СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ДЕРМАТОФИТОВ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА Российский патент 2002 года по МПК C12N1/14 C12Q1/04 

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии, а именно к микологии, лабораторной диагностике дерматомикозов.

Дерматофиты представляют собой основную группу патогенных для человека грибов. Они представлены 39 видами, объединенными в роды Trichophytoh, Microsporum и Epidermophiton. Возможным признаком, объединяющим эти грибы, является то, что в процессе эволюции основные патогенные представители дерматофитов покинули почву и приспособились к жизни в тканях человека и животных, содержащих кератин.

Источником инфекции служит почва, зараженный человек или животное.

Дерматофиты поражают волосы, ногтевые пластинки и кожу человека и в структуре кожной патологии занимают одно из первых мест.

Диагноз дерматофитии ставится на основе микроскопии или на результатах посева патологического материала на различные питательные среды. Но даже при соблюдении всех правил сбора материала, при наличии современного оборудования лабораторий и высокой квалификации персонала число положительных результатов культурального исследования невелико. Процент положительных результатов при онихомикозах в отечественных лабораториях едва достигает 30. Таким образом, в 2 из каждых 3 случаев этиологию установить не удается. В зарубежных лабораториях процент положительных исследований не превышает 50 (Ю.В. Сергеев, А.Ю.Сергеев. Микозы стоп. 1998).

Морфологическая идентификация возбудителей в образцах тканей затруднена и требует выделения чистой культуры, которое осуществляется путем помещения отдельных волос или фрагментов кожи и ногтей на неселективные и селективные питательные среды.

Известен способ выделения дерматофитов, который предусматривает посев клинического материала на поверхность плотной среды Сабуро следующего состава, г/л:
Глюкоза или мальтоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 литра
Инкубация посевов производится при температуре 28-30^oС в течение 30 дней (П. Н. Кашкин, В.В.Лисин. Практическое руководство по медицинской микологии. Л.: Медицина, 1983).

Недостатком этого способа является то, что используемая питательная среда совершенно не обладает способностью подавлять рост сопутствующей бактериальной флоры и сапрофитных плесеней.

Известен способ выделения дерматофитов из клинического материала на плотной среде Сабуро с селективными добавками - - пенициллин (20000 ЕД) или стрептомицин (40000 ЕД), гентамицин (0,005 г/л); левомицетин (0,016 г/л); г/л:
Глюкоза или мальтоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 литра
Инкубируют посевы при температуре 28-30^oС в течение 30 дней (П.Н.Кашкин, В. В.Лисин. Практическое руководство по медицинской микологии. Л.: Медицина, 1983).

Данные антибиотики вносят в среду для подавления роста бактериальной флоры и устранения тем самым ее антагонистического действия на дерматофиты. Недостатком этого способа является длительность процесса выделения чистой культуры, к применяемым антибиотикам появились устойчивые штаммы бактерий, а кроме этого сапрофитные плесени также оказывают антагонистическое действие на культуры грибов.

Наиболее близким к заявленному является способ выделения патогенных грибов родов Microsporum, Trichophyton, Epidermophyton на плотной селективной среде Сабуро с добавлением левомицетина (0,016 г/л) и циклогексимида (0,001 г/л), который вносят в среду для ингибирования бурного роста плесеней, подавляющих медленно растущие дерматофитные грибы, г/л:
Глюкоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 литра
Смесь автоклавируют при медленном поднятии давления до 1 атм (120^oС), затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют, г/л:
Циклогексимид - 0,001
Левомицетин - 0,016
Стерилизуют среду при 0,5 атм (110^oС) 20 минут и разливают по 3-5 см в пробирки со скошенным срезом. Посев исследуемого материала проводится на поверхность среды.

Инкубируют посевы при температуре 28-30^oС в течение 30 дней (П.Н. Кашкин, В.В. Лисин, 1983).

Недостатком этого способа является длительность процесса выделения дерматофитов из клинического материала, добавление к среде левомицетина в качестве ингибитора роста сопутствующей бактериальной флоры утрачивает свое значение в связи с широким распространением к данному антибиотику устойчивых штаммов (в пределах 76%), поэтому возникла необходимость замены его более эффективным антибактериальным препаратом широкого спектра действия, к которому практически не выявлено устойчивой микрофлоры.

Задача изобретения - повышение эффективности выделения патогенных грибов - дерматофитов из клинического материала (волос, ногтевых и кожных чешуек).

Поставленная задача достигается тем, что осуществляют посев и выделение дерматофитов из клинического материала на селективной среде с добавлением жидкой медицинской желчи, дрожжевого аутолизата и антибиотика из группы фторхинолонов, например ципрофлоксацина, при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 литра
Жидкая медицинская желчь - 1,0
Аутолизат дрожжевой концентрированный - 5,0
Ципрофлоксацин - 5,0
при этом инкубируют посев при температуре 37^oС 5-7 дней и 15 дней при температуре 28-30^oС с последующей идентификацией вида колоний.

Новизна заявляемого способа состоит в том, что выделение дерматофитов происходит на среде с повышенными селективными свойствами за счет создания композиции компонентов среды, подавляющих рост бактерий и плесени: к антибиотику ципрофлоксацин (ципролет, группа фторхинолонов) практически не выявлено устойчивой микрофлоры, желчь оказывает бактерицидное действие на плесени, широко распространенных в окружающей среде, дрожжевой аутолизат - стимулятор роста совместно с подобранным опытным путем температурным режимом. Инкубирование посевов первые 5-7 дней при температуре 37^oС обеспечивает более быстрое выделение дерматофитов из патологического материала.

Сущность способа заключается в следующем.

Для выделения дерматофитив из клинического материала готовится плотная селективная среда следующего состава, г/л:
Глюкоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 литра
Смесь автоклавируют при медленном поднятии давления до 1 атм (120^oС), затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют, г/л:
Жидкая медицинская желчь - 1,0
или
Циклогексимид - 0,001
Аутолизат дрожжевой концентрированный - 5,0
Ципрофлоксацин - 5,0
Стерилизуют среду при 0,5 атм (110^oС) 20 мин и разливают по 3-5 см в пробирки со скошенным срезом. Посев исследуемого материала проводится на поверхность среды, инкубируют посевы при 37^oС 5-7 дней и 15 дней при 28-30^oС. Затем по характеру роста, цвету и т.д. определяют вид дерматофита.

Пример 1
Выделение дерматофитов из ногтевых пластинок.

В колбу помещают глюкозы 40,0 г; пептона 10,0 г, агара 18 г, заливают дистиллированной водой до 1 литра. Смесь автоклавируют при медленном поднятии давления до 1 атм (120^oС), затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют жидкую желчь 1,0 г; аутолизат дрожжевой концентрированный 5,0 г; ципрофлоксацин 5,0 г. Среду стерилизуют при 0,5 атм (110^oС) 20 мин и разливают по 3-5 см в пробирки со скошенным срезом. Посев измельченных ногтевых пластинок проводится на поверхность среды. Инкубируют посев при t 37^oС 5 дней и 15 дней при t 28-30^oC. В результате удается получить чистую культуру Tr. rubrum, колонии Tr. rubrum на селективной среде красно-коричневые, бархатисто-пушистые.

Пример 2.

Выделение дерматофитов из фрагментов кожи.

В колбу помещают глюкозы 40,0 г; пептона 10,0 г; агара 18 г, заливают дистиллированной водой до 1 литра. Смесь автоклавируют при медленном поднятии давления до 1 атм (120^oС), затем фильтруют через ватно-марлевый фильтр и добавляют жидкую желчь 1,0 г; аутолизат дрожжевой концентрированный 5,0 г; ципрофлоксацин 5,0 г. Среду стерилизуют при 0,5 атм (110^oС) 20 мин и разливают по 3-5 см в пробирку со скошенным срезом. Посев кожных чешуек проводится на поверхность среды. Посев инкубируют 7 дней при t 37^oС и 15 дней при t 28-30^oС.

Выделенные чистые колонии Tr. verrucosum на селективной среде кожистые, крупноморщинистые, радиально-складчатые, серовато-белого цвета.

Ингибирующие свойства селективной среды в сравнении со средой Сабуро с левомицетином и циклогексимидом представлены в таблице.

Таким образом, полученные результаты доказывают, что заявляемый способ выделения дерматофитов позволяет значительно улучшить диагностику грибковых инфекций: за более короткий срок получить чистую культуру дерматофитов.

Изобретение относится к медицинской и ветеринарной микробиологии, а именно к микологии, лабораторной диагностике дерматомикозов. Осуществляют посев и выделение дерматофитов из клинического материала на селективной среде с добавлением жидкой медицинской желчи, дрожжевого аутолизата и антибиотика из группы фторхинолонов, например ципрофлоксацина, при следующем соотношении компонентов, г/л: глюкоза 40,0, пептон 10,0, агар 18,0-20,0, дистиллированная вода до 1 л, жидкая медицинская желчь 1,0, аутолизат дрожжевой концентрированный 5,0, ципрофлоксацин 5,0. Инкубируют посев при температуре 37^oС 5-7 дней и 15 дней при температуре 28-30^oС и индентифицируют вид колоний. Способ повышает эффективность выделения патогенных грибов - дерматофитов из клинического материала, позволяет за более короткий срок получить чистую культуру дерматофитов. 1 табл.

Способ выделения дерматофитов из клинического материала, заключающийся в выделении патогенных грибов на плотной селективной среде Сабуро с добавлением антибиотика и инкубирования ее при температуре 28-30^oС, отличающийся тем, что осуществляют посев и выделение дерматофитов из клинического материала на селективной среде с добавлением жидкой медицинской желчи, аутолизата дрожжевого и антибиотика из группы фторхинолонов, например, ципрофлоксацина при следующем соотношении компонентов, г/л:
Глюкоза - 40,0
Пептон - 10,0
Агар - 18,0 - 20,0
Дистиллированная вода - До 1 л
Жидкая медицинская желчь - 1,0
Аутолизат дрожжевой концентрированный - 5,0
Ципрофлоксацин - 5,0
при этом инкубируют посев при температуре 37^oС 5-7 дней и 15 дней при температуре 28-30^oС с последующей индентификацией вида колоний.