Штамм вируса гриппа A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) для получения инактивированных и живых гриппозных вакцин Российский патент 2019 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к области медицинской биотехнологии и предназначено для получения моно- или поливалентных инактивированных (ИГВ) и живых (ЖГВ) гриппозных вакцин в целях иммунизации населения против потенциально пандемических вирусов гриппа А подтипа H5N8. Полученный вакцинный штамм относится к семейству Orthomyxoviridae, род Influenza virus А.

Вирусы гриппа, циркулирующие среди животных, создают угрозу здоровью человека в случае непосредственного инфицирования различными подтипами вируса птичьего или свиного происхождения и еще большую - при реассортации с вирусами человека.

Потенциально пандемическим подтипом вируса гриппа птиц является A/H5N8. Выделяют 2 группы вируса гриппа подтипа A/H5N8 - a (Buan-like) и b (Gochang-like) [Lee D.H. et al., 2017]. Вирус гриппа подтипа A/H5N8 впервые был обнаружен в 2013 году в Китае, затем в 2014 в Южной Корее и Северо-Восточной Сибири. На данный момент, благодаря сезонной миграции птиц, вирусы группы А распространились по всей Евразии и Северной Америке и обозначаются icA (от intercontinental - межконтинентальный). При этом они вызвали большую смертность у разных видов диких и домашних птиц [Kapczynski D.R. et al., 2017; Kleyheeg E. et al., 2017].

Вирус подтипа A/H5N8 признан высоко патогенным [Woo С. et al., 2017]. В настоящий момент случаев заражения людей данным вирусом не выявлено [Hui D. S. С., Lee N., Chan Р. K. S., 2017]. Однако данный вирус является птичьим, для которых доказана способность пересечь межвидовой барьер и инфицировать млекопитающих [Leymarie О. et al., 2017]. Так, для родственного вируса подтипа A/H5N6, относящегося к тому же клайду, зарегистрированы случаи инфицирования и смерти у человека [Grund С. et al., 2018]. У штаммов вируса гриппа подтипа A/H5N8 выделенных на территории России были обнаружены мутации, отвечающие за вирулентность, изменение хозяйской специфичности и за адаптацию вирусов для передачи от человека к человеку [Марченко В.Ю. и др., 2017].

Пути миграции многих видов перелетных птиц пересекаются в районе озера Увс-Нуур, находящегося на Российско-Монгольской границе. Оно является постоянной средой обитания для 46 видов водоплавающих птиц и местом остановки 215 видов птиц, мигрирующих на юг из Сибири. Во время широкого распространения высоко патогенных вирусов гриппа подтипа A/H5N1 в 2006 и 2009 г., эти вирусы были обнаружены у диких водоплавающих птиц на озере Увс-Нуур, поэтому эта зона представляет собой значимое место для отслеживания выскопатогенных вирусов птиц. В июне 2016 года в данном районе было выделено и охарактеризовано 3 штамма, относящихся к группе b вирусов гриппа подтипа A/H5N8 клайда 2.3.4.4: A/common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016, A/great crested grebe/Uvs-Nuur Lake/341/2016 и A/gray heron/Uvs-Nuur Lake/20/2016 [Lee D.H. et al., 2017].

Необходимость разработки противопандемических мер, в том числе и для борьбы с вирусами птичьего гриппа, отражена в приказе Роспотребнадзора РФ [Приказ №40 от 28.12.2004]. В «Глобальном плане ВОЗ по подготовке к борьбе с гриппом» до начала пандемии национальным органам рекомендуется испытывать и лицензировать пандемические вакцины, а также поддерживать развитие производства и обмена прототипами сезонных и пандемических вакцин, для возможного целевого их применения. В связи с этим актуальными являются исследования по подготовке вакцинных препаратов против вирусов гриппа подтипов A/H5N8, а также испытания этих вакцинных препаратов на животных моделях.

В настоящий момент нет данных о проведении клинических испытаний вакцин против вируса гриппа подтипа A/H5N8 [Tables on clinical evaluation of influenza vaccines, URL: http://www.who.int/inmiraization/diseases/influenza/clinical_evaluation_tables/en/#].

В качестве донора генов внутренних белков для получения реассортанта на основе вируса A/H5N8 мы использовали разработанный в ФГБУ «НИИ гриппа» Минздрава России универсальный донор А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) [Патент №2511431 от 25.07.2011], который ориентирован на получение реассортантных штаммов как для живой, так и для инактивированной гриппозных вакцин.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, было получение реассортанта на основе вируса гриппа A/H5N8 и донора генов внутренних белков А/Гонконг/1/68/162/35(Н3Н2) методом классической генетической реассортации, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин.

Получение штамма вируса гриппа RA-54 (A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8))

Штамм вируса гриппа RA-54 (A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8)) был получен методом классической генетической реассортации штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2) и потенциально пандемического вируса A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016 (H5N8). При получении штамма было проведено 7 пассажей в 10-12 дневных развивающихся куриных эмбрионах. Селективными факторами для отбора необходимых клонов являлись пониженная температура (26°С) и присутствие гипериммунной сыворотки к штамму А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).

Штамм представляет собой реассортант с формулой генома 2:6. Состав генома: 2 гена (НА и NA) от вируса дикого типа и 6 генов внутренних и неструктурных белков (РВ2, РВ1, PA, NP, М и NS) от вируса-донора А/Гонконг/1/68/162/35 (H3N2).

Подтверждение состава генома было выполнено с использованием рестрикционного анализа ДНК-копий сегментов РНК, полученных с помощью обратно-транскриптазной полимеразно-цепной реакции (ОТ-ПЦР). Полученные с помощью ОТ-ПЦР ДНК-копии сегментов РВ2, РВ1, PA, NP, NS и М вирусов А/Гонконг/1/68/162/35 и A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016 (обозначены на фиг. 1 как НК и UNL) обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Acc36I, MhlI, BsmBl, Acc36I, Bse3D1 и Bse3D1 соответственно. Принадлежность NA и НА определяли методом ОТ-ПЦР с типоспецифичными праймерами к различным субтипам. Анализ ДНК-копий сегментов РНК (фиг. 1) показал, что реассортант RA-54 имеет состав генома 2:6.

Антигенное соответствие гемагглютинина родительскому штамму дикого типа у реассортанта RA-54 было подтверждено в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (табл. 1).

Показано, что вакцинный кандидат RA-54 антигенно идентичен родительскому штамму дикого типа.

Полногеномное секвенирование показало наличие у реассортанта RA-54 нескольких нуклеотидных и аминокислотных замен, по сравнению с родительскими штаммами (табл. 2-4). Нуклеотидные последовательности сегментов реассортанта RA-54 опубликованы в базе данных GISAID под номером EPI_ISL_321098.

Примечание: Жирным шрифтом выделены мутации, приводящие к замене аминокислоты

Характеристика полученного штамма

Пример 1. Репродуктивные свойства штамма A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) (RA-54).

Штамм вируса гриппа RA-54 тестировали на инфекционную активность путем заражения развивающихся куриных эмбрионов 10-дневного возраста в соответствии с Методическими указаниями 3.3.2.1758-03 "Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа". Готовили десятикратные падающие разведения вируссодержащей аллантоисной жидкости. Каждым разведением начиная с 10^-4 до 10^-10 заражали по 3 куриных эмбриона. Инкубировали 48 часов при температуре 32°С. Наличие вируса определяли в РГА, инфекционную активность вируса рассчитывали по методу Рида и Менча.

Штамм вируса гриппа A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8) показал высокую репродуктивную активность в РКЭ. Гемагглютинирующая активность реассортанта составила RA-54 16-64 ГАЕ/50 мкл с 0,5% взвесью куриных эритроцитов. Инфекционная активность в РКЭ составила - 7,75 lgЭИД₅₀/0,2 мл.

Пример 2. Вакцинный штамм RA-54 обладает свойствами температурной чувствительности и холодоадаптированности.

Донор А/Гонконг/1/68/162/35 является универсальным, то есть обладает как высокой репродуктивностью, так и маркерами аттенуации - имеет температурочувствительный (ts) и холодоадаптированный (са) фенотип. Реассортанты на основе донора А/Гонконг/1/68/162/35, также наследуют ts-, са - фенотип.

Полученный реассортант наследовал от штамма-донора А/Гонконг/1/68/162/35 ts-, са- фенотип - способность хорошо репродуцироваться при пониженной температуре и почти полную потерю способности к репродукции при повышенной температуре (табл. 5).

RCT (Reproductive capacity at different temperatures) - репродуктивная способность при различных температурах

ts - температурочувствительный фенотип (RCT₃₉ более 5 lgЭИД₅₀/0,2 мл)

са - холодоадаптированный фенотип (RСТ₂₆ не более 3 lgЭИД₅₀/0,2 мл)

Стабильность реассортанта проверяли 5-кратным пассированием при температуре 32°С в системе РКЭ. Степень температурочувствительности и холодоадаптированности, а также уровень репродукции реассортантного штамма не изменялись. Таким образом, реассортантный штамм удовлетворяет требованиям температурочувствительности и холодовой адаптации, предъявляемым к вакцинным штаммам для ЖГВ, и требованиям высокой репродуктивности для ИГВ.

Пример 3. Заявляемый вакцинный штамм RA-54 безопасен для мышей.

Тестирование штамма вируса гриппа RA-54 на специфическую безопасность проводили на линейных белых мышах Balb/c, самках, массой 18-20 г (16 шт.). В исследованиях использовали здоровых животных, на которых ранее не проводили какие-либо испытания. Испытания проводили в соответствии с методическими указаниями МУК 4.1/4.2.588-96.

Мышей инфицировали интраназально в дозе 6,5 lgЭИД₅₀ на мышь, в объеме 50 мкл. В течение периода наблюдения (14 суток) все животные остались живы и ни у одного из них не были выявлены видимые признаки заболевания. На 3-и и 6-е сутки после заражения у трех мышей проводили забор органов (легкие, носовые ходы и мозг) с целью индикации антигена и его накопления. Репродукцию вируса определяли по показателям титрования суспензии органов в культуре клеток MDCK. Результаты приведены в табл. 6.

У мышей, инфицированных штаммом дикого типа, наблюдается репродукция вируса в носовых ходах и легких на 3-и сутки. К 6-м суткам вирус показывает высокий уровень репродукции во всех рассматриваемых органах мышей. У мышей, инфицированных реассортантным штаммом, наблюдалось наличие вируса только в носовых ходах на 3-и и 6-е сутки. В легких и мозге вирус не реплицируется, что подтверждает его аттенуированный фенотип. Полученные данные доказывают специфическую безопасность реассортантного штамма RA-54.

Пример 4. Вакцинный штамм RA-54 является иммуногенным для мышей.

На основе реассортантных штаммов были подготовлены кандидатные вакцинные препараты живой и инактивированной гриппозных вакцин (ЖГВ и ИГВ соответственно). Для получения ЖГВ накопленный вирусный материал реассортантного вируса разводили фосфатно-солевым буфером (ФСБ) до концентрации 6,5 lgЭИД₅₀/50 мкл. ЖГВ вводили интраназально, в объеме 50 мкл. Для получения ИГВ вирусный материал инактивировали 0,02% формалином, затем очищали и концентрировали методом изопикнического центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Содержание гемагглютинина в вакцинном препарате оценивали методом электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией. Доза ИГВ (250 мкл) содержала 10 мкг НА. В качестве адъюванта в одной из групп использовали полиоксидоний (ПО)- 200 мкг на дозу. ИГВ вводили внутримышечно (в верхнюю треть бедра задних конечностей).

Препараты ЖГВ и ИГВ использовали для иммунизации мышей и исследования иммуногенности. Иммунизация была проведена двукратно с двухнедельным интервалом. Данные по содержанию антигемагглютинирующих антител к вирусам гриппа в сыворотках крови мышей, иммунизированных препаратами ЖГВ и ИГВ RA-54, демонстрируют достоверное (р<0,05) повышение уровня антигемагглютинирующих антител по сравнению с контрольными животными. Среднегеометрический титр (СГТ) антигемагглютинирующих антител в сыворотках после 2й иммунизации ЖГВ и ИГВ составил 285.3 и 205.8 соответственно (фиг. 2). СГТ нейтрализующих антител в сыворотках после 2й иммунизаций ЖГВ и ИГВ составил 7240.8 и 2560.0 соответственно (фиг. 3).

Полученные данные показывают, что после иммунизации мышей моновакцинами ЖГВ и ИГВ на основе реассортанта RA-54 формируются как гемагглютинирующие, так и нейтрализующие антитела в титрах, превышающих защитные титры (защитный титр в РТГА≥1:40; защитный титр в РН≥1:80). Таким образом, и живая, и инактивированная моновакцины на основе полученного реассортанта RA-54, являются высоко иммуногенными.

Пример 5. Вакцинный штамм RA-54 обладает протективным действием для мышей.

Степень защиты, которую дают моновакцины ЖГВ и ИГВ на основе реассортанта RA-54, в сравнении с контрольной группой, оценивали на самках мышей линии Balb/c на модели летального заражения. Мышей (по 10 в группе) через 2 недели после последней иммунизации заражали интраназально вирусом дикого типа A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016 в дозе 10LD₅₀. За мышами наблюдали в течение 14 суток после заражения, ежедневно оценивали изменение массы тела (показатель тяжести инфекции) и гибель животных.

У мышей, иммунизированных моновакциной ЖГВ максимальная потеря массы тела составила 2,7% на 5-й день после заражения, а у мышей, иммунизированных моновакциной ИГВ, не наблюдалось снижения массы тела (фиг. 4). В контрольной группе мышей наблюдалось резкое снижение массы тела мышей, начиная с 5-х суток после заражения (максимальное снижение массы тела составило 21%), и проявлялись клинические признаки заболевания: возникало частое, поверхностное дыхание, шерсть становилась взъерошенной, снижалась двигательная активность, уменьшалось потребление корма.

Иммунизация мышей моновакцинами ЖГВ и ИГВ обеспечивала полную защиту (фиг. 5) от летального заражения вирусом гриппа A/H5N8 в дозе 10LD₅₀ (выживаемость 100%). Все мыши контрольной группы погибли.

Полученные данные свидетельствуют, что моновакцины ЖГВ и ИГВ обладают выраженным защитным действием против вируса гриппа A/Common tern/Uvs-Nuur Lake/26/2016. У мышей, иммунизированных моновакцинами ЖГВ и ИГВ на основе реассортанта RA-54, после заражения вирусом гриппа A/H5N8 в дозе 10LD₅₀ не наблюдалось снижения массы тела, развития признаков гриппозной инфекции, гибели животных, что свидетельствует о формировании защитного стерильного иммунитета.

Изобретение относится к области биотехнологии. Influenzavirus А, подтип H5N8, штамм A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2885, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H5N8. Изобретение позволяет усилить защитные действия вакцин против пандемического вируса гриппа А подтипа Н5. 6 ил., 5 табл., 5 пр.

Influenzavirus А, подтип H5N8, штамм A/UNL/HK/2:6/2017 (H5N8), депонированный в Государственную коллекцию вирусов ФГБУ «ФНИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России под №2885, для производства инактивированных и живых гриппозных вакцин против потенциально пандемического вируса гриппа A/H5N8.