ПРИМЕНЕНИЕ БАКТЕРИИ CLOSTRIDIUM PERFRINGENS ТИПА С ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА ВАКЦИНЫ Российский патент 2012 года по МПК A61K39/08 

Настоящее изобретение относится к применению бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины.

Клостридии представляют собой грамположительные спорообразующие анаэробные бактерии. Клостридии широко известны как патогены как домашних, так и диких животных. Обзор различных клостридий и заболеваний животных, которые они вызывают, представлен Songer, J.G. в The Clostridia; Chapter 10: Clostridial Diseases of Animals, Molecular biology and Pathogenesis, ed. Rood, J.I. et al., Academic Press Ltd (1997) ISBN 0-12-595020-9.

Из известных в настоящее время видов клостридий Clostridium perfringens иногда рассматривают как наиболее распространенный бактериальный патоген, и из всех видов клостридий он безусловно является наиболее важной причиной кишечного клостридиального заболевания у домашних животных. Вид Clostridium perfringens подразделен на пять типов; типы A-E, на основании главных токсинов, которые они производят.

Clostridium perfringens типов A и C и Clostridium difficile являются основными кишечными клостридиальными патогенами свиньи.

Клостридиальные кишечные инфекции у свиней более конкретно описаны Songer, J.G. и Uzal, F.A. (J. Vet. Diagn. Invest 17: 528-536 (2005)).

Clostridium perfringens типа C инфицирует свиней, рогатый скот, кур, людей, овец, собак и лошадей. Поросята наиболее уязвимы по отношению к инфекции Clostridium perfringens типа C. У 1-2 дневных поросят инфекция приводит к проценту заболеваемости в диапазоне 30-50% и проценту смертности в результате болезни 50-100%. Более взрослые поросята (1-2 недели) могут иметь более длительное развитие инфекции. Свиньи являются обычным источником инфекции.

Обычным подходом для защиты поросят является вакцинация свиней вакциной Clostridium perfringens типа C для индуцирования антител, которые передаются их потомству через молозиво. Это приводит к высокому уровню защиты у поросят во время, когда они наиболее уязвимы по отношению к клостридиальной инфекции. Такие вакцины основаны на токсоидах. Обычно они представляют собой детоксифицированные супернатантные вакцины, в которых не присутствуют клетки. Токсоидные вакцины описаны i.a. Springer, S. и Selbitz, H.-J. (FEMS Immun. and Medical Microbiol. 24: 333-336(1999)).

Clostridium perfringens типа A инфицирует ягнят, коз, телят, кур, свиней, лошадей, собак и людей. У зрелых свиней Clostridium perfringens типа A является компонентом нормальной флоры кишечника. В связи этим в настоящее время предполагается, что на зрелых свиньях присутствие Clostridium perfringens типа A в кишечнике отрицательно не сказывается.

Однако он может вызывать свиной некротический энтероколит у новорожденных и отлученных от матери свиней. Вакцины для защиты свиней от Clostridium perfringens типа A являются редкими. В настоящее время существует только одна (условно лицензированная) коммерчески доступная вакцина.

Одной из причин этому может быт тот факт, что, как отмечено выше, Clostridium perfringens типа A является компонентом нормальной флоры. В связи с этим можно было бы ожидать, что он не активирует иммунную систему. Как следствие, можно было бы ожидать, что продуцирование антител против Clostridium perfringens типа A не будет индуцировано. Если бы антитела были индуцированы, то Clostridium perfringens тип A не остался бы в кишечнике, не говоря о том, чтобы быть компонентом нормальной флоры. В качестве дальнейшего следствия, безусловно, можно было бы ожидать, что свиноматки не передадут какую-либо защиту потомству через молозиво. По любой причине, очевидно, что Clostridium perfringens типа A не индуцирует достаточную иммунную стимуляцию.

В настоящее время неожиданно было обнаружено, что вакцины Clostridium perfringens типа C, содержащие детоксифицированный супернатант культуры, в значительной степени способны к стимулированию перекрестного иммунитета против инфекции Clostridium perfringens типа A.

Более неожиданно было обнаружено, что вакцинация свиноматок супернатантом культуры Clostridium perfringens типа C приводит к значительной защите их поросят против инфекции Clostridium perfringens типа A.

Еще более неожиданно было обнаружено, что даже производительные функции свиноматок улучшаются после данной вакцинации. Это неожиданно, поскольку обычно предполагалось, как отмечено выше, что на зрелых свиней, таких как свиноматки, неблагоприятно не влияет инфекция Clostridium perfringens типа А. Это открытие впервые доказывает, что имеет место обратное.

В связи с этим первый вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты зрелых свиней против инфекции Clostridium perfringens типа A.

Второй вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты свиноматок против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Третий вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для свиноматок для защиты поросят против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Четвертый вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты поросят против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Как будет понятно специалисту в данной области, фактически применение бактерии Clostridium perfringens типа C для производства вакцины представляет собой процесс из двух стадий: бактерию Clostridium perfringens типа C используют для выращивания в питательной среде для получения супернатанта культуры, который является основой для производства вакцины в соответствии с изобретением.

В связи с этим другой вариант осуществления настоящего изобретения относится к применению супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты зрелых свиней против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Еще один вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты свиноматок против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Еще один вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для свиноматок для защиты поросят против инфекции Clostridium perfringens типа А.

Также один вариант выполнения настоящего изобретения относится к применению супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты поросят против инфекции Clostridium perfringens типа А.

В пределах типа токсина Clostridium perfringens типа C может быть осуществлено разделение между штаммами, которые продуцируют бета-2 токсин, и штаммами, которые не продуцируют его. Приблизительно 40% всех штаммов Clostridium perfringens типа C продуцируют данный токсин.

Было обнаружено, что бактерия Clostridium perfringens типа C, которая продуцирует бета-2 токсин, подходит даже больше, чем бактерия Clostridium perfringens типа C, не продуцирующая бета-2 токсин. Такие штаммы и их идентификация описаны, в частности, Fisher, D.J. и др. (Inf. и Immun. 74: 5200-5210 (2006)).

Таким образом, предпочтительная форма данного варианта осуществления относится к применению, в котором используют бактерию Clostridium perfringens типа C, которая продуцирует бета-2 токсин.

Вакцины, произведенные, как описано выше, ни в коем случае не являются единственными вакцинами, которые вводят свиньям в процессе коммерческого разведения свиней. Клостридиальные вакцины часто дают примерно в то же время, что и вакцины против других патогенных организмов и вирусов свиней.

Таким образом, в другом предпочтительном варианте осуществления вакцина, произведенная, как описано в настоящем изобретении, дополнительно содержит один или более антигенов, полученных из патогенных организмов или вирусов свиней, антитела против данных антигенов или генетическую информацию, кодирующую такие антигены.

Такие организмы или вирусы предпочтительно выбраны из группы вируса ложного бешенства, вируса PRRS, вируса свиного гриппа, свиного парвовируса, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae и Actinobacillus pleuropneumoniae.

В связи с этим более предпочтительная форма данного варианта осуществления относится к вакцине, произведенной, как описано в настоящем изобретении, которая дополнительно содержит один или более антигенов, полученных из патогенных организмов или вирусов свиней, где данные организмы или вирусы выбраны из группы вируса ложного бешенства, вируса PRRS, вируса свиного гриппа, свиного парвовируса, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae и Actinobacillus pleuropneumoniae.

После инфекции Clostridium perfringens поросята часто страдают от инфекции Escherichia coli. Escherichia coli является причиной другого тяжелого кишечного заболевания у поросят. В связи с этим поросят или супоросных свиноматок часто вакцинируют вакцинами Escherichia coli. Вакцины E. coli обычно используют в данной области, и они коммерчески доступны. В связи с этим комбинированная вакцина, содержащая как супернатант культуры Clostridium perfringens типа C, так и компоненты вакцины Escherichia coli, является очень желательной, поскольку она защищает от инфекции Clostridium perfringens типа C, Clostridium perfringens типа A и Escherichia coli.

В связи с этим наиболее предпочтительная форма данного варианта осуществления относится к вакцине, произведенной, как описано в настоящем изобретении, которая дополнительно содержит один или более антигенов, полученных из патогенного организма Escherichia coli свиньи.

Изобретение проиллюстрировано, без ограничений, в следующих примерах.

ПРИМЕРЫ

Получение антигена Clostridium perfringens типа C

Стандартный штамм Clostridium perfringens типа C, штамм 587 (также названный CWC 1/S, из коллекции Weybridge U.K.), культивировали в ферментере до начала стационарной фазы роста. Культуру центрифугировали и осадок, содержащий бактериальные клетки, отделяли. Формальдегид добавляли к супернатанту до конечной концентрации 0,5% об/об для инактивации токсинов, с последующей концентрацией средствами ультрафильтрации и 0,2 мкм фильтрации.

Приготовление вакцины

Вакцину готовили путем смешивания антигена Clostridium perfringens типа C и адъюванта на основе токоферола. Каждая доза вакцины (2 мл) содержала 20 мкл 17-кратно концентрированного супернатанта токсоида антигена культуры Clostridium perfringens типа C.

Вакцина соответствовала монографии европейской фармакопеи 0363 (вакцина Clostridium perfringens для ветеринарного применения) в отношении безопасности и силы вакцин типа C.

Дополнительно, в данном эксперименте были добавлены очищенные антигены E. coli (F4ab, F4ac, F5 и F6 фимбриальный и термолабильный токсин) для подавления возможной инфекции E. coli. Данные компоненты известны из уровня техники, и специалисту в данной области было бы известно, как приготовить вакцину на основе данных компонентов.

Альтернативно, несмотря на это, квалифицированный специалист мог бы использовать коммерчески доступную и готовую вакцину E. Coli, такую как Porcilis Porcoli DF (доступную через Intervet Int. B.V., Wim de Korverstraat 35, Boxmeer, Netherlands).

Контрольная вакцина содержит те же компоненты за исключением антигена Clostridium perfringens типа C, который не присутствовал в контрольной группе.

Защита свиноматок

Голландская свиноводческая ферма, на которой произошла клиническая вспышка Clostridium perfringens типа А, была выбрана для рандомизированного двойного слепого полевого исследования эффективности. Было обнаружено, что изолят Clostridium perfringens типа A с фермы продуцирует как α-токсин, так и β2-токсин.

Свиноматок вакцинировали в/м в период беременности приблизительно за 6 и 2 недели перед опоросом либо вакциной, содержащей только антигены E. coli (контрольная группа), либо вакциной, содержащей антигены E. coli и антиген Clostridium perfringens типа C (тестовая группа). На вакцины наносили цветовую маркировку (2x тестовая вакцина, 1x контрольная вакцина) для обеспечения слепого метода, и распределение свиней по группам было приблизительно 2:1 (таблица 1).

Таблица 1
Размеры групп Группа Количество свиноматок Количество живорожденных поросят на свиноматку Общее количество поросят Контроль 41 11,6 453 Тест 77 12,1 904

Со дня первой вакцинации до времени отлучения поросят от свиноматок (через 3-4 недели после опороса) за свиноматками наблюдали каждые 3 дня на общее состояние здоровья, потребление кормов и диарею. Для облегчения статистического анализа использовали клиническую систему баллов (таблица 2). За поросятами, рожденными вакцинированными свиньями, наблюдали ежедневно в течение первой недели жизни, один раз каждые три дня с одной недели до отлучения от свиноматок и еженедельно после этого до конца периода доращивания. Регистрировали общее состояние здоровья, потребление кормов, диарею и смертность (таблица 2).

Таблица 2
Система баллов, используемая для свиноматок и поросят Клинический балл Поведение Аппетит Консистенция фекалий Состав фекалий 0 Нормальное Нормальный Нормальная Нормальная 1 Депрессивное Небольшая утрата аппетита Мягкая Присутствует слизь 2 Летаргическое Выраженная утрата аппетита Жидкая Присутствует слизь с кровью 3 Умирающее Не сосет Водянистая Присутствует кровь с кишечными выбросами

Результаты

Таблица 3
Клинические наблюдения за свиноматками Балл (N) 0 1 2 3 Среднее Общее поведение Контроль 687 99 51 20 0,30 Тест 1623 33 0 0 0,02 Аппетит Контроль 597 139 71 49 0,50 Тест 1598 47 9 0 0,04 Консистенция фекалий Контроль 385 250 153 68 0,89 Тест 1564 67 17 7 0,07 Состав фекалий Контроль 780 71 4 0 0,09 Тест 1647 8 0 0 0,01

В таблице 3 показан эффект вакцинации вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C в сравнении с вакцинацией вакциной без антигенов Clostridium perfringens типа C.

Как однозначно следует из таблицы 3, вакцинация вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C, привела к значительному улучшению состояния здоровья свиноматок.

Защита потомства вакцинированных свиноматок

Также смертность в помете свиноматок, которых вакцинировали вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C, сравнивали с таковой в помете свиноматок, которых вакцинировали вакциной без антигенов Clostridium perfringens типа C.

Как однозначно следует из таблицы 4, смертность в помете свиноматок, которых вакцинировали вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C, была значительно ниже, чем в контрольной группе.

Кроме того, в таблице 5 показано, что поросята от свиноматок, которых вакцинировали вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C, имели значительно более низкие клинические баллы, чем контрольная группа.

Таблица 4
Еженедельная смертность в контрольном и тестовом помете Возраст (дни) Контроль Тест 0-6 29 22 7-13 3 3 14-21 7 2 21-27 6 1 28-34 2 1 35-41 0 0 42-48 1 1 49-55 1 1 56-62 1 0 63-70 0 0 Всего (%) 50 (11,04) 31 (3,43)

Таблица 5
Клинические наблюдения за поросятами Балл (N) 0 1 2 3 Среднее Общее поведение Контроль 336 232 137 73 0,93 Тест 1159 271 55 11 0,28 Аппетит Контроль 426 166 128 58 0,77 Тест 1336 125 31 4 0,13 Консистенция фекалий Контроль 544 118 71 40 0,49 Тест 1419 48 17 12 0,08 Состав фекалий Контроль 636 104 31 6 0,24 Тест 1414 70 10 1 0,06

Заключение: данные демонстрируют, что вакцинация свиноматок вакциной, содержащей антигены Clostridium perfringens типа C, приводит к значительному улучшению состояния здоровья как вакцинированных свиноматок, так и их потомства под угрозой вспышки Clostridium perfringens типа А.

Группа изобретений относится к области ветеринарии и биотехнологии. Применяют супернатант культуры Clostridium perfringens типа С для производства вакцины для защиты зрелых свиней и поросят от инфекции Clostridium perfringens типа А. Использование изобретений приводит к значительной защите поросят против инфекции, вызываемой Clostridium perfringens типа А, и улучшению состояния здоровья свиноматок. 5 табл.

1. Применение супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты зрелых свиней от инфекции Clostridium perfringens типа A.

2. Применение супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты свиноматок от инфекции Clostridium perfringens типа A.

3. Применение супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для свиноматок для защиты поросят от инфекции Clostridium perfringens типа A.

4. Применение супернатанта культуры Clostridium perfringens типа C для производства вакцины для защиты поросят от инфекции Clostridium perfringens типа A.

5. Применение по пп.1-4, отличающееся тем, что используют бактерию Clostridium perfringens типа C, которая продуцирует бета-2 токсин.

6. Применение по пп.1-4, отличающееся тем, что для производства указанной вакцины дополнительно используют один или более антигенов, полученных из патогенов или вирусов свиньи, антитела против данных антигенов или генетическую информацию, кодирующую такие антигены.

7. Применение по п.6, отличающееся тем, что указанный патоген или вирус выбран из группы вируса ложного бешенства, вируса PRRS, вируса свиного гриппа, свиного парвовируса, вируса инфекционного гастроэнтерита, ротавируса, Escherichia coli, Erysipelothrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella typhimurium, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Mycoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae и Actinobacillus pleuropneumoniae.

8. Применение по п.6, отличающееся тем, что указанный патоген свиньи представляет собой Escherichia coli.