СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ НАРУШЕНИЙ ЭНЕРГООБРАЗОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/50 G01N33/573 

Изобретение относится к медицине, а именно к способу диагностики нарушений образования энергии в митохондриях.

Обеспечение организма энергией осуществляется митохондриями клеток. Митохондрии - это клеточные органеллы, «энергетические «станции», принимающие участие в процессах энергообразования, в них происходит β-окисление свободных жирных кислот с освобождением активной формы уксусной кислоты (ацетил-КоА), ферментативное декарбоксилирование пировиноградной кислоты в ацетил-КоА, цикл трикарбоновых кислот, окислительное фосфорилирование. Основной функцией митохондрий является окислительное фосфорилирование, заключающееся в эстерификации неорганического фосфора с образованием макроэргов - это аденозинтрифосфат (АТФ, АДФ, АМФ) и креатинфосфат.

Митохондрии локализованы в местах наибольших энергозапросов и синтезируются дополнительно при увеличении энергопотребления органами и тканями (В.Н.Лузиков, 1980).

В качестве основных энергетических субстратов выступают углеводы (глюкоза), длинноцепочечные жирные кислоты (ДЦ-ЖК), молочная кислота (лактат), а также три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая, аланиновая.

В физиологических условиях в качестве основного энергетического субстрата для клеток является глюкоза. Глюкоза из крови транспортируется в цитоплазму клеток инсулинзависимых органов (печень, мышцы, подкожно-жировая клетчатка) через плазматическую мембрану (сарколемму) пассивно (без затрат АТФ) по градиенту концентрации с помощью белков - переносчиков - «глюкозных транспортеров». В цитоплазме клеток глюкоза подвергается последовательным ферментативным гликолитическим реакциям, в результате которых образуется пировиноградная кислота (пируват).

Под окислением глюкозы следует понимать сумму двух процессов - гликолитического превращения глюкозы в пируват и последующего окисления пирувата в митохондриях.

В условиях достаточного поступления О₂ образовавшийся пируват поступает из цитоплазмы в митохондрий и ферментативно декарбоксилируется, превращаясь в ацетил-КоА, который в дальнейшем включается в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса).

Лактат (анион молочной кислоты) в физиологических условиях поступает в клетки из плазмы крови и с помощью фермента лактатдегидрогеназы (ЛДГ) превращается в пируват, из которого в митохондриях образуется ацетил-КоА.

В условиях же недостаточного поступления O₂ происходит превращение пирувата в лактат, который не утилизируется, а секретируется в кровь. Увеличение концентрации лактата в крови является первым признаком наступления гликолиза в клетках.

Свободные жирные кислоты (НЭЖК) используются в качестве второго субстрата для образования АТФ в митохондриях. Метаболические превращения свободных жирных кислот связаны с процессами β-окисления в митохондриях. Процесс происходит в четыре этапа, каждый из которых катализирует специфический фермент. В результате одного цикла β-окисления жирной кислоты из ацил-КоА (активная форма) образуются ацетил-КоА (активная форма уксусной кислоты) и новая ацил-КоА. Ацетил-КоА вступает в цикл трикарбоновых кислот (цикл Кребса) и конкурирует с ацетил-КоА, образующимся при окислении пирувата.

Усиление β-окисления жирных кислот тормозит окисление пирувата в митохондриях и вклад глюкозы в образование АТФ значительно снижается.

В качестве третьего вида энергетического субстрата для синтеза АТФ в определенных ситуациях используются три аминокислоты: глутаминовая, аспарагиновая и аланиновая. Вышеуказанные аминокислоты в результате процессов трансаминирования превращаются в соответствующие α-кислоты, являющиеся компонентами цикла Кребса. В митохондриях они окисляются в цикле трикарбоновых кислот и превращаются в АТФ.

Таким образом, глюкоза, свободные жирные кислоты, окисляющиеся до активной формы уксусной кислоты (ацетил-КоА), выступающей в качестве основного субстрата цикла Кребса, и аминокислоты, превращаясь в соответствующие α-кислоты, компоненты цикла Кребса, являются источником энергии.

Следует отметить, что окислительное фосфорилирование - процесс более лабильный и сильно подвержен изменениям под действием различных факторов.

Об интенсивности окислительного фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов судили по убыли неорганического фосфата, содержание которого определяли разработанным В.Г.Григорян и соавт. (1985 г.) методом ультрафиолетовой спектрофотометрии фосфатно-молибдатного комплекса, имеющего максимум светопоглощения при 320 ммк. Для этого использовали гомогенат ткани печени, инкубационную смесь осаждали 10-кратным объемом 5% ТХУ и центрифугировали. Из надосадочной жидкости отбирали по 0,5 мл и переносили в пробирки, содержащие 25 мл 0,1% раствора молибдата аммония на децинормальной серной кислоте, перемешивали и спектрофотометрировали в 1 см кюветах при 320 мкм против пробы, содержащей 0,5 мл 5% ТХУ и 25 мл раствора молибдата аммония.

Количество адениловых нуклеотидов (АТФ) определяли после их электрофоретического разделения на бумаге и элюирования децинормальной соляной кислотой, спектрофотометрией в ультрафиолетовых лучах (Воскобойников Г.В., 1966).

Указанный способ диагностики нарушений окислительного фосфорилирования (процесса энергообразования) в митохондриях печени, как имеющий наибольшее количество общих признаков с заявляемым способом, принят за прототип.

Однако способ является громоздким, так как для его выполнения необходимо использовать биопсийный материал (ткань печени) и сегодня в лабораторной диагностике использоваться не может.

Целью изобретения является повышение точности диагностики нарушений процессов энергообразования в митохондриях.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу диагностики нарушений процесса энергообразования у здоровых подростков, проживающих в районе с повышенным содержанием железа и марганца в воде и почве, определяли в сыворотке крови активность ферментов, участвующих в процессах энергообразования с использованием углеводов, свободных жирных кислот, аминокислот.

О нарушении функции митохондрий печени у здоровых детей, проживающих в условиях повышенного содержания железа и марганца в окружающей среде, судили на основании повышения активности фермента ACT при сохранении нормальной активности ферментов АЛТ, КФК, ЛДГ.

Таблица 1 Показатели активности ферментов, участвующих в процессах энергообразования, в сыворотке крови у подростков Фамилия Возраст ЛДГ Е/л АЛТ Е/л ACT Е/л ГГТ Е/л КФК Е/л Референтные величины 48-240 7-40 1,2-15,2 8-30 32-157 девочки Абрамова Ю. 11 194,4 22,5 47,11 16,4 101,9 Аккуратнова М. 14 148,8 15,4 35,7 16,7 135,9 Круглова М. 15 160,3 15,7 38 16,7 196,4 Костина К. 15 145,5 9,6 28,9 15,4 99,5 Писчизина O. 14 143,8 14,7 58,8 15,6 75,2 Зотова O. 14 146,1 9,8 23,9 15 92 Шеварева Д. 14 147,5 8,6 16,5 13,2 87,8 Бахтеева М. 15 154,6 11,1 31,6 14,5 140,8 Киприянова 12 159,3 13,6 31,3 15,8 99,8 Князькина O. 12 180,7 14,8 32,9 17 119,9 Кузнецова А. 13 143,8 8,1 24,5 17,8 110,3 Бочалдина К. 14 144,4 9,8 39,3 12,8 16,5 Новикова И. 12 187,4 11,4 34,5 13,7 84,7 Кубынина Т. 13 194 14,3 40,5 20,3 136 Алмагаева А. 13 174,6 11,8 35,4 18 92,3 Симагина М. 14 91,9 13 23,3 13,5 86,4 Останюкк М. 14 109,8 15,1 41,4 16 77,5 Сорокина Н. 15 131,1 15,1 33 15,4 94,4 Зорина А. 14 115,8 12,8 32,1 15 86,9 Ермошкина Ю. 14 129 9,1 38,6 17,8 98,9 Саакян Ю. 14 124,2 12,7 38,5 17 107,7 Бахтеева Н. 13 136,9 15,6 28 18,7 103,7 Русяева В. 12 167,7 13 56,3 14,1 85,8 Горбунова М. 12 198,5 11,5 34,8 15,5 272,6 Мошнина М. 13 172,5 17,6 29,5 16,6 115,9 Сенюкова Е. 13 169,8 17,6 35,9 17,5 79 Уткина М. 13 141,4 13,1 26,2 13,7 91,1

Шанина Д. 13 127,2 9,8 29,8 16,7 84,4 Прошева А. 12 186,3 8,7 23,2 16,7 122,4 Семенова А. 15 148,2 12,4 29,4 26,8 119 (мальчики) Вдовиченко И. 14 165 14 33,3 19,6 184 Гашевский Ю. 15 149,8 10,7 45,6 16,8 216 Небылицын И. 15 232,6 8,9 43,4 19,8 374,6 Мальцев С. 15 133,6 13,8 32,5 13,7 431,7 Глушков А. 15 138 19,9 49,2 21,1 168,7 Колясов С. 14 146,2 20,1 31,1 23,7 89,3 Нечепуренко С. 12 206,2 8,4 31,9 15,8 125,2 Фарахов Н. 12 131,9 12 29,3 24,9 110,8 Юдин С. 13 153,7 13,4 39,8 17,8 132,3 Рвянин С. 13 153,9 15,1 34,1 29,8 106,4 Дуднев Д. 12 241,1 15,2 43,6 17,7 276,2 Петров Б. 13 218,9 12,1 42,1 16,5 334,7 Ибрагимов И. 12 202,9 8,5 29,4 18,8 131,3 Кривов А. 13 176,9 17,5 73,5 16,4 365,3 Юдин М. 13 225,5 20,9 44,7 15,8 146,6 Ибряев Н. 14 132,6 11 38,6 14,7 84,8 Козлин А. 13 114,1 11,7 44 15,1 109,6 Полстяное А. 14 156,7 13,9 43,3 13,8 162,1 Шаталов Е. 14 124,4 13,1 43,4 17,4 102,9 Голенев В. 14 132,6 9,8 32,1 15,8 197,5 Юдин М. 14 162,6 12,4 41 19,9 417,4 Юранов М. 13 176,4 13,2 33,3 22 121,4 Акимов Е. 14 196,7 13,4 31,5 19,4 160,1 Клонов В. 14 204,2 12,2 32,5 16,2 216,7 Киселев Д. 13 246,5 19,4 54,7 16,9 107,7 Семенов Е. 12 104,1 9,5 24 13,3 89,1 Крагушев А. 13 167,1 16,9 40,2 15,7 107,4 Сладкое М. 14 151,1 14,4 29,2 16,8 81,6 Лыжин Р. 12 147,6 13,2 38,3 16,3 176 Заплаткин А. 13 129,3 10,5 36,3 16,7 106,4 Крыжановский А. 12 171 10,3 28,3 17,1 96,7

Способ осуществляется следующим образом. Из локтевой вены утром, натощак, спустя 12-14 ч после последнего приема пищи берут 3 мл крови и центрифугирования при 2000 об/мин в течение 30 мин получают сыворотку.

Затем в сыворотке определяется оксалацетат, образованный при переаминировании L-аспартата и α-кетоглутаровой кислоты в щелочной среде, который превращается в пируват, дающий с 2,4-динитрофенилгидразином гидразон пирувата, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 540 нм и путем калибровочного графика или фактора пересчета рассчитывается активность фермента ACT. При превышении активности фермента выше референтных величин диагносцируется нарушение энергопродуцирующей функции митохондрий печени за счет преобладания процессов переаминирования аспарагиновой кислоты.

В настоящее время все клинико-диагностические лаборатории оснащены биохимическими анализаторами и наборами реактивов. Данный метод оценки активности ферментов ACT может выполняться в любой лаборатории для своевременной оценки дисфункции митохондрий у здорового населения и предотвращения нарушения адаптационных механизмов.

Дисфункция митохондрий в гепатоцитах развивается в результате постоянного длительного поступления в организм подростков малых доз Fe, принимающего участие в ингибировании окислительного фосфорилирования при изменении соотношения в клетке Fe⁺²/Fe⁺³. Механизмы подавления окислительного фосфорилирования и снижения уровня АТФ, скорее всего, связаны с реакцией Фентона и образованием гидроксильного радикала, что может быть обусловлено наличием карбоновых кислот, образующихся в результате переаминирования в митохондриях.

Присутствие в клетке активированных производных кислорода приводит к генерации высокотоксичного для мембраны гидроксильного радикала, что в соответствии с классической реакцией Хабера-Вейса выглядит следующим образом:

Согласно Мид Дж (1979) и У.Прайор (1979) для ее реализации необходимо наличие в системе какого-нибудь металла, выполняющего функцию катализатора

У подростков были изучены ферменты (ЛДГ, ACT, АЛТ, КФК), участвующие в процессах энергообразования (таблица 1). Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) - гликолитический фермент, обратимо катализирующий окисление L-лактата в пировиноградную кислоту, аланинаминотрансфераза (АЛТ) в цитоплазме и аспартатаминотрансфераза (ACT) преимущественно (81% от общего количества ACT) в митохондриях участвуют в процессах трансаминирования соотвествующих аминокислот, креатинфосфокиназа катализирует процесс образования креатинфосфата.

Фермент ACT представлен двумя изоинзимами - митохондриальной и растворимой, содержащейся как в митохондриях, так и в цитоплазме. В печени на долю митохондриальной формы ACT приходится 81% от общей активности фермента (ц-АСТ - растворимая в цитоплазме, м-АСТ - митохондриальная).

По результатам наших исследований активность фермента ACT была повышена у 100% подростков при сохранении активности АЛТ, ЛДГ и КФК, что позволило говорить о нарушение структурно-функциональной целостности митохондрий и нарушениях процессов энергообразования (С.А.Лобанов, В.В.Данилов, Е.В.Данилов, и др., 2007). Полученные данные свидетельствуют о высокой эффективности предлагаемого способа, который позволяет выявить нарушения энергообразования на уровне митохондрий, дисфункцию митохондрий.

Независимо от специфики патологии выделяют фазные состояния системы энергопродукции, соответствующие фазам тревоги, резистентности и истощения общего адаптационного синдрома. Для каждой фазы установлены особенности метаболизма митохондрий (В.А.Хазанов, 1984-2007). В стадию тревоги возрастает интенсивность окисления всех доступных митохондриям субстратов при сохранении высокой сопряженности окислительного фосфорилирования.

Пролонгация нагрузки вызывает формирование состояния резистентности, которое обеспечивается процессами кратковременной и долговременной адаптации. Первая характеризуется напряжением путей поставки субстратов и удаления продуктов реакций, участвующих в наработке макроэргов, вторая - синтезом новых ферментов и митохондрий.

Стадия истощения адаптивной реакции системы энергопродукции характеризуется снижением скорости окисления субстратов, разобщением окислительного фосфорилирования.

Клинические проявления данного состояния многолики. Сюда можно отнести все случаи хронизации патологии, развитие терминальных состояний (если "перегрузка" затронула жизненно важные органы и системы), локальные деструктивные изменения с последующим фиброзом, формирование "старческого" типа метаболизма (В.П.Скулачев, 1999).

Источники информации

1. Г.В.Воскобойников. Количественное определение свободных тканевых рибонуклеотидов методом высоковольтного электрофореза. - Биохимия, 1966, вып.5. С.1041-1045.

2. В.Г.Григорян, B.C.Кирошка, Т.И.Шинкарева, Г.Г.Цымбаларь. Биоэнергетические и пластические процессы при легочной патологии. - Кишинев. - 1985. 97 с.

3. В.А.Хазанов. Фармакологическая регуляция энергетического обмена // Экспериментальная и клиническая фармакология - 2009, №4, стр.61-64.

4. B.C.Камышников. Справочник по клинико-биохимическим исследованиям и лабораторной диагностике. М., «МЕДпресс-информ». - 2009. - 889 с.

5. С.А.Лобанов, В.В.Данилов, Е.В.Данилов, С.К.Асаева, Г.Ф.Арсланова. Морфофункциональные изменения митохондрий при стрессе.// Бюлл. эксп. биологии и медицины. - 2007. - 12. - С.699-702.

6. В.А.Хазанов. Гипоксия: механизм адаптации, коррекция. - М., 1997, 125 с.

Изобретение относится к области медицины и касается способа диагностики нарушений образования энергии в митохондриях у подростков. Сущность способа заключается в том, что в сыворотке крови здоровых детей ферментов аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ). При повышении активности фермента ACT и сохранении нормальной активности ферментов АЛТ, КФК, ЛДГ диагностируют нарушение энергопродуцирующей функции митохондрий гепатоцитов у подростков. Использование способа позволяет с высокой точностью диагностировать нарушение энергообразования в митохондриях у подростков. 1 табл.

Способ диагностики нарушений образования энергии в митохондриях гепатоцитов у подростков, включающий определение в сыворотке крови ферментов аспартатаминотрансферазы (ACT), аланинаминотрансферазы (АЛТ), креатинфосфокиназы (КФК), лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и при повышении активности фермента ACT при сохранении нормальной активности ферментов АЛТ, КФК, ЛДГ диагностируют нарушение энергопродуцирующей функции митохондрий гепатоцитов у подростков.