РЕАССОРТАНТ ReM8 - ВАКЦИННЫЙ ШТАММ ВИРУСА ГРИППА А ПОДТИПА Н1N1 Российский патент 2012 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к области вирусологии и может быть использовано для производства инактивированных и субъединичных вакцин против вируса гриппа А (H1N1).

Эпидемия гриппа, охватившая в 2009 году почти все страны земного шара и получившая, по решению ВОЗ, статус пандемии, была вызвана новым вариантом вируса гриппа А подтипа H1N1 [6, 7], возникшим в результате скрещивания двух вирусов гриппа свиней [8, 14, 16, 18]. Он резко отличается по антигенным свойствам от циркулировавшего в предшествующие годы вируса подтипа H1N1. Поскольку новый вирус имеет значительные антигенные отличия от предшествующих вирусов подтипа H1N1, вакцины, содержащие антигены прежних штаммов, непригодны для профилактики заболеваний, вызванных пандемическим вирусом. Этим обусловлена необходимость создания новых вакцинных штаммов.

В последние годы для получения вакцинных штаммов с определенным набором генов все большее применение находит метод обратной (реверсной) генетики с плазмидной трансфекцией [9]. Этот подход был применен для получения вакцинных штаммов, содержащих гены гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA) пандемического вируса 2009 года [20, 21]. Наряду с этим в производстве инактивированных или субъединичных противогриппозных вакцин находят применение и вакцинные штаммы, полученные классическим методом. Их традиционно получают путем скрещивания эпидемического вируса с высокопродуктивным штаммом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) и последующего его клонирования. Именно посредством скрещивания пандемического вируса 2009 года с вирусом A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) был создан в Нью-йоркском медицинском колледже первый штамм для инактивированных и субъединичных вакцин против пандемического вируса 2009 года [22].

Даже небольшие различия в аминокислотной последовательности поверхностных белков вируса могут быть важными для продуктивности вакцинных штаммов при размножении в эмбрионах кур и в клеточных культурах [5, 10, 19], а также для других фенотипических свойств вируса и его иммуногенности. Поэтому представляется оправданным расширение круга штаммов пандемического вируса гриппа A (H1N1), используемых для получения реассортантных вакцинных штаммов.

Сущность настоящего изобретения - создать путем скрещивания вакцинный штамм, который должен содержать гены гемагглютинина и нейраминидазы пандемического вируса гриппа А (H1N1) 2009 года, а остальные 6 геномных сегментов его должны быть от высокопродуктивного вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Задача состояла в том, чтобы получить и охарактеризовать вирус-реассортант, содержащий гены НА и NA штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 [2, 3], который был изолирован на территории России и депонирован в Государственную коллекцию вирусов (ГКВ) под номером 2452, и 6 генов высокопродуктивного вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Предлагаемый вакцинный штамм, названный ReM8, обладает всеми признаками и характеристиками вируса гриппа А подтипа H1N1, депонирован в ГКВ на базе Федерального государственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательского института вирусологии им. Д.И.Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России) за №2632.

Сложность работы заключалась в том, что оба вируса-родителя содержат гемагглютинин подтипа H1, что затрудняло селекцию реассортантов с использованием антител против НА подтипа H1, применяемую обычно при скрещивании штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) с вирусами других подтипов. Поэтому в качестве вируса-донора генов штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) мы предложили использовать реассортантный штамм Х-31, который был получен скрещиванием вируса A/Aichi/2/68 (H3N2) и вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [13].

Штамм Х-31 содержит гены НА и NA вируса A/Aichi/2/68 подтипа H3N2, а остальные 6 генов внутренних и неструктурных белков от вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1). Такое сочетание генов обеспечивает его высокую продуктивность.

Получение штамма

Вирус A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 в концентрации 10⁷ ЭИД₅₀/мл в виде осветленной центрифугированием на малой скорости и разведенной раствором Хэнкса аллантоисной жидкости подвергали УФ-облучению в дозе, необходимой для снижения инфекционного титра на 5 lg. Облученный вирус смешивали с равным количеством необлученного вируса Х-31 (H3N2), и смесь использовали без разведения для заражения куриных эмбрионов. После 14 часов инкубации при 37°С и охлаждения эмбрионов в течение 18 часов при 4°С вирус собирали, обрабатывали иммунной сывороткой против вируса Х-31 (H3N2) и использовали для заражения куриных эмбрионов (по 12 эмбрионов на каждое 10-кратное разведение вируса). Вирус собирали раздельно из каждого эмбриона в предельном разведении и клонировали посредством 6-кратного пассирования в предельных разведениях. Вируссодержащую аллантоисную жидкость хранили при 4°С или замораживали и хранили при -80°С.

Присутствие в составе вируса Х-31 НА подтипа Н3 и NA подтипа N2 облегчает получение реассортанта, содержащего гены поверхностных белков пандемического вируса, поскольку позволяет использовать поликлональную иммунную сыворотку против вируса подтипа H3N2 для отбора клонов при селекции реассортантов. Использование штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в качестве вируса-родителя потребовало бы тонкой дифференциации антигенов НА и NA пандемического вируса и вируса-донора высокопродуктивности, принадлежащих к одному и тому же подтипу H1N1, для чего было бы необходимо получение специальной панели моноклональных антител.

Секвенирование генома. Вирусную РНК выделяли из вируссодержащей аллантоисной жидкости с помощью набора RNeasy Mini kit (Qiagen). Обратно-транскриптазную реакцию и ПЦР проводили с праймерами, специфическими для генов вируса гриппа А. Продукты полимеразной цепной реакции очищали, используя набор QIAquick PCR purification kit (Qiagen). ДНК секвенировали с использованием секвенатора DNA ABI Prism 3130 (Applied Biosystems) и BigDye Terminator v3.1 kit. Нуклеотидные последовательности обрабатывали с помощью программы DNASTAR sequence analysis software package (DNASTAR Inc.). Полученный штамм-реассортант ReM8 генотипирован посредством частичного секвенирования геномных РНК-сегментов. Секвенирование подтвердило наличие у предлагаемого вакцинного штамма генов НА и NA от вируса A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 и остальных 6 генов от штамма A/Puerto Rico/8/34 (H1N1).

Биологические свойства. Вакцинный штамм-реассортант ReM8 размножается в десятидневных куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную полость, инкубация 48 часов при температуре 37°С, до титра 10⁸ ЭИД₅₀ и гемагглютинирующего титра 256 гемагглютинирующих единиц (ГАЕ). Агглютинирует эритроциты кур и человека 0(1) группы. Штамм чувствителен к озельтамивиру и арбидолу, резистентен к ремантадину.

Серологические свойства. Вакцинный штамм-реассортант ReM8 реагирует до гомологичного титра в РТГА с моноклональными антителами к НА вируса A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 [2].

Инфекционный титр штамма в аллантоисной жидкости - 10⁸ ЭИД₅₀ и гемагглютинирующий титр в аллантоисной жидкости - 256 ГАЕ.

Вакцинные штаммы, полученные скрещиванием дрейфовых вариантов вируса гриппа А человека и вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), обычно обладают высокой продуктивностью, близкой к продуктивности вируса-родителя A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [13]. Однако для некоторых вирусов гриппа А при получении высокопродуктивных реассортантов могут возникнуть трудности, обусловленные неполным функциональным соответствием генов вирусов-родителей. Реассортанты, содержащие гены НА и NA вирусов гриппа птиц, обычно имеют более низкую продуктивность, чем вирус-родитель A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [1, 10, 15, 17].

Пример 1. Определение уровня репродукции реассортанта ReM8 и вирусов-родителей. Уровень репродукции определяли по данным реакции гемагглютинации (РГА) и титрования инфекционности на куриных эмбрионах, а также посредством концентрации вирусов из определенного объема аллантоисной жидкости и последующим электрофорезом и анализом результатов сканирования. (Фиг.1).

Вируссодержащую аллантоисную жидкость после осветления центрифугированием на малой скорости наслаивали на 4 мл 20% сахарозы в буферном растворе (0,15 М NaCl, 0,01 М Tris-HCl pH 7,6) и осаждали центрифугированием в роторе SW-27 при 23000 об/мин в течение 90 мин. Бляшки ресуспендировали в малом объеме буферного раствора (0,15 М NaCl, 0,01 М Tris-HCl pH 7,6). Анализ вирусных белков проводили посредством электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) с бис-акриламидной сшивкой при концентрации акриламида 13% без β-меркаптоэтанола с окрашиванием Кумасси синим G-250 и сканированием пластины геля. Обработку результатов сканирования проводили с использованием компьютерной программы TotalLab TL120. Расчет количества вирусного белка в пробе проводили по соотношению вирусных белков и бычьего сывороточного альбумина.

Приведенные в таблице 1 (фиг.1) данные показывают, что гены внутренних и неструктурных белков высокопродуктивного вируса-родителя резко повышают продуктивность реассортанта ReM8 по сравнению с пандемическим вирусом-родителем A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1. Однако они не обеспечивают реассортанту продуктивности вируса-родителя Х-31 (H3N2), которая близка к продуктивности вируса A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) [13]. Увеличение продуктивности реассортанта ReM8 по сравнению с вирусом-родителем A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 имело место во всех опытах, причем продуктивность реассортанта была в 3-4 раза выше, чем продуктивность вируса A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 (Фиг.1).

Пример 2. Определение иммуногенности в опыте иммунной защиты

Известно, что белые мыши различных линий обладают разной чувствительностью к пандемическому вирусу гриппа А (H1N1) 2009 года [4, 12]. У мышей линии BALB/c вирус 2009 года вызывает гибель только после адаптации [11].

Иммуногенность вируса-реассортанта ReM8 была определена в опытах на мышах BALB/c. В предварительных опытах установили, что реассортант ReM8 вызывает гибель беспородных белых мышей, но у мышей линии BALB/c даже при заражении очень высокими дозами вируса (10⁶ ЭИД₅₀ на мышь) наблюдается лишь временное снижение веса, но не гибель животных.

В опытах иммунной защиты мышей линии BALB/c иммунизировали вирусом ReM8 очищенным и инактивированным глютаральдегидом в концентрации 0,1% в течение 7 дней при 4°С. Мышам линии BALB/c весом 10,0 г вводили внутримышечно по 20,0 мкг инактивированного вируса. Контрольные группы мышей получали дозу глютаральдегида, соответствующую дозе, полученной мышами опытных групп при иммунизации. Иммунизацию повторяли через 3 недели. Через 3 недели после второй иммунизации мышей заражали интраназально вирусом для определения уровня иммунной защиты. Мышей наблюдали в течение 13 дней, регистрируя вес тела и гибель животных. После двукратной иммунизации как иммунизированных мышей, так и мышей, получивших плацебо, заражали интраназально вирусом ReM8. Мыши, получавшие плацебо, реагировали на инфекцию значительным снижением веса, тогда как у иммунизированных мышей снижение веса было выражено очень слабо (Фиг.2).

Таким образом, высокая продуктивность полученного реассортанта ReM8, а также его иммуногенность, выявляемая в опытах иммунной защиты на мышах, позволяет рассматривать вирус-реассортант ReM8 как штамм-кандидат для производства инактивированных и субъединичных вакцин против пандемического вируса гриппа A (H1N1) 2009 года. Штамм ReM8 (H1N1) (семейство Ortomyxoviridae, род Influenzavirus А) получен путем скрещивания пандемического штамма A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1, выделенного от человека и депонированного в ГКВ под номером 2452, с высокоурожайным штаммом Х-31 (H3N2). Гены гемагглютинина и нейраминидазы получены реассортантом от пандемического штамма, а гены внутренних и неструктурных белков от донора высокопродуктивного штамма Х-31 (H3N2). Использованный прием скрещивания с реассортантным донором высокопродуктивности может быть использован в будущем для получения вакцинных штаммов против дрейфовых вариантов, если они возникнут в ходе дальнейшей циркуляции вируса H1N1.

Изобретение относится к области вирусологии. Предложен вакцинный штамм вируса A ReM8 (H1N1), депонированный в ГКВ под №2632. Высокая продуктивность полученного реассортанта ReM8, а также его иммуногенность, выявляемая в опытах иммунной защиты на мышах, позволяет рассматривать вирус-реассортант ReM8 как штамм-кандидат для производства инактивированных и субъединичных вакцин против пандемического вируса гриппа А (H1N1) 2009 года. 2 ил., 1 табл., 2 пр.

Вакцинный штамм вируса гриппа А подтипа H1N1 семейства Ortomyxoviridae рода Influenzavirus А, депонированный в ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России под №2632 - реассортант ReM8.