СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ АНТИГЕНОВ Burkholderia pseudomallei in vitro Российский патент 2012 года по МПК G01N33/48 C12Q1/00 C12N5/07 

Изобретение относится к области микробиологии и иммунологии и касается применения клеточной модели для оценки цитотоксичности антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro, позволяющей получить объективные данные о токсических свойствах ряда антигенов Burkholderia pseudomallei с помощью реакции цитотоксичности, выполняемой на перевиваемых монослойных клеточных линиях мышиных фибробластов L929 или клеток яичника китайского хомячка СНО-К1.

Известны различные способы оценки токсичности. Традиционные методы определения потенциально токсических химических и биологических веществ на биомоделях трудоемки, длительны и дорогостоящи. Альтернативой им являются методы оценки токсических свойств различных соединений на модели перевиваемых клеточных культур. Объем информации о преимуществах этих методов как наиболее технологичных, объективных, точных и удовлетворяющих требования биоэтики растет с каждым годом. Одно из важных преимуществ моделей in vitro заключается в возможности работы с коллекционными перевиваемыми линиями клеток с известными свойствами. Их применяют для изучения токсинов холерного микроба (Сальникова О.И. Тестирование и изучение токсинов холерного вибриона в культуре монослойных клеток. Дисс.канд. биол. наук, Ростов-на-Дону, 1994 г.), дифтерийного токсина (Дмитриева М.Н., Грубер И.М., Гаврилова Н.А., Титова Н.Г., Яковлева И.В., Свиридов В.В. Оценка количества дифтерийного токсина и его активности разными тестами в динамике культивирования Corynebacterium diphtheria PWB // Журн. микробиол., 1999, №2. С.32-35).

Наиболее близким аналогом является «Способ оценки токсичности бактериальных антигенов» (патент №2281507, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 августа 2006 г.), предложенный для оценки токсичности антигенов возбудителя мелиоидоза на модели одноклеточных организмов: на инфузорях Paramecium caudatum. Основными ограничениями широкого использования данного способа в условиях конкретной лаборатории являются трудности стандартизации самих мишеней (инфузорий), а также условий выполнения всех этапов экспериментов. Преимущества клеточных линий связаны прежде всего с тем, что они паспортизированы и не теряют своих свойств при криоконсервировании в течение любых по длительности сроков хранения.

Цель изобретения - выбор клеточной модели для определения токсических свойств антигенов возбудителя мелиоидоза in vitro и разработка оптимизированных условий постановки теста микроцитотоксичности, предназначенного для выявления in vitro токсичных компонентов в биологически активных комплексах, изолированных из микробных клеток возбудителя мелиоидоза.

Предлагаемый способ включает себя следующие этапы:

1) подготовительный - размораживание клеточных линий и их адаптацию к условиям выполнения экспериментов,

2) постановка микроварианта теста цитотоксичности испытуемых образцов антигенов,

3) ежедневный учет результатов воздействия антигенов на клетки-мишени в течение 3 сут после формирования монослоя.

Поставленная цель достигается тем, что используют две коллекционные перевиваемые линии клеток с известными свойствами в качестве индикаторных культур, которые до начала основных экспериментов выводят из криоконсервированного состояния, помещая ампулы с клетками мышиных фибробластов L929 и клеток яичника китайского хомячка СНО-К1 в водяную баню с температурой 37°С на 2-3 мин, затем их отмывают в среде 199, центрифугируют, ресуспендируют в полной среде выращивания, высевают в лунки 6-луночных культуральных пластин для адаптации к условиям культивирования и восстановления пролиферативной активности, пластины помещают в СО₂-инкубатор с концентрацией СО₂ 5-7% и температурой 37°С для наращивания клеточной массы с обязательными пересевами клеток каждые 3-4 дня, сменой среды выращивания в эти же дни и контролем темпов формирования монослоя клеток каждой линии, их морфологии и функционального состояния по показателю адгезивности к пластику, параллельно готовят стерильные образцы исследуемых антигенов возбудителя мелиоидоза, изолированных из различных структурных элементов бактериальной клетки, охарактеризованных по химическому составу, после чего осуществляют постановку микроварианта теста, для которого используют 48-луночные пластины, в лунки которых вносят свежую трипсинизированную культуру клеток двух линий по 6×10⁴ клеток в лунку в объеме 0,25 мл, через сутки культивирования в СО₂-инкубаторе регистрируют формирование монослоя клеток, плотно прилегающих друг к другу, с характерной морфологией. Затем в опытные лунки вносят стерильные образцы тестируемых антигенов, по 20 мкл, оставляя на каждой пластине по 2 лунки с интактной культурой (контроль).

Пластину инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С и насыщении атмосферы 5-7% СО₂ в течение 3 сут, ежедневно просматривают лунки культуральных пластин, оценивая наличие или отсутствие изменений морфологии и функционального состояния клеток-мишеней по сравнению с контролем. Учету подлежат время контакта биологически активного вещества с клетками, концентрации вносимых веществ в лунку, морфологические изменения и адгезивные свойства клеток.

В случаях токсического воздействия исследуемых антигенов на монослой клеток индикаторных культур изменяется их форма (удлиненные, округлые, увеличенные в объеме, полигональные), появляются внутриклеточные включения, разрушенные клетки и их тени, детрит в межклеточных пространствах, участки свободной поверхности пластика, площадь которых при нарастании числа погибших клеток увеличивается. Массовая гибель клеток является признаком острого цитотоксического воздействия антигенов на клетки.

При выполнении микроварианта теста цитотоксичности исследуемых биополимеров получают объективные данные о характере морфологических изменений и функционального состояния клеток-мишеней вследствие контакта с тем или иным антигеном.

Пример 1. Подготовка клеточных линий L929 и СНО-К1 к выполнению микроварианта теста определения цитотоксичности различных антигенов

Подготовительный этап выполняют с целью выведения перевиваемых клеточных линий L929 и СНО-К1 из криоконсервированного состояния и их адаптации к конкретным условиям культивирования, используемым при выполнения основных опытов.

Работу проводят на двух монослойных клеточных линиях млекопитающих: L929 (мышиных фибробластах) и СНО-К1 (клетках яичника китайского хомячка), получаемых из Российской коллекции клеточных культур позвоночных института цитологии РАН (г.Санкт-Петербург). Эти коллекционные культуры клеток вне периода постановки опытов сохраняют в пластиковых ампулах с защитной средой, помещенных в биохранилище для криоконсервирования в жидком азоте при -196°С.

Для культивирования линий СНО-К1 и L929 в качестве основной среды используют полусинтетическую питательную среду F12, на этапах отмывания клеток - среду 199, для снятия монослоя клеток с поверхности пластика применяют коммерческие растворы трипсина и версена (все среды коммерческие, производитель - ФГУП «Предприятие по производству бактерийных и вирусных препаратов» института полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова. РАМН).

Для этапа криоконсервирования культур готовят среду для замораживания клеточных линий (основная среда F12 плюс 20% эмбриональной телячьей сыворотки и 7% ДМСО), для культивирования клеточных линий - полную среду (основная среда F12 плюс 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ глютамина, 4 мМ пирувата натрия, пенициллина 100 ЕД/мл, стрептомицина 100 мкг/мл).

Перед началом проверки антигенов на цитотоксичность ампулы с клетками достают из биохранилища и размораживают при температуре 37°С, выдерживая ампулу на водяной бане в течение 2-3 мин. С помощью теста прижизненной окраски клеток трипановым голубым определяют относительные показатели (%) их жизнеспособности. Суспензию клеток переносят в пробирку со средой 199 для проведения процедуры отмывания от примесей защитной среды. Пробирку центрифугируют при 800 об/мин в течение 15 мин, супернатант удаляют, осадок ресуспендируют в полний среде выращивания, рН 7,1-7,2.

Клетки высевают в лунки 6-л пластин или малые чашки Петри, по 6·10⁴ на 1 см. Культивирование проводят в СО₂-инкубаторе при температуре 37°С и концентрации СО₂ 5-7%, с периодичностью пересевов каждые 2-3 сут в течение 2 недель.

Для выполнения пересевов необходимо снять монослой клеток с поверхности пластика. Для этого используют рабочие растворы трипсина с версеном: для овариальных клеток китайского хомячка соотношение объемов трипсин : версен составляет 1:1, для линии мышиных фибробластов L929-1:3 (в соответствии с паспортными данными используемых линий клеток). С поверхности монослоя клеток удаляют среду выращивания и наносят первую порцию смеси трипсин : версен в объеме 3-5 мл. Контакт клеток с раствором длится не более 3-5 мин при легком покачивании пластин, после чего жидкость удаляют и вносят на поверхность клеток вторую порцию смеси трипсин : версен (по 2 мл/лунку). Клетки начинают постепенно округляться и через 3-5 мин полностью открепляются от поверхности пластика. Открепившиеся от поверхности пластика клетки собирают и отмывают от присутствия трипсин:версена при центрифугировании. Осадок суспендируют в полной среде и высевают в лунки 6-л пластин или в малые чашки Петри.

Через 2 недели клетки полностью адаптируются к выбранным условиям, восстанавливают пролиферативную активность и активно размножаются, что позволяет провести масштабирование популяций в количествах, необходимых для выполнения тестов по определению цитотоксичности различных антигенов.

В процессе тиражирования клеточной популяции ежедневно визуально с помощью инвертированного микроскопа оценивают их морфологию и функциональное состояние в части способности прикрепляться к поверхности пластика и формировать монослой. Формирование монослоя завершается через сутки. Типичная морфология интактных клеток в монослойной культуре представлена на рисунке 1.

Клетки мышиных фибробластов, линия L929. Веретенообразные удлиненные клетки, плотно прилегающие друг к другу, с четко очерченной клеточной стенкой; незначительное количество округлых неприкрепившихся к пластику клеток над монослоем.

Клетки яичника китайского хомячка СНО-К1. Овально-веретенообразные клетки, с более тонкой очерченностью клеточной стенки.

Пример 2. Подготовка образцов антигенов для проверки в тесте цитотоксичности

В работе использовали комплексные антигены B.pseudomallei:

1) растворимые антигены В. pseudomallei;

2) антигены, изолированные из капсулы В. pseudomallei, относящиеся к группе факторов вирулентности возбудителя мелиоидоза (гликопротеин, Аг 8, и фракции кислого экзополисахарида);

3) антигены клеточной стенки В. pseudomallei (липополисахарид, О-полисахарид, липид А, кор-Аг и антиген «6+d»).

Все исследуемые образцы антигенов проверяют потенциометрически для определения рН растворов; данный показатель не должен отклоняться от значений 7,0±0,1. Обязательным условием является также повторная стерилизация подготовленных к работе образцов с помощью мембранных фильтров с величиной пор 0,22 мкм.

Пример 3. Множественный скрининг антигенов возбудителя мелиоидоза в микроварианте теста цитотоксичности

При всех постановках опытов используют две линии клеток, выращенных в полной среде, и культуральные пластины одной и той же серии, подобранные на этапе подготовки к основным опытам, что сводит к минимуму ошибки при тестировании влияния биополимеров на клетки-мишени, обеспечивает почти идентичные результаты в лунках дублирующих пластин.

При регистрации результатов учитывают факторы времени контакта биологически активного вещества с клетками и концентрации вносимых веществ в среде выращивания клеток-мишеней.

Для постановки опыта используют свежую трипсинизированную культуру клеток двух линий. В лунки 48-луночных пластин для культивирования клеток (ф. Costar, США) вносят по 6×10⁴ клеток в лунку в объеме 0,25 мл. Через сутки проводят визуальный контроль образования монослоя. Затем в опытные лунки, с постоянной концентрацией клеток, вносят стерильные образцы тестируемых антигенов, по 20 мкл (день начала эксперимента - 0 день). Две лунки на каждой пластине с интактной культурой являются контролями.

Пластину инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С и насыщении атмосферы 5-7% СО₂ в течение 3 сут. Ежедневно просматривают лунки культуральных пластин, оценивая морфологию и функциональное состояние клеток-мишеней. Просмотр пластины всегда начинают с контроля.

При проведении множественного скрининга антигенов возбудителя мелиоидоза в микроварианте теста цитотоксичности регистрируют качественные показатели наличия/отсутствия изменения морфологии клеток и утраты адгезивных свойств. Антигены с выраженной токсичностью вызывают множественные изменения в монослое в отличие от контроля: нарушение типичной структуры клеток, появление зон лизиса в монослое, появление теней клеток, внутриклеточных включений, детрита в межклеточном пространстве, у части клеток появляется утрата связи с поверхностью пластика, нарастающая в течение срока наблюдения (3 сут). Для острого цитотоксического воздействия характерна массовая гибель клеток-мишеней, которую можно зарегистрировать через сутки после внесения антигена. При минимальном цитопатогенном потенциале антигенной фракции изменения, происходящие в монослое, незначительны и касаются прежде всего формы клеток.

Предлагаемый вариант тестирования удобен для одномоментной проверки большого числа различных антигенных фракций при их минимальном расходе.

Результаты острого токсического воздействия фракций экзополисахарида В. pseudomallei (антигены №4 и №5) на клетки-мишени представлены на рисунках 2-5.

Предлагаемый способ определения цитотоксичности антигенов in vitro имеет ряд преимуществ, универсален, воспроизводим, относительно прост в исполнении, пригоден для проведения множественного скрининга антигенов В. pseudomallei. Получаемые данные значимы в тех случаях, когда работу проводят с образцами экспериментальных химических вакцин, а также антигенным материалом, используемым для иммунизации животных на этапах получения высокоактивных сывороток для производственных целей.

Он может найти применение в качестве дополнительного метода оценки:

1) экспериментальных химических комплексных вакцин,

2) корректного выбора антигенного материала для воспроизведения различных схем иммунизации животных-продуцентов гипериммунных сывороток,

3) динамики накопления токсичных метаболитов в жидких питательных средах выращивания штаммов В. pseudomallei с различной вирулентностью для биомоделей,

4) при отборе штаммов-продуцентов токсичных биополимеров В. pseudomallei.

Результаты теста микроцитотоксичности в случаях выявления токсичных для клеток компонентов в составе сложных антигенных смесей могут служить основанием для введения дополнительного этапа очистки в технологическую схему подготовки антигенного материала для иммунизации животных: проведения предварительного истощения этого материала с целью удаления выявленного токсичного компонента из смеси антигенов.

Способ предусматривает использование клеточной модели для оценки токсичности антигенов В. pseudomallei - возбудителя мелиоидоза in vitro. Реакцию цитотоксичности выполняют на перевиваемых монослойных клеточных линиях мышиных фибробластов L929 или клеток яичника китайского хомячка СНО-К1. До начала экспериментов клетки выводят из криоконсервированного состояния, параллельно готовят исследуемые антигены, изолированные из различных структурных компонентов бактериальной клетки возбудителя мелиоидоза, с рН 7,0±0,1, стерилизуют их через мембранные фильтры и вносят по 20 мкл в лунки подготовленных к основным опытам в 48-луночных культуральных пластинах со сформированным монослоем клеток-мишеней, оставляя на каждой пластине по 2 лунки с интактной культурой (контроль). Пластину инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С и насыщении атмосферы 5-7% СО₂ в течение 3 суток. Лунки культуральных пластин ежедневно просматривают, оценивая наличие или отсутствие изменений морфологии и функционального состояния клеток-мишеней по сравнению с контролем. Учету подлежат время контакта биологически активного вещества с клетками, концентрации вносимых в лунку веществ, морфологические и адгезивные свойства клеток. В случае изменения морфологических и/или адгезивных свойств клеток, в том числе и гибель клеток, определяют наличие цитотоксического воздействия исследуемых антигенов на клетки, при этом гибель 50% и более клеток свидетельствует о проявлении острой цитотоксичности антигенов. Способ по изобретению универсален, воспроизводим, пригоден для проведения множественного скрининга антигенов В. pseudomallei, при работе с образцами экспериментальных химических вакцин, антигенным материалом, используемым для иммунизации животных на этапах получения высокоактивных сывороток. 1 з.п. ф-лы, 5 ил., 3 пр.

1. Способ определения цитотоксичности антигенов Burkholderia pseudomallei in vitro, отличающийся тем, что определение цитотоксичности проводят на двух клеточных линиях индикаторных культур мышиных фибробластов L929 и клеток яичника китайского хомячка СНО-К1, предварительно выведенных из криоконсервированного состояния путем помещения ампул с клетками в водяную баню с температурой 37°С на 2-3 мин, последующего отмывания клеток в среде 199, центрифугирования, ресуспендирования в полной среде выращивания и высева в лунки 6-л культуральных пластин, помещаемых на две недели в СО₂-инкубатор с концентрацией СО₂ 5-7% и температурой 37°С для адаптации клеток к условиям культивирования и восстановления пролиферативной активности, с обязательными пересевами клеток каждые 3-4 дня, контролем формирования монослоя клеток каждой линии в течение суток, их морфологии и функционального состояния по показателю адгезивности к пластику, параллельно с процессом размораживания и наращивания популяций клеток готовят стерильные образцы исследуемых антигенов возбудителя мелиоидоза, изолированных из различных структурных компонентов бактериальной клетки, охарактеризованных по химическому составу, далее осуществляют постановку микроварианта теста цитотоксичности, для которого используют 48-л пластины, в лунки которых вносят свежую трипсинизированную культуру клеток двух линий по 6·10⁴ клеток в лунку в объеме 0,25 мл, через сутки культивирования в СО₂-инкубаторе регистрируют формирование монослоя клеток с характерной морфологией, плотно прилегающих друг к другу, затем в опытные лунки на сформированный монослой вносят по 20 мкл стерильных образцов исследуемых антигенов, изолированных из бактериальных клеток, пластины помещают в СО₂-инкубатор на 3 суток, ежедневно просматривают опытные и контрольные лунки, регистрируют изменения морфологии - появление удлиненных, округлых, увеличенных в объеме, полигональных, разрушенных клеток, внутриклеточных включений, детрита в межклеточных пространствах и участков свободной поверхности пластика и функционального состояния клеток - утрата адгезивных свойств по сравнению с контролем и оценивают гибель 50% клеток и более как проявление острой цитотоксичности, в случае более низких показателей гибели - как свидетельство различной степени цитотоксичности проверяемых антигенов.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исследуемые образцы антигенов Burkholderia pseudomallei проверяют потенциометрически для определения рН растворов и приведения данного показателя к 7,0±0,1, затем растворы антигенов стерилизуют с помощью мембранных фильтров с величиной пор 0,22 мкм.