Способ исследования функций митохондрий Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

оо оо

О5 QD

Изобретение относится к биохимии и биофизике, а именно к биологическо энергетике, и может быть использован I при изучении in vitro механизма деис ВИЯ фармакологических и других биологически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий.

Цель изобретения - упрощение способа при одновременном сохранении физиологического состояния митохондрий .

Способ осуществляется следующим образом..

Получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, .печени), инкубируют в среде, содержащей 0,1-0,15 М хлорид натрия и 0,005-0,015 М однозамещенный фосфат калия, с рН 7,5 и измеряют характеристики окислительного фосфорилиро- вания.

Пример 1. Из печени крысы получают препарат митохондрий, инкубируют в среде, содержащей 0,15 М NaCl и 0,01 М KHiP04, и определяют |Характеристики окислительного фосфо- рилирования. Одновременно проводят инкубацию в среде по известному способу, содержащей 0,1 М сахарозу, 0, 05 М КС1, 1,5 мМ трис-буфер и 0,01 М KHjPO.

I

Данные окислительного фосфорштирования в средах инкубации митохондрий разного состава приведены в табл.1.

Пример 2. Исследуют окислительное фосфорилирование митохондрий в присутствии продигиозана (ПРГ) - фармакологического препарата, известного как индуктора интерферона. Сведений об энергетических изменениях под влиянием зтого препарата нет. Продигиозан в пределах 5-25 мкг/мл активирует фосфорилирующее дыхание, значительно ускоряет фосфорилировани и увеличивает коэффициент эффективности окислительного фосфорилиро- вания.

Данные влияния продигиозана на окислительное фосфорилирование мито

хондрий печени крыс представлены в табл. 2.

Из табл. 2 видно, что продигиозан в пределах указанных концентраций (5-50 мкг/мл) повьпцает энергетическую эффективность митохондрий.

Результаты исследования влияния ионов Са на эффект продигиозана на митохондрии приведены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что 50 мкмоль мкг/мл продигиозана несколько снижают величину ДК и коэффициента АДФ/0 на фоне активации дыхания в безакцепторной системе и в койтроли- руемом состоянии, что свидетельствует о развивающемся разобщении окислительного фосфорилирования.

Данные изменения влияния продигиозана на окислительное фосфорилирование митохондрий с увеличением концентрации Са представлены в табл.4.

Увеличение концентрации Са до ТОО мкмоль вызывает зависимое от дозы продигиозана нарастание фосфорили- рующего дыхания, скорости фосфорилирования, величины ДК и коэффициента АДФ/0.

Предлагаемый способ при упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании.

Формула изобретения

Способ исследования функций митохондрий путем выделения митохондрий из биологического объекта, инкубации изолированных митохондрий в среде, содержащей однозамещенный фосфат калия и соль соляной кислоты при рН 7,5, с последующим определением характеристик окислительного фосфорилирования, отличающий- с я тем, что, с целью упрощения способа при одновременном сохранении физиологического .состояния митохондрий, используют среду, содержащую 0,1-0,15 М хлорид натрия и 0,005- 0,015 М однозамещенный фосфат калия.

31386900

Таблица 1

Продолжение табл.1

Изобретение относится к биохимии, биофизике, точнее к биоэнергетике, предназначено для изучения in vitro механизма действия фармакологических и других биологически активных веществ на окислительное фосфорилирование и другие функции митохондрий. Цель изобретения - упрощение способа при одновременном сохранении физиологического состояния митохондрий. Для этого получают препарат митохондрий из биологического объекта (например, печени), инкубируют в среде с 0,1-0,15 М NaCl и 0,005-0,015 М однозамещенным фосфатом калия при рН 7,5. Измеряют характеристики окислительного фосфорили- рования. Предлагаемый способ при его упрощении, обеспечиваемом уменьшением числа компонентов в среде инкубации, обеспечивает сохранение и даже улучшение функциональных свойств митохондрий при их исследовании. 4 табл. (Л

до добавки АДФ 15,610,7 17,2±1,4 состояние III 56,8±1,6 59,,7 состояние IV 16,8±0,9 20,812,3

+ДНФ

79,,7 83,,8

Ф

15,6tO,7 16,7±0,7 16,810,9 18,010,8

,05

16,810,9 19,Oil,4 18,8±0,6 18,510,9

89,014,2 99,115,8 119,3t6,5 106,Bi5,9

,01 ,05 3,5210,14 3,1910,2 3,3410,13 3,1510,14

1,6910,07 1,9910,11 2,04-1:0,09 1,7610,03

Примечание, р- сравнительно с контролем, т.е.

с интактными митохондриями без продигиозана в среде инкубации.

Примечай не. V - скорость фосфорилирования;АДФ - аденозин- трифосфат; ДНФ - 2,4-диннтрофенол; ДК - дыхательный коэффициент.

1 I7,0t0,a58,0t1,8

С 509 (5,710,457,2tl,8

С«харо н«я ер«да 7 17,2tl,459,,7

ПРГ 510 16,7tO,755,1t2,1

ПРГ 5 С« 50 6 18,311,462,,6

ПРГ 2525 16,,965,,2

,01

ПРГ 25 С«« 50 7 22,,1762,7t3,2

Р 0,05

ПРГ 5014 I8,0t0,860,612,7

р 0,05 ПРГ 50 Св «6 19,511,2

р 0,01

23,411,4 75,512,5 р «О,05

р 0,01

1l6,4t9,6 2,,13 ,,064 р 0,01 р f0,05

18,310,9 78,415,9 106,815,9 3,1510,14 1,,03

59,,623,,7 77,5+3,0 100,,0 2,54±0,12 1,72+0,04

Р 0,01

Примеч1Инс. р- сравнительно с нитахтиыми митохондриями (беэ продмгиоявна и Свэ ионоэ Са ).

Таблица 4

16,5±1,2 17,510,9 16,0±0,6 20,0±1,7

43,111,9 48,411,4 54,1±3,0 58,2±3,9

р ,05 р ,05 р 0,05

10,,4 12,6±0,6 11,910,7 15,5±0,7

р ,01

Таблица 3

V. ммжАО/нии

ДК

р 0,01

р 0,01

1l6,4t9,6 2,,13 ,,064 р 0,01 р f0,05

р 0,01 р 0,05