при соотношении эффектор/мишень 10:1 в течение от 18 до 20 часов. Для CD8+ Т-клеток 1×10⁵ эффекторных клеток/лунку повторно стимулировали аутологичными iDC, нагруженными OLP, при соотношении эффектор/мишень 10:1 в течение от 18 до 20 часов. Все тесты проводились в трех повторах и включали положительные контроли анализа (Staphylococcus Enterotoxin В (Sigma Aldrich)). iDC, нагруженные OLP из контрольного пула, и эффекторы использовали только в качестве отрицательных контролей. Пятна визуализировали с помощью конъюгированного с биотином антитела против IFN-γ (Mabtech) с последующей инкубацией с Extra-Avidin-Alkaline Phosphatase (Sigma-Aldrich) и субстратом BCIP/NBT (Sigma-Aldrich). Планшеты сканировали с использованием анализатора CTL ImmunoSpot ® S6Core ELISpot Analyzer и анализировали с помощью программного обеспечения ImmunoCapture™ v6.6. Т-клеточные ответы, стимулированные мутантными пептидами, сравнивали с контрольными пептидами (пул нерелевантных пептидов). Ответ был определен как положительный, когда среднее число пятен было по меньшей мере в два раза выше по сравнению с соответствующими контролями.

Пептиды

Для in vitro стимуляции были использованы синтетические 15-мерные пептиды (неочищенные продукты) с перекрытием в 11 аминокислот, охватывающие 27-мерные неоантигенные последовательности (обозначаемые как перекрывающиеся пептиды (OLP)). Все синтетические пептиды были приобретены и предварительно объединены JPT Peptide Technologies GmbH и растворены в ДМСО (AppliChem) до стандартной концентрации 5 мг/мл в пересчете на OLP. Для in vitro стимуляции использовали конечную концентрацию 2,5 мкг/мл в пересчете на OLP, для ELISpot Readout 3,5 мкг/мл. Пулы различных неоантигенов (4 OLP на неоантиген) использовали для in vitro стимуляции и для ELISpot-считывания с использованием матричного подхода.

Проточные цитометрические анализы

Чистоту культур CD4 и CD8 Т-клеток оценивали проточной цитометрией (CD25 РЕ, CD56 РЕ CY7, CD8 АРС, eFluor780 FVD, CD3 BV421, CD4 FITC). Проточный цитометрический анализ проводили на приборе BD FACSVerseTM (BD Biosciences). Полученные данные были проанализированы с использованием десятой версии программного обеспечения FlowJo (Tree Star).

Результаты

К настоящему времени были проанализированы семь пациентов и было обнаружено, в общей сложности, 26 реактивностей, которые опосредованы как CD4+, так и CD8+ Т-клетками.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> БИОНТЕК РНА ФАРМАСЬЮТИКАЛС ГМБХ

<120> СПОСОБЫ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРИМЕНИМОСТИ СПЕЦИФИЧНЫХ ДЛЯ

ЗАБОЛЕВАНИЯ АМИНОКИСЛОТНЫХ МОДИФИКАЦИЙ ДЛЯ ИММУНОТЕРАПИИ

<130> 674-187 PCT2

<150> PCT/EP2017/064140

<151> 2017-06-09

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (1)..(3)

<223> Часть последовательности повторяется a раз, где a независимо

представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(15)

<223> a + b + c + d + e отличные от 0 и предпочтительно обозначают 2

или более,

3 или более, 4 или более, 5 или более

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (4)..(6)

<223> Часть последовательности повторяется b раз, где b независимо

представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (7)..(9)

<223> Часть последовательности повторяется c раз, где c независимо

представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (10)..(12)

<223> Часть последовательности повторяется d раз, wherein d

независимо представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20

<220>

<221> ПОВТОР

<222> (13)..(15)

<223> Часть последовательности повторяется e раз, независимо

представляет собой число, выбранное из 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9,

10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20

<400> 1

Gly Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

<210> 2

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкерная последовательность

<400> 2

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 3

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 3

Lys Ser Gln Arg Glu Phe Val Arg Arg

1 5

<210> 4

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 4

Met Arg Met Asn Gln Gly Val Cys Cys

1 5

<210> 5

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 5

Lys Phe Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Thr Lys Ser

1 5 10

<210> 6

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 6

Gly Gln Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser

1 5 10 15

<210> 7

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 7

Gly Leu Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp

1 5 10 15

<210> 8

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Asp Gln Leu Ala Gln Thr Lys Ser Leu Ser Leu Asp Asp Cys

1 5 10 15

<210> 9

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 9

Thr Arg Leu Ser Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser

1 5 10 15

<210> 10

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 10

Lys Val Phe Ser Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala

1 5 10 15

<210> 11

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 11

Ala Met Leu Ala Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met

1 5 10 15

<210> 12

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 12

Ile Tyr Ser Asn Lys Pro Ala Leu Trp Ile Met Ala Ala Lys Trp

1 5 10 15

<210> 13

<211> 19

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 13

Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu

1 5 10 15

Arg Ala Gln

<210> 14

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 14

His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys

1 5

<210> 15

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 15

His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg

1 5

<210> 16

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 16

Ala Cys Tyr Gly Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys

1 5 10 15

<210> 17

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 17

Ala Asp His Asp Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser

1 5 10 15

<210> 18

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 18

Leu Gly Arg Leu His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln

1 5 10 15

<210> 19

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 19

His Ser Cys Val Met Ala Ser Leu Arg Ala Gln Ser Pro Ile Pro

1 5 10 15

<210> 20

<211> 31

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотид

<400> 20

gccaccatga tcctaaacaa agctctgmtg c 31

<210> 21

<211> 33

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Олигонуклеотид

<400> 21

tatgcgatcg ctcacaakgg cccytggtgt ctg 33

<210> 22

<211> 27

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 22

Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Leu Cys Leu

1 5 10 15

Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu

20 25

<210> 23

<211> 18

<212> БЕЛОК

<213> Homo sapiens

<400> 23

Met Pro Arg Ser Glu Ser Tyr Cys Phe Pro Gly Val Thr Leu Ala Ser

1 5 10 15

Thr Pro

<---

Группа изобретений относится к области фармацевтики и медицины. 1 и 2 объекты представляют собой способ оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для противораковой иммунотерапии и способ выбора и/или ранжирования специфических для заболевания модификаций аминокислот по их применимости в противораковой иммунотерапии, включающие определение презентации одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС и реактивности в отношении Т-клеток. 3 объект – способ получения вакцины, включающий стадию идентификации одной или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано с помощью способа, будут применимы для противораковой иммунотерапии. Технический результат заключается в получении персонализированных вакцин для онкопациентов, обеспечивающих эффективное нацеливание на мутаном. 3 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Способ оценки применимости специфичной для заболевания аминокислотной модификации в пептиде или полипептиде, экспрессированном в больной клетке, для противораковой иммунотерапии, причем способ включает определение одного или более из следующего:

(i) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул MHC класса I и класса II и являются ли они, при презентации в контексте молекул MHC класса I и класса II, реактивными в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток, при этом презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС класса I и класса II и реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС класса I и класса II, в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии,

(ii) определение того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, при этом реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии, и/или

(iii) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул MHC класса I и являются ли они при презентации в контексте различных молекул MHC класса I реактивными в отношении различных CD8+ Т-клеток, причем презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул МНС класса I и реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул MHC класса I, в отношении различных CD8+ Т-клеток указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии.

2. Способ по п. 1, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

3. Способ выбора и/или ранжирования специфичных для заболевания аминокислотных модификаций по их применимости в противораковой иммунотерапии, причем способ включает стадии:

(i) идентификации пептидов и/или полипептидов, экспрессированных в больных клетках, причем каждый пептид и/или полипептид содержит по меньшей мере одну специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, и

(ii) определения одного или более из следующего:

(1) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС класса I и класса II и являются ли они, при презентации в контексте молекул MHC класса I и класса II, реактивными в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток, причем презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС класса I и класса II и реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте молекул МНС класса I и класса II, в отношении CD4+ и CD8+ Т-клеток указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии,

(2) определение того, является ли фрагмент пептида или полипептида, содержащий специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, реактивным в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, причем реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте одинаковой молекулы МНС, в отношении Т-клеток, имеющих различные Т-клеточные рецепторы, указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии, и/или

(3) определение того, презентируются ли одинаковые или различные фрагменты пептида или полипептида, содержащие одинаковую специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте различных молекул MHC класса I и являются ли они, при презентации в контексте различных молекул MHC класса I, реактивными в отношении различных CD8+ Т-клеток, причем презентация одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию в контексте различных молекул МНС класса I и реактивность одинаковых или различных фрагментов пептида или полипептида, содержащих специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, при презентации в контексте различных молекул MHC класса I, в отношении различных CD8+ Т-клеток указывает на то, что специфичная для заболевания аминокислотная модификация применима для противораковой иммунотерапии, и

(iii) повторения стадии (ii) для по меньшей мере одной дополнительной аминокислотной модификации, идентифицированной на стадии (i).

4. Способ по п. 3, в котором различные Т-клеточные рецепторы имеют различные клонотипы.

5. Способ по любому из пп. 3 или 4, в котором различные аминокислотные модификации, протестированные на стадии (ii), присутствуют в одинаковых и/или в различных пептидах или полипептидах.

6. Способ по любому из пп. 3-5, который дополнительно включает сравнение баллов, полученных для различных аминокислотных модификаций, протестированных на стадии (ii).

7. Способ по любому из пп. 1-6, в котором специфичная для заболевания аминокислотная модификация(и) происходит (происходят) вследствие специфичной для заболевания соматической мутации(й).

8. Способ по п. 7, в котором специфичная для заболевания соматическая мутация представляет собой онкоспецифичную соматическую мутацию.

9. Способ по любому из пп. 1-8, в котором специфичная для заболевания аминокислотная модификация представляет собой онкоспецифичную аминокислотную модификацию.

10. Способ по любому из пп. 1-9, в котором молекулы МНС класса I и класса II представляют собой молекулы HLA класса I и класса II.

11. Способ по любому из пп. 1-10, в котором презентация фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в контексте молекул МНС может быть установлена с использованием любого способа прогнозирования связывания пептид:MHC и/или путем экспериментального определения связывания фрагмента с молекулами МНС.

12. Способ по любому из пп. 1-11, в котором реактивность фрагмента пептида или полипептида, содержащего специфичную для заболевания аминокислотную модификацию, в отношении Т-клеток при презентации в контексте молекул МНС может быть установлена экспериментально.

13. Способ по любому из пп. 1-12, который является применимым в получении вакцины.

14. Способ получения вакцины, включающий стадии:

(i) идентификации одной или более специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано с помощью способа по любому из пп. 1-12, будут применимы для противораковой иммунотерапии,

(ii) получения вакцины, включающей одно из следующего:

(1) пептид или полипептид, экспрессированный в больных клетках, причем пептид или полипептид содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для противораковой иммунотерапии,

(2) пептид или полипептид, содержащий фрагмент пептида или полипептида по (i), причем фрагмент содержит по меньшей мере одну из специфичных для заболевания аминокислотных модификаций, которые, как спрогнозировано, будут применимы для противораковой иммунотерапии, или

(3) нуклеиновая кислота, кодирующая пептид или полипептид по (1) или (2).

15. Способ по любому из пп. 1-14, в котором фрагмент представляет собой МНС-связывающий пептид или потенциальный МНС-связывающий пептид или может быть процессирован с получением MHC-связывающего пептида или потенциального MHC-связывающего пептида.