ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОВИРУСНЫМ ДЕЙСТВИЕМ И СОДЕРЖАЩЕЕ 2-МЕТИЛТИО-5-МЕТИЛ-6-НИТРО-1,2,4-ТРИАЗОЛО[1,5-a]ПИРИМИДИН-7(3Н)-ОН Российский патент 2009 года по МПК C07D487/04 A61K31/4196 A61P29/00 

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается лекарственного средства, содержащего 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладающего противовирусным действием, предназначенного для лечения и профилактики инфекционных вирусных заболеваний животных и человека, и может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, в животноводстве и птицеводстве.

Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью. В литературе описано получение 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она нитрованием 5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Y.Makisumi Synthesis of potential anti-cancer agents. VII. 6-Nitro- and 6-amino-s-triazolo[2,3-a]pyrimidines, Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 1961, №9, p.873-877; Т.П.Кофман, Т.А.Уварова, Г.Ю.Карцева, Т.Л.Успенская 6-Нитро- и 6-бромпроизводные 4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она, Журнал органической химии, 1997, т.33, вып.12, с.1784-1793); упоминается также натриевая соль 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а] пиримидин-7-она (М.Н.Кушнир, В.Л.Русинов, Е.Н.Уломский, Н.А.Клюев, С.В.Шоршнев, Г.Г.Александров, О.Н.Чупахин Нитроазины. XXII. Алкилирование и прототропная таутомерия в ряду 6-нитро-7-оксо-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидинов, Журнал органической химии, 1993, т.29, вып.3, с.629-638); также имеются данные об анти-арбовирусной активности 5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (Виноград И.А., Пластунов В.А., Козловский М.М., Бенцель Л.В., Билецка Г.В., Лозинский И.М., Рогочий Е.Г., Шоломей М.Д. Микробioлогичнiй Журнал. 2001, т.63, №2, с.14-19).

В качестве изобретения предлагается лекарственное средство, содержащее активную составляющую, обладающую противовирусным действием и представляющую собой 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он формулы (1). Кроме соединения (1) лекарственное средство может содержать фармацевтически приемлемые компоненты: наполнители, разбавители и/или другие вспомогательные вещества.

Для оценки противовирусных свойств соединения (1) и лекарственного средства на его основе использованы известные противовирусные лекарственные препараты - ремантадин, арбидол и рибавирин.

Соединение (1) получено конденсацией 3-метилтил-5-амино-1,2,4-триазола (2) с ацетоуксусным эфиром с последующим нитрованием образующегося 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7-она (3).

Соединение (1) представляет собой бледно-желтое кристаллическое вещество, растворимое в воде, этаноле, диметилсульфоксиде, нерастворимое в этилацетате, хлороформе, гексане.

Данные элементного анализа, ЯМР ¹Н и ИК-спектроскопии соединения (1) полностью соответствуют приписываемому строению (см. пример 1).

Лекарственное средство может быть использовано либо перорально, либо с помощью парентеральных инъекций в растворе. Оно может применяться самостоятельно, например в форме микрокапсул, либо с подходящими вспомогательными средствами и/или наполнителями.

Подходящие твердые или жидкие лекарственные формы включают, к примеру, гранулы, порошки, покрытые оболочкой таблетки, микрокапсулы, суппозитории, сиропы, эликсиры, суспензии, эмульсии, капли или инъекционные растворы, а также препараты с целевой доставкой активной субстанции, в производстве которых обычно используются вспомогательные вещества, такие как наполнители, дезинтеграторы, связующие, создающие оболочку агенты, разрыхлители, смазочные добавки, отдушки или подсластители. Подходящими вспомогательными веществами являются, например, диоксид титана, лактоза, маннитол и другие сахара, тальк, молочный альбумин, желатин, мука, целлюлоза и ее производные, животные и растительные масла, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода, и моноатомные и полиатомные спирты, например глицерин.

Пример 1. Синтез 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]-пиримидин-7(3Н)-она (1)

1 стадия: 2-Метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (2). Смесь 130 г (1 моль) 3-метилтио-5-амино1,2,4-триазола (3) и 140 мл (1,1 моль) ацетоуксусного эфира в 300 мл уксусной кислоты кипятят в течение 2 часов. После охлаждения реакционной массы выпавший осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают из воды и сушат на воздухе при комнатной температуре. Выход (2) 125,5 г (64%).

2 стадия: 2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он (1). К смеси 76 мл (1,25 моль) концентрированной азотной кислоты (d 1,4 г/мл) и 250 мл концентрированной серной кислоты (d 1,83 г/мл), охлажденной до 0°С, добавляют порциями 98 г (0,5 моль) 2-метилтио-5-метил-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-она (3) таким образом, чтобы температура реакционной массы не превышала 40°С. После добавления всего вещества реакционную массу перемешивают 3 часа при комнатной температуре и выливают в 500 мл ледяной воды. Полученный раствор нейтрализуют концентрированным водным аммиаком и отфильтровывают выпавший осадок аммониевой соли. Аммониевую соль суспендируют в 40 мл воды, охлаждают до 5°С и аккуратно приливают концентрированную соляную кислоту до рН 1. Выпавший осадок отфильтровывают и сушат на воздухе. Выход (1) 67,5 г (54%).

2-Метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он имеет следующие физико-химические характеристики:

Т_ПЛ>280°С; ¹Н ЯМР-спектр в ДМСО-d₆ δ, м.д.: 2,57 (3Н, т, С-СН₃), 3,02 (3Н, с, SCH₃), 10,2 (1Н, уш.с, NH). Найдено: С - 34.62, Н - 3,07, N - 29,22. Брутто-формула - С₇Н₇N₅O₃S. Вычислено: С - 34.85, Н - 2.92, N - 29.03%. ИК-спектр, ν, см^-1: 1365, 1558 (вал, NO₂), 1720 (вал, С=O), 3420 (вал, NH).

Пример 2. Оценка токсичности соединения (1)

1. Оценка цитотоксичности.

Цитотоксичность оценивали в отношении культуры клеток GМК-АН-1(Д) и СПЭВ. Плотность клеток составляла 250 тыс./мл. Суспензию клеток по 1 мл вносили в стеклянные пробирки, в течение 48 ч инкубировали при 37°С для формирования монослоя. Подготовленные на среде поддержания в концентрации от 500 до 2 мкг/мл соединение (1) вносили в пробирки с монослоем культуры клеток. На каждую дозу соединения (1) использовали по 4 пробирки с монослоем. Визуальный учет с помощью светового микроскопа проводили ежедневно. Начальные этапы цитопатического действия (ЦПД) характеризовались изменением морфологии клеток, далее наблюдали их округление и отслоение от стекла, разрушение монослоя. В зависимости от концентрации препарата ЦПД наступало на 1-7 сутки после внесения препаратов.

Деструктивные изменения 50% клеток СПЭВ наблюдали при внесении в питательную среду 500 мкг/мл соединения (1). В 25% случаях деструкцию монослоя клеток вызывало соединение в дозе 250 мкг/мл. В культуре клеток GMK-AH-(Д) 50% деструкцию монослоя вызывало внесение в питательную среду 500 мкг/мл соединения. При внесении соединения в концентрации 250 мкг/мл цитопатические изменения в культуре клеток СПЭВ и GMK-AH-1(Д) не были обнаружены.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что максимально-переносимая доза (МПД) соединения (1) для культуры клеток СПЭВ составляет 125 мкг/мл, GMK-AH-1(Д) - 25 мкг/мл.

2. Острая токсичность для лабораторных животных

Острую токсичность соединения (1) оценивали для неинфицированных 2-недельных белых мышей-сосунков при однократном пероральном введении соединения (1). Разведения соединения (1) в диапазоне от 30 мг/кг до 2000 мг/кг готовили на физ. растворе и вводили животным по 0.05 мл однократно. На каждое разведение использовали не менее 20 животных, за которыми осуществляли наблюдение в течение 14 дней. Рассчитывали ЛД₅₀ по Керберу в модификации И.П.Ашмарина. Контролировали изменения в поведении животных, внешнего вида, веса, а также отсутствие или наличие гибели животных. Результаты оценки токсичности, приведенные в таблице 1, свидетельствуют о том, что соединение (1) в концентрации от 30 до 250 мг/кг нетоксично для белых мышей массой 4-5 г при однократном пероральном применении. При максимально используемой дозе 100% гибель животных при однократном применении соединения (1) также отсутствовала.

Таким образом, рассчитать ЛД₅₀ для белых мышей не представляется возможным. В более высоких концентрациях в малом объеме растворителя соединение (1) плохо растворимо, густая консистенция их не позволяет использовать конюли для введения животным.

Таблица 1
Оценка токсичности препаратов при однократном пероральном введении белым мышам - сосункам Препарат Концентрация препарата, мг/кг массы животного 2000 1000 500 250 125 62 31 количество животных павших/количество животных в опыте Соединение (1) - 2/20 1/20 0/20 0/20 0/20 0/20

Пример 3. Изучение эффективности соединения (1) в культурах клеток

1. В отношении вируса Западного Нила

Изучение противовирусной эффективности соединения (1) в отношении вируса Западного Нила (ЗН) проводили в культуре клеток GMK-АН-1(Д). Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 4 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,01 БОЕ/кл. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина. Затем вносили свежую среду, содержащую исследуемые дозы соединения (1), и инкубировали в течение 2-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации клетки разрушали криодеструкцией: трехкратным быстрым замораживанием (в криостате при температуре минус 30°С) и быстрым оттаиванием (водяная баня при комнатной температуре). Уровень накопления возбудителя в исследуемых пробах определяли титрованием проб методом получения негативных колоний вируса в монослое культуры клеток GMK-AH-1(Д) под твердым агаровым покрытием.

Результаты оценки противовирусной эффективности представлены в таблице 2. При применении в максимально переносимой концентрации соединения (1) подавление репродукции вируса составило 60,0%.

Таблица 2
Изучение влияния препаратов на репродукцию вируса ЗН, штамм Eg 101 в культуре клеток GMK-AH-1(Д) Препарат Доза препарата, мкг/мл Уровень накопления вируса, lg БОЕ/мл Уровень подавления репродукции вируса, Δ, lg Коэффициент ингибирования, процент 2 3 4 5 6 Соединение (1) 100 6,5 0,4 60,0 10 6,7 0,2 37,5 1 6,8 0,1 18,8 Рибавирин 100 5,0 1,9 98,6 Контроль дозы вируса - 6,9 - -

2. В отношении вируса гриппа A (H5N1)

Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vitro в культуре клеток МДСК. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД₅₀/мл.

Для изучения противовирусной эффективности соединение (1) и ремантадин вносили в поддерживающую среду через 1 час после инфицирования. На каждую дозу препарата использовали не менее 10 пробирок с монослоем культуры клеток двухсуточного возраста. Инфицирующая доза вируса составила 0,1 ЦПД₅₀/клетку. После адсорбции вируса в течение 60 минут при температуре от (37,0±0,5)°С монослой трижды промывали питательной средой ПС-4 на растворе Хенкса, содержащей 2% сыворотки КРС и по 100 ЕД/мл пенициллина и стрептомицина, затем вносили свежую среду, содержащую различные концентрации исследуемых препаратов, и инкубировали в течение 3-х суток при температуре от (37,0±0,5)°С. По окончании инкубации визуально учитывали цитопатический эффект, вызванный в культуре клеток вирусом, с использованием светового микроскопа (объектив х 8-10, окуляр х 7-10).

Результаты изучения подавления цитопатической активности вируса гриппа препаратами в культуре клеток MDCK, представленные в таблице 3, свидетельствуют о том, что при использовании соединения (1) через 1 ч после инфицирования культуры клеток уровень подавления ЦПД вируса составил 40%.

Таблица 3
Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению цитопатического действия вируса Препарат Доза препарата, мкг/мл Частота выявления ЦПД, Х Подавление ЦПД, процент, Х±σ_х Соединение (1) 100,0 19/30 36,6±3,3 10,0 25/30 16,7±3,3 1,0 10/10 0 Ремантадин 25 3/30 86,7±3,3 Контроль дозы - 30/30 - Контроль среды - 0/10 -

В таблице 4 проведены результаты изучения подавления репродукции вируса в культуре клеток MDCK. Уровень накопления вируса оценивали титрованием проб по гибели РКЭ. Соединение (1) в максимальной концентрации также статистически значимо подавляет репродукцию вируса гриппа. При этом коэффициент ингибирования составил 98,2%. Препарат сравнения ремантадин практически полностью подавлял репродукцию вируса.

Таблица 4
Оценка эффективности препаратов в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) в культуре клеток MDCK по подавлению репродукции вируса Препарат Доза препарата, мкг/мл Схема внесения препарата Уровень накопления вируса, lg ЭЛД₅₀/мл Уровень подавления накопления вируса, Δ, lg Коэффициент ингибирования, процент Соединение (1) 100 +1 ч 5,3 1,7 98,2 Ремантадин 25 +2 ч 2,0 5,0 99,99 Контроль - - 7,0 - -

Пример 4. Изучение эффективности препаратов на лабораторных животных 1. Изучение эффективности препаратов в отношении вируса гриппа А (H5N1)

Оценку эффективности в отношении вируса гриппа, штамм А/курица/Курган/2/05 (H5N1) проводили in vivo с использованием белых мышей массой 12-15 г. В качестве инфицирующего препарата использовали аллантоисную жидкость инфицированных РКЭ с биологической активностью 6,5 lg ЦПД₅₀/мл, 9,01g ЭЛД₅₀/мл, 5,0 lg ЛД₅₀/мл.

Соединение (1) и соединение сравнения вводили белым мышам перорально по профилактической и лечебной схемам, а также по схеме экстренной профилактики.

Результаты изучения профилактической эффективности соединения в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1), представлены в таблицах 5. Защита от гибели при использовании соединения (1) составила в среднем 20%.

Таблица 5
Изучение профилактической эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) Препарат Схема введения препарата Доза препарата,
мг/кг Количество животных в группе Гибель животных Защитная эффективность от гибели, процент Среднее время жизни животных в группе, дни Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни   -120 ч…         9,4 0,7 Соединение (1) -24 ч, -1 ч 50 20 16 20         60 20 11 47 11,3 2,8 Арбидол -24 ч, -1 ч                 30 20 11 45 11,6 2,5 Контроль дозы - - 20 20 - 8,7 - Контроль стада - - 20 0 - 14 -

Результаты изучения эффективности соединения (1) и препаратов сравнения при применении его по схеме экстренной профилактики и лечебной схеме, представленные в таблицах 6 и 7, свидетельствуют об эффективности заявляемого соединения.

Таблица 6
Изучение эффективности в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) при введении его по схеме экстренной профилактики Препарат Схема введения препарата Доза препарата, мг/кг Частота гибели животных Защитная эффективность от гибели, процент Среднее время жизни животных в группе, дни Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни Соединение (1) +1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч, +120 ч, 144 ч 50 10/20 50 11,7 3,5 Арбидол 30 16/20 20 9,4 1,2 Контроль дозы - - 20/20 - 8,2   Контроль стада - - 0/20 - 14,0 -

Таблица 7
Изучение лечебной эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы гриппа у белых мышей, интраназально инфицированных вирусом гриппа, штамм А/курица/Курган/Россия/02/05 (H5N1) Препарат Схема введения препарата Доза препарата, мг/кг Частота гибели животных Защитная эффективность от гибели, % Среднее время жизни животных в группе, дни Увеличение средней продолжительности жизни, Δ, дни Соединение (1) +24 ч, +48 ч, +72 ч, +96 ч,   15/20 25 8,4 1,7   +120 ч, +144 ч 50         Арбидол +24 ч, +48 ч, +7 135 18/20 10 7,1 0,4   2 ч, +96 ч           Контроль дозы - - 20/20 - 6,7 - Контроль стада - - 0/20 - 14,0 -

2. Изучение эффективности в отношении вируса Западного Нила

Для оценки протективной эффективности белых мышей инфицировали подкожно в дозе 10ЛД₅₀. Препараты вводили перорально в дозе 50 мг/кг по следующим схемам: профилактика - в течение 6 суток до инфицирования раз в день и за 1 ч до инфицирования; экстренная профилактика - через 1 ч после инфицирования и далее в течение 5 суток; лечение - через 24 ч после инфицирования и далее в течение 6 суток. Результаты оценки эффективности, представленные в таблице 8, свидетельствуют о том, что соединение (1) эффективно в отношении экспериментальной формы ЛЗН у белых мышей и защищает от гибели 20% инфицированных животных. При этом удлинение СВЖ составило 2,3 суток. При экстренной профилактике защитная эффективность составила 20%.

Таблица 8
Результаты оценки эффективности препаратов в отношении экспериментальной формы лихорадки Западного Нила у белых мышей Препарат Схема Коэффици-
ент
защиты, % Среднее время жизни, сутки Удлинение среднего времени жизни, Δ сутки Уровень накопления вируса в головном мозгу павших животных lg БОЕ/мл Δ, lg   -144 ч, -120 ч, -96 ч, 20,0 14,5 2,3 7,4 0,9   -72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч           Соединение +1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, 20,0 14,0 1,8 7,5 0,8 (1) +96 ч, +120 ч, +144 ч             +24 ч, +48 ч, +72 ч, +9 0 12,1 0 8,5 0   6 ч, +120 ч, +144 ч             -72 ч, -48 ч, -24 ч, -1 ч 50,0 17,1 4,9 6,1 2,2   +1 ч, +24 ч, +48 ч, +72 ч, 85,0 21,0 8,8 0 8,3 Рибавирин +96 ч, +120 ч, +144 ч             +24 ч, +48 ч, +72 ч, +9 10,0 12,3 0,1 7,8 0,5   6 ч, +120 ч, +144 ч           Контроль дозы - - 12,2 - 8,3 - Контроль стада - - 21,0 -   -

Таким образом, лекарственное средство, содержащее в качестве активной составляющей соединение (1) - 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он, обладает высоким противовирусным действием, превышающим действие известных лекарственных средств, и может быть использовано в качестве противовирусного средства.

Описывается новое применение 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3н)-она. Вещество обладает противовирусным действием в отношении вируса гриппа A (H5N1), вируса лихорадки Западного Нила и других вирусных инфекций. Противовирусная активность широкого спектра действия выявлена впервые. 8 табл.

Лекарственное средство, обладающее противовирусным действием и содержащее 2-метилтио-5-метил-6-нитро-1,2,4-триазоло[1,5-а]пиримидин-7(3Н)-он формулы