СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ ФАГА SPZ7 Российский патент 2012 года по МПК A61K39/00 A61P31/04 C12N9/00 

Изобретение относится к микробиологии, биохимии и медицине, в частности к способам получения действующего вещества из очищенного препарата фаговых бактериолитических ферментов для изготовления лечебных препаратов, в частности новых поколений антимикробных препаратов и высокоэффективных, высокоселективных диагностических систем.

Уровень техники

Известен бактериофаг сальмонеллезный групп ABCDE жидкий и сухой с кислотоустойчивым покрытием (Bacteriophagum salmonellae gr. ABCDE liquidum et siccum cum indumento acidoresistentis) (см. http://www.medtrust.ru/pls/farmspravochnic/show.html? ontosObjectId=13606).

Состав его - фильтрат фаголизатов активный против наиболее распространенных возбудителей сальмонеллеза.

Фаговые препараты при применении не нарушают нормального биоценоза человека и незаменимы при устойчивости возбудителей к антибиотикам; могут применяться в комплексной терапии с другими лекарственными средствами.

Применение фаговых препаратов может вызывать различные реакции, например высыпание на коже, покраснение и воспаление (при подкожном и внутримышечном введении) и др. Противопоказаниями является индивидуальная непереносимость препарата.

Недостатком известного технического решения является - множественные противопоказания и побочные эффекты при его применении.

Известно средство для применения в терапии (лечении) бактериальных инфекций, представляющее собой фермент эндолизин бактериофага SPZ7, разрушающий в том числе клетки Salmonella enteritidis (Плешакова В.А. и др. Биолюминесцентное определение АТФ: возможности использования ферментов для повышения специфичности определения бактериальных клеток. Тезисы международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008», секция Химия, подсекция «цикл наук о живом», 8-11 апреля 2008, с.288).

Цель изобретения - получение фермента фага SPZ7.

Указанная цель достигается за счет того, что способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", состоит в том, что в бульон Хоттингера вносят 18-часовую культуру Salmonella enteritidis с концентрацией 1·10¹⁰ КОЕ/мл и подращивают ее при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 часов, в полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 с концентрацией 1·10¹⁴ БОЕ/мл и культивируют с аэрацией в течение 25 минут, осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 минут, полученные клетки помещают в 0,05 М трис-НСl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют при 37°С в течение 60 минут, добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют при ускорении 27000 g в течение 2,5 часов при температуре 5°С, супернатант отделяют от осадка и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм, затем раствор фермента осаждают добавлением (NH₄)₂SO₄ до 100%-ного насыщения при температуре 0°С, осадок белка растворяют в буферной смеси 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента 24 мл/ч, г полученный предварительно очищенный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см² 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, элюцию белков осуществляют градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента.

Раскрытие изобретения

Способ получения фаговых ферментов фага SPZ7 из коллекции Федерального Государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" включает несколько этапов:

- получение раствора неочищенного фермента;

- получение предварительно очищенного раствора фермента (далее - препарат №1);

- получение очищенного раствора фермента (далее - препарат №2).

В качестве исходного материала для получения фаговых ферментов был использован фаг SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии".

Получение раствора неочищенного фермента производится следующим образом. 30 мл 18-часовой культуры Salmonella enteritidis (сведения о Salmonella enteritidis приведены, например на сайте http://dic.academic.ru/dic.nsf/medic2/41291) с концентрацией 1·10¹⁰ КОЕ/мл (колоний образующих единиц) вносятся в 3 л бульона Хоттингера (сведения о бульоне Хоттингера приведены, например на сайте http://dic.academic.ru/dic.nsf/medic2/50634) и подращиваются при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 часов до концентрации 1·10¹⁰ КОЕ/мл. Далее 300 мл очищенного фаголизата (взвеси фаговых частиц в физиологическом растворе) с концентрацией 1·10¹⁴ БОЕ/мл (бляшкообразующих единиц) добавляются в приготовленную культуру Salmonella enteritidis и культивируются с аэрацией в течение 25 минут. Затем инфицированные фагом клетки осаждаются на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 минут. Клетки ресуспендируются в 100 мл 0,05 М трис-НСl буферной смеси рН 7,0, содержащей 7,5 мг рибонуклеазы (сведения о рибонуклеазах приведены, например на сайте http://slovari.yandex.ru/рибонуклеазы/ Естественные %20науки/Рибонуклеазы./). Суспензия культивируется при 37°С в течение 60 минут. При этом клетки разрушаются, выпуская литический фермент. Затем добавляется этилендиаминтетраацетат (далее - ЭДТА) до концентрации 5 мМ и суспензия центрифугируется при ускорении 27000 g в течение 2,5 часов при температуре 5°С. Супернатант отделяется от осадка, фильтруется через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм. Супернатант, содержащий бактериолитический фаговый фермент, исследуется на бактериолитическую активность и наличие свободного фага. Полученный раствор неочищенного фермента может храниться не более 1 суток в замороженном виде при температуре -20°С.

При получении препарата №1 используется следующая технология проведения первичной очистки раствора неочищенного фермента. Раствор фермента размораживается, и производится осаждение белка добавлением (NH₄)₂SO₄ до 100%-ного насыщения при температуре 0°С. В препараты с концентрацией общего белка менее 1 мг/мл перед осаждением дополнительно добавляется бычий сывороточный альбумин (сведения о бычем сывороточном альбумине приведены, например на сайте http://ru. wikipedia.org/wiki/%D0%91%D1%8B%D1%87%D0%B8%D0%B9_%D1%81%D1%8B%D0%B2%D0%BE%D1%80%D0%BE%D1%82%D0%BE%D1%87%D0%BD%D1%8B%D0%B9_%D0%B0%D0%BB%D1%8C%D0%B1%D1%83%D0%BC%D0%B8%D0%BD) до достижения концентрации общего белка не менее 1 мг/мл. Добавленный бычий сывороточный альбумин практически полностью отделяется от активных фракций на стадии гельфильтрации. Осадок белка растворяется в 5-8 мл буферной смеси 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Полученный раствор фермента вносится в хроматографическую колонку 5 см² 33 см с декстраном модифицированным (например, Sephadex G75 superfine), уравновешенную буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Хроматографическое разделение производится при температуре 2-3°С. Скорость подачи элюента 24 мл/ч. Фракции, содержащие 60% общей активности фермента, объединяются, замораживаются и хранятся при температуре -20°С. Полученный препарат №1 может храниться в таком замороженном виде не менее 2 недель без потери активности.

Полученный препарат №1 подвергается дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см² 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана (например, DEAE-Toyopearl 650M), уравновешенной буферной смесью 0,02 М трис-НСl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. Элюция белков осуществляется градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М (50×50 мл). Хроматографическое разделение производится при температуре 2-3°С. Скорость подачи элюента 35 мл/ч. Фракции, содержащие 70% общей активности фермента, объединяются, замораживаются и хранятся при температуре -20°С. Полученный препарат №2 может храниться в замороженном виде при температуре -20°С без потери активности не менее 10 месяцев. Размороженный препарат №2 сохраняет свою бактериолитическую активность в течение не менее 45 суток при температурах 20-37°С.

В качестве основного субстрата выбирают хозяина фага - живые клетки Salmonella enteritidis, в качестве дополнительного субстрата - живые клетки Escherichia coli (сведения о Escherichia coli приведены, например на сайте http://lingvo.yandex.ru/Escherichia%20coli%20/). При этом субстрат Escherichia coli используется для протоколирования процесса очистки фермента, так как не обнаружено никаких фракций, активных только по отношению к Salmonella enteritidis и неактивных по отношению к Escherichia coli и наоборот.

Для целей определения бактериолитической активности ферментов клетки Salmonella enteritidis и Escherichia coli выращивались на гидролизате рыбной муки с агаром (ГРМ-агаре) при температуре 37°С в течение 14 часов. Выращенные клетки суспендировались в 0,9% растворе NaCl, центрифугировались с ускорением 5000 g в течение 5 минут, затем ресуспендировались в 0,9% растворе NaCl, при этом концентрация клеток в данной суспензии подбирается такой, чтобы при разведении в 50 раз ее оптическая плотность составляла бы 0,5-0,6 при длине волны 650 нм. Для измерений должны использоваться свежевыращенные клетки или клетки, однократно замороженные жидким азотом, которые хранились при температуре -70°С не более 1 месяца. В течение эксперимента по определению бактериолитической активности ферментов (длительностью до 1 часа) препарат субстрата клеток должен сохраняться при температуре 5°С.

В качестве способа измерения бактериолитической активности в сравниваемых препаратах фермента выбрана турбидиметрия, а именно измерение падения оптической плотности (D) суспензии клеток при длине волны 650 нм. Для суспензий клеток с оптической плотностью D<0,7 начальное значение оптической плотности (D₀) пропорционально количеству добавленных клеток. При глубоком лизисе клеток остаточная оптическая плотность препаратов стремится к некоторому относительно постоянному значению оптической плотности (D∞), которое условно принято за значение оптической плотности суспензии «глубоко лизированных разрушенных клеток». Таким образом, значение величины Θ=(D₀-D)/(D₀-D∞) дает оценку полноты лизиса препарата, что подтверждается независимыми экспериментами по подсчету остаточных КОЕ.

В качестве стандартного раствора для измерения активности должна использоваться буферная смесь 0,01 трис-HCl с рН8,5. Измерения каталитической активности фермента должны проводиться при температуре 37°С.

Пример использования бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов. Специфичность фагового фермента весьма заметно отличается от специфичности яичного лизоцима. Фаговый фермент более избирательно и с большей эффективностью по сравнению с куриным яичным лизоцимом воздействует на клетки как Salmonella enteritidis, так и на клетки Escherichia coli. Проведенное сравнение субстратной специфичности очищенного фагового фермента (препарат №2) с концентрацией очищенного фагового фермента 1,9 мкг/мл и куриного яичного лизоцима с концентрацией лизоцима 5,6 мкг/мл, при начальной оптической плотности суспензии клеток показало, что воздействие фагового фермента на клетки Escherichia coli и Salmonella enteritidis соответственно в 2-2,2 и 6,4-6,6 раза выше воздействия на них куриного яичного лизоцима.

Исследование влияния различных добавок на скорость ферментативного лизиса клеток очищенным фаговым ферментом (препарат №2) показало, что почти все исследованные добавки не оказывают заметного влияния на ферментативный лизис, т.е. установлена относительная индифферентность к данным добавкам очищенного фагового фермента.

Использование бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов позволяет достичь исключения множественных противопоказаний и побочных эффектов, характерных при применении препаратов живых фагов.

Использование бактериолитического ферментативного препарата фаговых ферментов совместно с антибиотиком - полимиксином-М в малых концентрациях, заметно усиливает лизис клеток ферментом. Наибольший эффект наблюдается в узком диапазоне концентраций полимиксина-М (2,5·10^-6 М-3,5·10^-6 М). В указанном диапазоне концентраций отчетливо проявляется синергизм действия фермента и антибиотика, т.е. воздействие на бактериальные клетки смеси двух веществ существенно превышает сумму действий веществ по отдельности. При этом меньшие или большие концентрации полимиксина-М дают меньший синергетический эффект.

Изучение стабильности препарата очищенного фагового фермента (препарата №2) показало, что высокоочищенный фермент демонстрирует превосходную стабильность, сохраняя активность в течение 45 суток инкубации при температурах в диапазоне 25-37°С.

Изобретение относится к биохимии. Способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", заключается в следующем. В бульон Хоттингера вносят культуру Salmonella enteritidis и подращивают ее. В полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 и культивируют с аэрацией. Осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге. Полученные клетки помещают в 0,05 М трис-HCl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют. Добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют, супернатант отделяют от осадка и фильтруют. Затем фермент осаждают добавлением (NH₄)₂SO₄ до 100%-ного насыщения при температуре 0°С. Осадок белка растворяют в буферной смеси, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М Nad и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят со скоростью подачи элюента - 24 мл/ч, полученный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии. Хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента. Изобретение позволяет исключить множественные противопоказания и побочные эффекты, имеющие место при применении препаратов живых фагов.

Способ получения ферментов фага SPZ7 из коллекции Федерального государственного научного учреждения "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии", состоящий в том, что в бульон Хоттингера вносят 18-часовую культуру Salmonella enteritidis с концентрацией 1·10¹⁰ КОЕ/мл и подращивают ее при температуре 37°C с аэрацией в течение 2-3 ч, в полученную культуру добавляют очищенный фаголизат SPZ7 с концентрацией 1·10¹⁴ БОЕ/мл и культивируют с аэрацией в течение 25 мин, осаждают клетки Salmonella enteritidis на центрифуге с ускорением 6500 g в течение 15 мин, полученные клетки помещают в 0,05 М трис-HCl буферную смесь с рН 7,0, содержащую рибонуклеазу, культивируют при 37°С в течение 60 мин, добавляют этилендиаминтетраацетат до концентрации 5 мМ и полученную суспензию центрифугируют при ускорении 27000 g в течение 2,5 ч при температуре 5°С, супернатант отделяют от осадка и фильтруют через фильтры с диаметром пор 0,45, 0,22 и 0,1 мкм, затем раствор фермента осаждают добавлением (NH₄)₂SO₄ до 100%-го насыщения при температуре 0°С, осадок белка растворяют в буферной смеси 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, полученный раствор фермента вносят в хроматографическую колонку с декстраном модифицированным, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 24 мл/ч, полученный предварительно очищенный раствор фермента подвергают дальнейшей очистке с помощью ионообменной хроматографии на колонке размером 2 см² 12 см со сшитым поливиниловым спиртом с функциональными группами диэтиламиноэтана, уравновешенным буферной смесью 0,02 М трис-HCl с рН 7,5, содержащей 0,15 М NaCl и 1 мМ этилендиаминтетраацетата, элюцию белков осуществляют градиентом концентрации NaCl 0-0,5 М, хроматографическое разделение производят при температуре 2-3°С со скоростью подачи элюента - 35 мл/ч, выделяют и объединяют фракции, содержащие 70% общей активности фермента.