ВИДОСПЕЦИФИЧЕСКИЙ ВИРУЛЕНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИОФАГА, ОБЛАДАЮЩИЙ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ Staphylococcus aureus, ВКЛЮЧАЯ МУЛЬТИРЕЗИСТЕНТНЫЕ ШТАММЫ Российский патент 2014 года по МПК C12N7/00 A61K35/76 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии и касается штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA18, кодирующего фаг-ассоциированный литический фермент, причем как бактериофаг, так и фаговый литический фермент могут быть использованы для создания новых лечебных и дезинфекционных препаратов.

Бактерии вида Staphylococcus aureus часто являются возбудителями инфекций кожи и мягких тканей, остеомиелита, артрита. Они могут вызывать вне- и внутрибольничную пневмонию, эндокардит, сепсис.

Клинически значимыми особенностями Staphylococcus aureus являются множественная устойчивость к различным классам антимикробных препаратов, устойчивость к дезинфицирующим средствам, высушиванию, ультрафиолетовому облучению, толерантность к детергентам. Высокая выживаемость на объектах внешней среды и способность персистировать в течение продолжительного периода в условиях больничного окружения увеличивает риск горизонтальной передачи этого микроба через медицинский персонал или предметы обихода, что на фоне интенсивного использования антибиотиков широкого спектра приводит к возрастающему распространению метициллинрезистентных (MRSA) и метициллинчувствительных (MSSA) штаммов Staphylococcus aureus в стационарах лечебных учреждений.

В связи с этим чрезвычайно актуальной является проблема поиска и разработки новых средств лечения инфекций, вызываемых Staphylococcus aureus. Одним из таких средств могут быть бактериофаги, хорошо зарекомендовавшие себя, например, при комплексном лечении госпитальных инфекций, вызываемых псевдомонадами.

Известен штамм бактериофага КСТС 11154 ВР, обладающий литической активностью против Staphylococcus aureus (США, патент №8043613).

В описании патента указано, что данный бактериофаг относится к группе рhi29 - подобных фагов семейства Podoviridae, которое объединяет известные умеренные фаги, не указывается литический спектр бактериофага и примеры строятся на использовании одного чувствительного штамма S.aureus, выделенного от маститных коров.

Известен штамм бактериофага КАСС 9700IP, обладающий литической активностью против Staphylococcus aureus (США, патент №8071352).

В описании патента не указывается литический спектр бактериофага и примеры строятся на использовании одного чувствительного штамма S.aureus, выделенного от маститных коров.

В настоящее время существует коммерческий препарат бактериофага для лечения инфекций, вызванных стафилококками - Бактериофаг стафилококковый (http:// www.microgen.ru/catalog/detail.php?ID=485). Согласно описанию производителя препарат представляет собой фильтрат фаголизата, активный в отношении стафилококковых бактерий наиболее распространенных фаготипов, в т.ч. Staphylococcus aureus. Состав коммерческого препарата не охарактеризован, соответственно характеристики бактериофагов, входящих в его состав, отсутствуют.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новый вирулентный штамм видоспецифического бактериофага Staphylococcus aureus и его фаг-ассоциированный литический фермент, эффективно лизирующие клинические изоляты MRSA и MSSA.

Технический результат достигается получением нового видоспецифического вирулентного штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA18, семейства Myoviridae, обладающего высокой литической активностью, широким спектром действия в отношении штаммов Staphylococcus aureus, низкой частотой образования фагорезистентных форм и кодирующего литический фермент с высокой лизирующей активностью против стафилококков при применении извне.

Штамм бактериофага Staphylococcus aureus SA18 выделен из клинического материала, то есть бактериальный вирус приспособлен к функционированию в данной экологической нише, и депонирован в Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - ОБОЛЕНСК) Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) под регистрационным номером Ph 62.

Отличием предлагаемого штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA18 является высокая антимикробная активность, широкий спектр лизируемых штаммов Staphylococcus aureus, низкая частота образования фагорезистентных форм у чувствительных штаммов.

Предлагаемое изобретение иллюстрируется следующими фигурами:

Фиг.1 - фагочувствительность клинического изолята Staphylococcus aureus ГКПМ-Оболенск 75/41

Доза - 1RTD SA18 (титр бактериофага - 10⁶ БОЕ/мл)

Доза - 10RTD SA18 (титр бактериофага- 10⁷ БОЕ/мл)

Доза -100 RTD SA18 (титр бактериофага-10⁸ БОЕ/мл)

Бактериофаг стафилококковый - препарат коммерческого бактериофага производства НПО «Микроген» в исходной концентрации (видны фагорезистентные колонии).

Фиг.2 - электронная микрофотография бактериофага Staphylococcus aureus SA18. Масштаб 50 нм.

Фиг.3 - гидролиз ДНК бактериофага Staphylococcus aureus SA18 рестрикционными эндонуклеазами: (1) маркер молекулярных масс Lambda/Hindlll, (2) EcoRI, (3) EcoRV, (4) AcII, (5) PstI, (6) маркер молекулярных масс Lambda Mix 19 (#SM0231 Fermentas).

Бактериофаг Staphylococcus aureus SA18 относится к семейству Myoviridae и характеризуется следующими свойствами:

Морфология фаговой частицы: головка икосаэдрической формы диаметром 90-95 нм, сокращающийся хвостовой отросток длиной 250-270 нм (Фиг.2).

Морфология негативных колоний: на чувствительном бактериальном штамме формирует круглые прозрачные негативные колонии диаметром ~ 0,5 мм.

Частота образования фагорезистентных форм Staphylococcus aureus на одну клетку менее 10^-9.

Спектр литического действия: бактериофаг лизирует 98,6% выбранных для проведения исследования штаммов Staphylococcus aureus (n=148), выделенных от больных ожоговых отделений, отделений плановой и экстренной хирургии, терапевтического отделения, отделения реанимации и интенсивной терапии, а также отделения урологии; не проявляет литической активности к штаммам Staphylococcus epidermidis и представителям других родов и семейств (Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Enterococcus spp., Streptococcus spp).

Фаг-ассоциированный литический фермент бактериофага Staphylococcus aureus SA18 эффективно лизирует 100% выбранные для проведения исследования клинические изоляты Staphylococcus aureus (n=148), в том числе и штаммы, резистентные к бактериофагу SA18 (Таблица).

Геном бактериофага Staphylococcus aureus SA18 представлен двунитевой ДНК размером около 120 тысяч пар оснований. ДНК фага расщепляется рестрикционными эндонуклеазами: AccI, DraIII, AluI, SpeI, EcoRI, EcoRV, AvaI, AvaII, HinfI, HincII, HphI, MwoI, Hindlll, KpnI, MboII, NcoI, NdeI, NheI, AcII, PstI, RsaI, SacI, PleI, SmaI, TaiI, XbaI, XhoI, и не гидролизуется ферментами Aatll, BamHI, Bell, BgUI, NruI, MboI, ClaI, SacII, PvuII, SalI, BcII (фиг.3).

Бактериофаг Staphylococcus aureus SA18 хранится в виде фаголизата либо в лиофильно высушенном состоянии.

Бактериофаг Staphylococcus aureus SA18 может быть использован для разработки комплексных лечебных и дезинфекционных препаратов против клинических штаммов S. aureus, включая мультирезистентные штаммы, а также препаратов для санации продуктов питания от золотистого стафилококка.

Пример 1. Получение фаголизата бактериофага Staphylococcus aureus SA18

К 0,5 мл ночной бульонной культуры чувствительного штамма Staphylococcus aureus добавляют 4,5 мл бульона (Brain Heart Infusion Broth с добавлением 1 мМ сернокислого магния и 11 мМ хлористого кальция), подращивают культуру до 10⁹ м.к./мл и вносят 10 мкл суспензии штамма бактериофага SA18 с концентрацией 5×10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубируют в стационарных условиях при 25 °С до наступления полного просветления бактериальной культуры. Добавляют 0,25 мл хлороформа, перемешивают, выдерживают в холодильнике в течение 2 ч. Низкоскоростным центрифугированием (10000 g, 15 мин) удаляют обломки бактериальных клеток и титруют фаголизат. Он содержит 5×10⁹-10¹⁰ частиц фага в 1 мл.

Пример 2. Получение неочищенного фаг-ассоциированного литического фермента бактериофага Staphylococcus aureus SA18

В 90 мл бульона (Brain Heart Infusion Broth с добавлением 1 мМ сернокислого магния и 1 мМ хлористого кальция) вносят 5 мл ночной бульонной культуры чувствительного штамма Staphylococcus aureus, подращивают культуру до значения OD₆₅₀, равного 0.7, вносят 2 мл суспензии штамма бактериофага SA18 с концентрацией 5×10⁹ БОЕ/мл. Смесь инкубируют в стационарных условиях при 25 °С до выявления лизиса бактериальной культуры. Затем лизат быстро охлаждают на льду. Неразрушенные бактериальные клетки и клеточный дебрис удаляют с помощью центрифугирования и фильтрации через 0.45 мкм мембрану. Супернатант концентрируют в 50 раз ультрафильтрацией через Millipore YM-100 мембрану. Экстракт с неочищенным литическим ферментом хранят при температуре -18 °С до использования.

Пример 3. Проверка специфичности и спектра антибактериального действия бактериофага Staphylococcus aureus SA18

Специфичность штамма бактериофага проверяют методом спот-тестов. Для этого бульонные бактериальные культуры, находящиеся в фазе логарифмического роста, мутностью 10⁹ м.к./мл наносят на поверхность агара в чашках Петри с помощью стерильного ватного тампона. Инокуляцию проводят штриховыми движениями в трех направлениях, поворачивая чашку Петри на 60°. Наносят по 10 мкл фага в дозах 1, 10 и 100 RTD (титр фага - 10⁶, 10⁷ и 10⁸ БОЕ/мл), инкубируют чашки при комнатной температуре в течение 1-2 сут.

Специфичность штамма бактериофага и неочищенного фаг-ассоциированного литического фермента (спот-тесты) Представители вида * Наличие (+) или отсутствие (-) лизиса**   Бактериофаг SA18 Неочищенный литический фермент бактериофага SA18 Staphylococcus aureus MSSA (99) +(97)
-(2) +(99) Staphylococcus aureus MRSA (49)
Все штаммы MRSA мультирезистентны, т.к. устойчивы к различным комбинациям тетрациклинов, аминогликозидов, макролидов и фторхиналонов +(49) +(49) Staphylococcus epidermidis (3) - - Streptococcus spp. (3) - - Enterococcus spp. (2) - - Escherichia coli (3) - - Salmonella enteritidis (3) - - Pseudomonas aeruginosa (3) - - * - в скобках - количество штаммов данного вида, используемых при проверке ** - специфичность штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA18 не зависит от дозы в пределах исследованных концентраций (10⁶, 10⁷и 10⁸ БОЕ/мл)

Пример 4. Проверка специфичности и спектра антибактериального действия неочищенного фаг-ассоциированного литического фермента бактериофага Staphylococcus aureus SA18

Специфичность неочищенного фаг-ассоциированного литического фермента бактериофага Staphylococcus aureus SA18 проверяют методом спот-тестов. Для этого по 0,05 мл бульонных бактериальных культур, находящихся в фазе логарифмического роста (10⁹ м.к./мл), наносят на поверхность плотных питательных сред (содержащих 1% агарозы, 1 мМ сернокислого магния и 1 мМ хлористого кальция) в чашках Петри. Затем капают по 10 мкл неочищенного фаг-ассоциированного литического фермента стафилококкового бактериофага SA18, инкубируют чашки при комнатной температуре в течение 1-2 сут (Таблица).

Пример 5. Получение электронно-микроскопических данных о бактериофаге Staphylococcus aureus SA18, наработанном по примеру 1

Заключение о принадлежности фага к тому или иному морфотипу делают на основании электронно-микроскопического исследования морфологии фаговой частицы. Исследование проводят методом негативного контрастирования. Образцы фаголизата, полученного по примеру 1, дополнительно очищают методом дифференциального центрифугирования, фиксируют 1%-ным раствором глутарового альдегида, приготовленного на 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,0), и наносят на коллодиевые пленки-подложки, укрепленные на никелевых сетках. Нанесенные на подложки образцы контрастируют 1%-ным водным раствором уранилацетата и изучают на электронном микроскопе.

Электронная микрофотография бактериофага Staphylococcus aureus SA18 представлена на фиг.2.

Пример 6. Рестрикционный анализ ДНК штамма бактериофага Staphylococcus aureus SA18

Составляют рестрикционную смесь, содержащую 0,2 мкг/мкл ДНК бактериофага SA18, 2 мкл 10-кратного рестрикционного буфера, 1 единицу соответствующего фермента, деионизованную воду до общего объема 20 мкл. Смесь инкубируют при 37 °С в течение 16 ч. Электрофорез проводят в горизонтальном электрофорезном аппарате в 0,6%-ном агарозном геле при напряжении 90 В в течение 4 ч. После 15 мин окрашивания в растворе 0,4 мкг бромистого этидия гель визуализируют под УФ-лампой.

Таким образом, штамм бактериофага Staphylococcus aureus SA18 относится к семейству Myoviridae, является специфичным и вирулентным для Staphylococcus aureus и кодирует фаг-ассоциированный литический фермент с высокой лизирующей активностью против стафилококков при применении извне. Широкий спектр литической активности бактериофага Staphylococcus aureus SA18, как и фаг-ассоциированного литического фермента бактериофага Staphylococcus aureus SA18, позволяет использовать бактериофаг SA18 для разработки комплексных лечебных и дезинфекционных препаратов против инфекций, вызванных золотистым стафилококком, а также для препаратов для санации продуктов питания от Staphylococcus aureus. При проверке фагочувствительности клинических изолятов золотистого стафилококка отмечено наличие единичных фагорезистентных колоний у всех штаммов при использовании коммерческого препарата бактериофага стафилококкового жидкого и у 19% исследованных штаммов при использовании бактериофага Staphylococcus aureus SA18 (титр 10⁶-10⁸ БОЕ/мл или 1-100 RTD).

Изобретение относится к области медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к штамму бактериофага. Штамм обладает литической активностью в отношении Staphylococcus aureus. Штамм депонирован под номером Ph 62 в коллекции «ГКПМ-Оболенск». Штамм может найти применение для разработки комплекных лечебных и дезинфекционных препаратов против инфекций, вызванных золотистым стафилококком, а также препаратов для санации продуктов питания от Staphylococcus aureus. 1 табл., 3 ил., 6 пр.

Видоспецифический вирулентный штамм бактериофага, обладающий литической активностью в отношении Staphylococcus aureus, включая мультирезистентные штаммы, депонированный в Государственной Коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (ГКПМ - ОБОЛЕНСК) Федерального бюджетного учреждения науки Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии (ФБУН ГНЦ ПМБ) под регистрационным номером Ph 62.