НАТРИЕВАЯ СОЛЬ 2-МЕТИЛТИО-6-НИТРО-1,2-4-ТРИАЗОЛО[5,1-C]-1,2,4-ТРИАЗИН-7(4H)-ОНА, ДИГИДРАТ, ОБЛАДАЮЩАЯ ПРОТИВОВИРУСНОЙ АКТИВНОСТЬЮ Российский патент 2007 года по МПК C07D487/04 A61K31/53 

1. Область техники, к которой относится изобретение.

Изобретение относится к области биологически активных соединений и касается натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата, обладающей противовирусным действием, предназначенной для лечения и профилактики инфекционных заболеваний вирусной природы человека и животных. Изобретение может быть использовано в лечебных учреждениях, научно-исследовательских лабораториях, а также в животноводстве и птицеводстве.

Актуальность проблемы противовирусной терапии, в особенности в условиях быстрой мутации вирусов, выявления новых возбудителей опасных и медленных вирусных инфекций, вызывает постоянную потребность в новых средствах, которые бы обладали высокой активностью, продолжительным действием и низкой токсичностью.

2. Предшествующий уровень техники.

В ряду конденсированных азолоазинов имеются данные о противовирусном действии 6-нитро-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-онов в отношении вируса болезни Ауески (ВБА) [Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чупахин О.Н. и др. Химико-фармацевтический журнал. 1990, № 96, с.41-44]. Известно также противовирусное действие 4-алкилтио-5,7-дигидро-7-оксо-1,2,4-триазоло[4,3-с1]-1,2,4-триазинов [Cristesku С., Derivati de 5-oxo-5,6-dihidro-s-triazolo(4,3-d)-as-triazina si procedeu pentru prepararea lor. Пат. СРР, кл. 12(C 07 d 55/10), № 56269, 13.03. 1974], а также - противоопухолевое действие имидазо[2,1-с]-1,2,3,5-тетразинов [Yongfeng W., Stevens M.F.G. Antitumor Imidazotetrasines. 35. New Synthetic Routesto to the Antitumor Drug Temozolomide. J. Org. Chem. 1997, vol. 62, №21, p.7288-7294]. В качестве прототипа наиболее подходящим является соединение - натриевая соль 6-нитро-4,7-дигидро-1,2,4-триазоло[5.1-с]-1,2,4-триазин-7-она - проявившее противовирусное действие в отношении в отношении ВБА [Русинов В.Л., Уломский Е.Н., Чупахин О.Н. и др. Химико-фармацевтический журнал. 1990, № 96, с.41-44].

3. Раскрытие изобретения.

Техническим результатом предлагаемого изобретение является нахождение нового химического соединения, обладающего широким спектром противовирусного действия, эффективного в отношении РНК и ДНК содержащих вирусов.

Указанный технический результат достигается тем, что согласно изобретению, предложено новое соединение - натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающее противовирусной активностью и имеющее формулу 1

Натриевую соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата (1) получают конденсацией соли диазония (3), получаемой диазотированием 3-амино-5-метилтио-1,2,4-триазола (2), с этилнитроацетатом в щелочной среде.

Заявляемое соединение представляет собой желтое кристаллическое высокоплавкое, растворимое в воде, метаноле, ацетоне, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, малорастворимое в метаноле, нерастворимое в бензоле, хлороформе и большинстве апротонных растворителей.

Данные элементного анализа и ЯМР-спектроскопии полностью соответствуют приписываемому строению. Присутствие в заявляемом соединении двух молекул воды подтверждается данными дериватографии (фиг.1, 2).

Фиг.1. Термограмма натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с] -1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата.

Фиг.2. Убыль массы натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата при нагревании.

Для отрыва воды из натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата вещество необходимо длительное время нагревать при 150°С в вакууме над P₂O₅. Безводный препарат на воздухе моментально поглощает влагу и при обычных условиях и за 2-3 ч полностью превращается в дигидрат.

Пример 1. Синтез натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата (1)

К охлажденному до 0°С раствору 13 г (0,1 моль) 5-амино-3-метилтио-1,2,4-триазола в 16 мл азотной кислоты (d=1,4) и 100 мл воды добавляют раствор 8 г нитрита натрия в 50 мл воды в течение 15 мин, выдерживают 10 мин и вносят порциями охлажденную смесь 11 мл (0,1 моль) этилнитроацетата в 150 мл 2 М растворе карбоната натрия. Перемешивают 2 часа при 0-5°С, образовавшийся осадок отфильтровывают, последовательно кристаллизуют из 20%-ной уксусной кислоты, воды и сушат на воздухе. Выход: 21,2 г (74%).

Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло [5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат имеет следующие физико-химические характеристики: Т_ПЛ>300°С; ¹H ЯМР спектр в ДМСО-d₆ δ, м.д.: 2,52 (3Н, с, SCH₃), 4,76 (4Н, уш.с., 2 Н₂O). Найдено: С - 20.83, Н - 2.62, N - 29.21, S - 11.54%. Брутто-формула - C₅H₇N₆NaO₅S. Вычислено: С - 20.98, Н - 2.47, N - 29.36, S - 11.20%.

Пример 2. Изучение противовирусного действия в отношении вируса венесуэльского энцефаломиелита лошадей (ВЭЛ) и Синдбис

Противовирусную активность и цитотоксическое действие заявляемого соединения изучали микрометодом в 96-луночных микропанелях в перевиваемой культуре клеток Vero в отношении вирусов ВЭЛ штамм 230 и Синдбис штамм EgA2-339, относящихся к роду альфавирусов. Множественность инфекции вирусов (м.и.) была 0,01 ТЦД₅₀. Опыт учитывали через 72 часа до наступления 100% цитопатического эффекта (ЦПЭ) в лунках контроля вируса. ЦПЭ определяли по 4-крестовой схеме; 4+-100% деструкции клеточного монослоя, 3+-75%, 2+-26% деструкции (табл.1, 2).

Антивирусную активность изучали по снижению инфекционного титра (И.Т.) вируса ВЭЛ-230 и вируса Синдбис в культуре клеток Vero через 24 часа после заражения при инфицирующей дозе вируса 0.01 БОЕ/клетку. Результаты приведены в табл.2. Заявляемое соединение в концентрации 200, 12,5 мкг/мл снижало И.Т. вируса ВЭЛ-230 на 4,0, 1,9 IgБОЕ/мл соответственно, а И.Т. вируса Синдбис на 3,9, 1,8 lg БОЕ/мл соответственно. Соединение-прототип в концентрации 125, 6,25 мкг/мл снижало И.Р. вируса Синдбис на 3,0, 1,0 lg БОЕ/мл соответственно, а И.Т. вируса ВЭЛ-230 на 3,3, 1,5 lg БОЕ/мл соответственно. Ремантадин в концентрации 50, 25 мкт/мл снижал И.Т. вируса ВЭЛ-230 на 2,0, 1,4 lg БОЕ/мл соответственно. ХТИ (химиотерапевтический индекс) соединений: описываемого - 20, прототипа - 12, ремантадина - 2.

Пример 3. Изучение антивирусной активности в отношении вируса западного энцефаломиелита лошадей (ЗЭЛ)

Заявляемое соединение вводили беспородным мышам массой 10-12 г перорально по 2-м схемам: 1 - профилактическая - за 24 часа, через 2, 24, 48, 72, 96 часов после инфицирования 10 ЛД₅₀ вируса, II схема - лечебная - вирус вводили через 2, 24, 48, 72, 96 часов после заражения той же инфицирующей дозой вируса.

Разовая доза соединений 50 мг/кг массы, соответствовала 1/32 ЛД₅₀ для этих соединений. Курсовая доза обоих соединений составляла 300-250 мг/кг массы в зависимости от применяемой схемы. Инфицирующая доза вируса ЗЭЛ 10 ЛД₅₀ в объеме 0,1 мл внутримышечно. Способ применения соединений пероральный. Как видно из таблицы 3, при лечебно-профилактической схеме введения (I) описываемого соединения защита составила 65%, средняя продолжительность жизни животных удлинена на 10 суток (табл.3). Процент защиты при применении лечебной схемы составил 60%, а средняя продолжительность жизни увеличилась на 5,9 суток. Соединение-прототип оказалось неэффективно в отношении ЗЭЛ.

Пример 4. Изучение противовирусного действия в отношении вирусов лихорадки долины Рифт (ЛДР)

Заявляемое соединение вводили беспородным белым мышам массой 6-8 г перорально по 2-схемам: 1 схема - лечебно-прфилактическая (за 24 часа и через 1, 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10 суток после заражения той же инфицирующей дозой вируса). Разовая доза соединений 50 мг/кг массы, что соответствует 1/32 ЛД₅₀ этих соединений. Курсовая доза обоих соединений составляла 500-450 мг/кг массы в зависимости от применяемой схемы. Инфицирующую дозу вируса 10 ЛД₅₀ в объеме 0,2 мл вводили подкожно. Как видно из таблицы 4, при лечебно-профилактической схеме введения заявляемого соединения защита составила 90%, средняя продолжительность жизни леченных животных увеличилась на 12,2 суток. Процент защиты при применении лечебной схемы был несколько выше и равнялся 80%, а средняя продолжительность жизни увеличилась на 13,4 суток (табл.4).

Пример 5. Изучение противовирусной активности в отношении вируса парагриппа и респираторно-синцитиального вируса

Изучение противовирусной активности в отношении данных вирусов проводили в опытах на культуре ткани с использованием вируса парагриппа 3 типа (штамм НА-1) и респираторно-синцитиального вируса (штамм Лонг).

В каждый опыт включали 2 группы:

1) пробирки с культурой ткани, в которые вводили испытуемое соединение;

2) пробирки с культурой ткани, в которые вместо испытуемого соединения вводили питательную среду.

Установлено, что ингибиция вируса парагриппа наблюдалась при использовании дозы препарата 500 мкг/мл, тогда как для ингибирования респираторно-синцитиального вируса достаточной была концентрация 60 мкг/мл (табл.5).

Пример 6. Изучение противовирусного действия в отношении вируса болезни Ауески, гриппа птиц и инфекционного ляринготрахеита птиц

Испытания проводили с вирусом гриппа птиц (ВГП) и инфекционного ляринготрахеита птиц (ИЛТ) на 10-дневных куриных эмбрионах (КЭ) и вирусом болезни Ауески (ВБА) на культуре клеток куриных фибробластов (КФ).

При определении вирусстатического (ингибирующего) действия КЭ инфицировали вирусом ИЛТ в дозе 50-100 БОЕ₅₀, а культуру клеток КФ-ВБА в дозе ТЦД₅₀ (тканевых цитопатических доз). Через 1-1,5 часа после заражения КЭ и КФ вносили испытуемое соединение в дозах 50, 100, 250 мкг/КЭ и инкубировали в термостате при 37,5°С КЭ в течение 120 часов до 100% образования бляшек на хориоаллантоисной оболочке (ХАО), а КФ - до четкого цитопатического действия в контроле. На каждую дозу изучаемого соединения брали по 10 КЭ или 4 флакона с КФ эксперименты проводили в 3-х повторностях.

Вирусстатическое действие определяли по разнице титров вируса в опыте и в контроле в КФ и по подавлению бляшкообразования в опыте и контроле с КЭ. Ингибирующее действие выражено в ТЦД₅₀ в КФ и в % подавления бляшек с КЭ. Контролем служили КЭ и КФ, зараженные вирусом, а также интактные КЭ и КФ.

При изучении вирулицидного действия (инактивирующего) заявляемое соединение смешивали с материалом, содержащим ВГП, и инкубировали при 37,5°С в течение 24 часов, после чего титровали на КЭ параллельно с контролем. Контролем служил вирусосодержащий материал, к которое вместо заявляемого соединения добавляли физраствор (плацебо) и интактные КЭВ. Вирулицидное действие определяли по разнице титров в опыте и контроле и выражали в ЭЛД₅₀ (эмбриональных летальных доз).

Установлено, что в опытах на КЭ с вирусом ИЛТ заявляемое соединение в дозе 500 мкг/КЭ подавляло развитие бляшек ХАО на 30% при 100%-ном образовании в контроле. В опытах на КЭ с ВБА заявляемое соединение в дозе 100 мкг/мл подавляло репродукцию вируса на 2,75, а в дозе 50 мкг/мл - 1,5 ТЦД₅₀. В опытах на КЭ с ВГП заявляемое соединение в дозе 500 мкг/мл и при экспозиции 24 часа интактировало ВГП на 3,6 ЭЛД₅₀.

Пример 7. Определение токсичности заявляемого соединения

Определение токсичности проводили на беспородных белых мышах массой 7-8 г в диапазоне концентрации 50-200 мг/кг (табл.6). Из табл.7 видно, что ЛД₅₀ натриевой соли 2-метилтио-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата составляет 1400 мг/кг.

Изучение противовирусного действия заявляемого соединения (натриевой соли 2-метилтио-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрата) и сопоставление его с прототипом - натриевой солью 1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она и используемым в медицинской практике препаратом "ремантадин" показало следующее.

1. В отношении вирусов ВЭЛ и Синдбис заявляемое соединение значительно превосходит ремантадин. В опытах на лабораторных животных заявляемое соединение обладает более сильным защитным эффектом, чем прототип.

2. Заявляемое соединение обладает более широким спектром противовирусного действия, чем прототип. Натриевая соль 2-метилтио-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат защищает животных от инфекций, вызываемых вирусами лихорадки долины Рифт. Особенно ценно, что соединение активно при лечебной схеме применения.

Заявляемое соединение, в отличие от соединения-прототипа и ремантадина, активно в отношении вируса ЗЭЛ, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса болезни Ауески, инфекционного ляринготрахеита птиц, вируса гриппа птиц.

Таким образом натриевая соль 2-метилтио-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат обладает более выраженным, чем прототип и рематадин противовирусным действием. Заявляемое соединение имеет более широкий спектр биологической активности, чем соединение-прототип и используемый в медицинской практике препарат ремантадин.

Таблица 1
Противовирусная активность заявляемого соединения, прототипа и ремантадина в отношении вирусов ВЭЛ и СиндбиссоединениеМПК, мкг/млВЭЛ-230СиндбисЭД₅₀, мкг/млХТИЭД₅₀; мкг/млХТИРЗаявляемое20010,02010,0200,01прототип12510,01210,0120,01ремантадин502522520,01МПК - максимально переносимая концентрация; ЭД₅₀ - минимальная концентрация, задерживающая развитие цитопатического эффета (ЦПЭ) на 50%;
ХТИ - химиотерапевтический индекс (МПК/ ЭД₅₀); Р - уровень достоверности.Таблица 2
Противовирусная активность заявляемого соединения, прототипа и ремантадина в отношении вирусов ВЭЛ и СиндбиссоединениеМПК, мкг/млконцентрация, мкг/млВЭЛ-230Синдбиститр вируса, lg БОЕ/млсниж. титра, lg БОЕ/млХТИтитр вируса, lg БОЕ/млсниж. титра, lg БОЕ/млХТИР  2005,54,0±0,06 6,03,9±0,14 0,01заявляемое20012,57,61,9±0,08167,91,8±0,11160,01  09,3  9,5     506,03,3±0,16 5,23,0±0,14 0,01прототип1255,127,81,5±0,06128,01,0±0,08120,01  09,3  9,5     507,32,0±0,11 7,52,0±0,08 0,01ремантадин50257,91,4±0,1628,01,5±0,1420,01  09,3  9,5   МПК - максимально переносимая концентрация; ХТИ - химиотерапевтический индекс (МПК/ЭД₅₀); Р - уровень достоверности.

Таблица 5
Противовирусная активность заявляемого соединения в отношении вирусов парагриппа и респираторно-синцитиальноговирусдоза соединения, мкг/млдоза вируса, ТЦД₅₀опытконтрольвсего пробирокиз них содержащих вирусиндекс защиты, %всего пробирокиз них содержащих вируспарагрипп5001-10204602019  10-1002016152013респираторно-601-10103551010синтициальный 10-1001010101010Таблица 6
Определение ЛД₅₀ заявляемого соединения при пероральном введении его белым мышам массой 7-8 гконцентрация препарата, мг/кг5010020040080014002000относительная смертность ^а0/60/60/60/60/63/64/6а - выражается как отношение количества павших белых мышей к количеству белых мышей в эксперименте.

Изобретение относится к области биологически активных соединений, касается разработки нового вещества - натриевой соли 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-с]-1,2,4-триазин-7-она, дигидрата и предназначено для лечения и профилактики заболеваний, вызываемых патогенными для человека и животных вирусами и имеющего формулу:

Описываемое соединение защищает от инфекций, вызываемых вирусами лихорадки долины Рифт. Особенно ценно, что соединение активно при лечебной схеме применения. Оно активно в отношении вируса ЗЭЛ, парагриппа, респираторно-синцитиального вируса, вируса болезни Ауески, инфекционного ляринготрахеита птиц, вируса гриппа птиц, всего более 10 РНК и ДНК содержащих вирусов. 6 табл., 2 ил.

Натриевая соль 2-метилтио-6-нитро-1,2,4-триазоло[5,1-c]-1,2,4-триазин-7(4Н)-она, дигидрат, обладающая противовирусной активностью и имеющая формулу