Способ определения недостаточности печени Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 

t

Изобретение относится к медицине, а именно клинической биохимии, и может быть использовано в клинической и экспериментальной хирургии, трансплантологии.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет состояния интактных энергизованных митохондрий.

Цель достигается путем измерения величины выхода ионов в суспензию митохондрий, индуцированного дробными добавками СаС1 по 25 мкМ до сосл,

тояния насьш1ения им, и спонтанного выброса из митохондрий с помощью поочередного внесения в инкубационную смесь с заранее добавленным сукцина- том АДФ и глутамата. Далее определяется их отношение, отражающее степень роста накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината после фосфорилирования АДФ относительно 10 ° уровня после влияния на окисление сукцината углутаматом.

После добавления АДФ и синтеза АТФ в присутствии сукцината слособность

4

сл

СП

со

О

сл

15

20

31А55305

митохондрий к накоплению кальция увеличивается, Глутанат действует на способность митохондрий к накоплению кальция, изменяя интенсивность окисления сукцината(избирательно регулирует активность специфического фермента окисления сукцината). Это действие глутамата проявляется при патологии и отсутствует в норме,

Изменения способности митохондрий к накоплению кальция под действием АДФ и глутамата наиболее четко отражаются их отношением. При уменьшении значения этого отношения ниже 1,21 диагностируется недостаточность пе- че ни, ,

Способ осуществляется следующим образом,.

Крыс линии Вистар после подсадки им сердца от крыс линии Август в гетеротопическую позицию через 2- 12 сут забивают под эфирным наркозом. Крыс линии Август после введем ния им взвеси димфоцитов крови (10 клеток в объеме 0,1 мл) от крые линии Вистар с заранее подсаженным им сердцем от крыс линии Август забивают через 3-7 сут под эфирным наркозом и быстро извлекают печень, из которой выделяют митохондрии общепринятым ме

тодом

у больных ,во время полостных операций по поводу резекции язвы 12- перстной кишки или рака желудка, биоп- сируют ткань печени. Из биоптата вы- 35 деляют митохондрии общепринятым ме- тодом.

Инкубацию м 1тохондрий и регистрацию величины закисления суспензии митохондрий при выходе Н ионов под действием СаС, (добавляя дробно по 25 мкМ до состояния полного насыщения и последующего обратного выхода его) производят, в двух .пробах; 1. проба S в инкубационную смесь последова- 45 тельно вводят сукцинат 9 мМ, глута- мат 2 мМ, митохондрии, а затем сч;: CaCl ,2 проба; последовательно вводят сукцинат 9 мМ, АДФ 200 мкМ, выжидают, пока из АДФ синтезируется 50 АТФ, а затем вносят СаС.

Измеряют величину выхода Н ионов в суспензию митохондрий в каждой из указанных смесей, т.е. после очередного добавления АДФ, который 55 синтезируе тся в АТФ, и глутамата, и определяют отношение этих величин. Оно отражает степень роста накопленного в митохондриях кальция в при

сутствии сукцината (С) после фосфо- рилирования- АДФ относительно его уровня после воздействия на окисление сукцината глутаматом (Гл)

С+АЦФ

С+Гл

Время с момента выделения митохондрий, в течение которого вьдается результат анализа, составляет в среднем 20-25 мин. Для расчета указанного отношения нет необходимости измерять содержание митохондриального белка. При значениях 1,21 и ниже диагностируется недостаточность печени.

Пример 1, Крыса забита на 5-е сутки. Изъята печень, вьщелены митохондрии и измерен выход H ионов под воздействием CaClj в присутствии С+АДФ и С+Гл и С:

Ь Н С+АДФ С+Гл

С+Гл

0,5 ед;

1,45 ед (прототип).

Диагностирована недостаточность печени,

П р и м е р 2. Крыса забита на 2-е сутки. Изъята печень, вьщелены митохондрии и измерен выход Н ионо под воздействием CaCl в присутстви С+АДФ, С+Гл и С: С+АДФ 1,195 ед:

С+Гл

U Н С + Гл

- гпТ7 1,03 ед (прототип)

Н J С Диагностирована недостаточность

печени.

П р и м е р 3. Крыса забита на 2-е сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионо под воздействием CaCl2 в присутстви С+АДФ, С+Гл и С:

С+АДФ

1,48 ед;

С+Гл

С+Гл

0,85 ед (прототип).

litH lc

514

Диагноз не установлен ни по предлагаемому способу, ни по прототипу. Он также не установлен по параметрам дыхания митохондрий (полярографический анализ).

П р и м е р 4, Крыса забита на 3-е сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием CaClj в присутствии С+АДФ, С+Гл и С:

С+АДФ

0,53 ед;

С+Гл

U, С+Гл

0,81 ед (прототип),

ЬМ С

Диагностирована недостаточность печени.

-П р и м е р 5, Крыса забита на 5сутки. Изъята печень, вьщелены митохондрии и измерен выход Н ионов под

0,79 ед:

воздействием CaCl в присутствии С+АДФ, С+Гл и С: Л и С+АДФ

н С+Глб п С+Гл

- 0,86 ед (прототип).

йМ С

Диагностирована недостаточность печени.

П р и м е р 6. Крыса забита на 3сутки. Изъята печень, выделены митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием СаС в присутствии С+АДФ, С+Гл и С:

С+Гл

1,379 ед.

Диагностирована недостаточность печени.

Примере, Больная Д., 41 год При клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз язвенной деформации луковицы 12-перстней кишки. Проведена биопсия печени. Вьщеле ны митохондрии и измерен выход Н ионов под воздействием CaCl.

С+АДФ

0,85 ед;

С+Гл

н С+гл

2,937 ед.

Диагностирована недостаточность

печени.

П р и м е р 9. Больная.Д., 70 лет. При клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз: рак желудка. Проведена биопсия печени. Выделены митохондрии,из биоптата и измерен выход Н ионов под воздействием CaClj, :

С+АЛФ

с+гл с+ гл

0,646 ед;

1,976 ед.

Изобретение относится к медицине, касается клинической биохимии и может быть использовано в клинической и экспериментальной хирургии, трансплантологии. Цель изобретения - повьшение точности способа путем учета состояния интактных энергизованных митохондрий. Задача решается за счет объективизации оценки обмена ее митохондрий, выделенных из биопсированной ткани печени больных людей и животных. Для этого измеряют величины выхода Н ионов в суспензию митохондрий (индуцированного дробными добавками СаС по 25 мкК до полного насыщения ими спонтанного выброса из митохондрий) с помощью поочередного внесения в инкубационную смесь с заранее добавленным сукцинатом АДФ и глутамата и последующим определением отношения уровня накопленного в митохондриях кальция в присутствии сукцината после фосфорилирования АДФ к его уровню после влияния на окисление сукЦината глутаматом. При уменьшении значения этого отношения ниже 1,21 ед диагностируется недостаточность печени. Способ повышает точность диагностики недостаточности печени до 90,9%, обеспечивает срочность вьщачи результатов, не требует дополнительных технических средств анализа. 2 табл. сл

1,21 ед;

0,83 ед (прототип)

Диагностирована недостаточность печени,

П р и м е р 7, Больной А,, 61 год при клиническом и специальном обследовании поставлен диагноз рубцово- язвенной деформации луковицы 12- перстной кишки.Проведена биопсия печени. Вьщелены митохондрии из биоптата и измерен выход Н ионов под воздействием

U н С+АДФ

С+Гл

1,0 ед;

Диагностирована недостаточность печени.

Предлагаемым способом обследовано 57 крыс. Результаты анализа приведены в табл.1 и 2,

Точность диагноза недостаточности печени у обследованных животных по предлагаемому способу при пересадке сердца и пересадке лимфоцитов составляла соответственно 90,4 и 91,7%, в то время как точность диагноза по известному способу - 66,6 и 58,3%.

Предлагаемый способ позволяет диагностировать недостаточность печени у всех обследованных больных.

55

-Форм, ула изобретения

Способ определения недостаточности печени, включающий определение реакции митохондрий печени путем инкубаи регистрации выхода ионов водорода из митохондрий после добавления хлоно добавляют АДФ, а во вторую - глу- тамат, регистрируют величины выход ристого кальция, отличающий- ионов водорода в первой и второй с я тем, что, с целью повышения средах, рассчитывают отношение первой точности способа за счет учета состо- величины к второй и при его значении яния интактных энергизованных мито- И,21 и ниже определяют недостаточхондрий, используют две среды инкуность печени.

Таблица 1

9145530510

, IПродолжение табл.

Результаты анализа обмена митохондрий печени по способу

прототипупредлагаемому

Контроль Пересадка Контроль Пересадка

сердца I лимфоцитовсердца I лимфоцитов

1,33 1,,99 2,05

2,135 2,31 2,70

Отличие от контроля,

I

Таблица2

Вид экспе- Коли- ; Количество животныхТочность диагримента честно с правильно установ-ноза, % по

живрт- ленным, диагнозом поспособу

ныхспособу

1прото- ;предлапрототипу предлага-типу гаемому емому

Контроль 242124

Пересадка

сердца21141966,690,4

Пересадка

лимфоцитов 1211158,391,7