СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ МИКРОСПОРИИ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 C12R1/645 

Изобретение относится к медицине, а именно к дерматологии, разделу микологии, и может быть использовано для усовершенствования диагностики, прогнозирования клинического течения микроспории, продолжительности заболевания и лечения.

Заболеваемость микроспорией (грибковое заболевание кожи и волос) в Российской Федерации остается на высоком уровне и достигает ежегодно 72541-69816 новых случаев, из которых большая часть (до 80%) приходится на детское население (1-3). На фоне резкого ухудшения социально-экономических условий, неблагоприятной санитарно-эпидемиологической и экологической ситуации, снижения общей иммунологической реактивности организма стали чаще регистрироваться атипичные и резистентные к терапии формы микроспории, что также может быть связано с особенностями возбудителя микроспории (3-5).

Наиболее частым возбудителем микроспории в России в настоящее время является Microsporum Canis, относящийся к зоофильной группе микроспорумов, который по данным исследователей является причиной заболевания в 80% случаев, в то время как антропофильные микроспорумы - М.audouinii, М.Ferrugineum и геофильные - М.gypseum, М.fulvum, М.boullardii, М.nanum, М.simii, также могут являться возбудителями микроспории, но в более редких случаях, и эпидемиологически их значение невелико (3,6-10).

Внутри рода М. Canis выделяют вариант - М.Canis var.distortum, и в литературе описаны случаи, когда возбудителем заболевания микроспорией является именно данный вариант М.Canis var.distortum (1,4,11-14). Диагностика M.canis var. Distortum крайне сложна, поскольку микроскопическая картина соскоба с кожи и исследование волос при M.canis и М.Canis var.distortum неотличимы (13, 15).

Культуральный метод исследования для выделения и определения рода и вида микромицета считается «золотым стандартом» и позволяет не только оценивать внешнюю картину роста колоний гриба, но дает возможность изучения морфологических особенностей мицелия, макро-, микроконидий и других фрагментов культуры выращенного гриба, т.е. позволяет выявить атипичные видовые признаки у микроскопических грибов, если таковые имеются (8-10).

Другие известные методы дифференциальной диагностики M.canis (типичный вариант) и М.Canis var.Distortum (атипичный вариант), описанные в литературе, основанные на определении антигенной структуры грибов, генетических особенностях грибковой теломеразы, специфическом антителогенезе, не стандартизованы, дорогостоящи и не воспроизводимы в повседневной клинической практике (6, 11, 17).

Именно культуральный метод позволяет дифференцировать М.Canis var.distortum (16). К диагностическим признакам данного способа микроспории, вызванной M.canis var.distortum относится выявление клинических проявлений, макро- и микрофология культуры данных грибов. Данный способ осуществляется путем исследования уже выращенной с помощью культурального метода культуры гриба. Кроме того, известный способ выявления М.Canis var.distortum в качестве возможного возбудителя может быть использован только после периода роста и формирования культуры гриба, то есть не ранее 10-12 дней от момента посева на питательную среду, тогда как специалист нуждается в этиологической диагностике заболевания в более ранние сроки - прототип.

Задачей изобретения является оптимизация этиологической диагностики грибкового процесса у больных с дерматомикозами кожи и волосистой части головы.

Технический результат заключается в более точном установлении варианта гриба, вызывающего заболевание микроспорией и на основании этого назначается более качественная и полная терапия грибкового процесса.

Технический результат достигается тем, что устанавливаются клинические особенности проявления процесса микроспории, проводится анализ (изучение) макро- и микрофологии культуры и при наличии единичных двухклеточных макроконидий в виде подковы с толстой изъеденной стенкой диагностируют микроспорию, вызванную M.canis var.distortum.

Сущность изобретения заключается в комплексном выявлении анамнестических, эпидемиологических, клинических и морфо-биологических особенностей для выставления точного этиологического диагноза дерматомикоза.

Изучение отдельных анамнестических и клинических признаков заболевания у больных микроспорией, включающее тщательный сбор анамнеза, фиксацию особенностей клинических проявлений, анализ взятого у больного материала из очага поражения, определение родовой и видовой принадлежности возбудителя, а затем при культуральном исследовании тщательное изучение макро- и микроморфологии культуры (вид колоний, макроконидий и мицелиального аппарата гриба) обеспечивают более точное установление варианта гриба, вызывающего заболевание микроспорией и на основании этого назначение более качественного процесса терапии.

Причем данные анамнеза и клинической картины заболевания - наличие 1-2 очагов размером 0,5-1,5 мм с локализацией преимущественно на волосистой части головы определяются в момент первого обращения больного за медицинской помощью, т.е. специалист может ориентироваться на них, уже на этом этапе подозревая у пациента наличие атипичного возбудителя, а выявление при изучении макро- и микрофологии культуры единичных двухклеточных микроконидий в виде подковы с толстой изъеденной стенкой позволяет с высокой точностью диагностировать, совместно с приведенными выше признаками, микроскопию, вызванную M.canis var.distortum.

Из анализа научно-технической и патентной литературы заявляемой совокупности признаков, позволяющих с высокой точностью определять наличие гриба M.canis var.distortum в более короткие сроки, нами не выявлено, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критериям «новизна» и «изобретательский уровень».

Изобретение осуществляется следующим образом.

На предварительном этапе нами были проведены культуральные исследования у 124 пациентов с подозрением на микроспорию. При этом у всех больных изучены клинико-анамнестические, эпидемиологические данные, динамика и результативность проведенной терапии. Все пациенты были разделены на 2 группы в соответствии с выявленными характеристиками возбудителя. В таблице 1 представлена характеристика процесса в группе пациентов, у которых в качестве возбудителя был диагностирован М.canis в его типичном проявлении (группа I) и группы II, где микробиологически был выявлен М.canis var.distortum в качестве возбудителя микроспории.

Из данных Таблицы 1 видно, что при атипичном варианте возбудителя (M.canis var.distortum) значительно чаще страдали мальчики.

Длительность заболевания в обеих группах у большинства больных была до 1 месяца, но в группе с атипичным вариантом M.canis var.distortum таких больных было больше - 88,9% и 82% соответственно.

Отмечено, что в 2 раза чаще атипичный возбудитель регистрировался у пациентов, которые заразились от собак.

У больных с атипичными культурами M.canis var.distortum на волоситой части головы и на гладкой коже процесс носил малоочаговый характер. Процесс, вызванный M.canis var.distortum, отличался высыпаниями в виде мелких очагов от 0,5 до 1,5 см в диаметре в 100% случаев, и в случае M.canis - размер очагов был крупнее от 1,5 до 4,0 см в диаметре. Важным оказалось, что клинический регресс заболевания наступал в случае возбудителя М.canis и M.canis var.distortum через 16 и 40 дней соответственно, то есть наличие атипичного возбудителя определяло большую длительность заболевания. Первые отрицательные посевы при возбудителе M.canis var.Distortum получали в значимом числе случаев (40,1%) только после 5-6 и более недель лечения, что свидетельствовало о трудности в достижении микологического излечения у этой группы пациентов и подтверждалось более длительными общими курсами терапии.

При проведении данного исследования для определения рода грибка нами использовались данные П.Н.Кашкина (1979) по оценке особенностей макро- и микроморфологии.

В отличие от прототипа, когда данные были получены на 10-12 день, данные анамнеза и клинической картины заболевания по предлагаемому изобретению определяются в момент первого обращения больного за медицинской помощью, т.е. специалист может ориентироваться на них уже на этом этапе, подозревая у пациента наличие атипичного возбудителя.

Приемы выполнения изобретения:

1. Тщательный сбор анамнеза (отмечается пол больного, длительность процесса, источник заражения - собаки);

2. Описание и фиксирование клинических проявлений заболевания (обращают внимание на количество очагов, локализацию, размеры);

3. Проведение микроскопии нативного материала в 20% растворе КОН.

После проведения этапов 1-3, при наличии в микропрепарате нитей мицелия или характерного поражения волоса по типу ectothrix microides и выявлении дифференциально диагностических признаков (Таблица 1), предполагается возможность наличия M.canis var.distortum;

4. Микологический посев биологического материала (кожные чешуйки, волосы, ногти, брови, ресницы) на твердую питательную среду Сабуро в две пробирки с инкубацией в термостате при температуре 28°С на протяжении 12-28 дней с дальнейшей оценкой макроморфологии культур и микроскопией культур;

5. Не ранее 10 суток проводится оценка макроморфологии культур, изучаются морфологические признаки атипии микроморфологии возбудителя;

6. В случае микроскопического подтверждения высказанного после 1-3 этапов предположения о наличии M.canis var.distortum этот возбудитель диагностируется окончательно;

7. В соответствии с установленным этиологическим фактором M.canis var.distortum формируется план лечения с учетом необходимости длительного лечения (не менее 6 недель терапии).

Таким образом, учет дополнительных диагностических признаков анамнеза (в том числе эпидемиологического) и клинических особенностей процесса позволяет специалисту на раннем этапе предположить наличие атипичного возбудителя, в обязательном порядке направить больного на микологическое исследование (культуральное), при котором после тщательной морфо-биологической оценки культуры устанавливается точный этиологический агент возбудитель - M.canis var.distortum.

Изобретение иллюстрируется следующими конкретными примерами.

Больной Б., 7 лет поступил в Клинику для уточнения диагноза и терапии. Болен в течение 3-х недель, когда после контакта с собакой на коже волосистой части головы заметил очаг с потерей волос, сопровождающийся умеренным зудом. Данный эпизод возник впервые в жизни. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено.

Объективно: кожные покровы вне очага бледно-розового цвета, тургор, влажность, эластичность сохранены. На волосистой части головы в затылочной области локализован 1 очаг в диаметре 1 см. Очаг округлой формы с нечеткими краями, эритематозной окраски. Поверхность очага покрыта мелкими чешуйками. В очаге видны обломанные волосы до 8 мм, окруженные серовато-белыми чехликами. При проведении люминесцентной диагностики - зеленоватое свечение.

При проведении микроскопического исследования пораженных волос в 20% растворе КОН найден септированный мицелий, внутри волоса - мелкие споры, что свидетельствует о наличии грибкового процесса. Учитывая пол ребенка, анамнестические данные о заражении от собаки, наличие 1 мелкого очага, было высказано предположение о возможном наличии M.canis var.distortum в качестве возбудителя процесса.

Проведено культуральное исследование: пораженные волосы засевались на скошенный агар Сабуро в 2 пробирки с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре 28°C на протяжении 28 дней. Культура просматривалась каждые 3 дня, оценивали скорость роста колонии. Первые колонии появились на 3-й день с момента посева, отличались медленным ростом. Макроскопически: стелющийся полупрозрачный мицелий. На 12-й день в обеих пробирках выросли идентичные беловато-серые колонии с воздушным мицелием, колонии мелкие до 0,8 см в диаметре. При микроскопии у выращенной культуры: мицелий септированный, диаметром 2,5-3 мкм, иногда заканчивающийся короткими множественными ветвлениями в виде канделябров, макроконидии - толстостенные с бугристой поверхностью, многоклеточные, неправильной, совсем не веретенообразной формы, как бы перекрученные по длине, свободный конец макроконидий широкий, внутренний более узкий, короткий. Встречаются единичные макроконидии, состоящие из двух клеток, в форме подковы с изъеденными и шиповатыми стенками.

При сравнении с классическими клинико-эпидемиологическими признаками микроспории, вызванной M.canis, выявлен ряд отличий и диагностирован как M.canis var.distortum.

Таким образом, больному уже на I этапе был выставлен предварительный диагноз: микроспория волосистой части головы, возможно обусловленная М.canis var.distortum, что в дальнейшем было подтверждено проведенным макро- и микроскопическим исследованием выращенной культуры. Длительность терапии составила 45 дней.

Больная С., 12 лет поступила в Клинику с жалобами на появление шелушащегося очага на волосистой части головы и двух красноватых очагов на гладкой коже верхней части туловища после контакта с уличной кошкой спустя 4 дня. Данный эпизод возник впервые в жизни. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено.

Объективно: кожные покровы вне высыпаний физиологичной окраски, тургор, жирность, эластичность сохранены. На волосистой части головы в височной области локализован один очаг округлой формы с четкими границами диаметром 4 см. В очаге волосы обломаны до 6 мм. Очаг розовой окраски, шелушение не выражено. При проведении люминесцентной диагностики ярко-изумрудное свечение. На коже туловища спереди в верхней части локализовано 2 очага округлой формы, с четкими границами, диаметром 1,5-2,5 см. По периферии умеренная инфильтрация, поверхность очагов шелушащаяся с мелкими серо-белыми чешуйками. При проведении люминесцентной диагностики - зеленое свечение очагов с поражением пушковых волос.

При проведении микроскопического исследования пораженных волос и кожных чешуек в 20% растворе КОН найден ветвящийся септированный мицелий в кожных чешуйках, в волосах - споры по типу мелкоспорового эктотрикса, на корне волоса - муфта из спор, что свидетельствует о наличии грибкового процесса.

Проведено культуральное исследование: пораженные волосы и кожные чешуйки засевались на скошенный агар Сабуро по 2 пробирки соответственно с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре 28°С на протяжении 28 дней. Культура просматривалась каждые 3 дня, оценивали скорость роста колонии. Первые колонии появились в пробирках с кожными чешуйками на 3 день с момента посева биологического материала - колонии в виде пушистого возвышения, в пробирках с засеянными волосами первые колонии появились на 5 день. К 7-му дню - колония плоская, дискообразная, лучисто-ворсистая. Макроскопически выращенные культуры во всех 4-х пробирках на 18 день: колонии 1,5-2 см в диаметре, белесовато-перламутровый пушок вползает на стенки пробирки. Зрелые культуры мучнистые с неглубокими складками. Макроконидии веретенообразные, с шиповатой двухконтурной стенкой, состоящие из 4-12 клеток. По ходу мицелия определяются интеркалярные хламидоспоры. Микроконидии грушевидные.

Таким образом, описанная клиническая и морфо-биологическая картина не отличается от классической, возбудитель расценен как M.canis. Больной был выставлен диагноз: Микроспория волосистой части головы и гладкой кожи, вызванная M.canis. Продолжительность лечения составила 29 дней.

Больной В., 10 лет поступил в Клинику, когда впервые отметил появление двух округлых очагов на волосистой части головы, сопровождающихся умеренным зудом и обламыванием волос в пределах очага. Появление очагов заметил после контакта с собакой. Данный эпизод впервые в жизни. Поступил в Клинику для обследования, установления диагноза и лечения. При общем осмотре патологических отклонений по системам и органам не выявлено.

Объективно: кожные покровы вне высыпаний физиологичной окраски, тургор, жирность, эластичность сохранены. На волосистой части головы в теменно-затылочной области локализованы 2 очага округлой формы с нечеткими краями, диаметром 0,8 см, признаки инфильтрации отсутствуют. В пределах очага волосы обломаны на высоте до 0,6 см. Поверхность очага покрыта тонкими сероватыми чешуйками. При проведении люминесцентной диагностики наблюдается зеленое свечение.

При проведении микроскопического исследования пораженных волос в 20% растворе КОН найден септированный мицелий, на корне волос - муфта из спор, внутри волоса - цепочка из спор, что свидетельствует о наличии грибкового процесса. Учитывая особенности клинических проявлений (малоочаговость, мелкий размер очагов), было высказано предположение о наличии M.canis var.distortum в качестве возбудителя процесса.

Проведено культуральное исследование: пораженные волосы засевались на скошенный агар Сабуро в 2 пробирки с дальнейшей инкубацией в термостате при температуре 28°С на протяжении 28 дней. Культура просматривалась каждые 3 дня, оценивали скорость роста колонии. Первые колонии появились на 7-й день с момента посева, отличались медленным ростом. Макроскопически: воздушный белый мицелий. На 12-й день в обеих пробирках выросли идентичные беловато-серые колонии с воздушным мицелием, колонии мелкие до 0,6-0,8 см в диаметре. При микроскопии выращенной культуры: мицелий септированный, диаметром 2,5-3 мкм, иногда заканчивающийся короткими множественными ветвлениями в виде канделябров, макроконидии - толстостенные с бугристой поверхностью, многоклеточные, неправильной, совсем не веретенообразной формы, как бы перекрученные по длине, свободный конец макроконидий широкий, внутренний более узкий, короткий. При сравнении с классическими клинико-эпидемиологическими признаками микроспории, вызванной M.canis, выявлен ряд отличий и диагностирован как M.canis var.distortum. Таким образом, больному на I этапе был выставлен предварительный диагноз: микроспория волосистой части головы (обусловленная M.canis var.distortum). В дальнейшем при культуральном исследовании был выделен и идентифицирован возбудитель М.canis var.distortum. Длительность терапии составила 40 дней.

Всего заявленным способом обследовано 124 пациента. Из них типичный вариант M.canis - 75,8%, нетипичный вариант M.canis var. distortum - 24,2%.

Таким образом, заявленный способ диагностики дерматомикоза - микроспории, позволяет с помощью использования комплекса анамнестических, клинических, микроскопических и морфо-биологических признаков установить точный этиологический диагноз возбудителя микроспории - M.canis var.distortum, что важно в процессе проведения антимикотической терапии, поскольку заболевание, вызываемое данным микромицетом, требует более длительных сроков лечения.

Использованная литература:

1. Smith, J.М.В. Microsporum Distortum Ringworm in New Zealand. Australasian Journal of Dermatology, 11, 197; 131-138.

2. И.М.Корсунская, И.Я.Климова, И.В.Оленич, С.Е.Зеленцова, А.К.Беличков. Дерматомикозы в педиатрии. Consilium Medicum. Том 07/N, 2/2005.

3. Малишевская Н.П., Нестеров С.Н. Клинические исследования. - 01/06.

4. Microsporum canis var.Distortum. Данные, доступные на электронном ресурсе - http://www.cdc.gov/index.htm.

5. Рукавишникова В.М. Современные особенности клиники и лечения микроспории // Метод, рекоменд., М., 2001, с.10.

6. Polonelli L, Morace G. Antigenic characterization of Microsporum canis, М.distortum, М.equinum, М.ferrugineum and Trichophytonsoudanense cultures.

7. B.M.Лещенко. Лабораторная диагностика грибковых заболеваний. М. - Медицина, 1982, с.141.

8. В.Б.Сбойчаков. Медицинская микология (руководство для врачей). М. - ГЭОТАР-Медиа, 2008, с.206.

9. Р.А.Аравийский, Н.К.Климко, Н.В.Васильева. Диагностика микозов. СПб. - Издательский дом СПбМАПО, 2004, с.185.

10. А.Ю.Сергеев, Ю.В.Сергеев. Грибковые инфекции. М. - БИНОМ, 2008, с.480.

11. Zaini F, Sadeghi G, Elmi Akhouni E. Acta Medica Iranica. The Carbohydrate assimilation pattern in Iranian typical and atypical strains of Microsporum Canis. - 2000; 38(3): 132-137.

12. Zooanthroponotic microsporosis caused by Microsporum distortum. Sheklakov ND, Vedrova IN, Ziserman VE, Il'chenko LS. Vestn Dermatol Venerol. 1978 Apr; (4): 83-4.

13. П.Н.Кашкин, Н.Д.Шеклаков. Руководство по медицинской микологии. М. - Медицина, 1978, с.325.

14. Н.П.Елинов. Дерматомицеты (учебное пособие). СПб. - КОСТА, 2010, с.48.

15. П.Н.Кашкин, В.В.Лисин. Практическое руководство по медицинской микологии. Л. - Медицина, 1983, с.187.

16. П.Н.Кашкин. Определитель патогенных, токсигенных и вредных для человека грибов. Л. - Медицина, 1979, с.269.

17. Makimura К, Tamura Y, Murakami A, Kano R, Nakamura Y, Hasegawa A, Uchida K, Yamaguchi H. Microbiol Immunol. Cluster analysis of human and animal pathogenic Microsporum species and their teleomorphic states, Arthroderma species, based on the DNA sequences of nuclear ribosomal internal transcribed spacer 1. - 2001; 45(3): 209-16.

Способ диагностики микроспории осуществляется путем установления особенностей клинических проявлений процесса, изучения макро- и микрофологии культуры. При наличии 1-2 очагов размером 0,5-1,5 см с локализацией преимущественно на волосистой части головы и наличии единичных двух клеточных макроконидий в виде подковы с толстой изъеденной стенкой диагностируют микроспорию, вызванную Microsporum canis var.distortum. Изобретение позволяет с помощью использования комплекса анамнестических, клинических, микроскопических и морфо-биологических признаков установить точный этиологический диагноз возбудителя микроспории - М.canis var.distortum, что важно в процессе проведения антимикотической терапии. Использование способа позволит усовершенствовать диагностику, прогнозирование клинического течения микроспории, продолжительность заболевания и лечения. 1 табл.

Способ диагностики микроспории путем установления особенностей клинических проявлений процесса, изучения макро- и микрофологии культуры, отличающийся тем, что при наличии 1-2 очагов размером 0,5-1,5 см с локализацией преимущественно на волосистой части головы и наличии единичных двух клеточных макроконидий в виде подковы с толстой изъеденной стенкой диагностируют микроспорию, вызванную Microsporum canis var.distortum.