ПРОИЗВОДНЫЕ 1-(1-АДАМАНТИЛ)ЭТИЛАМИНА И ИХ ПРОТИВОВИРУСНАЯ АКТИВНОСТЬ Российский патент 2012 года по МПК C07D233/61 C07D339/04 C07C311/32 C07K5/65 C07K5/87 A61P31/16 A61K31/4172 A61K31/18 A61K31/381 A61K38/05 A61K38/06 

Изобретение относится к новым биологически активным производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина) и может найти применение в фармакологии и вирусологии.

Вирус гриппа на сегодня остается самым массовым инфекционным заболеванием, приносящим огромный экономический ущерб. Важнейшей проблемой современной медицинской вирусологии является преодоление резистентности вирусов к еще недавно эффективным химическим препаратам.

Антигенная структура вируса подвержена изменениям в результате селективного давления иммунной системы организма-хозяина и прессингом от применения химиопрепаратов. Эти два процесса приводят к появлению вариантов вирусов, способных избегать как нейтрализующие антитела, и тем преодолевать иммунную систему, так и преодолевать действие химиопрепаратов, исходно направленных на определенный этап репродукции вируса. Сложность проблемы в том, что каждый тип вируса имеет свой механизм приспособления к химическому препарату. Известно, что ингибировать репродукцию вируса гриппа можно на разных стадиях его жизненного цикла. В настоящее время используют лекарственные препараты, действия которых направлено на подавление репликации вируса гриппа. Это ингибиторы нейраминидазы - Озельтамивир (Тамифлю) и Занамивир (Реленза), они действуют на этапе выхода вновь синтезированных вирионов вируса гриппа из оболочки клетки, путем блокирования отщепления вирусных частиц от поверхности клеток. И селективные ингибиторы функций белка-канала М2 вирусов гриппа А - препараты адамантановоного ряда: Ремантадин и Амантадин, которые блокируют процесс закисления внутри эндосом [1].

Адамантановые препараты значительно дешевле и проще в производстве, что делает их более доступными для лечения и профилактики гриппа среди населения. Однако в настоящее время в результате широкого использования адамантановых препаратов (ремантадин и амантадин) значительно утрачены их противовирусные свойства в отношении вирусов гриппа А. Потерю активности в основном связывают с мутацией в трансмембранном домене белка М2 вируса гриппа. В настоящее время методами кристаллографии установлено, что четыре субъединицы этого белка образуют в мембране вируса канал, по которому осуществляется транспорт протонов через мембрану вирусной частицы. Ключевым элементом работы протонного канала служит аминокислота гистидин в 37-м положении (His37). Остатки гистидина из четырех белковых цепей объединяются в виде тетрамера и образуют кольцо. При высоком рН (в щелочной среде) это кольцо неподвижно, а при низком рН (в кислой среде) оно изменяет конфигурацию из-за того, что остатки гистидина сдвигают свою ориентацию на 45 градусов. Такая трансформация происходит со скоростью 50 тысяч раз в секунду. Это рабочее состояние «насоса» для проведения внутрь протонов. Поставщиками протонов из клетки хозяина служат ионы Н₃О⁺. Они подходят в канал М2 и соединяются водородными связями с имидозольным кольцом гистидина, а при изменении конфигурации аминокислотного остатка отсоединяются во внутреннее пространство вирусной частицы [2].

Протоны запускают процесс диссоциации вирусных белков и выход генетического материала вируса в цитоплазму клетки. Механизм противовирусного действия ремантадина и амантадина состоит в том, что адамантановый карбоцикл закрепляется в фосфолипидной мембране вируса, а единственная аминогруппа способна вступать во взаимодействие с аминокислотными остатками как внутри, так и снаружи протонпроводящего канала, тем самым нарушать нормальный ток протонов.

Исследования генома вирусов гриппа, резистентных к действию ремантадина, показали, что мутация коснулась лишь одной аминокислотной замены в трансмембранной области белка М2. Этого было достаточно, чтобы ремантадин и амантадин потеряли свою противовирусную активность. Потерю противовирусной активности адамантановых препаратов (ремантадин, амантадин) связывают с заменой в 31 положении остатка серина на аспарагин, реже на аспарагиновую кислоту. Такая мутация делает невозможным закрепление аминоадамантана в поре канала белка М2, так как не образуется водородная связь между аминогруппой карботрицикла адамантана и гидроксильной группой остатка серина [3]. Штаммы, резистентные к препарату ремантадин, сначала составляли менее 10% (1995-2002), затем резистентность быстро выросла до 58% в 2003, в 2004 году она уже была зафиксирована на отметке 74%, и в течение 2005-2006 г. составила 92% [4, 5].

В ряде случаев возникшую резистентность штаммов гриппа А можно преодолеть, привнося некоторые структурные изменения в окружение адамантановоного карбоцикла. В настоящее время ведутся разрабоки по крайней мере в двух направлениях по преодолению лекарственной устойчивости к адамантановым производным. Первый подход - это композиция ремантадина с другими лекарственными препаратами или субстанциями. Известны комплексы, способствующие пролонгации свойств ремантадина с альгинатом натрия [6] или с но-шпой [7], а также композиции, снижающие токсичность ремантадина, например комплекс с 3,6-диоксоциклогекса-1,4-диен-1,2,4,5-тетрасульфатом натрия [8].

Второй подход это - синтез нового противовирусного соединения на базе карбоцикла ремантадина. Известен патент РФ [9], в котором предложен комплексный лекарственный препарат, ингибирующий репродукцию вирусов гриппа А. Данное соединение ремантадина и полимерных матриц под названием «Полирем» обладает токсичностью в 5-10 раз ниже, чем у ремантадина [10].

Один из способов восстановления противовирусных свойств соединений аминоадамантанов - это обеспечение их дополнительными функционально активными группами, которые в процессе взаимодействия с трансмембранным доменом были бы способны нарушать процесс транспорта протонов через мембрану вируса. Источником таких функционально активных групп могут являться аминокислотные остатки, введенные в ремантадин методами пептидного синтеза.

Задачей предлагаемого изобретения является создание новых производных ремантадина в качестве соединений, высокоселективно подавляющих репродукцию вируса гриппа и эффективных против штаммов, резистентных к действию ремантадина.

Предлагаемые соединения относятся к новым адамантановым производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина) и имеют общую формулу:

где R - функциональная группа аминокислотного остатка (I-IV) или остаток липоевой кислоты (V):

I - дитретбутилоксикарбонил-орнитил-1-(1 -адамантил)этиламина,

II - третбутилоксикарбонил-саркозил-1-(1-адамантил)этиламина,

III - третбутилоксикарбонил-гистидил-1-(1-адамантил)этиламина

IV - 1-(1-адамантил)этиламид-2-аминоэтансульфоновой кислоты

V - 1-(1-адамантил)этиламид-α-липоевой кислоты

Для получения соединений I-V может быть использован следующий синтетический подход на примере соединения I:

Образование пептидной связи между карбоциклом, содержащим аминогруппу, и аминокислотами, защищенными по аминогруппе трет-бутилоксикарбонильной группой (Воc-) или с липоевой кислотой (3-(4-карбоксибутил)-1,2-дитиолан) в соединении V, проводили в одну стадию в условиях реакции смешанных ангидридов в эквимолярном соотношении. При необходимости третбутилоксикарбонильную группу удаляли действием этилацетата насыщенного 4 н НСl при температуре 20-24°С.

В работе использовались только L-аминокислоты, выпушенные фирмой Nova Biochem (США). Используемые для конденсации растворители готовили по стандартной методике. Анализ тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили на пластинах Silufol (Чехия) в системах: втор-бутанол - 3%аммиак (100:44) (А), метанол-хлороформ (13:60) (В), бутанол-уксусная кислота-вода-пиридин (30:3:12:10) (С), позволяющих констатировать полное отсутствие в испытуемых образцах следов ремантадина. Настоящее изобретение проиллюстрировано нижеследующими примерами.

Пример 1. Синтез Boc-Sar-Rem (третбутилоксикарбонил-саркозил-1-адамантаилэтиламина) (R=-СО-СН₂-NН(Вос)-СН₃) и его выделение.

К 1,5 г (0,0079 моль) третбутилоксикарбонил-саркозину (Boc-Sar-OH) в 15 мл СНСl₃ прибавляют 0,87 мл (0,0079 моль) N-метилморфолина (МММ). Охлаждают до -20-25°С и при перемешивании в реакционную массу добавляют 1,08 мл (0,0079 моль) изо-бутилхлорформиата (ИБХФ). Перемешивают от 10 до 15 мин. Затем добавляют, заранее приготовленный и охлажденный до - 20°С, второй компонент, хлоргидрат 1-(1-адамантаил)этиламина 1,71 г (0,0079 моль) в 15 мл СНСl₃ с 0,87 мл (0,0079 моль) NMM. Перемешивают - 30 мин, затем еще 1 час при 0°С и 2 часа при 24°С.

Реакционную массу упаривают от СНСl₃ в вакууме. Остаток растворяют в 35 мл этилацетата. Экстрагируют последовательно Н₂О (5 мл×1), 0,5 н NaHCO₃ (10 мл×2), 10% лимонной кислотой (4 мл×1) и Н₂О (5 мл×1). Органический слой сушат над безводным Na₂SO₄. Этилацетат удаляют в вакууме, получают белые кристаллы. Выход: 2,55 г (83%), R_f ^A=0,86; B_f ^B=0,68; R_f ^C=0,91, [α]^D ₂₀=-2,5°, Тпл. 116°С.

Аналогичным образом были получены соединения I, III, IV и V, физико-химические константы которых представлены в таблице 1 (Фиг.1).

Пример 2. Исследование противовирусной активности соединений формулы I-V в отношении вируса гриппа А.

В работе использовали вирусы гриппа, резистентные к действию ремантадина: пандемический штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)v [11], и эпидемический штамм вируса гриппа А/Москва/26/2009 (H3N2).

Изучение противовирусной активности ремантадина и новых соединений (производных ремантадина) проводили на 96-луночных панелях со сформировавшимся монослоем клеток культуры ткани MDCK. Одномоментно с инфицированием в монослой клеток вносили производные ремантадина: соединение I или II, или III, или IV, или V - в концентрации 5 мкг/мл и в качестве контроля на каждой панели вносили ремантадин в этой же концентрации. Панели инкубировали 24 часа при 37°С, останавливали реакцию фиксированием клеток 80% ацетоном на фосфатном буфере. Постановку метода клеточного иммуноферментного анализа (ИФА) проводили по методике, описанной ранее [12]. Процент ингибирования вирусной активности соединениями определяли как отношение:

где ОП - оптическая плотность при 492 нм, ОП_кл.к - ОП₄₉₂ клеточного контроля, ОП_вир.к - ОП₄₉₂ вирусного контроля.

Обнаружено, что синтезированные соединения (I-V) показали высокий процент ингибирования репродукции штаммов вируса гриппа А, устойчивых к действию ремантадина и амантадина. Данные представлены в таблице 2 (Фиг.2).

Пример 3. Определение цитотоксического действия соединений формулы I-V.

Токсичность соединений была изучена при внесении их концентраций (5, 20, 40 и 80 мкг/мл) на монослой клеток культуры ткани MDCK в 96-луночных панелях и инкубации при 37°С. Состояние клеточного монослоя проверяли под микроскопом. Концентрацию вещества, вызывающую дегенерацию 50% клеток по сравнению с контролем, принимают за среднетоксичную концентрацию (СТ₅₀). Наименьшую концентрацию вещества, вызывающую дегенерацию клеток, считают минимально токсичной концентрацией (МТК). Максимально переносимой концентрацией (МТК) считают половину концентрации соединения, которая не оказывает на клетки токсического действия. Оценку цитотоксичности проводили колориметрическим методом. После инкубации в течение 72 час при 37°С монослой отмывали раствором PBS (фосфатный буфер). Количество жизнеспособных клеток определяли сравнением интенсивности окрашивания раствора в контрольных и опытных лунках при добавлении нейтрального красного на автоматическом спектрофотометре при длине волны 450 нм. Концентрацию препарата, ингибирующую значение ОП₄₅₀ на 50% по сравнению с клеточным контролем, принимают за 50% цитотоксическую дозу (ЦД₅₀) Данные представлены в таблице 2 (Фиг.2). Отмечено, что токсический эффект действия на клетки соединений (I-V) не превосходил действие ремантадина. Более того, цитотоксическое действие соединений IV и V значительно меньше, чем у ремантадина.

Т.о., получены новые соединения формулы I-V на основе ремантадина, обладающие избирательной противогриппозной активностью с эффективностью, превышающей эффективность действия ремантадина гидрохлорида. Представленные соединения способны ингибировать репликацию вирусов гриппа А, в том числе и штаммов гриппа, устойчивых к действию препаратов ремантадина. Соединения формулой IV и V in vitro обладают значительно меньшей токсичностью по сравнению с ремантадином. Эти аминокислотные, аминосульфоновые и сульфгидридные производные ремантадина, описанные формулой I-V, способны эффективно проникать в мембранный фосфолипидный бислой оболочки вируса. Механизм противовирусного действия полученных соединений до конца не ясен. Основной предполагаемый механизм противовирусного действия, вероятно, сходен с действием ремантадина, адамантановый карбоцикл которого проникает в мембрану вирусной частицы, и будет исполнять роль носителя, к которому «прицеплена» функционально активная группа соответствующей аминокислоты. Полученные соединения могут быть применены для создания новых противовирусных лекарственных препаратов.

Литература

1. Balannik V., Wang J., Ohigashi Y., «Design and pharmacological characterization of inhibitors of amantadine-resistant mutants of the M2 ion channel of influenza A virus». Biochemistry v.48, p.11872-11882 (2009).

2. Hu F., Luo W., Hong M. «Mechanisms of Proton Conduction and Gating in Influenza M2 Proton Channels from Solid-State NMR». Science, v.330 no. 6003. p.505-508 (2010).

3. Balannik V., Camevale V., Fiorin G., «Functional studies and modeling of pore-lining residue mutants of the influenza a virus M2 ion channel». Biochemistry v.49, p.696-708(2010).

4. Laohpongspaisan C., Rungrotmongkol E., Intharathep P., «Why Amantadine Loses Its Function in Influenza M2 Mutants: MD Simulations» J. Chem. Inf. Model, v.49, p.847-852 (2009).

5. Бурцева E.И., Шевченко E.С., Ленева И.А. и др. «Чувствительность к ремантадину и арбидолу вирусов гриппа, вызвавших эпидемические подъемы заболеваемости в России в сезоне 2004-2005 г.» Вопр. вирусол. №2., с.24-29 (2007).

6. Киселев В.И., Киселев О.И., Юрьев М.З. «Препарат для лечения и профилактики вирусных заболеваний». Патент РФ №2185822 (RU).

7. Ашмарин И.Л., Жилинская И.Н., Киселев О.И. Осидак Л.В. «Средство для лечения гриппа». Патент РФ №2229877 (RU).

8. Еропкина Е.М., Киселев О.И., Еропкин М.Ю., Тверьянович И.А. «Средство, обладающее антигипоксической и цитопротектерной активностями, используемое для снижения токсичности ремантадина при лечении гриппозной инфекции». Патент РФ №2302236 (RU).

9. Киселев О.И., Чижов Н.П., Ильенко В.И. и др. «Противовирусный препарат ПОЛИРЕМ». Патент РФ №2071323 (RU).

10. Киселев О.И., Соминина А.А, Козелецкая К.Н. «Структура и антивирусная активность адамантансодержащих полимерных препаратов», Воп. вирусол., №5, с.19-26 (2003).

11. Львов Д.К.. Бурцева Е.И., Прилипов А.Г. и др. «Штамм вируса гриппа A/IIV-Moscow/01/2009 (H1N1)sw1 для разработки средств и методов биологической защиты». Патент РФ №2412244 (RU).

12. Ленева И.А., Федякина И.Т., Соколова М.В., Гуськова ТА. «Использование иммуноферментного анализа для изучения действия противовирусного препарата на репродукцию респираторно-синцитиального вируса, Вопр. вирусол. №2., с.42-45 (2002).

Изобретение относится к производным 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина)

общей формулы:

где R - функциональная группа аминокислотного остатка (I-IV) или остаток липоевой кислоты (V):

, которые обладают избирательной противовирусной активностью в отношении штаммов гриппа А, включая штаммы вируса, резистентные к действию ремантадина. Полученные соединения могут быть перспективны в качестве субстанций в составе лекарственных форм противовирусного назначения и применены для создания новых противовирусных лекарственных препаратов. Соединения, где R означает группы (I), (II), (III) и (V) являются новыми. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 3 пр.

1. Производные 1-(1-адамантил)этиламина (ремантадина) общей формулы:

где R - функциональная группа аминокислотного остатка (I-III)
или остаток липоевой кислоты (V):

2. Соединения по п.1 и соединение формулы по п.1, где R - означает группу аминокислотного остатка , обладающие избирательной противовирусной активностью в отношении штаммов гриппа А, включая штаммы вируса, резистентные к действию ремантадина.