СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕНСИБИЛИЗАЦИИ К АЛЛЕРГЕНАМ Российский патент 2000 года по МПК G01N33/52 G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии и аллергологии, и может быть использовано для выявления сенсибилизации организма к аллергенам в стационаре и поликлинике.

Известен способ определения сенсибилизации к аллергенам путем проведения скарификационных и внутрикожных проб (см. Методы специфической диагностики аллергии у детей. Под ред. Потемкина А.М. - Л., 1988. - С. 40 -42): на предварительно обработанную 70%-ным спиртом кожу ладонной поверхности предплечья наносят капли специфических аллергенов отдельными шприцами на расстоянии 34 см друг от друга, затем через каждую каплю отдельной иглой или скарификатором делают две царапины длиной до 0,5 см, стараясь не повредить кровеносные сосуды. Результат оценивают каждые 15 - 20 мин.

Внутрикожные аллергические пробы ставят также на внутренней поверхности предплечья. Кожу обрабатывают 70%-ным спиртом, иглу вводят в поверхностный слой эпидермиса. При правильном введении аллергена на коже образуется белый бугорок (инфильтрат), который должен рассосаться в течение 15 - 20 мин.

Однако данные способы инвазивны, возможны местные и общие аллергические реакции, имеется большое количество противопоказаний (обострение аллергического заболевания, декомпенсированные состояния при заболеваниях сердца, печени, почек, системы крови, опухолевые состояния), необходимо подготовить больного (отмена антигистаминных средств, симпатомиметиков, глюкокортикоидов, гипоаллергенная диета) и специально обучить медперсонал, при этом внутрикожные пробы более чувствительны, но менее специфичны, чем скарификационные, так как дают большее число ложноположительных реакций.

Известны способ определения сенсибилизации к аллергенам с помощью электродиагностического автоматического хемилюминесцентного аппарата CLAI ЗАО "МЕДЛАНД-Москва", содержащего набор сложных диагностических аллергенспецифических реактивов (20 панелей по 36 аллергенов в одном наборе), являющегося дорогостоящей, закрытой системой (использующей только реактивы данной фирмы), и хемилюминесцентный способ оценки неинфекционной аллергии "CIBA CORDING" с применением импортных реактивов и аппаратуры СП "Амерканд" (см. Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии: сб. трудов 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов (28 - 31 января 1997 г.) - М., 1997. - С. 698 - 699). Оба способа требуют подготовки больного к исследованию (отмена глюкокортикоидов за 7 дней до взятия крови), мониторинг негативного результата при положительном анамнезе, клиническое наблюдение при положительном результате, без данных анамнеза.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к заявляемому изобретению является способ определения сенсибилизации к аллергенам (см. а.с. СССР N 1569705, кл. G 01 N 33/48, 20.01.87), заключающийся в выделении из крови больного лимфоцитов и определении их спонтанной хемилюминесценции и хемилюминесценции после 10 - 20 мин инкубации с 20 мкл раствора аллергена с последующим сравнением полученных показателей. Способ характеризуется трудоемкостью, большими временными и материальными затратами (реактивы, оборудование), процесс подсчета числа клеток является субъективным.

Задача изобретения заключается в упрощении способа определения сенсибилизации к аллергенам и снижении материальных затрат.

Для этого в способе определения сенсибилизации к аллергенам путем инкубации лимфоцитов с аллергеном и без него с последующим измерением их хемилюминесценции, согласно изобретению используют цельную кровь, измеряют с помощью люминолзависимой хемилюминесценции интенсивность свечения ее до и после инкубации и при увеличении этого показателя пробы без аллергена после инкубации (в контроле) по сравнению с показателем пробы до инкубации (с исходным) и увеличении или снижении на 15% и более показателя пробы с аллергеном после инкубации (в опыте) по сравнению с контролем или при снижении показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 49% и более показателя в опыте по сравнению с контролем определяют сенсибилизацию к аллергену.

Реакция люминолзависимой хемилюминесценции со специфическими аллергенами в стандартных разведениях проводилась с оценкой результатов на хемилюминомере ХЛ-003 (производитель УГАТУ МНИЛ ТСМЭИ). За показатель интенсивности свечения принята величина светосуммы хемилюминесценции - площадь, измеряемая под кривой записи излучения за 5 мин, в условных единицах в мин по эталону СФХМ 1 (ГОСТ 9411-81), суммарный световой поток которого 5,1 • 10⁵ квант в сек.

Взаимосвязь определенных показателей светосуммы хемилюминесценции с характером реакции на аллерген изучалось методом корреляционного анализа.

Исходная выборка данных состояла из следующих показателей состояния иммунной системы: светосумма хемилюминесценции в исходной (спонтанная) и в контрольной пробах, в опытных пробах с аллергенами различных типов; биологические показатели - кожные пробы положительные и отрицательные (КП+, КП-).

Путем сравнения результатов интегральной светимости контрольных проб с данными светимости при добавлении аллергенов исследовалась их корреляция с результатами кожных проб.

Обследовано 100 человек, 23 из них были расценены как практически здоровые, а 77 имели то или иное аллергическое заболевание с сенсибилизацией к различным аллергенам, подтвержденной кожными пробами. Анализ данных проводился с использованием ППП Statistika for Windows (см. таблицу).

Полученные значения парной корреляции между показателями хемилюминесценции как в контрольных пробах, так и в пробах с аллергенами с показателями кожных проб составили величины в пределах от 0,33 до 0,63 при уровне значимости p < 0,05, что свидетельствует о достаточно высокой степени статистической связи с указанными пробами и подтверждает возможность частичной замены кожных проб предлагаемым менее инвазивным способом.

Светосумма спонтанной хемилюминесценции в группе здоровых составила 4,29 ± 0,79 у.е.•мин, у аллергиков 5,88 ± 0,73 у.е.•мин. По характеру изменения значений светосуммы контрольной пробы относительно исходной пробы обследованные были разделены на две группы: с уменьшением и с увеличением. Сенсибилизация к специфическому аллергену определялась также по изменению светосуммы опытной пробы с аллергеном по сравнению с контрольной. В группе больных с увеличением светосуммы контрольной пробы по сравнению с исходной сенсибилизацию устанавливали при увеличении или снижении на 15% и более светосуммы опытной пробы по сравнению с контрольной, а в группе с уменьшением светосуммы контрольной пробы по сравнению с исходной - при увеличении или снижении на 49% и более светосуммы опытной пробы по сравнению с контролем.

Способ осуществляют следующим образом.

Готовят физиологический раствор с люминолом 5 • 10⁵M из расчета 2 мл на одну пробу. У больного натощак производят забор крови из локтевой вены в пластиковую посуду по 1 мл и добавляют гепарин из расчета 50 ед. гепарина на 1 мл крови: содержащий 5000 ед. препарат разводят в десять раз в физиологическом растворе, отбирают 0,1 мл и добавляют 1 мл крови. Хранят в течение 4 - 8 час при 2 - 4^oC.

0,1 мл гепаринизированной крови помещают в стеклянную кювету с 2 мл физиологического раствора с люминолом, подогретого до 37^oC, и регистрируют спонтанную (исходную) хемилюминесценцию за 5 мин. К 0,1 мл гепаринизированной крови 2-ой пробы (контрольной) добавляют 0,01 мл физиологического раствора и инкубируют в термостате при 37^oC в течение 20 мин, после чего переносят в стеклянную кювету с 2 мл физиологического раствора с люминолом, подогретого до 37^oC, и производят замер хемилюминесценции за 5 мин для контроля неспецифического воздействия температурного фактора. В остальные пробы (опытные) к 0,1 мл гепаринизированной крови добавляют по 0,01 мл раствора исследуемых аллергенов и инкубируют при 37^oC в термостате в течение 20 мин, затем помещают в стеклянную кювету с 2 мл раствора с люминолом, подогретого до 37^oC, и регистрируют хемилюминесценцию за 5 мин. Сопоставляя полученные результаты, выявляют сенсибилизацию к аллергену при увеличении показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 15% и более показателя в опыте по сравнению с контролем или при снижении показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 49% и более показателя в опыте по сравнению с контролем (таблица).

Хемилюминесценцию проб измеряют на хемилюминомере ХЛ-003.

Пример 1. Больной А., 10 лет.

Диагноз: поллиноз; бронхиальная астма, атопическая форма, внеприступный период.

Считает себя больным с 6 лет. Заболевание началось в конце мая 1991 года остро с приступообразного мучительного кашля с выделением скудной, трудноотходящей мокроты слизистого характера, ощущения нехватки воздуха, субфебрильной температуры. Ребенок был госпитализирован в центральную районную больницу с диагнозом: астматический бронхит. После проведенного лечения состояние улучшилось. В дальнейшем отмечались повторяющиеся приступы одышки, кашля с вязкой, трудноотходящей мокротой слизистого характера, субфебрильной температурой, цианозом губ и слизистых 1-3 раза в весенне-осенний период. Постепенно увеличивалась тяжесть состояния, ребенок принимал вынужденное положение с фиксацией пояса верхних конечностей. Лечился как амбулаторно, так и в стационаре. Проведено два курса специфической гипосенсибилизации. В настоящий момент поступает для проведения третьего курса специфической гипосенсибилизации.

Проведены скарификационные кожные пробы с аллергенами:
Домашняя пыль - +++
Перо подушки - ++
Лещина - +++
Береза - ++
Дуб - ++
Ольха - +++
Ребенку проведено исследование согласно предлагаемому изобретению. Утром натощак взята и гепаринизирована венозная кровь в количестве 1 мл. 0,1 мл гепаринизированной крови поместили с 2 мл подогретого до 37^oC физиологического раствора с люминолом в стеклянную кювету и произвели замер спонтанной (исходной) хемилюминесценции за 5 мин. К 0,1 мл гепаринизированной крови 2-ой пробы добавили 0,01 мл физиологического раствора и инкубировали в термостате при 37^oC в течение 20 мин, затем перенесли с 2 мл подогретого до 37^oC физиологического раствора с люминолом в стеклянную кювету и замерили хемилюминесценцию (контрольную) за 5 мин. В остальные 6 проб (опытных) к 0,1 мл гепаринизированной крови добавили по 0,01 мл стандартных растворов соответствующих аллергенов и инкубировали при 37^oC в термостате в течение 20 мин, после чего поместили в стеклянную кювету с 2 мл подогретого до 37^oC физиологического раствора с люминолом и произвели замер хемилюминесценции за 5 мин. Получены следующие результаты:
исходная светосумма хемилюминесценции (1-й пробы) 3,75 у.е.•мин;
светосумма контрольной пробы (2-й) 1,75 у.е.•мин - уменьшение показателя относительно исходного;
светосумма 3-й пробы с аллергеном домашней пыли 2,7 у.е.•мин - увеличение на 54% по сравнению с контрольным показателем,
светосумма 4-й пробы с аллергеном пера подушки 2,61 у.е.•мин - увеличение показателя на 49,1% по сравнению с контролем,
светосумма 5-й пробы с аллергеном лещины 2,83 у.е.•мин - увеличение показателя на 61,7% по сравнению с контролем,
светосумма 6-й пробы с аллергеном березы 2,78 у.е.•мин - увеличение на 58,9% по сравнению с показателем в контроле,
светосумма 7-й пробы с аллергеном дуба 3,78 у.е.•мин - увеличение на 116% по сравнению с контролем,
светосумма 8-ой пробы с аллергеном ольхи 3,37 у.е.•мин - увеличение на 92,6% по сравнению с контролем.

На основании данных сделано заключение о наличии сенсибилизации больного к пыльцевым аллергенам лещины, березы, дуба, ольхи, а также бытовой сенсибилизации к домашней пыли и перу подушки.

Пример 2. Больная Ш., 6 лет.

Диагноз: атопический дерматит, респираторный аллергоз.

Больна с детства, неоднократно лечилась в условиях стационара. Ухудшение состояния отмечает в летнее время: появляются гиперемия и высыпания на коже лица, туловища, конечностей, сильный зуд, кашель, заложенность носа. В зимний период проявления заболевания затухают. В настоящий момент поступила для определения аллергена с целью проведения специфической гипосенсибилизации.

Проведены скарификационные кожные пробы с аллергенами:
Трава ежи - +++
Ольха - ++
Лещина - Отр.

Ясень - Отр.

Лисохвост - Отр.

Дуб - Отр.

Клен - Отр.

Береза - +
Домашняя пыль - +
Перо подушки - +
Исследование проведено согласно указанной методике.

Получены следующие результаты:
исходная светосумма хемилюминесценции (1-й пробы) составила 1,71 у.е. •мин;
светосумма контрольной (2-й) пробы) 2,2 у.е.•мин - увеличение относительно исходной;
3-я проба (трава ежи) - 2,55 у.е.•мин, увеличение на 15,9% по сравнению с контролем,
4-я проба (ольха) - 1,77 у.е.•мин, уменьшение на 19,5% по сравнению с контролем,
5-я проба (лещина) - 2,05 у.е.•мин, уменьшение на 6,8% по сравнению с контролем,
6-я проба (ясень) - 2,1 у.е.•мин, уменьшение на 4,5% по сравнению с контролем,
7-я проба (лисохвост) - 2,32 у.е.•мин, увеличение на 5,45% по сравнению с контролем,
8-я проба (дуб) - 2,37 у.е.•мин, увеличение на 7,7% по сравнению с контролем,
9-я проба (клен) - 2,3 у.е.•мин, увеличение на 4,5%,
10-я проба (береза) - 1,81 у.е.•мин, уменьшение на 17,7% по сравнению с контролем,
11-я проба (домашняя пыль) - 1,82 у.е.•мин, уменьшение на 17,2% по сравнению с контролем,
12-я проба (перо подушки) - 3,45 у.е.•мин, увеличение на 56,8% по сравнению с контролем.

Таким образом, у больной Ш. выявлена сенсибилизация к пыльцевым аллергенам травы ежи, ольхи, березы, бытовая сенсибилизация к домашней пыли и перу подушки, так как увеличение или снижение (уменьшение) показателя исследуемой пробы по сравнению с контролем составляет величину, большую 15%, при одновременном увеличении показателя в контроле по сравнению с исходным.

Пример 3. Больной Б., 6 лет.

Диагноз: бронхиальная астма, инфекционно-аллергическая форма, межприступный период.

С 3 месяцев экссудативно-катаральный диатез. После 6 месяцев наблюдались частые заболевания, сопровождавшиеся сухим, приступообразным, длительным кашлем. Впервые одышка появилась в возрасте 2,5 лет во время перенесенной бронхопневмонии. После начала посещения детского дошкольного учреждения у ребенка ежегодные повторные бронхиты, с 4-х лет с астматическим компонентом. Выраженная аллергическая реакция на пенициллин по типу крапивницы. Дважды лечился в условиях стационара. Наследственный анамнез отягощен: мать ребенка страдает бронхиальной астмой.

При обследовании аллергологом были проведены скарификационные кожные пробы со специфическими аллергенами:
Библиотечная пыль - +
Домашняя пыль - +++
Перо подушки - +
Куриное яйцо - Отр.

Измерение хемилюминесценции проб крови по предлагаемому способу выявило сенсибилизацию к бытовым аллергенам: библиотечной и домашней пыли, перу подушки.

Исходная светосумма хемилюминесценции 5,51 у.е.•мин;
светосумма хемилюминесценции в контроле 7,71 у.е.•мин - увеличение по сравнению с исходной;
3-я проба (библиотечная пыль) - 11,27 у.е.•мин, увеличение на 46,2% по сравнению с контролем,
4-я проба (домашняя пыль) - 11,23 у.е.•мин - увеличение на 45,7% по сравнению с контролем,
5-я проба (перо подушки) - 11,07 у.е.•мин - увеличение на 43,6% по сравнению с контролем,
6-я проба (куриное яйцо) - 7,02 у.е.•мин - снижение на 8,95% по сравнению с контролем.

В данном случае показатель в контроле увеличился по сравнению с исходным и показатели в пробах с аллергенами библиотечной пыли, домашней пыли, пера подушки увеличились более чем на 15% по сравнению с контролем, что позволяет судить о сенсибилизации больного Б. к бытовым аллергенам, исследованным нами.

Предлагаемый способ определения сенсибилизации к аллергенам в сравнении с известными обладает следующими преимуществами:
- меньшая инвазивность;
- простота в исполнении, снижение материальных затрат, отсутствие подготовки и зависимости от его состояния;
- возможность использования реактивов различных фирм.

Разработанный способ может быть использован для выявления сенсибилизации больных к различным аллергенам в качестве скриннинг-теста в иммуноаллергологическом отделении стационара или в поликлинике.

Способ может быть использован в медицине, а именно в иммунологии и аллергологии. Инкубируют лимфоциты с аллергеном и без него с последующим измерением хемилюминесценции. Используют цельную кровь. Измеряют с помощью люминолзависимой хемилюнесценции интенсивность свечения ее до и после инкубации. При увеличении показателя пробы без аллергена после инкубации (в контроле) по сравнению с показателем пробы до инкубации (с исходным) и увеличении или снижении на 15% и более показателя пробы с аллергеном после инкубации (в опыте) по сравнению с контролем или при снижении показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 49% и более показателя в опыте по сравнению с контролем судят о сенсибилизации к аллергену. Способ обеспечивает упрощение определения. 1 табл.

Способ определения сенсибилизации к аллергенам путем инкубации лимфоцитов с аллергеном и без него с последующим измерением их хемилюминесценции, отличающийся тем, что используют цельную кровь, с помощью люминолзависимой хемилюминесценции измеряют интенсивность свечения ее до и после инкубации и при увеличении этого показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 15% и более показателя в опыте по сравнению с контролем или при снижении показателя в контроле по сравнению с исходным и увеличении или снижении на 49% и более показателя в опыте по сравнению с контролем определяют сенсибилизацию к аллергену.