СПОСОБ ОЦЕНКИ НАРУШЕНИЯ МИКРОВЯЗКОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БЕРЕМЕННЫХ НА ТРЕТЬЕМ ТРИМЕСТРЕ ГЕСТАЦИИ, ПРИ ОБОСТРЕНИИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/53 

В эритроцитах периферической крови источником энергии является аденозинтрифосфат, который образуется при участии аденилатциклазы путем превращения АМФ в АТФ и, включаясь в реакции гликолиза, переходит в макроэргическое соединение - аденозинтрифосфат (АТФ).

АТФ имеет для эритроцитов большое значение, поскольку его энергия используется для активного транспорта катионов через клеточную мембрану и поддержания соотношения между ними калия и натрия [6]. АТФ обеспечивает целостность мембран, поскольку взаимоотношения между липид-белковыми элементами выполняются за счет энергии АТФ эритроцитов [1, 5]. В доступной литературе нет сведений, касающихся влияния цитомегаловирусной инфекции на микровязкость мембран эритроцитов при снижении аденозинтрифосфата в эритроцитах в период гестации.

Цель исследования - выяснить влияние цитомегаловирусной инфекции на энергетическую функцию эритроцитов периферической крови у беременных, которая отражается на изменении микровязкости мембран эритроцитов.

Заявленный способ имеет следующие приемы:

1. Обследовано 40 беременных на сроке гестации 20-22 недели в возрасте 18-25 лет с хронической цитомегаловирусной инфекцией (ЦМВИ) в стадии обострения (основная группа) и 15 беременных на тех же сроках гестации без патологии (контрольная группа). У беременных симптоматически ЦМВИ проявлялась в виде острого респираторного заболевания, сопровождающегося ринофарингитом. Клинический диагноз - обострение ЦМВИ - устанавливался при комплексном исследовании периферической крови на наличие IgM или четырехкратного и более нарастания титра антител IgG в парных сыворотках в динамике через 10 дней, индекса авидности - более 65%, а также ДНК ЦМВ. Исследования проводились с учетом требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных исследований с учетом человека» с поправками 2000 г. и правилами клинической практики в Российской Федерации, утвержденными приказом Министерства РФ №266 от 19.06.2003 г.

Верификация ЦМВ, определение типоспецифических антител, индекса авидности осуществлялись методами ИФА на спектрофотометре «Stat Fax 2100» (USA) с использованием тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск); выявление ДНК ЦМВ методами ПЦР на аппарате ДТ-96 с использованием наборов НПО «ДНК-технология» (Москва).

2. Измерение микровязкости мембран эритроцитов проводили методом латеральной диффузии гидрофобного флюоресцентного зонда пирена. Определение микровязкости основано на образовании эксимеров (активных димеров) пирена в липидном окружении [2, 3]. Флюоресценцию пирена измеряли спектрофлюорометрически на спектрофлюориметре «Hitachi» (Япония). Для определения микровязкости липидного бислоя находили интенсивность флюоресценции или свечение пирена при длине волны возбуждения 334 нм, длина волны мономеров - 395 нм, длина волны эксимеров - 470 нм. Для определения микровязкости зоны липид-белковых контактов длина волны возбуждения - 286 нм, длина волны мономеров - 395 нм, длина волны эксимеров - 470 нм. Оценка микровязкости основывается на вычислении коэффициента эксимеризации пирена (К_ЭКС=F₄₇₀/F₃₉₅), который равен отношению интенсивности флюоресценции эксимеров к интенсивности флюоресценции мономеров. Коэффициент эксимеризации находится в обратной зависимости от микровязкости и обозначается как Fэ/Fм.

3. Содержание АТФ определяли по прописи Лугановой И.С. и Блиновой М.Н. [4].

В наших исследованиях отмечалось, что снижение содержания в эритроцитах АТФ оказывало влияние на микровязкость мембран. При обострении цитомегаловирусной инфекции в третьем триместре гестации до титра 1:1600 количество АТФ в эритроцитах снижалось до 0,40±0,08 мкмоль/мл (контроль - 0,98±0,07 мкмоль/мл). При таком подавлении энергетического запаса в эритроцитах отмечалось повышение микровязкости в их мембранах. Коэффициент эксимеризации пирена, определяющий микровязкость, составил в липидном бислое 0,59±0,006 Fэ/Fм (контроль - 0,86±0,003 Fэ/Fм); в белок-липидном слое до 0,70±0,004 F3/Fм (контроль - 1,1±0,005 Fэ/Fм), что создает угрозу нарушения устойчивости мембран эритроцитов.

Литература

1. Ворбьев А.И. Руководство по гематологии. // -М: Изд. «Ньюдиамед», 2007.

2. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов // -М.: Наука, 1989. - С.206.

3. Ишутина Н.А., Дорофиенко Н.Н., Андриевская И.А., Довжикова И.В., Болелова С.М. Изменение микровязкости мембран эритроцитов крови у беременных, инфицированных вирусом герпеса. // Бюл. Физиол. и патол. Дыхания СО РАМН, -Благовещенск, 2006. - Вып. 23 (приложение). - С.16-18.

4. Луганова И.С. Блинова М.Н. Определение 2,3-дифосфоглицериновой кислоты неэкзиматическим методом и содержание 2,3-дифосфоглицерата и АТФ в эритроцитах больных хроническим лимфолейкозом. // Лабораторное дело. - 1975. №11. - С.625-654.

5. Покровский А.А. Биохимические методы исследования. // Справочник. - М.: «Медицина», 1969. - С.337.

6. Федоров Н.А. Нормальное кроветворение и его регуляция. // -М.: «Медицина», 1976. - С.541.

7. Bishop Ch. Overall red cell metabolism. In: The red blood cell. Ed. Bishop Ch. and Surgenor D. New York, 1964, P. 147.

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для оценки устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации. Способ характеризуется тем, что определяют титр антител к цитомегаловирусу, коэффициент эксимеризации в липидном бислое и в белок-липидном слое, оценивают микровязкость в мембранах эритроцитов и определяют активность аденозинтрифосфата в эритроцитах. При титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности аденозинтрифосфата до 0,40±0,008 мкмоль/мл, нарушении микровязкости в мембранах эритроцитов, снижении коэффициента эксимеризации в липидном бислое до 0,59±0,006 Fэ/Fм, а в белок-липидном слое до 0,70±0,004 Fэ/Fм оценивают угрозу устойчивости мембран эритроцитов.

Способ оценки устойчивости мембран эритроцитов периферической крови у беременных с цитомегаловирусной инфекцией на третьем триместре гестации, характеризующийся тем, что определяют титр антител к цитомегаловирусу, коэффициент эксимеризации в липидном бислое и в белок-липидном слое, оценивают микровязкость в мембранах эритроцитов и определяют активность аденозинтрифосфата в эритроцитах, и при титре антител к цитомегаловирусу 1:1600, снижении активности аденозинтрифосфата до 0,40±0,008 мкмоль/мл, нарушении микровязкости в мембранах эритроцитов, снижении коэффициента эксимеризации в липидном бислое до 0,59±0,006 F_Э/F_M, а в белок-липидном слое до 0,70±0,004 F_Э/F_M, оценивают угрозу устойчивости мембран эритроцитов.