СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СЛОЖНОЙ ГИПЕРПЛАЗИИ ЭНДОМЕТРИЯ БЕЗ АТИПИИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, позволяет оптимизировать диагностику сложной гиперплазией эндометрия путем исследования маркера пролиферации в сыворотке крови пациенток.

Доброкачественные гиперпластические процессы эндометрия относятся к одной из основных форм пролиферативных заболеваний эндометрия и считаются наиболее распространенной патологией слизистой тела матки.

Согласно последнему варианту классификации ВОЗ (Lyon, 2003) гиперплазия эндометрия подразделяется следующим образом:

1. Эндометриальная гиперплазия без атипии

- простая

- сложная (аденоматозная)

2. Эндометриальная гиперплазия с атипией

- простая

- сложная

Актуальность проблемы гиперпластических процессов эндометрия у больных репродуктивного возраста не теряет своего значения как с позиций профилактики рака эндометрия, так и с позиций восстановления и сохранения репродуктивной функции. Гиперпластические процессы эндометрия, как возможная основа для формирования злокачественных опухолей, в течение многих десятилетий представляет важную медико-социальную проблему (Стрижаков А.Н., Давыдов А.И. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7 №4. - С.20-24).

Согласно одной из теорий канцерогенеза, различные формы эндометриальной гиперплазии рассматриваются как стадии одного процесса: простая гиперплазия без атипии → сложная гиперплазия без атипии → простая атипическая гиперплазия → наложная атипическая гиперплазия-нэндометриальная карцинома (Ожиганова И.Н., СПб., 2007. - С.42-53).

Именно поэтому онкогинекологи испытывают повышенную настороженность в отношении сложной гиперплазии без атипии, трактуя ее как переходный этап к простой атипической гиперплазии эндометрия.

Частота гиперпластических процессов эндометрия, а также отсутствие на сегодняшний день единых рекомендаций по ведению больных с эндометриальными гиперплазиями определяют необходимость поиска дополнительных критериев диагностики сложной гиперплазии эндометрия без атипии, что позволит повысить точность исследования эндометриальной гиперплазии не только на основании гистологического анализа.

На сегодняшний день существует «золотой стандарт» исследования пациенток при гиперпластических процессах эндометрия: трансвагинальная эхография + гистероскопия, раздельное диагностическое выскабливание + морфологическое исследование тотальных соскобов (Станоевич И.В., Ищенко А.И., и др. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7, №2. - С.52-56). В этой связи надо отметить, что важным звеном качества обследования является квалификация патоморфолога в гинекологической патологии. Только специалисты, часто имеющие дело с подобной патологией, могут профессионально интерпретировать такие анализы (Marsden D.E., Hacker N.F. Best Practice and Research Clin. Obst. and Gyn. - 2001. - Vol.3, N 15. - P.393-405.).

Вопросы микроскопической диагностики гиперпластических процессов эндометрия остаются дискуссионными из-за нередких случаев гипер- и гиподиагностики вследствие значительной вариабельности изменений в пределах препарата, частой скудности и фрагментации полученного материала, неполного удаления функционального слоя эндометрия при выскабливании слизистой полости матки «вслепую» (Zaino R.J., Kauderer J. et al. // Cancer. - 2006. - Vol.106, N 4. - P.804-811). Поэтому многие клиницисты и патоморфологи указывают на необходимость поиска дополнительных (биомолекулярных) критериев каждого морфологического варианта гиперплазии эндометрия (Карселадзе А.И. // Акушерство и гинекология. - 2006. - Прил. - С.36-39; Станоевич И.В. // М., 2007. - 157 с.).

Ангиогенез в эндометрии регулируется многочисленными факторами как стимулирующими, так и ингибирующими образование сосудов. Наиболее изученным активатором ангиогенеза, происходящего в органах репродуктивной системы женщины, является сосудисто-эндотелиальный фактор роста (СЭФР). По мере нарастания тканевой и клеточной атипии в эндометрии усиливается неоангиогенез с вовлечением в процесс качественно новых механизмов стимуляции образования сосудов (Станоевич И.В. и др. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7, №2. - С.52-56). Однако определение СЭФР в сыворотке крови не имеет большой ценности для диагностики патологии эндометрия вследствие наблюдающегося роста уровня СЭФР в сыворотке крови при различных опухолевых процессах (Gagne D., Page M., Robitaille G. et al. // Hum. Reprod. - 2003. - Vol.18. - P.1674-1680; Potlog - Nahari C., Stratton P., Winkel C. et al. // Fertil. and Steril. - 2004. - Vol.81. - P.1507-1512).

Помимо эстрогенов активаторами пролиферативной активности эндометрия являются факторы роста (IGF-I, EGF, TGFa), а также факторы пролиферации (PCNA, Ki-67), необходимые для репликации геномной ДНК (Elhafey A.S., Papadimitriou J.C. et al., // Arch. Pathol. Lab. Med. - 2001. - Vol.125. - P.872-879; Pierro E., Minici F. et al. // Biol. Reprod. - 2001. - Vol.64. - P.831-838).

Содержание PCNA и Ki-67 в нормальном эндометрии коррелирует с фазой менструального цикла: нарастает в пролиферативную фазу, достигая максимума в позднюю пролиферацию, и быстро снижается в раннюю секреторную фазу. Уровень PCNA возрастает в ряду «нормальный эндометрий поздней фазы пролиферации - гиперплазия эндометрия - рак эндометрия». Концентрации PCNA при гиперплазии и раке эндометрия значительно повышены как у женщин перименопаузального, так и постменопаузального возраста. Отмечена четкая связь между содержанием PCNA и степенью ядерной атипии при гиперплазии, вовлеченностью шейки матки, степенью инвазии в миометрий, наличием метастазов при аденокарциноме эндометрия. PCNA - индекс (% PCNA - позитивных ядер) более 25% четко коррелирует с худшим прогнозом (Hareyama H., 1994). Пролиферация, определяемая по уровню экспрессии ее маркера - Ki 67, зависит от количества эстрогеновых рецепторов в нормальном эндометрии (Risberg В., Karlsson К. et al. // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2002. - Vol.21. - P.155-160).

В то же время, в ряде иммуногистохимических исследований были получены данные о снижении пролиферативной активности в гиперплазированной ткани эндометрия (Чернуха Г.Е., Сухих Г.Т. и др. // Проблемы репродукции. - 2004. - №4. - С.30-34; Cinel L., Polat A. et al. // Pathol Int. - 2002. - Vol.52. - P.384-389; Risberg В., Karlsson K. et al. // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2002. - Vol.21. - P.155-160). Данные литературы относительно уровня пролиферации в зависимости от вида гиперплазии эндометрия противоречивы. Есть исследования, в которых не найдено различий в зависимости от вида ГПЭ (Ambros R.A. // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2000. - Vol.19. - P.206-211). Вместе с тем есть данные об увеличении пролиферативной активности при атипической гиперплазии эндометрия (Cinel L., Polat A. et al. // Pathol Int. - 2002. - Vol.52. - P.384-389; Risberg В., Karlsson K. et al. // Int. J. Gynecol. Pathol. - 2002. - Vol.21. - P.155-160).

Известно, что в эндометрии апоптоз поддерживает клеточный гомеостаз в течение менструального цикла путем элиминации стареющих клеток из функционального слоя эндометрия матки в поздней секреторной и менструальной фазах цикла (Kokawa K., Shikone Т., Nakano R. // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1996. - Vol.81, N 11. - P.4144-4147; Shikone Т., Kokawa K. et al // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1996. - Vol.81, N 11. - P.4144-4147).

Ряд исследователей сообщают о снижении темпов апоптоза в гиперплазированном эндометрии на основании уменьшения экспрессии FasL по сравнению со слизистой тела матки стадии пролиферации, а также выраженного понижения уровня фактора некроза опухоли (индуктора апоптоза) у больных с гиперплазией эндометрия (Сухих Г.Т., Чернуха Г.Е. и др. // Акушерство и гинекология. - 2005. - №5. - С.25-29).

Задача изобретения - усовершенствовать способ диагностики сложной эндометриальной гиперплазии без атипии, который позволит определить тактику адекватной терапии.

Поставленная задача решается тем, что в сыворотки крови женщин с гиперпластическим процессом эндометрия определяют методом иммуноферментного анализа уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию (APRIL), и если уровень APRIL больше 18,9 нг/мл, то диагностируют наличие у больной сложной гиперплазии эндометрия без атипии.

Заявляемый способ позволяет повысить чувствительность и специфичность способа диагностики сложной эндометриальной гиперплазии без атипии. Нами выявлен уровень маркера, позволяющий с высокой чувствительностью (100%) и специфичностью (96,77%) подтвердить наличие у больной сложной гиперплазии эндометрия без атипии и, следовательно, назначить адекватное лечение таким пациенткам как больным с высоким риском перехода в эндометриальную гиперплазию с атипией.

Гиперпластические процессы эндометрия необходимо рассматривать как сложный биологический процесс. Роль несбалансированной эстрогенной стимуляции в развитии гиперплазии эндометрия хорошо известна. Однако гистеогенетические механизмы развития различных повреждений эндометрия до сих пор полностью не изучены. Пролиферация и апоптоз - важнейшие события в клинических превращениях эндометрия. Роль лигандов в индукции и регуляции клеточных ответов играют различные ростовые факторы. Оценке экспрессии факторов роста и их рецепторов в эндометрии в норме и при патологии посвящено много исследований. Они подтверждают концепцию об увеличении соотношения ростовых и рост-ингибирующих сигналов в условии патологии (Сухих Г.Т., Серов В.Н. и др. // Акушерство и гинекология. - 2000. - №1. - С.41-45.; Новик А.А., Камилова Т.А., Цыган В.Н. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2004. - 224 с.; Reis F.M., Lhullier С., Edelweiss M.I. // J. assisted reproduction and genetics. - 2005. - Vol.22, N 1. - P.19-24).

Одним из маркеров, отражающим активность пролиферативных процессов, является лиганд, индуцирующий пролиферацию, (APRIL). APRIL - представитель семейства фактора некроза опухоли. Он способен стимулировать пролиферацию опухолевых клеток in vitro и может принимать участие в регуляции опухолевого роста in vivo (Hahne М. et al. // J. Exp. Med. - 1998. - Vol.188, N 6. - P.1185-1190). APRIL (известный также как TALL-2 (TNF and Apol-related Leukocyte-expressed Ligand 2 - родственный ФНО и аполипротеину лиганд-2) и TRDL-1-alpha (TNF related death ligand-alpha - родственный ФНО лиганд смерти-1-альфа)) является представителем семейства ФНО и позитивным регулятором клеточной пролиферации и опухолевого роста (Ware J. // J. Exp. Med. - 2000. - Vol.192. - P.F35-38). Уровень экспрессии APRIL повышен в различных типах злокачественных новообразований человека, а его эктопическая экспрессия прямо коррелирует с повышением туморогенности в модели с фибросаркомой (Ware J. // J. Exp. Med. - 2000. - Vol.192. - P.F35-38).

APRIL - мембранный белок 2 типа (N-конец обращен внутрь клетки), экспрессируется Т-лимфоцитами, дендритными клетками, моноцитами, макрофагами (Moore С. et al. // Clin Drug Invest. - 1999. - Vol.18. - P.271-278; Shu H.B. et al. // J. Leukocyte Biology. - 1999. - Vol.65, N 5. - P.680-683).

В нормальных тканях уровни транскрипции APRIL остаются низкими, их повышение отмечено в трансформированных клеточных линиях, злокачественных опухолях лимфоидных тканей, ободочной кишки и щитовидной железы у человека in vivo. Однако роль APRIL как индуктора пролиферации при различной патологии женских половых органов, в том числе гиперпластических процессах эндометрия, на сегодняшний день остается недостаточно исследованной.

В ходе нашей работы было обследовано 93 женщины репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами эндометрия и без патологии эндометрия.

В нашу задачу не входило выяснять этиологию развития гиперпластических процессов эндометрия, поэтому пациентки не разделялись на группы по наличию фоновых заболеваний и состоянию репродуктивной системы, основное внимание уделялось характеру полученного гистологического материала.

Все пациентки были разделены на группы в зависимости от диагноза, установленного на основании гистологического заключения:

- 27 женщин с подтвержденными гистологически полипами эндометрия (1-я группа),

- 21 женщина с простой гиперплазией эндометрия без атипии, подтвержденной гистологически (2-я группа),

- 31 женщина со сложной гиперплазией эндометрия без атипии, подтвержденной гистологически (3-я группа),

- 14 женщины без патологии эндометрия (цуг эндометрия проводился при оперативных вмешательствах на шейке матки по поводу фолликулярно-мышечной гипертрофии шейки матки и рубцовой деформации шейки матки) (0-я группа, группа контроля).

В ходе нашей работы было выявлено статистически значимое повышение уровня нового маркера пролиферации (APRIL) во второй и третьей группах по сравнению с группой контроля, а также статистически значимые различия уровней APRIL между первой и второй, первой и третьей, а также между второй и третьей группами, р<0,01.

В группе контроля значение APRIL составило 3,54 нг/мл, в первой группе - 4,26 нг/мл, во второй группе - 13,95 нг/мл, а в третьей 32,06 нг/мл (таблица 1).

Таблица 1 Уровень содержания APRIL в сыворотке крови женщин исследуемых групп Параметр Группа Valid N Median 25 th 75 th APRIL 1 27 4,26 2,58 5,13 2 21 13,95 12,45 15,29 3 31 32,06 24,5 35,34 0 14 3,545 3,0 4,18

Учитывая тот факт, что повышение в сыворотке крови маркеров пролиферации и ангиогенеза следует ожидать только лишь при «генерализации» патологического процесса или, по крайней мере, при появлении такой тенденции, достоверное увеличение концентрации APRIL в группах с простой и сложной гиперплазиями эндометрия позволяет сделать вывод о высокой активности пролиферативных процессов при подобных состояниях. При этом следует особо подчеркнуть нарастающий характер изменений APRIL в сыворотке крови женщин в группах с простой и сложной гиперплазиями. Это объясняется усилением интенсивности пролиферации, которая приводит к развитию гипоксии (ишемии) эндометрия, стимулирующей подключение механизмов неоангиогенеза, что проявляется нарастанием экспрессии СЭФР от простой гиперплазии эндометрия к сложной (Станоевич И.В. и др. // Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. - 2008. - Т.7, №2. - С.52-56).

В третьей группе женщин со сложной гиперплазией эндометрия уровень APRIL превышает уровень в контрольной группе в 9 раз, что отражает «тяжесть» исследуемого процесса.

С целью определения диагностической чувствительности и специфичности уровня лиганда, индуцирующего пролиферации, в качестве маркера сложной эндометриальной гиперплазии без атипии мы проанализировали Roc-кривые. Наименьшим значением точки отсечения является минимальное значение тестовой переменной минус 1, и максимальным значением отсечения является максимальное значение тестовой переменной плюс 1.

Наиболее достоверным маркером в выявлении активности пролиферации при гиперпластических процессах эндометрия следует признать уровень APRIL больше 18,9 нг/мл. Обладая 100% специфичностью и чувствительностью 96,77%, он также имеет высокую прогностическую ценностью положительного и отрицательного тестов (таблица 2).

Таблица 2 Таблица анализа Roc-кривых уровня APRIL   APRIL AUC 0,995 St. Error 0,00885 95% CI 0,923-1,000 z statistic 55,979 Criterion >18,9 Sensitivity 96,77 95% CI 83,3-99,9 Specificity 100,00 95% CI 83,9-100,0 +PV 100,0 95% CI 88,4-100,0 -PV 95,5 95% 77,2-99,9

Подробное описание способа и примеры его клинического использования

Всем больным проводят стандартное клинико-лабораторное обследование крови, мочи, нативных влагалищных мазков, исследование факторов свертывания крови.

Уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию, (APRIL) в сыворотке крови пациентов определяют методом иммуноферментного анализа наборами фирмы BENDER MEDSYSTEMS (Европа).

Стандарты, промывочный и рабочие буферы, конъюгаты и раствор субстрата готовят согласно инструкции к набору. Перед началом эксперимента лунки планшета, покрытые поликлональными антителами к APRIL человека, промывают дважды промывочным буфером на промывочном устройстве для микропланшетов ELISA WASHER HUMAN (USA).

Титрованием 100 мкл стандарта APRIL в 100 мкл рабочего буфера готовят последовательные двукратные разведения стандартных проб в соответствующих лунках планшета.

В остальные лунки добавляют по 50 мкл рабочего буфера и по 50 мкл опытных проб.

Во все лунки вносят по 50 мкл приготовленного раствора конъюгата биотина с поликлональными антителами к APRIL человека.

Инкубируют планшет в течение 2 часов при комнатной температуре на шейкере ST 3 (Латвия). Промывают планшет, как указано выше.

Во все лунки вносят по 100 мкл конъюгата стрептавидина с пероксидазой хрена.

Инкубируют планшет в течение часа при комнатной температуре на шейкере. Промывают планшет, как указано выше.

Во все лунки вносят по 100 мкл приготовленного раствора субстрата и инкубируют планшет 10-20 минут при комнатной температуре, защищая от света.

Останавливают цветную реакцию добавлением 100 мкл 1М фосфорной кислоты в каждую лунку.

Измерение оптической плотности при 450 нм и обсчет результатов проводят на фотометре MULTILABEL COUNTER 1420 (Финляндия).

В компьютерное обеспечение прибора вводят численные значения концентраций APRIL в стандартных сыворотках и получают после измерения концентрацию APRIL в опытных пробах. Полученное значение умножают на фактор разведения (2) и выражают уровень APRIL в нг/мл.

Пример 1. Пациентка С-ва М.В., 29 лет. Находилась на стационарном лечении в отделении гинекологическом ГОУ ВПО «РостГМУ Росздрава» с 31.03.2008 по 02.04.2008, история болезни №2922/275. Диагноз: Нарушение менструального цикла по типу гиперполименореи. Гиперплазия эндометрия? Произведена гистероскопия и выскабливание полости матки. Гистологическое заключение: простая гиперплазия эндометрия без атипии. После информированного согласия взята кровь из вены для определения уровня APRIL. Концентрация APRIL составила 18,0 нг/мл. Полученный результат у данной пациентки позволяет говорить об отсутствии избыточной пролиферативной активности и соответствует простой гиперплазией эндометрия без атипии, что совпадает с результатами гистологического заключения.

Пример 2. Пациентка К-ва Е.Н., 27 лет. Находилась на стационарном лечении в отделении гинекологическом ГОУ ВПО «РостГМУ Росздрава» с 11.02.2009 по 12.02.2009, история болезни №1158/88. Диагноз: Нарушение менструального цикла по типу метроррагии. Гиперплазия эндометрия (по данным УЗИ). Произведена гистероскопия и выскабливание полости матки. Гистологическое заключение: простая гиперплазия эндометрия без атипии. После информированного согласия взята кровь из вены для определения уровня APRIL. Концентрация APRIL составила 18,9 нг/мл. Полученный результат позволяет отнести пациентку в группу с простой гиперплазией эндометрия без атипии, что совпадает с результатами гистологического заключения.

Пример 3. Пациентка В-к Л.А., 45 лет. Находилась на стационарном лечении в отделении гинекологическом ГОУ ВПО «РостГМУ Росздрава» с 24.03.2010 по 26.03.2010, история болезни №2343/64. Диагноз: Нарушение менструального цикла по типу менометроррагии. Патология эндометрия? (по данным УЗИ). Произведена гистероскопия и выскабливание полости матки. Гистологическое заключение: простая гиперплазия эндометрия без атипии. После информированного согласия взята кровь из вены для определения уровня APRIL. Концентрация APRIL составила 19,0 нг/мл. Полученный результат у данной пациентке позволяет говорить о повышенной активности процессов пролиферации и позволяет отнести пациентку в группу со сложной гиперплазией эндометрия без атипии, что, однако, не совпадает с результатами гистологического заключения. По результатам гистологического заключения назначена гормональная терапия, которая оказалась неэффективна. У пациентки продолжались маточные кровотечения, вследствие чего была произведена операция в объеме гистерэктомии. По результатам гистологического исследования, которому подвергся весь внутренний слой тела матки, установлен диагноз: сложная гиперплазия эндометрия без атипии. Данное заключение совпадает с полученным ранее уровнем APRIL и подтверждает наличие у больной сложной эндометриальной гиперплазии без атипии.

Для решения поставленных задач было обследовано 93 женщины репродуктивного возраста с гиперпластическими процессами эндометрия и без патологии эндометрия. Всем пациенткам было проведено ультразвуковое исследование, гистероскопия в сочетании с диагностическим выскабливанием стенок полости матки и гистологическим исследованием для подтверждения патологии эндометрия.

Статистическая обработка исходных рядов признаков осуществлялась с использованием лицензионных пакетов AtteStat 7.3, MedCalc, Microsoft Excel 2003, Statistica 6.0.

Чувствительность метода определения APRIL составляет 96,77% при специфичности - 100%.

Преимущества заявляемого метода по сравнению с известными.

Преимущество заявляемого метода состоит в том, что на основании высокочувствительных современных лабораторных маркеров повышается точность диагностики сложной гиперплазии эндометрия без атипии. Метод удобен в применении, так как уровень маркера исследуется в сыворотке крови пациентки и позволяет оценивать активность пролиферативных процессов.

В клинической практике это позволит своевременно диагностировать сложную гиперплазию эндометрия без атипии, оптимизировать тактику ведения и лечения пациенток с данной патологией.

Заявляемый способ диагностики сложной эндометриальной гиперплазии без атипии апробирован на достаточном по объему клиническом материале и может быть рекомендован к применению в гинекологических стационарах.

Изобретение относится к медицине, а именно к гинекологии, и касается способа диагностики сложной гиперплазии эндометрия без атипии. В сыворотке крови больных иммуноферментным методом определяют уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию (APRIL). Если уровень APRIL больше 18,9 нг/мл, то диагностируют наличие у больной сложной гиперплазии эндометрия без атипии. Способ позволяет повысить чувствительность и специфичность диагностики сложной эндометриальной гиперплазии без атипии. 2 табл., 3 пр.

Способ диагностики сложной гиперплазии эндометрия без атипии путем исследования сыворотки крови, отличающийся тем, что иммуноферментным методом определяют уровень лиганда, индуцирующего пролиферацию (APRIL), и если уровень APRIL больше 18,9 нг/мл, то диагностируют наличие у больной сложной гиперплазии эндометрия без атипии.