Штамм Staphylococcus hyicus B-8870-продуцент стафилолитической амидазы и стафилолитическая амидаза Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 C12N9/80 C12R1/44 

Изобретение относится к области биотехнологии, ветеринарии и медицины, в частности к получению потенциальных препаратов для лечения бактериальных инфекций, вызванных стафилококками разных видов, в том числе устойчивых к антибиотикам.

Уровень техники

Стафилококкозы являются наиболее распространенными социально значимыми заболеваниями, охватывающими все возрастные слои населения. Высокая распространенность, устойчивость во внешней среде, а также к антибиотикам, способность поражать практически все органы и ткани, хронизация инфекции с образованием биопленок, делают стафилококковые заболевания трудноизлечимыми даже при наличии современного широкого спектра антимикробных препаратов. Исследование стафилолитических ферментов, является одним из этапов на пути создания высокоэффективных медицинских препаратов, которые могут быть с успехом включены как в имеющиеся схемы лечения стафилококкозов, так и использоваться индивидуально, например, в случаях таких серьезных, практически не излечимых заболеваниях как стафилококковый эндокардит, стафилококковое поражение суставов, разнообразные поражения внутренних органов с образованием биопленок.

В 80-90 годах прошлого века уже был известен тот факт, что Staphylococcus hyicus обладает высокой протеолитической активностью, которая была показана в тестах по гидролизу казеина, желатина, а также по лизису клеток Micrococcus luteus. С. Characteristic Bacteriolytic Activities of Staphylococcus hyicus. Journal of Clinical Microbiology, July 1989, p. 1682-1683. C. Staphylococcus hyicus, the cause of exudative epidermit is of swine. Review. 1990. Berliner und Munchener Tierarztliche Wochenschrift 103(2): 60-63. Было высказано предположение, что антибактериальная активность в отношении микрококков может рассматриваться как видовой признак Staphylococcus hyicus. Однако дальнейшие исследования привели к выводу, что эта характеристика должна рассматриваться только как индивидуальное свойство отдельных штаммов, а не как видовой признак. В. Skalka. Antibacterial effects of Staphylococcus hyicus and Staphylococcus chromogenes. Acta Vet. BRNO, 62, 1993: 39-47.

Из культуральной жидкости Staphylococcus hyicus 3682 был выделен бактериоцин (Hyicin 3682), обладающий широким спектром антибактериального действия в отношении грамположительных микроорганизмов, включающих такие патогены как Bacillus coagulans, Geobacillus stearothermophilus, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus.

Известен также штамм Staphylococcus hyicus 4244 - продуцент Hyicin 4244 - пептида с широким спектром действия в отношении грамположительных микроорганизмов. Аналогом предложенной стафилолитической амидазы является стафилолитическая амидаза из Staphylococcus sciuri DD 4747 содержащая в своей структуре домен CHAP (цистеин-гистидин зависимая амидогидролаза / пептидаза). Plasmid-specified Fern АВХ-like immunity factor in Staphylococcus sciuri DD 4747. FEMS Microbiology Letters 249 (2005) 227-231. Домен CHAP имеет длину около 120 аминокислот:

MGSNIQGENILNIKKIATYTVLSTLVLTGFTNIDTGVKNFTQHEAKAAAIDKYPRPIKTAQPNYH WKNNCTWWHNKJWQTKRYLPSSFTHAKNWLSEAKKAGFKTGKTPLAGAILQTSKGGGGLGH VAFVEKVNANGSIKISEYNYNVSLGYGTRTLTKAQAATYNYIY, и обладает уникальным свойством участвовать в двух разных каталитических реакциях в ходе гидролиза клеточной стенки (Bateman and Rawlings, 2003; Rigden и др., 2003). Пептидазная активность заключается в расщеплении связи между D-аланином и первым глицином пентаглицинового мостика. Амидазная же активность проявляется в расщеплении химической связи между MurNAc и L-аланином на N-конце стволового пептида (Bateman and Rawlings, 2003; Rigden et al., 2003). Некоторые CHAP-белки, имеют только пептидазу активность (например, фаговый фермент LysK), только амидазная активность (например, Ski) или обе (например, LytN) (Llull et al., 2006; Becker et al., 2009; Frankel and Schneewind, 2012). В фаговых белках домен CHAP в основном расположен в N-концевой области, тогда как в бактериальных белках он расположен на С-конце (Zou and Hou, 2010).

Ниже представлена таблица данных литической активности CHAP домена на различные виды стафилококков из работы М. Benesik, J. Novacek, et al. Virus Genes (2018) 54:130-139.

Техническим результатом изобретения является получение штамма Staphylococcus hyicus В-8870, секретирующего фермент со стафилолитической активностью, и выделение стафилолитической амидазы с более широким спектром действия в отношении микроорганизмов рода Staphylococcus, позволяющей расширить ряд стафилолитических ферментов.

Технический результат достигается тем, что предложен Штамм Staphylococcus hyicus В-8870 - продуцент стафилолитической амидазы и стафилолитическая амидаза, имеющая аминокислотную последовательность:

молекулярную массу 14000,75 Да, расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35, температурный оптимум ферментативной реакции в пределах 40°C, рН-оптимум фермента в пределах 7,7.

В аминокислотной последовательности белка из Staphylococcus hyicus В-8870 жирным шрифтом отмечены аминокислотные остатки, не соответствующие участку замены последовательности Staphylococcus sciuri DD 4747.

Штамм-продуцент стафилолитической амидазы Staphylococcus hyicus депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-8870.

В ходе исследований нами выделен из культуральной жидкости штамма Staphylococcus hyicus В-8870 стафилолитический фермент, охарактеризованный как энзим содержащий домен CHAP (цистеин-гистидин зависимая амидогидролаза / пептидаза), далее обозначенный нами как, CHAPh фермент.

Штамм Staphylococcus hyicus был выделен при высеве патологического материала из подглазничного синуса здорового бройлера на плотную питательную среду.

Биохимические показатели, определенные методом «STAPHYtest» выявили принадлежность изолята к виду Staphylococcus hyicus. Биохимические показатели имеют отличия от стандартных лишь по показателям расщепления лактозы, галактозы и утилизации нитрата, который свойственен для 70-80% штаммов, но отсутствует у данного микроорганизма (таблица 2).

Методом масс-спектрометрического анализа MALDI TOF подтверждена принадлежность изолята к виду Staphylococcus hyicus.

Выделенный микроорганизм Staphylococcus hyicus В-8870 растет на стандартных жидких и плотных питательных средах при 37°C и не требует для роста специфических добавок и компонентов среды. На плотной среде образует белые блестящие гладкие колонии, а на жидкой питательной среде растет с равномерным помутнением среды. Отличительным свойством штамма является угнетение роста других видов стафилококков при совместном культивировании на плотной питательной среде.

Чувствительность штамма Staphylococcus hyicus В-8870 к антимикробным препаратам определяли с использованием диск-диффузионного метода в соответствие с рекомендациями Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, 2013). Использовались диски (OXOID, Великобритания; HiMedia, Индия) - амоксиклав (10 μg), тилмикозин (15 μg), энрофлоксацин (5 μg), ампициллин (10 μg), доксициклин (30 μg), ципрофлоксацин (5 μg), флорфеникол (30 μg), цефтиофур (30 μg), гентамицин (10 μg), ко-тримоксазол (25 μg), и линкомицин (25 мкг). Условия культивирования - 37°C в течение 24 часов. Зоны задержки роста определяли с помощью автоматического штангельциркуля.

Штамм Staphylococcus hyicus В-8870 устойчив к действию таких антибиотиков как: эритромицин, линкомицин, энрофлоксацин.

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

Фиг. 1. Хроматограмма очистки стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870 катионообменной хроматографией. I - промывка колонки от балластных веществ буферным раствором, содержащим 250 мМ NaCl. II - элюция целевого вещества буферным раствором, содержащим 500 мМ NaCl.

Фиг. 2. Электрофорез в 15% полиакриламидном геле с использованием маркерных белков Thermo Scientific «PageRuler» PI26619. 1 - маркерные белки. 2 - очищенная катионообменной хроматографией стафилолитическая амидаза из Staphylococcus hyicus В-8870.

Фиг. 3. Температурная зависимость активности стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870.

Фиг. 4. Зависимость ферментативной активности фермента из Staphylococcus hyicus В-8870 от рН буферного раствора.

Фиг. 5. Начальная скорость лизиса стафилококковых клеток стафилолитической амидазой из Staphylococcus hyicus В-8870.

Пример 1. Культивирование штамма продуцента Staphylococcus hyicus В-8870. Штамм продуцент выращивают на плотной питательной среде LB ночь при 37°C. Микробиологической петлей производят посев материала с плотной питательной среды в качалочную колбу объемом 250 см³ с жидкой питательной средой LB. Культивируют на качалке 16-18 ч при 37°C при перемешивании 200 об/мин до оптической плотности ОП580 ~7. Посевной материал засевают в 4 качалочные колбы объемом 250 см³ по 50 см³. Культивируют в том же режиме, что и посевной материал. Культуральную жидкость центрифугируют при 8000 об/мин 15 мин (ротор "Backman" 14). Супернатант используют для выделения и очистки стафилолитической амидазы.

В ходе культивирования штамма, на жидкой питательной среде LB установлено, что микроорганизм секретирует белок, обладающий бактериолитической активностью в отношении тестового штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р, которая составила 4,5 ед/мл. За одну литическую единицу активности принимали уменьшение оптической плотности суспензии живых клеток тестового штамма Staphylococcus aureus FDA 209Р в 2 раза за 10 минут с учетом значения спонтанного лизиса контрольной суспензии клеток, при исходной оптической плотности ~0,3, в 50 мМ трис-буфере рН 7,4 + 100 мМ NaCl, при температуре 37°C.

Пример 2. Очистка стафилолитической амидазы из культуральной жидкости Staphylococcus hyicus В-8870.

Хроматографическую очистку проводят на колонке с КМ-сефарозой объемом 100 см³ уравновешенную буферным раствором (5 мМ трис-HCl, рН 7,8). Промывку проводят тем же буферным раствором, содержащим 250 мМ NaCl. Элюируют фермент все в том же буфере с 500 мМ NaCl (Фиг. 2). Фракцию, содержащую стафилолитическую амидазу, оценивают с помощью электрофореза в 15% полиакриламидном геле с использованием маркерных белков Thermo Scientific «PageRuler» PI26619, а также определяют удельную активность. Далее, раствор фермента замораживают для хранения при -18°C.

При проведении очистки стафилолитической амидазы с помощью изократической катионообменной хроматографии на колонке с носителем CM-Sepharose Fast Flow "Pharmacia" выделен электрофоретически чистый белок с молекулярной массой ~14 кДа по данным электрофореза в ПААГ (Фиг. 3). Нанесение белка и промывку проводили в 50 мМ трис-буфере +100 мМ NaCl. Примесные вещества удаляли промывкой 50 мМ трис-буфером рН 7,8+250 мМ NaCl. Элюировали продукт в том же буфере с 500 мМ NaCl. Удельная активность фермента составила 1370 ед/мг.

Первичная структура стафилолитической амидазы, определена хроматомасспектрометрическим анализом.

При оценке последовательности в базе данных NCBI показано 98% сходство участка аминокислотной последовательности данного фермента с аминокислотной последовательностью фермента из Staphylococcus hyicus В-8870. Анализ показал ~90% сходство с участком последовательности стафилолитической амидазы из Staphylococcus sciuri (Фиг. 4). Белок из Staphylococcus hyicus В-8870 состоит из 123 аминокислотных остатков, 12 из которых не соответствуют участку первичной последовательности белка из Staphylococcus sciuri DD 4747, что составляет 9,8%.

На основании первичной структуры стафилолитической амидазы вычислен коэффициент поглощения белка (1 мг/мл) при 280 нм, который составил . Расчет проводили по формуле: (5700 nTyr + 1300 nTrp)/М, где М - молекулярная масса.

Расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35.

Уточненное значение молекулярной массы - 14000,75 Да.

Определена температурная зависимость ферментативной активности стафилолитической амидазы. Ее максимальное значение находится в пределах 40°C. Начиная с 50°C активность резко падает и к 60°C практически полностью утрачивается (Фиг. 5).

рН-оптимум стафилолитической амидазы лежит в пределах 7,7.

Определение антистафилококковой активности стафилолитической амидазы из Staphylococcus hyicus В-8870 проводили на суспензии клеток контрольных штаммах и клинических изолятах различных видов стафилококков, с учетом спонтанного лизиса клеток. Фермент проявлял литическую активность во всех случаях, но скорость лизиса существенно различалась в зависимости от вида стафилококков. Результаты литической активности стафилолитической амидазы приведены на гистограмме.

Из рисунка видно, что литическая активность фермента из Staphylococcus hyicus В-8870 проявляется в отношении всех исследованных клинических изолятов и референсных штаммов стафилококков, в отличие от CHAP домена, неактивного в отношении таких видов, как: S. hyicus, S. lugdunensis, S. cohnii, S. gallinarum, S. pasteuri, S. piscifermentans, S. sciuri (Таблица 1), что свидетельствует о более широком спектре литических свойств исследуемого фермента.

Таким образом, из приведенных результатов видно, что впервые выделен и охарактеризован штамм Staphylococcus hyicus В-8870 обладает способностью секретировать в культуральную жидкость антистафилококковую амидазу, обладающий литической активностью в отношении всего исследованного спектра видов микроорганизмов рода Staphylococcus. Данные свойства делают стафилолитическую амидазу перспективным кандидатом для создания рекомбинантного ферментного антистафилококкового препарата как медицинского, так и ветеринарного назначения. Ее небольшая (для ферментов) молекулярная масса предполагает пониженную иммуногенность в ходе возможного парентерального применения.

Изобретение относится к штамму Staphylococcus hyicus, продуцирующему стафилолитическую амидазу, и стафилолитической амидазе, продуцируемой указанным штаммом. Предложен штамм Staphylococcus hyicus, продуцирующий стафилолитическую амидазу и депонированный в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-8870. Стафилолитическая амидаза, продуцируемая указанным штаммом, состоит из 123 аминокислотных остатков, имеет молекулярную массу 14000,75 Да, расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35, при этом температурный оптимум ферментативной реакции в пределах 40°C, а рН-оптимум фермента лежит в пределах 7,7. Указанная стафилолитическая амидаза является активной против микроорганизмов рода Staphylococcus, в том числе антибиотикоустойчивых, что позволяет расширить ряд стафилолитических ферментов. 2 н.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 2 пр.

1. Стафилолитическая амидаза, продуцируемая Staphylococcus hyicus В-8870, имеет аминокислотную последовательность:

EEIDKYPRVKSAQPNYHWKNNCTWCVHNKQTKRYLPSHFTHAKWLSEAKKAGFKTGKRPLAGAVLQTPKGGDGLGHVAFVERVNANGSIKJSEYNYNVRLGYGTRTLTKAQAATYNYIY, молекулярную массу 14000,75 Да, расчетное значение изоэлектрической точки pI=10.35, температурный оптимум ферментативной реакции в пределах 40°C, рН-оптимум фермента лежит в пределах 7,7.

2. Штамм Staphylococcus hyicus - продуцент стафилолитической амидазы по п. 1, депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ - Оболенск» под номером В-8870.