СПОСОБ ОБНАРУЖЕНИЯ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ЛОВУШЕК В МУКОЗАЛЬНЫХ СЕКРЕТАХ Российский патент 2012 года по МПК C12N15/10 C12Q1/06 

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и предназначено для обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек экспресс-методом с количественной оценкой данного явления.

Известен способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек с использованием метода сканирующей электронной микроскопии [3]. Авторы использовали его для визуализации образовавшихся структур. Однако данный способ обнаружения нейтрофильных ловушек требует наличия специального оборудования (электронного микроскопа), набор реактивов для приготовления препарата и очень аккуратного выполнения исследования, так как образующиеся структуры очень хрупкие и быстро разрушаются при механическом воздействии [3].

Для определения нейтрофильных ловушек, которые являются по своей сути волокнами ДНК, можно использовать метод выявления нуклеиновых кислот по способу Фельгена [2]. Данная реакция требует фиксации клеток на стекле по методу Лилли в 10% забуференном формалине, для приготовления реактивов используются агрессивные среды (соляная кислота, фуксинсернистая кислота, сернистая вода), готовые реагенты нуждаются в специальных условиях хранения. Кроме того, реакция проходит в 2 этапа, которые занимают около 2-2,5 часов. При соблюдении всех условий ядерное вещество окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Учет реакции проводят с помощью иммерсионной микроскопии при увеличении ×1000. Однако даже при соблюдении всех требований выполнения данной реакции учет представляет определенные сложности: при световой микроскопии не всегда удается рассмотреть тонкие, внеклеточно расположенные волокна ДНК активированных нейтрофилов, а бактерии-активаторы не определяются.

Предлагаемый способ не требует специальной подготовки препарата, сокращает сроки проведения исследования, позволяет более четко визуализировать хроматин и представителей флоры, определить жизнеспособность клеток.

Целью заявляемого способа является оптимизация выявления нейтрофильных ловушек и оценка эффективности улавливания ими микробных агентов в биологических жидкостях.

Сущность предлагаемого способа заключается в использовании двух красителей: Sytox Green для окрашивания внеклеточных волокон ДНК и ядер погибших клеток; синька Эванса для фонового окрашивания нативного препарата.

Предлагаемый способ диагностики соответствует критерию «новизна», так как в отличие от имеющихся способов обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек обладает следующими существенными отличительными признаками:

- исследуемый материал не фиксируется;

- для окраски используется сложный реактив (Sytox Green + синька Эванса);

- учет проводят с помощью люминесцентной микроскопии, позволяющей четко различать окрашиваемые структуры (погибшие клетки и нейтрофильные внеклеточные ловушки окрашиваются в ярко-зеленый цвет, жизнеспособные клетки и слизь окрашиваются в ярко-оранжевый цвет);

- позволяет количественно охарактеризовать данное явление.

Благодаря наличию указанных отличительных признаков в данном способе, а также использованию их в совокупности и в определенной последовательности действий, можно сделать вывод о соответствии заявляемого способа изобретательскому уровню.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

1) Слизистый секрет в количестве 0,1 мл вносят в 0,9 мл физиологического раствора.

2) 0,1 мл полученной суспензии смешивают с 0,1 мл сложного красителя, который готовят ex temporo в отдельной пробирке: 1 мл синьки Эванса в концентрации 1:8000 смешивают с 1 мл красителя Sytox Green в концентрации 1:500, инкубируют в течение 5 минут в темноте.

3) Из окрашенного материала готовят препарат «раздавленная капля».

4) Учет проводят с помощью люминесцентного микроскопа, используя фильтры, обеспечивающие возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм. Погибшие клетки и нейтрофильные внеклеточные ловушки окрашиваются в ярко-зеленый цвет, жизнеспособные клетки и слизь окрашиваются в ярко-оранжевый цвет.

При этом можно провести количественную оценку жизнеспособности нейтрофилов, так как при таком способе происходит дифференцированное окрашивание клеток: 1 группа объединяет жизнеспособные клетки ярко-оранжевого цвета, 2 группа включает апоптозные клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой, 3 группа объединяет погибшие клетки зеленого цвета, и к 4 группе относят свободнолежащие ярко-зеленые волокна, представляющие собой нити ДНК нейтрофила (нейтрофильные внеклеточные ловушки). Данные характеристики являются важными, так как позволяют оценить морфологические особенности нейтрофила. И, что не менее важно, отличить нити ДНК, от слизи, абсолютно разные компоненты мукозального секрета, характеризующие различные механизмы защиты. Проводят подсчет 100 структур разных групп и определяют процентное содержание каждой морфологической единицы. При предлагаемом способе окраски можно оценить показатели попадания микроорганизмов (нельзя заменить на бактерии, так как в это понятие входят еще и грибы) в нейтрофильные внеклеточные ловушки. Для этого рассчитывают следующие показатели:

- число нейтрофильных внеклеточных ловушек, содержащих бактериальные клетки, из 100 подсчитанных сетеподобных структур;

- число бактерий в 100 подсчитанных ловушках в пересчете на 1 структуру.

Предлагаемым способом окрашено и изучено 20 нативных препаратов назальной, цервикальной и вагинальной слизи (таблица 1 и 2).

Полученные результаты были подвергнуты статистической

обработке с использованием пакетов статистических программ БИОСТАТ и Statistica for Windows 6.0. [1].

Приводим примеры использования предлагаемого способа обнаружения нейтрофильных ловушек.

Пример 1

Окраске подвергалась назальная слизь женщины В., 33 года, страдающей острым бактериальным ринитом. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные нити ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в слизи - 82%, погибших нейтрофилов - 16%, апоптозных нейтрофилов - 0% и жизнеспособных 2%) и оценить среднее количество микроорганизмов, попавших в одну нейтрофильную внеклеточную ловушку - 6,3.

Пример 2

Окраске подвергалась вагинальная слизь женщины Е., 26 лет, с диагнозом «Бактериальный вагиноз». В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные нити ДНК и бактерии разных морфологических форм (кокки и палочки), что позволило провести количественную оценку образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в слизи - 2%, погибших нейтрофилов - 67%, апоптозных нейтрофилов - 23% и жизнеспособных 8%) и оценить среднее количество микроорганизмов, попавших в одну нейтрофильную внеклеточную ловушку - 0,5.

Пример 3

Окраске подвергалась цервикальная слизь здоровой женщины Ж., 26 лет. В мазках хорошо визуализировались ярко-зеленые и ярко-оранжевые ядерные структуры нейтрофилов, внеклеточно расположенные нити ДНК, что позволило провести количественную оценку образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек в слизи - 3%, погибших нейтрофилов - 51%, апоптозных нейтрофилов - 16% и жизнеспособных 30%).

Таким образом, применение предлагаемого способа позволяет оптимизировать выявление нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах и количественно охарактеризовать данное явление.

Литература

1. Гланц С.Медико-биологическая статистика. / С.Гланц. - М.: Практика, 1999. - 450 с.

2. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. / Г.А.Меркулов. - МЕДГИЗ. Ленинградское отделение, 1956. - 263 с.

3. Brinkmann V. Neutrophil extracelllulartraps kill bacteria. / V.Brinkmann, U.Rechard, C.Goosmann et al. // Science. - 2004. - Vol.303. - P.1532-1535.

Таблица 1 Оценка жизнеспособности нейтрофилов секретов слизистых оболочек, % Показатели Секрет слизистых оболочек Назальная слизь (n=8) Вагинальный секрет (n=6) Цервикальная слизь (n=6) Жизнеспособные нейтрофилы, % 19,12±10,72 17,00±8,46 26,33±4,32 Апоптозные нейтрофилы, % 3,50±3,20 18,50±5,24 11,50±3,80 Погибшие нейтрофилы, % 15,75±3,15 56,83±7,11 54,17±4,88 Содержание нейтрофильных внеклеточных ловушек, % 60,37±10,69 7,66±3,50 8,00±2,82

Таблица 2 Показатели внеклеточного захвата микроорганизмов нейтрофильными ловушками Показатели Секрет слизистых оболочек Назальная слизь (n=8) Вагинальный секрет (n=6) Цервикальная слизь (n=6) Число нейтрофильных ловушек, содержащих микробные клетки 43,28±3,20 5,23±0,11 6,14±0,16 Среднее количество микроорганизмов, попавших в одну нейтрофильную внеклеточную ловушку, у.е. 4,3±1,04 2,51±2,80 2,16±2,20

Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах предусматривает окрашивание 0,1 мл нативного препарата 0,1 мл равнокомпонентной смесью синьки Эванса в концентрации 1:8000 и красителя Sytox Green в концентрации 1:500, инкубацию в течение 5 минут в темноте. С помощью люминесцентной микроскопии с использованием фильтров, обеспечивающих возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм, обнаруживают нейтрофильные внеклеточные ловушки, живые бактериальные клетки, апоптозные бактериальные клетки, мертвые бактериальные клетки зеленого цвета. Оценивают число нейтрофильных внеклеточных ловушек (%), содержащих бактерии в 100 подсчитанных ловушках. Способ позволяет визуализировать хроматин, определить жизнеспособность клеток и ускорить проведение исследования. 2 табл., 3 пр.

Способ обнаружения нейтрофильных внеклеточных ловушек в мукозальных секретах, включающий окраску 0,1 мл нативного препарата 0,1 мл равнокомпонентной смесью синьки Эванса в концентрации 1:8000 и красителя Sytox Green в концентрации 1:500, инкубацию в течение 5 мин в темноте, при этом с помощью люминесцентной микроскопии с использованием фильтров, обеспечивающих возбуждающий свет с длиной волны не более 490 нм и эмиссию с длиной волны 520 нм, обнаруживают нейтрофильные внеклеточные ловушки, представляющие собой свободнолежащие ярко-зеленые волокна, образующие сеть, живые бактериальные клетки ярко-оранжевого цвета, апоптозные бактериальные клетки с зеленым ядром и ярко-оранжевой цитоплазмой, мертвые бактериальные клетки зеленого цвета и оценивают число нейтрофильных внеклеточных ловушек (%), содержащих бактерии в 100 подсчитанных ловушках.