СПОСОБ ОЦЕНКИ МИКРОВЯЗКОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПУТЕМ ВЫЧИСЛЕНИЯ КОЭФФИЦИЕНТА ЭКСИМЕРИЗАЦИИ ПИРЕНА К У БЕРЕМЕННЫХ, ПЕРЕНЕСШИХ ОБОСТРЕНИЕ ГЕРПЕС-ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ В ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ, С УЧЕТОМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОЦЕНТНОГО СОДЕРЖАНИЯ ОЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ В МЕМБРАНАХ ЭРИТРОЦИТОВ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Цель исследования - показать повышение микровязкости мембран эритроцитов, находящейся в обратной зависимости от коэффициента эксимеризации пирена, исследуется путем определения коэффициента эксимеризации пирена, который равен отношению интенсивности флюоресценции эксимеров к интенсивности флюоресценции мономеров при одновременном включении методом газовой хроматографии содержания олеиновой кислоты на фоне обострения в организме герпес-вирусной инфекции.

Олеиновая кислота рассматривается в настоящее время как сильный эндогенный антиоксидант с наиболее высокой константой скорости реакции [5, 6]. В связи с этим, при изменении содержания олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов при наличии в организме вирусных воспалительных процессов, это может тяжело отразиться на устойчивости мембран эритроцитов, приводя в конечном итоге к повышению их микровязкости.

Прототипом избран способ выявления нарушения микровязкости мембран эритроцитов в крови у онкологических больных [1, 2, 3, 4].

В вышеуказанных работах предполагают, что микровязкость зависит от белков, включенных в мембрану эритроцитов, или, как это следует из выводов Горошинской И.А., Глотиной Л.Ю. и др. [2], конкретный фактор, влияющий на изменение микровязкости, вовсе не исследован. Авторы ссылаются на то, что это явление наступает при онкологическом состоянии пациента: рак желудка, мочевого пузыря, яичников, не исследовав причинного компонента, влияющего на микровязкость.

С нашей точки зрения вышеприведенные данные имеют следующие недостатки:

1. Микровязкость мембран эритроцитов зависит не только от белкового состава, но также и от липидов, которые в мембране образуют липид-белковые комплексы.

2. Нет сведений о детализации, какая из жирных кислот оказывает влияние на микровязкость мембран эритроцитов.

3. Нет сведений, влияет ли на этот процесс обострение в организме герпес-вирусной инфекции.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Измерение микровязкости мембран эритроцитов проводили методом латеральной диффузии гидрофобного флюоресцентного зонда пирена. Определение микровязкости основано на образовании эксимеров (активных димеров) пирена в липидном окружении [3, 4]. Флюоресценцию пирена измеряли спектрофлюорометрически на спектрофлюориметре «Hitachi» (Япония). Для определения микровязкости липидного бислоя находили интенсивность флюоресценции или свечение пирена при длине волны возбуждения 334 нм, длина волны мономеров - 395 нм, длина волны эксимеров - 470 нм. Для определения микровязкости зоны липид-белковых контактов длина волны возбуждения - 286 нм, длина волны мономеров - 395 нм, длина волны эксимеров - 470 нм. Оценка микровязкости основывается на вычислении коэффициента эксимеризации пирена (К_экс=F₄₇₀/F₃₉₅), который равен отношению интенсивности флюоресценции эксимеров к интенсивности флюоресценции мономеров. Коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от микровязкости и обозначается как Fэ/Fм.

2. Одновременно с помощью хроматографа «Кристалл 2000м», ЗАО СКВ «Хроматэк» (Россия) определяли жирные кислоты - в нашем случае олеиновую кислоту в мембранах эритроцитов.

Липиды экстрагировали по методу Фолча [7], метилирование жирных кислот осуществляли по методу J.Carren [8].

Компьютерным методом определяли процентное содержание олеиновой кислоты у здоровых беременных и беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции (титр антител 1:12800) на третьем триместре гестации.

3. Титр антител к вирусу простого герпеса определяли иммуноферментным методом на спектрофотометре «Stat-Fax-2100» (USA).

4. Все исследования были проведены с учетом требований Хельсинской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 г. и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденные Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г. №226.

В наших исследованиях при изучении изменения микровязкости мембран эритроцитов, мы исследовали процентное содержание в мембранах эритроцитов олеиновой кислоты, которая как эндогенный антиоксидант в норме поддерживает текучесть мембранного бислоя.

Однако при обострении герпес-вирусной инфекции у беременных в третьем триместре процентное содержание олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов, выявленных методом газовой хроматографии, резко снижалось до 16,52±0,14% (контроль - 19,86±0,21%; p<0,001).

На этом фоне резко менялась и микровязкость мембран эритроцитов. Коэффициент эксимеризации пирена, определяющий микровязкость, составлял в липидном бислое 0,60±0,005 Fэ/Fм (контроль - 0,82±0,003 Fэ/Fм; р<0,001), а в белок-липидном бислое - 0,79±0,04 Fэ/Fм (контроль - 1,0±0,004 Fэ/Fм; p<0,001).

Таким образом, влияние герпеса (титр антител к вирусу герпеса - 1:12800 в третьем триместре гестации) конкретно снижает процентное содержание в мембранах эритроцитов олеиновой кислоты, поддерживающей как эндогенный антиоксидант, так и микровязкость мембран эритроцитов, повышая ее. Снижение олеиновой кислоты как антиоксиданта в мембранах эритроцитов грозит их разрушением в периферической крови.

ЛИТЕРАТУРА

1. Владимиров Ю.А., Арчаков P.M. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. - М.: Наука, 1972. - 252 с.

2. Горшинская И.А., Глотина Л.Ю., Горло Е.И., Рова Т.А., Бордюшков Ю.Н. Изменение микровязкости мембран лимфоцитов и эритроцитов крови у онкологических больных // Вопросы мед. химии. - 1999. - Т.45. - №1. - С.53-57.

3. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. - М.: Наука, 1989. - 206 с.

4. Ишутина Н.А., Дорофиенко Н.Н., Андриевская И.А., Довжикова И.В., Болелова С.М. Изменение микровязкости мембран эритроцитов крови у беременных, инфицированных вирусом герпеса // Бюл. физиол. и патол. дыхания СО РАМН, Благовещенск, 2006. - Вып.23 (приложение). - С.16-18.

5. Титов В.Н. Атеросклероз как патология полиеновых жирных кислот. Биологические основы терапии атерогенеза. - М., 2002. - 201 с.

6. Титов В.Н. Олеиновая жирная кислота. Олеиновые, линолевые и линоленовые липопротеины низкой плотности // Клин. лабор. диагностика. - 2006. - №6. - С.3-13.

7. Carren J.P., Dubacy J.P-J. Adaptation of a micro-seale metod to the micro-seale for fatty acid methyl trausestenif: cation of biological lipid extracts // Chromatography, 1978. - Vol.151. - P.384-390.

8. Folch J., Lees М., Sloane G.H. A simple metod for the isolation and purification of total lipids from animals tissues // J. Biol. Chem., 1957. - Vol. 226. - P. 497-509.

Изобретение применяют для оценки микровязкости мембран эритроцитов. Данный способ включает вычисление коэффициента эксимеризации пирена К_экс у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации. Дополнительно определяют содержание олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов. В случае, если при титре антител 1:12800 наблюдается снижение содержания олеиновой кислоты до 16,52±0,14%; снижение К_экс в липидном бислое до 0,60±0,005; К_экс в белок-липидных контактах до 0,79±0,004 - оценивают повышение микровязкости мембран эритроцитов.

Способ оценки микровязкости мембран эритроцитов, включающий вычисление коэффициента эксимеризации пирена К_экс, отличающийся тем, что у беременных, перенесших обострение герпес-вирусной инфекции в третьем триместре гестации, дополнительно определяют содержание олеиновой кислоты в мембранах эритроцитов, и в случае, если при титре антител 1:12800 наблюдается снижение содержания олеиновой кислоты до 16,52±0,14%; снижение К_экс в липидном бислое до 0,60±0,005; К_экс в белок-липидных контактах до 0,79±0,004, то оценивают повышение микровязкости мембран эритроцитов.