КОМПОЗИЦИИ ВАКЦИН И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2016 года по МПК A61K39/38 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Для данной заявки испрашивается приоритет по предварительной патентной заявке США № 61/165732, поданной 1-го апреля 2009 г. В данном документе авторы заявляют преимущество этой предшествующей патентной заявки, полное содержание которой включено в данный документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Данное изобретение в основном относится к области химии и иммунологии. Более конкретно, изобретение относится к вакцинам, композициям и способам индукции иммунного ответа у субъекта.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предупреждение микробных инфекций и патогенных процессов с помощью вакцин считается одним из наиболее эффективных и предпочтительных методов борьбы с заболеваниями. Антигены или иммуногены вводят в организм таким образом, что они стимулируют иммунный ответ в организме-хозяине перед инфекцией или заболеванием. Однако для создания защиты от многих патогенов и раковых заболеваний традиционные вакцинные стратегии не эффективны. С помощью традиционных вакцинных стратегий успешные вакцины были получены только для 20 из более чем 100 патогенов. Из вакцин, которые индуцируют сильный цитотоксический Т-лимфоцитарный ответ (CTL-ответ), некоторые часто имеют невысокую частоту объективных ответов вследствие плохой иммуногенности, механизмов избегания иммунного ответа и антигенной вариабельности. Существующие способы доставки вакцин имеют невысокий процент успешности относительно индукции защитного иммунного ответа, поскольку они не вызывают выраженных «сигналов опасности», они запускают ингибиторные ответы, действующие по принципу обратной связи, и они доставляют антигены к непрофессиональным антиген-представляющим клеткам (АРС). Например, существующие противораковые вакцины, даже дающие высокий CTL-ответ, имеют низкую частоту объективных ответов (2,6%). У этих вакцин присутствует ряд недостатков, включая плохую иммуногенность и механизмы избегания иммунного ответа. Более того, наиболее многообещающие противораковые вакцины (на основе дендритных клеток и на базе G-vax) являются очень дорогими по себестоимости, а получение этих вакцин является очень сложным (например, требующим индивидуальных схем и производства по стандартам GMP).

Генетическая вакцинация или генетическая иммунизация, которая включает введение генетических материалов хозяевам-млекопитающим для продукции антигенов, рассматривается как потенциальный подход в отношении вакцин, в том числе противораковых вакцин. Доставленный в организм вектор для экспрессии в клетках млекопитающих, который кодирует целевой антиген, приводит в результате к in vivo экспрессии и впоследствии к развитию антиген-специфичных ответов. Кроме того, гены представляют собой отрицательно заряженные полимеры, которые не могут преодолевать клеточные мембраны и проникать в ядро клетки, где они могут экспрессировать целевой белок. Генетическая вакцинация предоставляет ряд преимуществ, включая создание полного спектра нативных эпитопов, экспрессирующихся in vivo, получение нативной конформации белка по сравнению с введением рекомбинантного белка, экспрессированного in vitro, индукцию гуморального и клеточного иммунных ответов и устранение необходимости дорогостоящих и обычно проблемных стадий продукции антигена. Однако генетическая вакцинация связана с рядом недостатков, в том числе с нарушением толерантности к собственным антигенам, плохой in vivo доставкой нуклеиновых кислот в клетку и ядро, отсутствием специфичности к конкретным типам клеток и слабыми иммунными ответами.

Другие формы вакцин также имеют свои недостатки. Например, вирусная доставка генов приводит к сильным иммунным ответам на вирусные векторы, но ее безопасность вызывает вопросы. Очистка белка из бактерий и получение пептидов для использования в качестве антигенов дороги и занимают время.

На текущий момент не существует экономически выгодных, эффективных форм вакцин, мишенью которых являются АРС, для получения специфичных и сильных иммунных ответов, которые при этом не имеют или имеют немного побочных эффектов. Необходима вакцина, мишенью которой являются профессиональные АРС, которая вызывает сильный и специфичный клеточный и гуморальный ответы, а также безопасная, выгодная по себестоимости и легкая в применении.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны композиции, наборы и способы, а также платформы, на основе наночастиц для доставки антигена или нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, к профессиональным АРС (РАРС) in vivo, которые приводят в результате к сильному и специфичному иммунному ответу на антиген. Также в данном документе описаны композиции, наборы и способы, а также платформы, на основе наночастиц для доставки киРНК к профессиональным АРС и доставки нуклеиновых кислот, пептидов или белков к клеткам (например, опухолевым клеткам, экспрессирующим МНС II класса). Основной проблемой существующих вакцинных стратегий является то, что они индуцируют супрессорные клетки, включая регуляторные Т-клетки. Известно, что направленная доставка антигена к РАРС снижает или ингибирует активацию супрессорных механизмов, в частности, опосредованных регуляторными Т-клетками. Композиции, наборы и способы включают объединенное применение МНС-направленных и иммуногенных пептидов (например, PADRE, HA) с заряженными (например, положительно заряженными) высоко разветвленными полимерными дендримерами (например, РАМАМ и другими дендримерами) в качестве носителей для направленной доставки нуклеиновых кислот, пептидов или полипептидов к определенным клеткам, давая начало новому способу, основанному на применении наночастиц, для генетической или белковой вакцинации. Типичные вакцины, описанные в данном документе, включают заряженный (например, положительно заряженный) высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный с МНС-направленным и иммуногенным пептидом, таким как Т-хелперный пептид (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа), по меньшей мере один полипептидный антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один антиген, и, необязательно, поли-I-С. Положительно заряженные высоко разветвленные полимерные дендримеры, описанные в данном документе, эффективно связывают отрицательно заряженные биомолекулы, включая ДНК, РНК и другие. Заряженные (например, положительно заряженные) высоко разветвленные полимерные дендримеры, конъюгированные с Т-хелперным пептидом (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа), обеспечивают более эффективные вакцины благодаря специфичной доставке антигена к РАРС. В описанных в данном документе экспериментах показано первое применение PADRE для направленной доставки к РАРС через его связывание с молекулами МНС II класса. В представленных в данном документе экспериментах описано эффективное применение двух различных направленных пептидов, чьим уникальным признаком является связывание с МНС II класса. Таким образом, описанные в данном документе вакцины, способы и композиции охватывают все пептиды, связывающие МНС II класса. Вакцины, наборы и композиции, описанные в данном документе, обеспечивают специфичную и эффективную трансфекцию РАРС in vivo и встроенную универсальную Т-хелперную активность, что приводит к созреванию аутологичных РАРС и, следовательно, к сильным и специфичным иммунным ответам.

Дендримеры являются идеальными кандидатами для доставки ДНК, поскольку они обеспечивают структурный контроль по размеру и форме (вследствие наличия «грузового отсека»), биологически совместимы (нетоксичны и неиммуногенны), образуют высокоточные каркасы, имеют на поверхности строго определенные модифицируемые функциональные группы для направленного взаимодействия с молекулами, способны прикрепляться к клетке и за счет эндоцитоза попадать в цитоплазму или ядро, имеют приемлемую биодеградацию (способность безопасно разлагаться в организме), а их синтез (с медицинской чистотой) является легким и стабильно воспроизводимым. В описанных в данном документе экспериментах конъюгированный с ДНК, киРНК, пептидом или полипептидом положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример включает пептид (например, PADRE-пептид или НА вируса гриппа), который направленно связывается с АРС и активирует хелперные Т-клетки как у людей, так и у мышей. PADRE-пептид имеет две основные функции: сопровождение ДНК к РАРС благодаря своей способности связываться с присутствующими на РАРС МНС II класса и стимуляцию Т-хелперных клеток, что усиливает генерацию цитотоксических Т-клеток и переключение между классами, необходимое для гуморального ответа. Эта новая наноконструкция обладает уникальными свойствами в отношении доставки генов и пептидов, а также вакцинации. В описанных в данном документе экспериментах также показано, что положительно заряженные высоко разветвленные полимерные дендримеры (РАМАМ-дендримеры), конъюгированные с PADRE, задерживают рост и уменьшают размер сформировавшихся и высоко агрессивных опухолей меланомы B16/LU8 у мышей C57BL на 50% при терапевтической схеме введения и полностью (на 100%) элиминируют опухоль B16/OVA при профилактической схеме введения, индуцируют сильные иммунные ответы против продукта гена, используемого для вакцинации, демонстрируют 2- или 3-кратное увеличение эффективности трансфекции АРС как мыши, так и человека, доставляют плазмиду, кодирующую GFP, in vivo в дренирующие лимфатические узлы и эффективно доставляют киРНК в В- и Т-клетки человека и мышиные макрофаги.

Описанные в данном документе композиции и вакцины являются подогнанной и идеальной платформой для вакцинации, поскольку они направлены на клетки, положительные по МНС II класса, все или практически все из которых являются РАРС. Однако, что важно, клетки, положительные по МНС II класса, экспрессируют весьма важные коингибиторные и костимуляторные молекулы (в том числе, но не ограниченные этим, CD80, CD86, B7-H1, B7-H4, B7-DC, CD137, OX40, Foxp3 и их гипотетические костимуляторные рецепторы), которые подавляют или усиливают активацию Т-клеток. Направленные манипуляции с экспрессией молекул, вовлеченных в эти сигнальные пути, можно использовать для: i) иммунотерапии/вакцинации против рака, инфекционных заболеваний или других новых подходов в вакцинации, таких как вакцинация от различных типов зависимости или бесплодия, или нейтрализации болезнетворного агента у субъекта, а также для контроля аутоиммунных явлений. Описанная в данном документе направленная доставка вакцин к АРС предлагает решение проблем, ассоциированных с существующими стратегиями вакцинации, благодаря гораздо более сильным иммунным ответам, уменьшению действия супрессирующих механизмов/механизмов, действующих по принципу обратной связи, и предупреждению токсичности вследствие снижения дозы вакцины.

Соответственно, в данном документе описана вакцина, содержащая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена. В вакцине по меньшей мере один дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой. Этот вариант осуществления может включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле». В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является эпитоп Pan-DR (PADRE), например, два PADRE-эпитопа, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. По меньшей мере один Т-хелперный пептид может также быть НА вируса гриппа. Нуклеиновая кислота может быть экспрессионным вектором, а по меньшей мере один антиген может быть раковым антигеном или антигеном из инфекционного патогена. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером.

Также в данном документе описана вакцина, содержащая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. В одном варианте осуществления изобретения один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример дополнительно конъюгирован со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. Вакцина может дополнительно содержать второй заряженный сильно разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и второй пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью второго заряженного сильно разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и второго пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против второго пептидного или полипептидного антигена. По меньшей мере один дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой. Вакцина может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле». По меньшей мере один Т-хелперный пептид является эпитопом Pan-DR (PADRE), например, двумя Pan-DR-эпитопами, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один Т-хелперный пептид является НА вируса гриппа. По меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген может быть раковым антигеном или антигеном из инфекционного патогена. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером.

Дополнительно в данном документе описан способ доставки антигена в организм млекопитающего и индукции в организме млекопитающего продукции моноклональных антител к антигену. Способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота или по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты или по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена; причем композицию вводят в количестве, эффективном для индукции опосредованной МНС II класса активации Т-хелперных клеток, а введение композиции млекопитающему приводит к продукции моноклональных антител к по меньшей мере одному пептидному или полипептидному антигену. В варианте осуществления изобретения, в котором млекопитающее имеет раковое заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген является раковым антигеном, а композиция является противораковой вакциной. Обычно введение композиции не вызывает местных побочных реакций у млекопитающего. В другом варианте осуществления изобретения, в которой млекопитающее имеет инфекционное заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген относится к инфекционному патогену, а композиция представляет собой вакцину против инфекционного патогена, обычно не вызывающую местных побочных реакций у млекопитающего. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой, и/или может включать фармацевтически приемлемый носитель и/или эмульсию «вода в масле».

В одном варианте осуществления этого способа по меньшей мере один Т-хелперный пептид является PADRE-эпитопом, например, двумя PADRE-эпитопами, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. По меньшей мере один Т-хелперный пептид также может быть НА вируса гриппа. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть дополнительно конъюгирован со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена. Композиция может дополнительно содержать второй заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и второй пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, второго заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и второго пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против второго пептидного или полипептидного антигена.

В одном варианте осуществления изобретения для продукции и получения антител, млекопитающим может быть грызун или кролик, и моноклональные антитела выделяют из млекопитающего. В этом варианте осуществления изобретения моноклональные антитела получают с использованием следующих стадий: выделения антител из млекопитающего, титрования антител, удаления селезенки из млекопитающего и проведения слияния с миеломой. Антитела можно гуманизировать.

Дополнительно в данном документе описана композиция, включающая по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный кроме того по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и киРНК конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками. По меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE-пептидом, а киРНК может быть направлена против, например, CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1.

Кроме того, в данном документе описан способ доставки киРНК в профессиональные антиген-представляющие клетки, включающий стадии: предоставления композиции, содержащей по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и киРНК конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками; и введения композиции млекопитающему субъекту в условиях, при которых по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, связывается с антиген-представляющей клеткой, и киРНК входит в профессиональную антиген-представляющую клетку. Заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть, например, PADRE, а киРНК может быть направлена против, например, CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1. В одном варианте осуществления изобретения киРНК предупреждает экспрессию CTLA-4, Foxp3, CD28, IDO или аргиназы 1 в профессиональной антиген-представляющей клетке.

Еще дополнительно в данном документе описан способ ингибирования пролиферации опухолевых клеток, несущих на поверхности молекулы МНС II класса (например, лимфомы или части клеток лимфомы), или индукции апоптоза в опухолевых клетках, несущих на поверхности молекулы МНС II класса, у млекопитающего. Этот способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и связанный с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы и связаны с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что, по меньшей мере, один Т-хелперный пептид специфично связывается с опухолевыми клетками, несущими на поверхности молекулы МНС II класса, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты или белка, кодируемого нуклеиновой кислотой, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток, несущих на поверхности молекулы МНС II класса, или индуцирует апоптоз в опухолевых клетках, несущих на поверхности молекулы МНС II класса. Например, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE. Однако можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды.

Способ доставки нуклеиновой кислоты в клетку, описанный в данном документе, включает контактирование клетки с композицией, содержащей по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным эпитопом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного эпитопа, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. В этом способе пептид или белок обычно экспрессируются в клетке. Хотя можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть, например, РАМАМ-дендримером, а по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть, например, PADRE-пептидом.

Композиция для доставки нуклеиновой кислоты в клетку, описанная в данном документе, включает по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. Например, положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример может быть РАМАМ-дендримером, а по меньшей мере один Т-хелперный пептид может быть PADRE-пептидом. Однако можно использовать любые подходящие положительно заряженные высоко разветвленные дендримеры и Т-хелперные пептиды.

Если не указано иное, то все используемые в данном документе технические термины имеют такое же значение, которое обычно понимает под ними средний специалист в области, к которой относится изобретение.

Используемые в данном документе термины «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» означают цепь из двух или нескольких нуклеотидов, такую как РНК (рибонуклеиновая кислота) и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота), а также химически модифицированных нуклеотидов. «Очищенной» молекулой нуклеиновой кислоты является та, которая по существу отделена от других нуклеотидных последовательностей в клетке или организме, в которых нуклеиновая кислота встречается в природе (например, свободная от примесей на 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100%). Термины включают, например, молекулу рекомбинантной нуклеиновой кислоты, включенную в вектор, плазмиду, вирус или геном прокариот или эукариот. Примеры очищенных нуклеиновых кислот включают кДНК, фрагменты геномных нуклеиновых кислот, нуклеиновые кислоты, полученные с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), нуклеиновые кислоты, полученные обработкой ферментом рестрикции геномных нуклеиновых кислот, рекомбинантные нуклеиновые кислоты и химически синтезированные молекулы нуклеиновых кислот. Молекула «рекомбинантной» нуклеиновой кислоты представляет собой молекулу, собранную искусственным объединением двух в ином случае разделенных сегментов последовательности, например, с помощью химического синтеза или с помощью манипуляций с выделенными сегментами нуклеиновых кислот с использованием методик генной инженерии.

При упоминании аминокислотного остатка в пептиде, олигопептиде или белке, термины «аминокислотный остаток», «аминокислота» и «остаток» используются взаимозаменяемо и при использовании в данном документе означают аминокислоту или аминокислотный миметик, ковалентно присоединенные по меньшей мере к одной другой аминокислоте или к одному другому аминокислотному миметику через амидную связь или имитацию амидной связи.

Используемые в данном документе термины «белок» и «полипептид» применяются в качестве синонимов для обозначения любой соединенной пептидной связью цепи аминокислот, вне зависимости от длины или пост-трансляционной модификации, например, гликозилирования или фосфорилирования.

При упоминании молекулы нуклеиновой кислоты, полипептида или инфекционного патогена, термин «нативный (нативная)» относится к нуклеиновой кислоте, полипептиду или инфекционному патогену, встречающимся в природе (например, дикого типа (WT)).

Используемый в данном описании термин «антиген» или «иммуноген» означает молекулу, которую специфично узнает и связывает антитело.

При упоминании эпитопа (например, Т-хелперного эпитопа) под биологической активностью понимается способность связывать соответствующую молекулу МНС, а в случае пептидов, пригодных для стимуляции CTL-ответов - способность индуцировать Т-хелперный ответ и CTL-ответ против целевого антигена или миметика антигена.

Термины «специфичное связывание» и «специфично связывает» относятся к такому связыванию, которое происходит между двумя такими парными элементами, как фермент/субстрат, рецептор/агонист, антитело/антиген и т.д., и которое может опосредоваться ковалентными или нековалентными взаимодействиями или комбинацией ковалентных и нековалентных взаимодействий. Когда взаимодействие двух элементов дает нековалентно связанный комплекс, то возникающее связывание обычно является электростатическим, образуется за счет водородных связей или является результатом липофильных взаимодействий. Соответственно, «специфичное связывание» возникает между парными элементами, когда между двумя элементами, образующими связанный комплекс, существует взаимодействие, имеющее характеристики взаимодействия антитела с антигеном или фермента с субстратом. В частности, специфичное связывание отличается связыванием одного члена пары с конкретными элементами, но не с другими элементами в семействе соединений, к которому принадлежит соответствующий член связанной пары.

Используемые в данном описании термины «Pan-DR-эпитопы», «Pan-HLA-DR-связывающий эпитоп», «PADRE» и «PADRE-пептиды» означают пептид от 4 до 20 остатков, способный связывать с высокой аффинностью по меньшей мере примерно 7 из 12 наиболее распространенных DR-аллелей (DR1, 2w2b, 2w2a, 3, 4w4, 4w14, 5, 7, 52a, 52b, 52c и 53). В данном документе «высокая аффинность» определена как связывание с IC₅₀% меньше 200 нМ. Например, высокоаффинное связывание включает связывание с IC₅₀% меньше 3100 нМ. Для связывания с МНС II класса, типичным порогом аффинности связывания является 1000 нМ, а аффинность меньше 100 нМ обычно считается высокоаффинным связыванием. Конструирование и применение PADRE-пептидов подробно описано в патенте США № 5736142, включенном в данный документ путем ссылки.

Используемый в данном документе термин «Т-хелперный пептид» относится к пептиду, распознаваемому Т-клеточным рецептором Т-хелперных клеток. Например, описанные в данном документе PADRE-пептиды являются Т-хелперными пептидами.

Используемый в данном документе термин «дендример» означает заряженную (например, положительно заряженную, отрицательно заряженную) высоко разветвленную полимерную макромолекулу приблизительно сферической формы. Примером положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера является РАМАМ-дендример. Под терминами «РАМАМ-дендример» и «поли-амидоаминный дендример» понимается тип дендримера, в котором третичные амины расположены в местах разветвления, а структурные слои соединены амидной связью.

Под терминами «РАМАМ-дендример» и «поли-амидоаминный дендример» понимается тип дендримера, в котором третичные амины расположены в местах разветвления, а структурные слои соединены амидной связью. РАМАМ-дендримеры имеют большой положительный заряд на своей поверхности.

Под термином «производное дендримера» понимается дендример, имеющий одну или несколько функциональных групп, конъюгированных с его поверхностью.

«PADRE-производное дендримера» или «PADRE-дендример» представляют собой наноконструкцию, в которой один или несколько PADRE-пептидов ковалентно присоединены к функциональным группам на поверхности заряженного (например, положительно заряженного) высоко разветвленного полимерного дендримера (например, РАМАМ-дендримера).

Термин «конъюгированный» означает, что одна молекула или агент физически или химически присоединены или прикреплены к другой молекуле или другому агенту. Примеры конъюгации включат ковалентную связь и электростатическое комплексообразование. Термины «находится в комплексе», «находится в комплексе с» и «конъюгированный» используются в данном документе взаимозаменяемо.

Используемая в данном документе фраза «идентичность по последовательности» означает процент идентичных субъединиц в соответствующих позициях в двух последовательностях (например, нуклеотидных последовательностях, аминокислотных последовательностях) при выравнивании двух последовательностей до максимального совпадения субъединиц, то есть с учетом пропусков и вставок. Идентичность по последовательности можно определить с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, программного пакета для анализа последовательностей от Accelrys CGC, San Diego, CA).

Фразы «выделенный» или «биологически чистый» относятся к материалу, который по существу или практически свободен от компонентов, обычно сопровождающих его в природе.

Используемый в данном документе термин «наночастица» означает микроскопическую частицу, чей размер исчисляется нанометрами. Например, наночастицей является конъюгат PADRE-дендримера или частица, объединяющая несколько PADRE-дендримерных конъюгатов и нуклеиновый или аминокислотный материал с общим диаметром в диапазоне приблизительно 2-500 нм.

Термин «антитело» включает поликлональные антитела, моноклональные антитела (mAb), химерные антитела, гуманизированные антитела, анти-идиотипические (anti-Id) антитела к антителам, которые можно пометить в растворенной или или связанной форме, а также их фрагменты, области или производные, полученные с помощью любой известной методики, такой как, но не ограниченной этим, ферментативное расщепление, пептидный синтез или рекомбинантные методики.

Используемый в данном документе термин «адъювант» означает любой материал, который усиливает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ.

Используемые в данном документе термины «представленный» или «экспонированный на поверхности» считаются синонимами, и относятся к антигенам или другим молекулам, которые присутствуют (например, доступны для распознавания иммунного участка) на внешней поверхности структуры, такой как наночастица (например, PADRE-дендример).

Под термином «мультивалентный» подразумевается, что на наночастице представлено более одной копии или типа антигена или молекулы.

Используемый в данном документе термин «вакцина» включает все профилактические и терапевтические вакцины. Описанные в данном документе композиции вакцин подходят для введения субъектам в биологически совместимой форме in vivo. Используемое в данном документе выражение «биологически совместимая форма, подходящая для введения in vivo» означает форму вводимого вещества, для которой терапевтические эффекты перевешивают любые токсические эффекты. Вещества можно вводить любому животному, например, человеку. В некоторых вариантах осуществления изобретения вакцину, описанную в данном документе, вводят млекопитающему, например, грызуну или кролику, для получения моноклональных антител к конкретному антигену.

Под фразой «иммунный ответ» понимается индукция гуморального и/или иммунного клеточного ответов, специфичных к антигену или антигенам. Индукция иммунного ответа зависит от множества факторов, включая иммуногенное состояние вакцинируемого организма, химическую композицию и конфигурацию антигена и способа и времени введения антигена. Иммунный ответ имеет много аспектов, некоторые из которых осуществляются клетками иммунной системы (например, В-лимфоцитами, Т-лимфоцитами, макрофагами и плазматическими клетками). Клетки иммунной системы могут участвовать в иммунном ответе через взаимодействие с антигеном или другими клетками иммунной системы, высвобождение цитокинов и реакцию на эти цитокины. Иммунные ответы в общем разделяются на две основных категории - гуморальный и клеточный иммунный ответ. Гуморальная составляющая иммунного ответа включает продукцию антител, специфичных к антигену. Клеточная составляющая включает создание гиперчувствительности отложенного типа и индукцию цитотоксических эффекторных клеток против антигена.

Под фразами «терапевтически эффективное количество» и «эффективная дозировка» понимается количество, достаточное для получения терапевтически (например, клинически) желаемого результата; точный характер результата будет варьировать в зависимости от природы заболевания, против которого проводится лечение. Например, если заболеванием, против которого проводится лечение, является раковое заболевание, то результатом может быть уничтожение раковых клеток, включая раковую опухоль. Описанные в данном документе композиции и вакцины можно вводить от одного или нескольких раз в день до одного или нескольких раз в неделю. Опытный специалист сможет определить, какие конкретные факторы могут влиять на дозировку и схему приема, необходимые для эффективного лечения субъекта, в том числе, но не ограниченные этим, тяжесть течения болезни или заболевания, предшествующие методы лечения, общее состояние здоровья и/или возраст субъекта и другие присутствующие болезни. Кроме того, лечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиций или вакцин по изобретению может включать разовое введение или серию введений.

Используемый в данном документе термин «лечение» определен, как применение или введение пациенту терапевтического агента, описанного в данном документе или идентифицированного описанным в данном документе способом, или применение или введение терапевтического агента в выделенную ткань или клеточную линию от пациента, который имеет заболевание, симптом заболевания или имеет предрасположенность к заболеванию, для полного излечения, заживления, смягчения, ослабления, изменения, лечения, улучшения, выздоровления от или влияния на заболевание, симптомы заболевания или предрасположенность к заболеванию.

Термины «пациент», «субъект» и «индивидуум» используются в данном документе взаимозаменяемо и означают субъект-млекопитающее, которое подвергается лечению, причем предпочтительными пациентами являются люди. В некоторых случаях способы по изобретению можно использовать на лабораторных животных, в ветеринарной практике и при разработке животных моделей заболевания, включая, но не ограничиваясь этим, грызунов, в том числе мышей, крыс и хомяков, а также приматов, кроме человека.

Хотя на практике или при тестировании данного изобретения можно использовать вакцины, композиции, наборы и способы, аналогичные или эквивалентные описанным в данном документе, ниже описаны подходящие вакцины, композиции, наборы и способы. Все упомянутые в данном документе публикации, патентные заявки и патенты полностью включены путем ссылки. В случае возникновения противоречий данное описание, включая определения, будет превалировать. Описанные ниже конкретные варианты осуществления изобретения являются только иллюстративными и не предполагают ограничение объема изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фиг.1 изображены две схемы, на которых показан PADRE-дендример, который можно смешать с плазмидой или соединить с пептидным или полипептидным антигеном для направленной доставки к АРС. Фиг.1 является иллюстрацией того, что описанные в данном документе PADRE-дендримеры обеспечивают платформу, в которую можно встроить любой целевой антиген или нуклеиновую кислоту, кодирующую любой целевой антиген. Описанные в данном документе PADRE-дендримеры являются активаторами врожденного иммунитета, разработанными таким образом, чтобы их захватывали профессиональные АРС.

На фиг.2 представлен ряд изображений точечных диаграмм анализа В-клеток человека с помощью проточной цитометрии, показывающих in vitro доставку PADRE-дендримеров, находящихся в комплексе с короткими нуклеотидными последовательностями, меченными красным флуорохромом. Эта нуклеиновая кислота является меченным красным флуорохромом дцРНК-олигомером, подобранным для использования в анализе РНК-интерференции для облегчения оценки и оптимизации доставки киРНК-олигонуклеотидов в клетки млекопитающих. Клетки культивировали совместно с комплексами PADRE-дендримеров и мультинуклеотидов или контролями в течение 4 часов, после которых удаляли старую и добавляли новую среду. На изображениях показана доставка дцРНК-олигомера, меченного Alexa Fuor, в очищенные В-клетки человека. На нижнем изображении в четвертой колонке показана доставка олигонуклеотида в приблизительно 92% клеток.

На фиг.3 представлен ряд фотографий, показывающих in vivo доставку ДНК PADRE-дендримерами. Комплексы PADRE-дендримера и GFP-плазмиды вводили в кожу с помощью инъекций (общее количество плазмиды составляло 5 мкг) и роговицу (1 мкг на роговицу). Были получены флуоресцентные микроскопические стереоизображения на живых анестезированных мышах. На левом изображении показана экспрессия GFP в коже, а на правом изображении показана экспрессия GFP в роговице.

На фиг.4 представлен график, показывающий лечение сформировавшихся опухолей у мышей. Мышей C57BL подкожно иммунизировали плазмидами, кодирующими либо GFP (однократно) или OVA (дважды). Собирали сыворотку трех мышей и проводили ELISA (слева) или FLISA (справа).

На фиг.5 представлены два графика, показывающих терапию сформировавшихся опухолей с помощью PADRE-дендримера. Мышей, которым были имплантированы клетки меланомы В16 (вверху) или TSA (внизу), вакцинировали на второй или третий день после имплантации опухоли с последующей ревакцинацией через неделю.

На фиг.6 представлена серия гистограмм проточной цитометрии, на которых показана экспрессия GFP в мононуклеарных клетках периферической крови человека (РВМС) (нижняя панель) и В-клеток человека (верхняя панель) после совместного культивирования GFP-плазмиды (5 мкг) в комплексе с PADRE-дендримером. В качестве контроля использовали комплекс дендримера и GFP-плазмиды (левые гистограммы).

На фиг.7 представлена серия точечных графиков, полученных с методом проточной цитометрии, которые показывают in vitro доставку белка, альбумина-FITC, в В-клетки человека с помощью PDD. На изображениях слева показана доставка PDD/альбумина-FITC в очищенные В-клетки человека. Очищенные В-клетки человека собирали и культивировали совместно с PDD/альбумином-FITC. На гистограммах слева показана доставка альбумина-FITC в В-клетки человека на следующее утро после добавления PDD/альбумина-FITC к В-клеткам человека. На верхней гистограмме показаны только В-клетки, на средней гистограмме показаны В-клетки с добавленным комплексом дендримера/альбумина-FITC, а на нижней гистограмме показаны результаты добавления к В-клеткам человека комплекса PDD/альбумина-FITC. На правой картинке приведено полученное с помощью флуоресцентного микроскопа изображение поглощения альбумина В-клетками через один час после добавления комплекса PDD/альбумина-FITC.

На фиг.8 представлена серия точечных графиков, полученных методом проточной цитометрии, которые показывают in vivo направленную доставку к DC (дендритным клеткам) в лимфатическом узле. На левом изображении приведена временная схема инъекций и забора лимфатических узлов и анализа, а на правом изображении приведены два точечных графика, полученных методом проточной цитометрии при анализе клеток лимфатического узла, примыкающего к месту инъекции PDD/GFP-плазмиды или дендримера/GFP-плазмиды, относительно лимфатического узла неиммунизированной мыши. На этих изображениях показана эффективность направленной доставки in vivo с помощью PADRE-дендримера к мышиным DC и B-клеткам в месте инъекции рядом с лимфатическим узлом. Лимфатические клетки окрашивали на CD11c (маркер DC), MHC II класса и CD20 (B-клеточный маркер). Гистограммы в правом верхнем углу показывают, что инъекция дендримера/GFP-плазмиды приводила к экспрессии GFP в приблизительно 6% DC, тогда как на расположенном ниже точечном графике ясно показано, что инъекция PDD/GFP-плазмиды приводила к экспрессии GFP в более чем 70% DC.

Фиг.9 представляет собой два графика, на которых показано, что DRHA, дендример с присоединенными различными Т-хелперными эпитопами, направленно взаимодействует in vivo с DC в лимфатическом узле, демонстрируя, что DRHA способствует трансфекции GFP в DC. Этот эксперимент аналогичен эксперименту, представленному на фиг.8, отличаясь тем, что были использованы мыши Balb/c совместно с дендримером, конъюгированным с IAd-ограниченным НА-пептидом (пептидом НА, взаимодействующим только с МНС II класса Iad). Лимфатический узел, примыкающий к месту инъекции DRHA/GFP-плазмиды или дендримера/GFP-плазмиды, и лимфатический узел неиммунизированной мыши удаляли на 5-й день после инъекций DRHA/GFP-плазмиды или дендримера/GFP-плазмиды. На графиках показаны результаты анализа данных, полученных с помощью проточной цитометрии на клетках из лимфатических узлов после окрашивания антителами к CD11c (маркер DC) на присутствие DC. На верхней панели показано число DC, положительных по GFP, найденных в дренирующих лимфатических узлах мышей, получавших указанное воздействие. На нижней панели показана средняя интенсивность флуоресценции GFP в DC. Эти результаты ясно указывают, что DRHA не только увеличивает число DC, трансфицированных in vivo, но также и число молекул плазмиды, попадающих в клетки.

Фиг.10 представляет собой полученный с помощью микроскопа снимок В-клеток человека, трансфицированных PADRE-дендримером в комплексе с меченным красным красителем (Alexa Fluor) дцРНК-олигомером.

На фиг.11 представлены два полученных с помощью микроскопа изображения РВМС бабуина, трансфицированных дендримером в комплексе с меченным красным красителем (Alexa Fluor) дцРНК-олигомером (левая панель), и клеток, трансфицированных PADRE-дендримером в комплексе с меченным красным красителем (Alexa Fluor) дцРНК-олигомером (правая панель). Снимки с помощью флуоресцентного микроскопа были сделаны через два часа после добавления PDD/дцРНК-Alexa-Fluor или контрольного комплекса к РВМС бабуина. На изображениях показана эффективность направленной доставки полинуклеотидов в РВМС обезьян с помощью PDD.

На фиг.12 представлены два полученных с помощью микроскопа изображения РВМС бабуина, трансфицированных дендримером в комплексе с кодирующей GFP плазмидой (левая панель), и клеток, трансфицированных PADRE-дендримером в комплексе с кодирующей GFP плазмидой (правая панель). РВМС бабуина были трансфицированы дендримером в комплексе с кодирующей GFP плазмидой (левая панель) и трансфицированы PADRE-дендримером в комплексе с кодирующей GFP плазмидой (правая панель). Снимки с помощью флуоресцентного микроскопа были сделаны через один день после добавления PDD/GFP-плазмиды или контрольного комплекса к PBMC бабуина. Изображение показывает высокую эффективность направленной доставки плазмиды и экспрессии гена, кодируемой плазмидой, с помощью PDD.

Фиг.13 представляет собой график, показывающий, что однократная ДНК-вакцинация PADRE-дендримером в комплексе с плазмидой (плазмида DRP-ova) превосходит in vivo электропорацию плазмидой (плазмида EP-ova).

На фиг.14 представлены две фотографии мультилуночных планшетов после внутриклеточного Вестерн-анализа с использованием сыворотки иммунизированных мышей, которые демонстрируют индукцию высоких титров антител у мышей после иммунизации PDD/плазмидой, кодирующей PCARD-антиген. Мультилуночные планшеты содержали клетки cos-7, трансфицированные плазмидой, кодирующей антиген (левая панель), и клетки cos-7, трансфицированные контрольной плазмидой (правая панель).

На фиг.15 представлены график и ряд фотографий мультилуночных планшетов после внутриклеточного Вестерн-анализа с использованием сыворотки иммунизированных мышей, которые демонстрируют индукцию высоких титров антител у мышей после двух иммунизаций PDD/плазмидой. Также показаны результаты внутриклеточного анализа Вестерн-FLISA после однократной иммунизации PADRE-дендримерами в комплексе с плазмидами, кодирующими либо GFP, либо ova, или двух иммунизаций PADRE-дендримерами в комплексе с плазмидами, кодирующими CCR5, vgPCR, CathL или p2.

На фиг.16 представлены две фотографии мультилуночных планшетов после внутриклеточного Вестерн-анализа с использованием сыворотки иммунизированных мышей, которые демонстрируют индукцию антител у мышей после однократной иммунизации PDD/VgPCR-плазмидой, которая дополнительно усиливалась после второй иммунизации PDD/VgPCR-плазмидой. Эти результаты показывают, что однократная иммунизация PDD/VgPCR-плазмидой приводит к образованию антител, количество которых повышается при ревакцинации.

Фиг.17 представляет собой график, показывающий УФ-видимый спектр G5-дендримера, конъюгата и пептида.

Фиг.18 представляет собой график, показывающий ликвидацию В16/OVA-опухолей при профилактическом введении вакцины, описанной в данном документе (PADRE-дендримера/OVA-плазмиды).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В данном документе описаны вакцины, композиции, наборы и способы на основе наночастиц для эффективной доставки одного или нескольких антигенов in vivo для вакцинации и продукции антител (например, моноклональных антител) и для эффективной доставки пептидов, белков, киРНК, РНК или ДНК к РАРС или клеткам, положительным по МНС II класса (например, опухолевым клеткам). В типичной вакцине или композиции заряженный (например, положительно заряженный) высоко разветвленный полимерный дендример конъюгирован с МНС-направленным и иммуногенным пептидом, таким как Т-хелперный пептид (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа, и т.д.) и конъюгирован или связан по меньшей мере с одной молекулой для индукции иммунного ответа к конкретному антигену у субъекта. Молекулой может являться белок или пептид бактериальной, грибковой, протозойной или вирусной природы, или фрагмент, полученный из этих антигенов, углевод, или пептидный миметик углевода. Молекула может также включать собственные антигены для лечения аутоиммунных заболеваний. Кроме того, молекула (молекулы) антигена могут также включать одну или несколько нуклеиновых кислот, включая нуклеиновые кислоты в плазмидах для экспрессии в клетках млекопитающих, кодирующие по меньшей мере один антиген. Например, антигенами могут быть одна или несколько нуклеиновых кислот, которые экспрессируют один или несколько иммуногенных белков и вызывают сильный и специфичный иммунный ответ на экспрессированный белок (экспрессированные белки) у субъекта (например, млекопитающего). В другом примере антигенами также могут быть иммуногенные пептиды или полипептиды, которые процессируются и представляются на поверхности АРС. Заряженный (например, положительно заряженный) сильно разветвленный полимерный дендример может быть конъюгирован с двумя или несколькими различными антигенами и аналогичным образом может быть конъюгирован с двумя или несколькими нуклеиновыми кислотами, каждая из которых кодирует различный антиген. Описанные в данном документе вакцина или другая композиция могут включать множество заряженных (например, положительно заряженных) высоко разветвленных полимерных дендримеров, которые конъюгированы с одним типом антигена (например, пять дендримеров конъюгированы с пятью копиями конкретного антигена), или множество заряженных (например, положительно заряженных) высоко разветвленных полимерных дендримеров, конъюгированных с множеством различных антигенов (например, пять дендримеров конъюгированы с пятью различными антигенами). Дендример образует комплекс (конъюгат) с антигенами (нуклеиновыми кислотами и белкам) из-за противоположного заряда дендримера (положительного) и заряда антигена (отрицательного), или конъюгат может быть образован через ковалентную химическую связь.

В одном варианте осуществления изобретения описанный в данном документе способ для доставки антигенов in vivo на базе наночастиц включает инъекцию вакцины, состоящей из плазмидной ДНК, кодирующей антиген, связанной с, или антигенного пептида или полипептида, конъюгированных с заряженным (например, положительно заряженным) высоко разветвленным полимерным дендримером (например, PADRE-производным дендримером (PDD)), который также конъюгирован с МНС-направленным и иммуногенным пептидом, таким как Т-хелперный пептид (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа и т.д.). Отрицательно заряженные плазмиды естественным образом связываются с положительно заряженными PADRE-дендримерами, в то время как пептидные или полипептидные антигены можно химически присоединить к PADRE-дендримерам (если они не несут отрицательного заряда). В других вариантах осуществления изобретения для связывания с положительно заряженными белками и пептидами дендример имеет отрицательный заряд. Экспонированные на поверхности антигены (антиген) или нуклеиновые кислоты (нуклеиновая кислоты), кодирующие антигены, можно конъюгировать с дендримерами любыми подходящими способами, известными в данной области. Способы конъюгации включают химическое комплексообразование, которое может быть либо ионным, либо неионным по своей природе, электростатическое связывание или ковалентное связывание. Дендример, конъюгированный с Т-хелперным эпитопом, описанным в данном документе, может быть мультивалентным; то есть на своей поверхности он может представлять более одной копии или типа антигена или нуклеиновой кислоты. Представление мультивалентных или агрегированных антигенов (или нуклеиновых кислот, кодирующих антигены) может улучшить иммунный ответ у субъекта. Одна или несколько копий или один или несколько типов антигенов или нуклеиновых кислот могут быть присоединены к дендримеру через два или несколько отдельных линкеров или спейсеров, или через общий линкер или спейсер. Описанные в данном документе композиции, наборы и вакцины можно применять как в профилактических, так и в лечебных целях, то есть их можно использовать в качестве профилактического средства для предупреждения начала заболевания или патологического состояния у субъекта, а также для лечения субъекта, имеющего заболевание или патологическое состояние. Описанную в данном документе вакцину можно использовать для индукции иммунного ответа против любых инфекционных патогенов или раковых заболеваний.

Описанные в данном документе терапевтические агенты можно использовать для направленной доставки к мононуклеарным клеткам, в частности, В-клеткам, и их можно использовать для лечения сопутствующих В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии и множественной миеломы. Описанную в данном документе комбинацию наночастицы (например, PADRE-производного дендримера) и терапевтического агента (например, лекарственного соединения) можно использовать в нескольких формах, например, в виде смеси наночастиц с терапевтическим агентом, образующих комплекс за счет электростатического связывания, химически конъюгированных терапевтического агента и наночастицы и т.п. Примеры терапевтических агентов включают, но не ограничены этим, токсины, иРНК, киРНК, микроРНК, плазмиды (например, гены, кодирующие опухолевые супрессоры, «суицидальные гены» (например, ТК) или любые гены, которые блокируют или изменяют пролиферацию и/или выживаемость опухолей), Таксол® (паклитаксел) (Bristol-Myers Squibb), антитела, мелфалан, преднизон, талидомид (МРТ), Велкад® (бортезомиб) (Millenium Pharmaceuticals), леналидомид и дексаметазон, или любую комбинацию подобных агентов.

Аналогичным образом, описанные в данном документе композиции и способы можно использовать для терапии аутоиммунных заболеваний, в которой терапевтический агент должен попасть (его необходимо доставить) в иммунные клетки, включая моноциты, DC, Т-клетки или В-клетки. Описанные в данном документе композиции можно использовать с адъювантами, такими как (но не ограничиваясь этим) поли-I:C, несущая отрицательный заряд и образующая комплекс с наноплатформой, описанной в данном документе.

Описанные ниже предпочтительные варианты осуществления изобретения иллюстрируют варианты этих композиций, вакцин, наборов и способов. Тем не менее, исходя из описания этих вариантов осуществления, изображения можно создать и/или применить на практике другие аспекты данного изобретения на основе приведенного ниже описания.

Биологические способы

В данном документе описаны способы, включающие стандартные методики молекулярной биологии. Такие методики обычно известны в данной области и подробно описаны в методологических учебниках, таких как Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; и Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York, 1992 (периодически обновляющихся). Иммунологические методики обычно известны в данной области и подробно описаны в методологических учебниках, таких как Advances in Immunology, volume 93, ed. Frederick W. Alt, Academic Press, Burlington, MA, 2007; Making and Using Antibodies: A Practical Handbook, eds. Gary C. Howard and Matthew R. Kaser, CRC Press, Boca Raton, Fl, 2006; Medical Immunology, 6^th ed., edited by Gabriel Virella, Informa Healthcare Press, London, England, 2007; и Harlow and Lane ANTIBODIES: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1988. Стандартные способы переноса генов и генной терапии также можно адаптировать для использования в данном изобретении. См., например, Gene Therapy: Principles and Applications, ed. T. Blackenstein, Springer Verlag, 1999; и Gene Therapy Protocols (Methods in Molecular Medicine), ed. P. D. Robbins, Humana Press, 1997. Способы получения и введения вакцин также в общем известны в данной области и подробно описаны, например, в Vaccine Protocols (Methods in Molecular Medicine) by Andrew Robinson, Martin P. Cranage, and Michael J. Hudson, 2nd ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003; Vaccine Adjuvants and Delivery Systems, by Manmohan Singh, 1st ed., Wiley-Interscience, Hoboken, NJ, 2007; Arvin A.M. and Greenberg H.B., Virology 344:240-249, 2006; и R. Morenweiser, Gene Therapy suppl. 1: S103-S110, 2005. Создание и применение вакцин, а также РАМАМ-дендримеров, также описано, например, в Arashkia et al., Virus Genes 40 (1): 44-52, 2010; Velders et al., J Immunol. 166:5366-5373, 2001; и S. Chauhan, N. K. Jain, P. V. Diwan. (2009) Pre-clinical and behavioural toxicity profile of PAMAM dendrimers in mice. Proceedings of the Royal Society A: Mathematical, Physical and Engineering Sciences (дата он-лайн публикации: 3-е декабря, 2009).

Синтез дендримеров, конъюгированных с нуклеиновыми кислотами, пептидами или полипептидами

Дендримеры действуют в качестве каркаса, удерживающего ДНК, и для создания сильного электростатического взаимодействия с отрицательно заряженной ДНК или РНК предпочтительны полностью положительно заряженные дендримеры. Получающийся комплекс дендримера/Т-хелперного эпитопа/ДНК, например, имеет общий заряд, зависящий от изменяемого N/P-соотношения (соотношения амино- и фосфатных групп или соотношения зарядов). В данном документе описаны дендримеры, конъюгированные с Т-хелперными пептидами (например, эпитопом, таким как PADRE или НА вируса гриппа) и антигеном, нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, или киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и антиген, нуклеиновая кислота или киРНК конъюгированы с внешней поверхностью заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с РАРС. В одном варианте осуществления изобретения дендримеры конъюгированы по меньшей мере с одним PADRE-пептидом (например, с 2, 3, 4, 5 и т.д.) и пептидным или полипептидным антигеном. В этом варианте осуществления изобретения дендример обычно конъюгирован или связан (например, с помощью электростатического связывания) с большим числом молекул пептидного или полипептидного антигена. Конъюгирование или связывание нескольких антигенов (например, большого числа молекул одного антигена) может быть очень полезным, когда антиген является низкомолекулярным соединением (особенно, в случае низкомолекулярных пептидов или углеводов), поскольку низкомолекулярные антигены обычно не способны вызывать эффективный иммунный ответ вследствие проблем, связанных с гаптен-подобным размером. Поэтому, включение множества копий антигена в конъюгаты дендримера/Т-хелперного пептида/нуклеиновой кислоты, описанные в данном документе, может усилить иммуногенность антигена. В другом варианте осуществления изображения дендримеры конъюгированы с PADRE-пептидами и связаны с нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген. В еще одном варианте осуществления изобретения дендримеры конъюгированы с PADRE-пептидами и связаны с киРНК направленной против целевого гена. В этих вариантах осуществления изобретения дендримеры можно получать и конъюгировать с Т-хелперным пептидом (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа) и связывать с нуклеиновой кислотой (например, ДНК, киРНК) или пептидом с использованием любого подходящего способа. Способы получения и использования дендримеров хорошо известны в данной области и описаны, например, в Zhang J-T et. al. Macromol. Biosci. 2004, 4, 575-578, и патентах США №№ 4216171 и 5795582, которые оба включены в данный документ путем ссылки. См. также: D.A. Tomalia, A.M. Naylor, and W.A. Goddard III, "Starburst Dendrimers: Molecular-Level Control of Size, Shape, Surface Chemistry, Topology, and Flexibility from Atoms to Macroscopic Matter", Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 29 (1990), 138-175. В описанных в данном документе экспериментах использовали РАМАМ-дендримеры. Однако можно использовать любой подходящий положительно заряженный, сильно разветвленный полимерный дендример. Дополнительные примеры положительно заряженных, сильно разветвленных полимерных дендримеров включают поли(пропиленимин)-дендримеры (PPI-дендримеры) или, в общем, любые другие дендримеры с первичными аминогруппами на своей поверхности.

Описанные в данном документе PADRE-дендримеры (PADRE-производные дендримеров) можно получить любым подходящим способом. Способы изготовления и использования PADRE известны в данной области. См., например, патент США № 5736142. Для получения PADRE-пептидов, описанных в патенте США № 5736142, использовали стратегию, первоначально описанную Jardetzky et al. (EMBO J. 9:1797-1083, 1990), в которой якорные остатки, которые содержат боковые цепи, критичные для связывания с МНС, встраивают в 13-членный полиаланиновый пептид. Например, PADRE-пептиды можно получить с помощью способов, описанных в патенте США № 5736142, или их можно приобрести в продаже (например, от компании Anaspec, Inc., Fremont, CA). Благодаря их относительно короткой длине PADRE-пептиды можно синтезировать в растворе или на твердой подложке по традиционным методикам. Различные аминокислотные синтезаторы доступны, и их можно использовать в соответствии с известными протоколами. В качестве альтернативы можно использовать технологию рекомбинантных ДНК, когда нуклеотидную последовательность, кодирующую Т-хелперный эпитоп, встраивают в экспрессионный вектор, трансформируют или трансфицируют в соответствующую клетку-хозяина и культивируют при условиях, подходящих для экспрессии. Эти процедуры обычно известны в данной области и в общем описаны в Sambrook et al., (выше), включенном в данный документ путем ссылки. Описанные в данном документе PADRE-пептиды могут включать модификации N- и C-концевых остатков. Для специалиста в данной области будет ясно, что N- и С-концы можно модифицировать для изменения физических или химических свойств пептида, например, для изменения связывания, стабильности, биологической доступности, легкости присоединения и т.п. Описанные в данном документе PADRE-пептиды можно модифицировать любыми способами для получения желаемых признаков, например, улучшенных фармакологических характеристик, при этом сохраняя по существу всю биологическую активность немодифицированного пептида.

В описанных в данном документе экспериментах PADRE-дендримерный конъюгат изготавливают простым присоединением -СООН конца PADRE-пептида и одной из аминогрупп дендримера. PADRE-пептид (Ac-D-Ala-Lys-Cha-Val-Ala-Ala-Trp-Thr-Leu-Lys-Ala-Ala-Ala-D-Ala-Ahx-Cys-OH) (SEQ ID NO:1, Ac=ацетил; D-Ala=D-аланин; Cha=циклогексилаланин; Ahx=аминогексановая кислота) был приобретен в Anaspec, Inc., (Fremont, CA) в ацетилированной форме для защиты N-конца и предупреждения реакций с его участием. Минимальная чистота приобретенного пептида составляла 95%. Реакцию амидного присоединения проводили в стандартных условиях (см. фиг.1, нижнюю схему) в растворе DMF. Для контроля числа PADRE-эпитопов, присоединенных к поверхности каждого дендримера, в реакции использовали соотношение пептида к дендримеру 2:1, чтобы к дендримеру присоединялось небольшое число молекул пептида, оставляя большинство аминогрупп свободными для сохранения большого положительного заряда на дендримере. В типичном варианте осуществления изобретения описанное в данном документе множество PADRE-дендримерных конъюгатов будет представлять собой набор дендримеров, содержащих 0, 1, 2, 3 и т.п. молекул PADRE (или другого пептида), присоединенных к ним. Ожидается, что распределение по популяциям будет следовать Пуассоновскому распределению. PADRE-пептид, aKXVAAWTLKAAa (SEQ ID NO:2), связывается с высокой или средней аффинностью (IC₅₀<1000 нМ) с 15 из 16 наиболее распространенных молекул HLA-DR ((Kawashima et al., Human Immunology 59:1-14 (1998); Alexander et al., Immunity 1:751-761 (1994)). Однако для мечения дендримера также можно использовать другие пептиды, которые также связывают МНС II класса и активируют CD4+ Т-хелперные клетки.

Примеры пептидов включают, но не ограничены этим: пептид (830-843 ак) столбнячного анатоксина (ТТ); «универсальный» эпитоп, описанный в Panina-Bordignon et al., (Eur. J. Immunology 19:2237-2242 (1989)); и следующие пептиды, которые реагируют с МНС II класса большинства HLA человека и многих мыши: aKFVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 3), aKYVAAWTLKAAa (SEQ ID NO: 4), aKFVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 5), aKXVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 6), aKYVAAYTLKAAa (SEQ ID NO: 7), aKFVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 8), aKXVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 9), aKYVAAHTLKAAa (SEQ ID NO: 10), aKFVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 11), aKXVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 12), aKYVAANTLKAAa (SEQ ID NO: 13), AKXVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 2), AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 14), AKYVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 15), AKFVAAYTLKAAA (SEQ ID NO: 16), AKXVAAYTLKAAA(SEQ ID NO: 17), AKYVAAYTLKAAA (SEQ ID NO: 18), AKFVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 19), AKXVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 20), AKYVAAHTLKAAA (SEQ ID NO: 21), AKFVAANTLKAAA (SEQ ID NO: 22), AKXVAANTLKAAA (SEQ ID NO:23) и AKYVAANTLKAAA (SEQ ID NO:24) (a=D-аланин, X=циклогексилаланин). Другим примером эпитопа, который можно использовать, является последовательность пептида из НА - SFERFEIFPKE (SEQ ID NO:25) (из НА провируса PR8-вируса), которая связывается с МНС II класса (IaD) мышей Balb/с.

Продукт очищали с помощью диализа против чистой воды в течение по меньшей мере 24 часов и затем высушивали под вакуумом. Полученный продукт, прозрачное масло, характеризовали с помощью ¹Н-ЯМР, спектроскопии в УФ и видимом диапазоне и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. На ЯМР-спектре PADRE-дендримерного конъюгата наблюдались высокие пики, соответствующие протонам дендримера, и небольшой набор пиков от пептидных протонов. MALDI-TOF-масс-спектр PADRE-дендримерного конъюгата показал пик с соотношением m/z примерно на 3000 единиц выше пика, наблюдаемого для самого дендримера. Эта избыточная масса соответствует приблизительно 2 пептидным эпитопам. Спектр конъюгата в УФ-видимом диапазоне показал поглощение в диапазоне длин волн, соответствующем поглощению триптофана.

Образование комплекса плазмидной ДНК с PADRE-дендримерным конъюгатом проводили, смешивая два компонента в водном растворе, с рН, подведенным до физиологического с помощью PBS. Типичное N/P-соотношение (аминогрупп к фосфатным группам) составляло 10:1. Для подтверждения полного включения ДНК в комплексы проводили гель-электрофорез. При физиологических показателях рН аминогруппы (-NH₂) протонированы, обеспечивая высокий положительный заряд на дендримере, что делает их особенно подходящими для доставки в клетки отрицательно заряженных ДНК или РНК. В водном растворе положительно заряженные дендримеры и отрицательно заряженные нуклеиновые кислоты образуют конденсаты или наночастицы, которые могут относительно легко проникать в биологические мембраны и пересекать их.

Дендримеры, конъюгированные с Т-хелперными эпитопами помимо PADRE, обычно получают способом, аналогичным описанному выше для PADRE-производных дендримеров. Например, С-конец пептида можно ковалентно присоединить к одной из аминогрупп на поверхности дендримера с помощью ряда хорошо известных способов синтеза, таких как амидированием с использованием карбодиимидов в качестве активаторов. В качестве другого примера присоединение этих пептидов к дендримерам с аминогруппами на поверхности проводят, используя два пути синтеза. N-конец пептидного эпитопа защищают ацетилированием. В первом пути используют карбоновую кислоту остатка концевого цистеина для присоединения в результате стандартного амидирования. Во втором пути используется тиольная группа цистеина (если есть в пептиде, в ином случая - может быть добавлена) для реакции с алкеновыми группами, добавленными на поверхность дендримера предшествующей обработкой малеимидом. Оба пути обеспечивают функциональность дендримеров с помощью эпитопов. Несколько пептидных эпитопов (например, 2, 3, 4, 5, 6 и т.д.) на молекулу дендримера будут усиливать свойства направленной доставки агентов для доставки ДНК, улучшая их качества, важные для вакцинации. Однако важно оставить большое число непрореагировавших аминогрупп, для того чтобы дендример мог приобрести большой положительный заряд в результате протонирования при физиологических показателях рН. Описанные в данном документе дендримеры можно конъюгировать с любым Т-хелперным эпитопом. Примером дополнительного Т-хелперного эпитопа является НА вируса гриппа.

В общем, в описанных в данном документе композициях, наборах и способах используются дендримеры пятого поколения (G5). Однако можно использовать дендримеры другого поколения (см. таблицу 1).

Таблица 1
РАМАМ-дендримеры Поколение Молекулярный вес Диаметр (нм) Число групп на поверхности 0 517 1,5 4 1 1430 2,2 8 2 3256 2,9 16 3 6909 3,6 32 4 14215 4,5 64 5 28826 5,4 128 6 580548 6,7 256

Вакцины и композиции с заряженными полимерными носителями

Описанная в данном документе вакцина включает по меньшей мере один заряженный (например, положительно заряженный) полимерный носитель, такой как дендример, конъюгированный или связанный с МНС-направленным и иммуногенным пептидом, таким как Т-хелперный пептид (например, эпитоп, такой как PADRE-пептид или НА вируса гриппа), и по меньшей мере одним пептидным или полипептидным антигеном или по меньшей мере одной нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, таким образом что по меньшей мере один МНС-направленный и иммуногенный пептид и по меньшей мере одна нуклеиновая кислота или по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью заряженного (например, положительно заряженного) полимерного носителя (например, дендримера), и МНС-направленный и иммуногенный пептид (например, Т-хелперный эпитоп) специфично связывается с РАРС. Комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного дендримера и по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, или по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один антиген, способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена, включая индукцию опосредованной МНС II класса активации хелперных Т-клеток. Вакцина может дополнительно включать эмульсию «вода в масле». Введение вакцины млекопитающему приводит к продукции моноклональных антител против антигена. Описанные в данном документе антиген или антигены, которые представлены на поверхности или включены в дендример, индуцируют иммунный ответ, предупреждающий возникновение заболеваний, вызванных различными патогенными состояниями. В одном варианте осуществления изображения антиген может быть получен, но не ограничиваясь этим, из патогенных бактериальных, грибковых или вирусных организмов, видов Streptococcus, видов Candida, видов Brucella, видов Salmonella, видов Shigella, видов Pseudomonas, видов Bordetella, видов Clostridium, вируса Норволк, Bacillus anthracis, Mycobacterium tuberculosis, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), видов Chlamydia, папилломавирусов человека, вируса гриппа, видов парамиксовирусов, вируса герпеса, цитомегаловируса, вируса варицелла-зостер, вируса Эпштейна-Барра, вирусов гепатита, видов Plasmodium, видов Trichomonas, агентов заболеваний, передающихся половым путем, агентов вирусных энцефалитов, агентов протозойных заболеваний, агентов грибковых заболеваний, агентов бактериальных заболеваний, раковых клеток или их комбинаций.

По меньшей мере один дендример можно дополнительно конъюгировать с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой (поли(I:С)), и вакцина или композиция может дополнительно включать фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления изобретения по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп является эпитопом Pan-DR, например, двумя эпитопами Pan-DR, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В другом варианте осуществления изобретения Т-хелперным эпитопом является НА вируса гриппа. Однако Т-хелперным эпитопом может быть любой эпитоп, который активирует CD4+ T-хелперные клетки или участвует в их активации. Активация Т-хелперным эпитопом CD4+ T-хелперных клеток необходима для размножения и стимуляции CD8+ T-клеток, а также для продукции антител В-клетками, двух событий, которые оба необходимы для индукции защитного иммунного ответа против инфекционных агентов или рака. В варианте осуществления, в котором дендример конъюгирован с нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, нуклеиновая кислота обычно представляет собой экспрессионный вектор. Экспрессионный вектор обычно включает эукариотический промотор, функционально связанный с геном, кодирующим антиген, участок для клонирования, последовательность полиаденилирования, маркер селекции и бактериальную точку инициации репликации. В общем, антигеном обычно является раковый антиген или антиген из инфекционного патогена. По меньшей мере одним дендримером является G5-дендример. Аналогично, в вариантах осуществления изобретения, в которых дендример конъюгирован с пептидным или полипептидным антигеном, антиген обычно представляет собой раковый антиген или антиген из инфекционного патогена, а по меньшей мере одним дендримером является G5-дендример. В некоторых вариантах осуществления изобретения в вакцину или композицию может быть включен адъювант.

Дендримеры являются эффективными носителями для сопровождения ДНК (и других нуклеиновых кислот, включая ДНК, РНК, киРНК, микроРНК, РНКи и т.д.) в клетки. Однако в качестве платформы для доставки вакцин использование дендримеров всегда было неудачным по нескольким причинам. Во-первых, у дендримеров отсутствует адъювантная активность; они не способны к эффективной стимуляции врожденного иммунного ответа, и они не генерируют «сигнала опасности». Также, дендримеры не обеспечивают хорошей доставки к АРС, и обычно они плохо стимулируют приобретенный иммунитет. Соответственно, была очень необходима система доставки вакцин с сильными адъювантными свойствами, специфично направленная на РАРС, индуцирующая «сигнал опасности», рекрутирующая профессиональные мононуклеарные клетки к месту инъекции и являющаяся безопасной, особенно, в случае «плохих» антигенов с низкой иммуногенностью или «собственных антигенов» или антигенов с высокой гомологией с собственными антигенами, против которых у иммунной системы выработалась толерантность. Слабые антигены или антигены с низкой иммуногенностью приводят к отсутствию или низкому уровню специфичного иммунного ответа, гуморального ответа или клеточного иммунного ответа. Описанная в данном документе вакцинная платформа представляет собой биологически разлагаемую наночастицу в комплексе (или конъюгированную) с ДНК или пептидным или полипептидным антигеном. Платформа направленно доставляет мишени к РАРС посредством своего лиганда МНС II класса, связывается с клеточной мембраной и проникает через нее за счет своей сильно положительно заряженной внешней мембраны, платформа является безопасной, и ее получение легко масштабировать до больших объемов, а также действует в качестве сильного адъюванта вследствие природы модификаций на молекуле. В типичном варианте осуществления изобретения по меньшей мере одним дендримером является G5 РАМАМ-дендример, который представляет собой высоко разветвленную полимерную макромолекулу и является идеальным вспомогательным соединением благодаря своей усиленной растворимости. G5, в частности, является идеальным для доставки ДНК в клетки. Типичная вакцина, описанная в данном документе, включает эмульсию «вода в масле», которая индуцирует временный сигнал опасности, рекрутирующий мононуклеарные клетки к месту инъекции. Эти клетки после захвата ДНК перемещаются в региональные лимфатические узлы и представляют антиген. Включение универсального Т-хелперного агониста, например, PADRE, который связывается с боковой поверхностью молекул МНС II класса, приводя к опсонизации дендримерного комплекса для РАРС, а также хелперных Т-клеток. Это изменение превращает инертный и слабый дендример в надежный усилитель иммунного ответа на экспрессируемый целевой антиген. Также включение гидрофобного носителя, то есть масляной эмульсии (например, Montanide ISA 720), которая имеет как адъювантную активность, так и депо-эффект, приводит к медленному высвобождению антигена. Включение поли(I:C) дополнительно усиливает индукцию иммунного ответа против целевого антигена. Поскольку поли(I:C) имеет отрицательный общий заряд, то она легко связывает с дендримером и является адъювантом, повышающим силу иммунного ответа. Эти признаки действуют как сильные «сигналы опасности» и дополнительно рекрутируют мононуклеарные клетки (включая АРС) к месту инъекции. В общем, эти признаки стимулируют врожденный иммунитет и приводят к усиленной экспрессии провоспалительных цитокинов, необходимых для индукции эффективного иммунного ответа.

В одном варианте вакцины Т-хелперный пептид является PADRE-эпитопом, а дендример является PADRE-производным. PADRE представляет собой искусственно подобранный пептид, который связывает большинство молекул МНС II класса, и конъюгация PADRE-пептидов с дендримерами (например, PADRE-производное дендримера) делает получающийся комплекс или конъюгат лигандом РАРС, экспрессирующих высокий уровень МНС II класса. Таким образом, этот комплекс становится универсальной направленной системой доставки вакцин с высокой аффинностью к клеткам, экспрессирующим МНС II класса или РАРС. PADRE также активирует Т-хелперные клетки и приводит к синтезу провоспалительных цитокинов и рекрутирует другие иммунные клетки к месту инъекции. Совместно с дендримером PADRE дополнительно усиливает поглощение антигена, индуцируя «сигнал опасности». PADRE-производное дендримера дает некоторые преимущества относительно известных на сегодняшний день вакцин. Во-первых, G5-дендример является сильно заряженной биоразлагаемой молекулой, которая будет связываться с клеточной мембраной и проникать через нее с высокой эффективностью, давая высокую экспрессию белка. Во-вторых, PADRE является универсальным Т-хелперным эпитопом, который связывает многие молекулы МНС II класса человека и мыши. Он представляет собой синтетический неприродный Т-хелперный эпитоп [AKchxAVAAWTLKAAA (SEQ ID NO:26) (chxA=циклогексилаланин)]. При слиянии с поверхностью дендримера PADRE будет связывать и активировать преимущественно клетки, которые имеют молекулы МНС II класса, включая все РАРС. К каждому дендримеру могут быть присоединены несколько PADRE-эпитопов (например, 2, 3, 4, 5 и т.д.). Эпитоп присоединяют через соответствующие спейсеры для сохранения связывающих свойств пептида, которые отвечают за его иммуногенные свойства. При конъюгации антигена или других молекул с дендримерными конъюгатами, описанными в данном документе, можно использовать линкерную или спейсерную молекулу. Спейсеры могут представлять собой любую комбинацию аминокислот, включая AAA, KK, GS, GSGGGGS (SEQ ID NO:27), RS или AAY. Используемые в данном описании термины «линкер» или «спейсер» означают химические группы, которые располагаются между дендримером и молекулами, экспонированными на поверхности, такими как лиганд МНС II класса, эпитоп CD4+ Т-хелперов, полипептид или терапевтический агент, который конъюгирован или связан с дендримером (например, PADRE-дендримером), и молекулами, экспонированными на поверхности. Предпочтительно, линкеры конъюгированы на одном конце с молекулой на поверхности, а на другом конце - с наночастицей (например, PADRE-дендримером). Присоединение можно проводить с помощью либо гомо-, либо гетеробифункциональных агентов, например, SPDP, DSS, SIAB. Способы присоединения раскрыты в PCT/DK00/00531 (WO 01/22995) авторов deJongh, et al., которая тем самым полностью включена в данное описание путем ссылки.

В-третьих, в вариантах осуществления изобретения, в которых вакцина включает эмульсию «вода в масле», эмульсия «вода в масле» индуцирует временный «сигнал опасности», приводящий к рекрутированию мононуклеарных клеток к месту инъекции. Эти клетки после поглощения ДНК будут перемещаться в региональные лимфатические узлы и представлять антиген. Кроме того, для дополнительного усиления индукции иммунного ответа с дендримером (например, PADRE-дендримером) можно связать синтетическую двухцепочечную РНК (дцРНК), поли(I:C). Поли(I:C) является агонистом Толл-подобного рецептора 3 (TLR-3) с отрицательным общим зарядом и поэтому легко связывается с дендримером. Поли(I:C) является адъювантом, и благодаря своему отрицательному общему заряду будет связываться с дендримером и увеличивать силу иммунного ответа. Связывание поли(I:C) с дендримером особенно пригодно для продукции моноклональных антител (описано ниже), поскольку снижает частоту интервалов между инъекциями.

Молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, описанный в данном документе, могут представлять собой РНК (например, мРНК, микроРНК, киРНК, кшРНК или синтетически модифицированную РНК) или ДНК (например, кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК). ДНК может быть двухцепочечной или одноцепочечной, а если ДНК является одноцепочечной, то может быть кодирующей (смысловой) цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. В одном варианте осуществления изобретения нуклеиновая кислота может быть молекулой РНК, выделенной или амплифицированной из иммортализованных или первичных опухолевых клеточных линий.

Описанная выше в одном варианте осуществления изобретения вакцина для индукции иммунного ответа включает по меньшей мере один дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, причем полученный комплекс индуцирует иммунный ответ против антигена. Эти композиции и способы значительно безопаснее, проще и быстрее по сравнению с другим способами генетической иммунизации, которые требуют, например, использования вирусных векторов или электропорации in vivo. Использование ДНК для индукции гуморального или клеточного иммунных ответов имеет несколько преимуществ. Во-первых, использование ДНК обеспечивает полный спектр нативных (природных) процессированных эпитопов. Кроме того, дендримеры, конъюгированные с Т-хелперным эпитопом и нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, обеспечивают универсальную систему доставки вакцин, направленную на АРС более 95% всех МНС человека (AKA, HLA), и устраняют необходимость очистки белков, для которых она представляет проблему. Такие белки могут быть частью мультибелкового комплекса, могут быть мембранными белками и могут быть неправильно свернутыми и нерастворимыми. Описанные в данном документе дендримерные конъюгаты не требуют гликозилирования или пост-трансляционных модификаций белков, они встраиваются в промежутки в структуре или укладке белков, и они предполагают значительное сокращение расходов и времени. Тот факт, что PADRE-дендример направленно доставляет нуклеиновые кислоты к РВМС мышей, бабуинов и человека, делает эту платфому идеальным кандидатом для быстрого переноса исследований, проведенных на мышах, на приматов, кроме человека, и на человека.

Также как описано выше, в другом варианте осуществления изобретения вакцина, вызывающая иммунный ответ, включает эмульсию «вода в масле» и по меньшей мере один дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом (например, эпитопом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа) и пептидным или полипептидным антигеном, причем по меньшей мере один Т-хелперный эпитоп и пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью дендримера и способны вызывать иммунный ответ против пептидного или полипептидного антигена. Пептиды или полипептиды со слабой иммуногенностью вызывают сильные иммунные ответы при конъюгации (комплексообразовании) с комплексами Т-хелперного эпитопа/дендримера, описанными выше. Полипептиды и пептиды с отрицательным общим зарядом могут образовывать комплексы, например, с PADRE-дендримером без необходимости в ковалентном присоединении. Эмульсия «вода в масле», например, PADRE-дендримера, приводит к дополнительной адъювантной активности и депо-эффекту.

Как указано выше, описанные в данном документе композиции и вакцины можно применять как в профилактических, так и в лечебных целях; их можно использовать в качестве профилактического средства для предупреждения начала заболевания или патологического состояния у субъекта, а также для лечения субъекта, имеющего заболевание или патологическое состояние. Описанную в данном документе вакцину можно использовать для индукции иммунного ответа против любого инфекционного патогена или ракового заболевания. Примеры инфекционных патогенов включают вирусы, такие как, но не ограничиваясь этим, вирус гриппа, ВИЧ, вирус лихорадки денге, ротавирус, HPV, HBV, HCV, CMV, HSV, HZV и EBV, патогенные агенты, включая возбудителей малярии, Plasmodium falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax и P. knowlesi; возбудителей из рода Leishmania, L. major, L. tropica, L. aethiopica, L. mexicana, L. donovani, L. infantum (синоним - L. chagas); патогенные бактерии, включая Bacillus anthracis, Bordetella pertussis, Streptococcus pneumonia и менингококки. В описанных в данном документе экспериментах, PADRE-дендримеры ликвидировали сформировавшиеся опухоли меланомы у мышей. Однако описанные в данном документе дендримеры, конъюгированные с Т-хелперным эпитопом и антигеном или нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, можно использовать для индукции специфичного иммунного ответа против любого типа ракового заболевания. Дополнительные примеры раковых заболеваний включают вызываемые HPV раковые заболевания шейки матки (например, можно получить комплексы Е7/Е7-опухолеассоциированных антигенов (ТАА) или плазмид, кодирующие эти антигены, с описанными в данном документе конъюгатами Т-хелперных эпитопов и дендримеров (например, PADRE-дендримера)), меланому человека (например, можно использовать в качестве ТАА и получить комплексы TRP-1, TRP-2, gp-100, MAGE-1, MAGE-3 и/или p53 с описанными в данном документе конъюгатами Т-хелперных эпитопов и дендримеров (например, PADRE-дендримера)) и рак простаты (например, можно использовать TSA в качестве ТАА и получить комплекс с описанными в данном документе конъюгатами Т-хелперных эпитопов и дендримеров (например, PADRE-дендримера)). Аналогичным образом, для опухолей легких, молочных желез и лейкемии можно использовать любой подходящий ТАА, и многие из них описаны в литературе. Множество таких ТАА являются общими для различных типов раковых заболеваний (например, CEA, MUC-1, Her2, CD20). Коктейль ТАА или плазимд, кодирующих такие антигены, можно использовать для создания универсальной, многоцелевой противораковой вакцины, описанной в данном документе. В одном примере вакцины, описанной в данном документе, для CD4-эпитопа/дендримера (например, PADRE-дендример) можно получить комплексы более чем с одним антигеном, или более чем с одной плазмидой, кодирующей антиген. В качестве альтернативы, различные вакцины, каждая из которых несет комплекс одного антигена или одной плазмиды, кодирующей антиген, можно смешать и использовать как единую вакцину против различных патогенов или различных типов раковых заболеваний.

Способы доставки антигена в организм млекопитающего и индукции иммунного ответа

В данном документе описаны способы доставки антигена в организм млекопитающего (например, человека) и индукции продукции моноклональных антител к антигену для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Типовой способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один заряженный (например, положительно заряженный) полимерный носитель (например, дендример), конъюгированный с МНС-направленным и иммуногенным пептидом (например, Т-хелперным пептидом, таким как PADRE-пептид или НА вируса гриппа, т.д.) и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном или по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и по меньшей мере одна нуклеиновая кислота или по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного (например, положительно заряженного) полимерного носителя (например, дендримера) таким образом, что по меньшей мере один МНС-направленный и иммуногенный пептид (например, Т-хелперный эпитоп) специфично связывается с РАРС, а комбинация по меньшей мере одного МНС-направленного и иммуногенного пептида (например, Т-хелперного эпитопа), по меньшей мере одного заряженного (например, положительно заряженного) полимерного носителя (например, дендримера) и по меньшей мере одной нуклеиновой кислоты или по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против антигена. В одном способе композицию вводят в количестве, эффективном для индукции опосредованной МНС II класса активации хелперных Т-клеток, приводя к продукции моноклональных антител и иммунному ответу против антигена у млекопитающего. Композиция может дополнительно включать эмульсию «вода в масле». По меньшей мере одни дендример обычно дополнительно конъюгирован с поли(I:С), и композиция обычно дополнительно включает фармацевтически приемлемый носитель. По меньшей мере один Т-хелперный эпитоп может быть эпитопом Pan-DR, например, двумя эпитопами Pan-DR, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1. В качестве альтернативы, по меньшей мере одним Т-хелперным эпитопом может быть эпитоп помимо Pan-DR-эпитопа (PADRE), например, НА вируса гриппа. Обычно, по меньшей мере одним дендримером является G5-дендример.

В одном варианте осуществления изобретения млекопитающее имеет раковое заболевание, антиген является раковым антигеном, а композиция является противораковой вакциной. В другом варианте осуществления изображения млекопитающее имеет инфекционное заболевание, антиген является антигеном из инфекционного патогена, а композиция является вакциной против инфекционного патогена. В таких вариантах осуществления изобретения введение композиции обычно не дает у млекопитающего местных побочных реакций. Такие способы обычно проводят, составляя композицию (например, вакцину) вне млекопитающего и вводя композицию млекопитающему в количестве, достаточном для стимуляции иммунного ответа против антигена, например, ракового антигена, или антигена из инфекционного патогена, у млекопитающего. Описанные в данном документе композиции, вакцины и способы можно использовать у любого подходящего субъекта, например, животного, такого как млекопитающее (например, человека, грызунов, собак, кошек, коз, овец, коров, лошадей и т.д.). Типичным субъектом является человек, страдающий от рака или инфекционного заболевания или имеющий риск их развития.

Композиции и способы доставки киРНК в РАРС

Также в данном документе описаны композиции и способы доставки киРНК в РАРС. В типичном варианте осуществления изобретения композиция для доставки киРНК в РАРС содержит по меньшей мере один заряженный (например, положительно заряженный) полимерный носитель (например, дендример), конъюгированный по меньшей мере с одним МНС-направленным и иммуногенным пептидом (например, Т-хелперным пептидом) и киРНК. По меньшей мере один МНС-направленный и иммуногенный пептид (например, Т-хелперный эпитоп) и киРНК конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного (например, положительно заряженного) полимерного носителя (например, дендримера) таким образом, что по меньше мере один Т-хелперный эпитоп специфично связывается с РАРС. киРНК может быть направлена против любого целевого гена (например, Foxp3, CD-28, CTLA-4) (специфична к нему). Композиция может дополнительно включать эмульсию «вода в масле».

Типичный способ доставки киРНК в РАРС включает стадии: предоставления композиции, содержащей по меньшей мере один дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере одной киРНК, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и по меньшей мере одна киРНК конъюгированы с внешней поверхностью дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с РАРС; и введения композиции субъекту-млекопитающему в условиях, при которых по меньшей мере один дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной киРНК, связывается с РАРС, и киРНК проникает в РАРС и экспрессируется в РАРС. Композиция может дополнительно включать эмульсию «вода в масле». В способе киРНК может быть направлена против любого целевого гена (например, FOXp3) (специфична к нему) для подавления экспрессии целевого гена. В одном примере киРНК, направленная против FoxP3, используется для подавления экспрессии FoxP3, молекулы, которая приводит к индукции регуляторных Т-клеток, клеток, подавляющих иммунные ответы и действующих в качестве отрицательных регуляторов иммунных ответов. Этот вариант осуществления изобретения особенно пригоден в противораковой терапии, в которой регуляторные Т-клетки подавляют иммунотерапию и вмешательство. Регуляторные Т-клетки, которые экспрессируют МНС II класса, могут являться мишенью для PADRE-дендримера или другого дендримера, конъюгированного с CD4-эпитопом. Другим примером является CTLA-4 на CD4+ Т-клетках, который передает ингибирующий сигнал на Т-клетки. В одном варианте осуществления изобретения, в котором киРНК, специфичная к CTLA-4, образует комплекс с PADRE-дендримером, комплекс направленно взаимодействует с клетками, экспрессирующими МНС II класса, включая CD4+ Т-клетки, и подавляет экспрессию CTLA-4. Снижение экспрессии CTLA-4 повышает иммунные ответы на патоген или раковое заболевание, и при доставки в РАРС это предупреждает или снижает экспрессию молекул, которые ингибируют иммунные ответы (для усиления иммунных ответов на патогены, раковые заболевания или при вакцинации хозяина) или усиливают иммунные ответы, включая B7.1, LFA-3, ICAM-1 (индуктор сигнала 2, необходимый для активации Т-клеток), для терапии аутоиммунных заболеваний, таких как псориаз.

В типичном варианте осуществления изобретения описанная в данном документе композиция включает киРНК, специфичную к коингибиторным и костимуляторным молекулам и их гипотетическим костимуляторным рецепторам (например, Foxp3, CD28 CTLA-4). Специфичные к последовательности киРНК связываются с молекулой-мишенью нуклеиновой кислоты, ингибируя ее. киРНК эффективны для воздействия на патологические клетки, патологический рост клеток и опухоли, включая опухоли, вызываемые инфекционными болезнетворными агентами. Предоставлены композиции для доставки киРНК и способы их воздействия.

Способы конструирования и использования рибозимов, киРНК и антисмысловых молекул известны в данной области (например, Isaka Y., Curr Opin Mol Ther vol. 9:132-136, 2007; Sioud M. and Iversen P.O., Curr Drug Targets vol. 6:647-653, 2005; Ribozymes and siRNA Protocols (Methods in Molecular Biology) by Mouldy Sioud, 2^nd ed., 2004, Humana Press, New York, New York). «Антисмысловая» нуклеиновая кислота может включать нуклеотидную последовательность, которая комплементарна «смысловой» нуклеиновой кислоте, кодирующей белок, например, комплементарна кодирующей цепи двухцепочечной молекулы ДНК или комплементарна последовательности мРНК. Антисмысловая нуклеиновая кислота может быть комплементарна всей смысловой цепи целевого гена или только ее части. В другом варианте осуществления изобретения молекула антисмысловой нуклеиновой кислоты является антисмысловой к «некодирующей области» кодирующей цепи нуклеотидной последовательности, кодирующей целевой ген (например, 5'- и 3'-нетранслируемым областям). Антисмысловые агенты могут включать, например, от примерно 8 до примерно 80 нуклеотидных оснований (то есть, от примерно 8 до примерно 80 нуклеотидов), например, от примерно 8 до примерно 50 нуклеотидных оснований, или от примерно 12 до примерно 30 нуклеотидных оснований. Антисмысловые соединения включают рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS) (олигозимы) и другие короткие каталитические РНК или каталитические олигонуклеотиды, которые гибридизуются с целевой нуклеиновой кислотой и модулируют ее экспрессию. Антисмысловые соединения могут включать отрезок из по меньшей мере восьми последовательных нуклеотидных оснований, который комплементарен последовательности в гене-мишени (то есть, в целевом гене). Для специфичной гибридизации не требуется 100%-й комплементарности олигонуклеотида с последовательностью его нуклеиновой кислоты-мишени. Олигонуклеотид специфично гибридизуется, когда связывание олигонуклеотида с мишенью нарушает нормальную функцию молекулы-мишени, вызывая потерю функций, и степень комплементарности является достаточной, чтобы избежать неспецифичного связывания олигонуклеотида с последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, в которых желательно специфичное связывание, то есть при физиологических условиях в случае методов анализа in vivo или терапевтического воздействия, или в случае методов анализа in vitro - при условиях проведения анализа.

РНК-интерференция (РНКи) представляет собой необыкновенно эффективный процесс, в ходе которого двухцепочечная РНК (дцРНК, также именуемая в данном документе киРНК, для малых интерферирующих РНК, или дц-киРНК, для двухцепочечных малых интерферирующих РНК) вызывает зависимую от последовательности деградацию гомологичной мРНК в животных и растительных клетках (Hutvagner and Zamore, Curr. Opin. Genet. Dev., 12:225-232 (2002); Sharp, Genes Dev., 15:485-490 (2001)). В клетках млекопитающих РНКи может запускаться дуплексами малых интерферирующих РНК (киРНК) (Chiu et al, Mol. Cell, 10:549-561 (2002); Elbashir et al., Nature, 411:494-498 (2001)) или микроРНК (миРНК), функциональными малыми шпилечными РНК (кшРНК) или другими дцРНК, которые экспрессируются in vivo с использованием ДНК-матриц с промоторами РНК-полимеразы III (Zeng et al., Mol. Cell, 9:1327-1333 (2002); Paddison et al., Genes Dev., 16:948-958 (2002); Lee et al., Nature Biotechnol., 20:500-505 (2002); Paul et al., Nature Biotechnol., 20:505-508 (2002); Tuschl, Т., Nature Biotechnol., 20:440-448 (2002); Yu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(9):6047-6052 (2002); McManus et al., RNA, 8:842-850 (2002); Sui et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99(6):5515-5520 (2002)).

Молекулы дцРНК обычно включают 16-30, например, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов в каждой цепи, причем одна из цепей по существу идентична, например, идентична по меньшей мере на 80% (или больше, например, на 85%, 90%, 95% или 100%), например, имеет 3, 2, 1 или 0 несовпадающих нуклеотидов, с областью-мишенью в мРНК, а другая цепь идентична или по существу идентична первой цепи. Каждая цепь также может иметь один или несколько выступающих (т.е., некомплементарных) нуклеотидов, например, один, два, три, четыре или больше выступающих нуклеотидов, например, dTdTdT.

Молекулы дцРНК можно синтезировать химически или можно транскрибировать in vitro на ДНК-матрице, или in vivo на кшРНК. Молекулы дцРНК можно подобрать с использованием любого способа, известного в данной области; а в данной области известен ряд алгоритмов для этого, см., например, Tuschl et al., Genes Dev 13(24):3191-7 (1999), и многие из них доступны через интернет.

Отрицательные контрольные киРНК обычно имеют такой же нуклеотидный состав, как и выбранная киРНК, но без значительной комплементарности по последовательности в соответствующем геноме. Такие отрицательные контроли можно подобрать случайным перемешиванием букв в нуклеотидной последовательности выбранной киРНК; можно провести поиск гомологичных последовательностей для подтверждения того, что отрицательный контроль не имеет гомологии с никаким другим геном в соответствующем геноме. Кроме того, отрицательные контрольные киРНК можно подобрать введением в последовательность одного или нескольких нуклеотидных несовпадений. В некоторых вариантах осуществления изобретения киРНК можно получить с использованием модифицированных нуклеотидов (например, 2F-RNA) для устойчивости киРНК к нуклеазам.

Способы и наборы для получения антител

В данном документе описаны композиции, наборы и способы для получения антител, которые можно вводить субъекту для терапевтических или профилактических целей. Существующие способы доставки ДНК в клетки неэффективны, сложны и вызывают низкие иммунные ответы. Однако описанные в данном документе композиции и способы приводят к сильному гуморальному ответу и демонстрируют быструю и сильную экспрессию целевого антигена. В способе получения антител описанные в данном документе конъюгаты дендримера/Т-хелперного пептида (например, PADRE-дендримеры) можно ввести в комплекс (или конъюгировать) с пептидами или полипептидами, или нуклеиновой кислотой (например, ДНК). Связывание поли(I:C) с дендримерами особенно пригодно для продукции моноклональных антител (описано ниже), поскольку оно снижает частоту интервалов между инъекциями. В описанных ниже экспериментах доставка и экспрессия GFP в роговицу и кожу, а также сильные иммунные ответы, наблюдались после единственной инъекции PADRE-дендримера в комплексе с ДНК. 50% существующих на сегодняшний день лекарственных соединений направленно взаимодействуют с мембранными белками, наиболее трудными для очистки. Композиции, наборы и способы, описанные в данном документе, обеспечивают средства направленного взаимодействия с такими сложными для очистки белками без необходимости в их очистке.

Поликлональные антитела представляют собой гетерогенные популяции молекул антител, содержащихся в сыворотке иммунизированных животных. Поэтому, антитела, которые можно получить с использованием композиций, наборов и способов, описанных в данном документе, включают поликлональные антитела, и, кроме того, моноклональные антитела, одноцепочечные антитела, Fab-фрагменты, F(ab')₂-фрагменты и молекулы, получаемые с использованием Fab-экспрессирующей библиотеки. Моноклональные антитела, которые представляют собой гомогенные популяции антител к определенному антигену, можно получить использованием описанных в данном документе конъюгатов дендримера/Т-хелперного эпитопа и стандартной гибридомной технологии (см., например, Kohler et al., Nature 256:495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6:292, 1976; Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas", Elsevier, N.Y., 1981; Ausubel et al., выше). В частности, моноклональные антитела можно получить с помощью любой методики, обеспечивающей продукцию молекул антител бессмертными клеточными линиями в культуре, как, например, описано в Kohler et al., Nature 256:495, 1975, и патенте США № 4376110; с помощью В-клеточной гибридомной методики (Kosbor et al., Immunology Today 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026, 1983) и EBV-гибридомной методики (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy", Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983). Такие антитела могут относиться к любому классу иммуноглобулинов, включая IgG, IgM, IgE, IgA, IgD и любому их подклассу. Продуцирующую моноклональные антитела (mAb) гибридому можно культивировать in vitro или in vivo. Способность продуцировать высокие титры mAb in vivo делает описанные в данном документе композиции, наборы и способы особенно пригодными для получения mAb.

Описанные в данном документе композиции, наборы и способы, в которых дендример/Т-хелперный пептид (например, PADRE-дендримеры) находится в комплексе (конъюгирован или связан) с нуклеиновой кислотой, кодирующей белок или антиген, устраняют необходимость очистки белка или антигена, поскольку нуклеиновая кислота (например, плазмидная ДНК или РНК), кодирующая антиген или белок, дает преимущество в том, что: i) устраняет трудные, и/или дорогостоящие, и/или времязатратные стадии очистки белка; ii) белок экспрессируется in vivo клеточным аппаратом хозяина в нативной форме, что устраняет проблемы, связанные с ненативной формой белка, которая образуется в результате традиционных способов очистки белка; и iii) представляет собой идеальный способ создания терапевтических моноклональных антител, в котором мишенью является природная/нативная форма белка.

Антитела человека к конкретному антигену можно получить, адаптируя известные методики продукции антител человека в животных, таких как мыши. См., например, Fishwild, D. M. et al., Nature Biotechnology 14 (1996): 845-851; Heijnen, I. et al., Journal of Clinical Investigation 97 (1996): 331-338; Lonberg, N. et al., Nature 368 (1994): 856-859; Morrison, S. L., Nature 368 (1994): 812-813; Neuberger, M., Nature Biotechnology 14 (1996): 826; и патенты США №№ 5545806; 5569825; 5877397; 5939598; 6075181; 6091001; 6114598 и 6130314. Антитела, подобные антителам человека, или гуманизированные антитела к конкретному антигену можно получить из антител другого биологического вида, адаптируя известные способы, такие как описанные в патентах США №№ 5530101 5585089 5693761 и 5693762.

После получения поликлональные или моноклональные антитела можно тестировать на узнавание специфичного антигена с помощью Вестерн-блоттинга и иммуноосаждения стандартными или другими подходящими способами, например, описанными в Ausubel et al., выше. Антисыворотку можно получить в результате серии инъекций, предпочтительно включающих по меньшей мере три повторных инъекции.

Фрагменты антител, которые узнают и связывают специфичные эпитопы, можно получить известными методиками. Например, такие фрагменты включают, но не ограничены этим, F(ab')₂-фрагменты, которые можно получить расщеплением пепсином молекулы антитела, и Fab-фрагменты, которые можно получить восстановлением дисульфидных мостиков F(ab')₂-фрагментов. В качестве альтернативного варианта можно сконструировать Fab-экспрессионные библиотеки (Huse et al., Science 246:1275, 1989) для быстрой и легкой идентификации моноклональных Fab-фрагментов с желаемой специфичностью.

Типичный способ доставки антигена в млекопитающее и индукции продукции моноклональных антител к антигену в млекопитающем для получения моноклональных антител включает введение млекопитающему композиции, содержащей по меньшей мере один дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и пептидным или полипептидным антигеном или нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота или пептидный или полипептидный антиген конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с РАРС, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного дендримера и нуклеиновой кислоты или пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена. В этом способе композицию вводят в количестве, эффективном для индукции опосредованной МНС II класса активации Т-хелперных клеток, приводящей к продукции моноклональных антител к антигену. В способе получения антител в мышах после иммунизации мышей антигеном, описанном выше, антитела получают из одной или нескольких мышей и проводят их скрининг на высокий титр. Отбирают мышь с высоким титром антител, и удаляют селезенку из этой мыши. Затем проводят слияние спленоцитов с клетками миеломы и проводят скрининг полученных клонов на лучшее связывание антигена.

Также в данном документе описаны наборы для получения антител (например, моноклональных антител) к антигену, которые устраняют необходимость очистки белка. Типичный набор включает контейнер, который содержит множество дендримерных/Т-хелперных пептидных комплексов (конъюгатов), описанных в данном документе (например, PADRE-производные дендримеров, дендримеры, конъюгированные с НА вируса гриппа и т.д.), и физиологический буфер, обычно с рН 7,4. В одном примере буфера или среды, буфер или среда включают Минимальную среду Игла, забуференную HEPES и бикарбонатом натрия с добавками гипоксантина, тимидина, пирувата натрия, L-глутамина и меньше 10% бычьего сывороточного альбумина или отдельных сывороточных белков, включая инсулин и/или трансферрин, и 100 мг/л CaCl₂, в которой уровень эндотоксина меньше 1,0 ЭЕ/мл. В этом варианте осуществления изображения пользователь набора разводит по меньшей мере одну нуклеиновую кислоту (например, плазмидную ДНК), кодирующую один антиген, буфером до концентрации 100-200 мкг/мл, и при мягком перемешивании добавляет композицию (Т-хелпера с дендримером) к раствору плазмидной ДНК. В типичном варианте осуществления изобретения используется соотношение 10:1 Т-хелперного эпитопа/дендримера к плазмидной ДНК (N:P), которое составляет приблизительно 7 весовых частей композиции к одной весовой части плазмидной ДНК. В одном варианте осуществления изобретения используются следующие условия. После 10 минутной инкубации при комнатной температуре 100 мкл смеси, содержащей 10-20 мкг плазмидной ДНК/композиции, вводят подкожно мышам. За аналогичной повторной инъекцией через 14 дней следуют стандартные способы первичного скрининга, слияния с миеломными клетками и финального скрининга на продукцию моноклональных антител. Кроме нуклеиновых кислот, композиции и наборы, описанные в данном документе, можно конъюгировать с белками или антигенами. В таком варианте осуществления изобретения обычно аналогичное соотношение 10:1 композиции к белку приводит к образованию комплекса. В инструкциях по применению, включенных в набор, описанный в данном документе, описаны протокол получения правильных соотношений, буферы и оптимизация и варианты устранения проблем при необходимости. Образование комплекса между плазмидной ДНК или белком/антигеном и PADRE-дендримерными конъюгатами обычно осуществляют смешиванием двух компонентов в водном растворе, забуференном до физиологического рН с помощью физиологического буфера, в том числе PBS. Типичное N/P-соотношение (аминогрупп к фосфатным группам) составляет 10:1. Для демонстрации полного включения ДНК в комплекс с PADRE-дендримером можно использовать гель-электрофорез или другой подходящий метод анализа.

Описанный в данном документе набор можно использовать с любым вектором или плазмидой, кодирующими целевой антиген. Инструкции по получению и использованию комплексов (конъюгатов) дендримера/Т-хелперного эпитопа, описанных в данном документе, обычно включены в набор. Хотя инструкции обычно включают письменные или печатные материалы, они не ограничиваются ими. Любой информационный носитель, подходящий для хранения таких инструкций и передачи их конечному пользователю, входит в наборы и способы по данному изобретению. Такие носители включают, но не ограничены этим, электронные носители (например, магнитные диски, ленты, картриджи, чипы), оптические носители (например, компакт-диски с записями, доступными только для чтения) и т.п. Такие информационные носители могут включать адреса интернет-сайтов, на которых предоставлены такие инструкционные материалы.

Композиции и способы доставки нуклеиновой кислоты в клетку

В описанных в данном документе экспериментах ген, кодирующий GFP, специфично доставлялся к клеткам с МНС II класса (к клеткам, экспрессирующим МНС II класса), и наблюдалась экспрессия гена. Таким образом, композиции и способы, описанные в данном документе, могут найти применение в методах генной терапии. Композиция для доставки нуклеиновой кислоты к клетке обычно включает по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. Способ доставки нуклеиновой кислоты к клетке обычно включает контактирование клетки с композицией, включающей по меньшей мере один положительно заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одной нуклеиновой кислотой, кодирующей пептид или белок, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с клеткой, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, по меньшей мере одного положительно заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера и нуклеиновой кислоты интернализуется клеткой. В типичном варианте осуществления изобретения пептид или белок экспрессируются в клетке.

Введение композиций

Описанные в данном документе вакцины и композиции можно вводить млекопитающим (например, собакам, кошкам, свиньям, лошадям, грызунам, приматам (кроме человека), человеку) в любом подходящем составе. Например, композицию, включающую PADRE-дендример, конъюгированный с киРНК, или вакцину, включающую PADRE-дендример в комплексе с нуклеиновой кислотой или пептидным или полипептидным антигеном, можно ввести в фармацевтический состав в фармацевтически приемлемых носителях или разбавителях, таких как физиологический раствор или забуференный солевой раствор. Подходящие носители и разбавители можно выбрать, исходя из типа и пути введения и стандартной фармацевтической практики. Описание примеров фармацевтически приемлемых носителей и разбавителей, а также фармацевтических составов, можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences, стандартных материалах в этой области и в USP/NF (Фармакопее США - Национальном формуляре). Для стабилизации и/или хранения композиций можно добавить другие вещества.

Описанные в данном документе композиции и вакцины можно вводить млекопитающим любыми общепринятыми методиками. Обычно такое введение будет парентеральным (например, внутривенным, подкожным, внутриопухолевым, внутримышечным, внутрибрюшинным или интратекальным введением). Композиции можно также вводить напрямую в область-мишень. Композиции можно вводить однократным болюсом, многократными инъекциями или непрерывной инфузией (например, внутривенной, с помощью внутрибрюшинного диализа или помповой инфузией). Для парентерального введения композиции предпочтительно вводят в состав в стерильной апирогенной форме. При терапевтическом применении композиции и вакцины, описанные в данном документе, вводят индивидууму, уже страдающему от ракового заболевания или инфицированному целевым патогеном (например вирусом). При профилактическом применении композиции и вакцины, описанные в данном документе, вводят индивидууму, имеющему риск развития (например, в результате генетической предрасположенности или в результате воздействия окружающих факторов) к раковому заболеванию или инфекционному заболеванию (то есть, инфицированному целевым патогеном (например, вирусом)).

При терапевтическом применении композиции и вакцины, описанные в данном документе, вводят индивидууму, уже страдающему от ракового заболевания или инфицированному целевым патогеном (например вирусом). При профилактическом применении композиции и вакцины, описанные в данном документе, вводят индивидууму, имеющему риск развития (например, в результате генетической предрасположенности или в результате воздействия окружающих факторов) к раковому заболеванию или инфекционному заболеванию (то есть, инфицированному целевым патогеном (например, вирусом)).

Эффективные дозировки

Описанные в данном документе вакцины и композиции предпочтительно вводить млекопитающим (например, собакам, кошкам, свиньям, лошадям, грызунам, приматам (кроме человека), человеку) в эффективном количестве, которое представляет собой количество, обеспечивающее желаемый результат у получающего воздействие млекопитающего (например, предупреждение или устранение ракового заболевания у млекопитающего, защиту от инфекционных заболеваний и т.д.). Ниже описано, как можно определить такое терапевтически эффективное количество.

Токсичность и терапевтическую эффективность вакцин и композиций, описанных в данном документе, можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур, используя либо культуру клеток, либо экспериментальных животных для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции). Соотношение между дозировками, дающими токсический и терапевтический эффекты, является терапевтическим индексом и может быть выражено как соотношение LD₅₀/ED₅₀ (отношение полулетальной дозы к эффективной дозе). Предпочтительными являются композиции, которые имеют высокие терапевтические индексы. Хотя можно использовать композиции, проявляющие токсичные побочные эффекты, следует тщательно выбирать системы доставки, которые минимизируют потенциальный ущерб от таких побочных эффектов. Дозировка предпочтительных композиций находится предпочтительно в диапазоне, включающем ED₅₀ с минимальной токсичностью или ее полным отсутствием. Дозировка может варьировать в этом диапазоне в зависимости от используемой лекарственной формы и пути введения.

Терапевтически эффективное количество композиций и вакцин, описанных в данном документе, для первичной иммунизации (то есть для терапевтического или профилактического введения) находится в диапазоне от примерно 1 мкг до примерно 25000 мкг (например, составляет 1, 100, 500, 2000, 2500, 10000, 15000, 25000 мкг) комплекса Т-хелперного эпитопа/дендримера, конъюгированного с антигеном или связанного с нуклеиновой кислотой, кодирующей антиген, для пациента весом 70 кг (например, от 0,14 мкг до 357 мкг плазмидной ДНК или белка и от 0,86 мкг до 2142,85 мкг Т-хелперного пептида/дендримера) со следующими повторными дозами от примерно 1 мкг до примерно 2500 мкг комплекса (вакцины) в соответствии со схемой повторных введений через несколько недель или месяцев в зависимости от ответа и состояния пациента, оцениваемых измерением специфичной CTL-активности и/или гуморального ответа в крови пациента. В одном варианте осуществления изобретения млекопитающему можно вводить ежедневно в течение 15 дней дендример в дозировке, в 133 раза превышающей вышеуказанные дозировки, без признаков токсичности (см. Abhay Singh Chauhan et. al. 2009 Proc. R. Soc. A, 466, pp. 1535-1550, 2009).

Для лечения субъекта, уже страдающего от ракового заболевания или инфекционного заболевания, и/или у которого только что обнаружили раковое заболевание или инфекционное заболевание, введение предпочтительно начинать при первых симптомах заболевания, или сразу при обнаружении или хирургическом удалении опухоли, или сразу после постановки диагноза в случае острой инфекции. За первичным введением вводят последующие дозировки по крайней мере до практически полного исчезновения симптомов и в течение какого-то времени после этого. При хронической инфекции может потребоваться введение ударных дозировок с последующими поддерживающими дозировками. Для профилактического введения его можно начинать, когда индивидуум полагает, что у него есть предрасположенность к раковому заболеванию, или перед предполагаемым контактом с инфекционным заболеванием.

Как хорошо известно в медицине и ветеринарии, дозировка для любого одного субъекта зависит от множества факторов, включая размер субъекта, площадь поверхности тела, возраст, конкретную вводимую композицию, время и путь введения, общее состояние здоровья и другие лекарственные соединения, вводимые параллельно. Для дендримеров, таких как РАМАМ, были проведены доклинические и клинические исследования. На сегодняшний момент FDA (Управление по контролю за пищевыми продуктами и лекарственными препаратами) присвоило «ускоренный» статус препарату VivaGel® (Starpharma, Melbourne, Australia), уже находящемуся в III фазе клинических испытаний. Известно терапевтическое применение дендримеров на роговице, и дендримеры использовались для доставки генов в клетки роговицы. Примеры использования дендримеров при лечении роговицы включают терапию неоваскуляризации роговицы, фотодинамическую терапию и инженерию тканей в качестве замены роговицы. Поли(I:С) вводили людям на протяжении более 40 лет в качестве «природного» индуктора интерферона. В нескольких недавних клинических исследованиях были проверены различные дозировки и пути введения на безопасность и повышенную иммуногенность; общая безопасность и повышенная иммуногенность были повторно подтверждены и опубликованы.

ПРИМЕРЫ

Данное изобретение дополнительно проиллюстрировано на нижеследующих примерах. Примеры приведены только для иллюстративных целей и никоим образом не должны истолковываться как ограничение объема изобретения.

Пример 1 - Обладающая адъювантными свойствами и свойствами направленной доставки платформа на базе наночастиц для терапии сформировавшейся меланомы с помощью генетической вакцинации

Генетическую вакцинацию с использованием чистой ДНК используют для продукции антигенов в их природной форме. Однако низкая эффективность трансфекции in vivo, отсутствие эффективной доставки и плохая специфичность существующих подходов в генетической вакцинации ограничивают их эффективность. Для преодоления этих проблем в данном изобретении была разработана и описана новая и гибкая платформа для противоопухолевой ДНК-вакцинации, которая (1) позволяет специфичную и эффективную трансфекцию РАРС in vivo, (2) обеспечивает «сигналы опасности», приводящие к созреванию аутологичных РАРС и, таким образом, к сильному иммунному ответу, и (3) активирует хелперные Т-клетки, дополнительно усиливающие возникающий иммунный ответ.

Описанные в данном документе новые наночастицы на базе дендримеров обычно получают конъюгацией двух реагентов: РАМАМ-дендримера 5-го поколения с аминогруппами на концах и направляющего/усиливающего иммунный ответ пептида или универсального Т-хелперного эпитопа (PADRE). Описанные ниже данные показывают, что эта платформа: i) достигает заданного противоопухолевого эффекта с уменьшением размера опухоли на 50% для сформировавшихся и крайне агрессивных B16/LU8-меланомных опухолей у мышей C57BL, ii) индуцирует сильный иммунный ответ против продукта гена, используемого для вакцинации, и iii) увеличивает эффективность трансфекции АРС как мыши, так и человека, в 2-3 раза. Более того, в экспериментах in vivo с использованием кодирующей GFP плазмиды, конъюгированной с PADRE-дендримером, было показано, что GFP продуцируется в дренирующих лимфатических узлах.

Материалы и методы

PADRE-производные PAMAM-дендримера получали, как описано выше, со следующими модификациями. Комплекс PADRE-дендримера с ДНК или киРНК создавали, инкубируя их при комнатной температуре в течение 10 минут в подходящем соотношении N/P. Такие комплексы добавляли к первичным РВМС или спленоцитам для исследований in vitro или вводили подкожно для вакцинации. На фиг.1 показано присоединение PADRE (конъюгация) с РАМАМ-дендримером пятого поколения.

Для сохранения высокого положительного заряда на поверхности для связывания с нуклеиновыми кислотами одна молекула дендримера обычно имеет два PADRE-пептида, конъюгированных с ее поверхностью таким образом, что она все еще сохраняет свой положительный общий заряд. Добавление PADRE к дендримерам приводит к специфичной доставке к АРС и сильной активации CD4+ Т-хелперных клеток. PADRE-производные РАМАМ-дендримеров не только сопровождают плазмиду, кодирующую антиген, но также стимулируют врожденный и приобретенный иммунитет и действуют в качестве «сигналов опасности».

Для получения различных плазмид (включая pEGFP-C1, pMAX, GFP, TRP-2, P2, PCARD и OVA в PCDNA3.1) использовали свободные от эндотоксинов реагенты MaxiPrep. Флуоресцентный твердофазный иммуноферментный анализ (FLISA) и иммунофлуоресцентный анализ (IFA) проводили стандартными способами. Кратко, трансфицированные клетки cos-7 высевали (в количестве 0,02×10⁶ на лунку в 96-луночном планшете), клетки фиксировали и пермеабилизовали. Для изменения полученного иммунного ответа разведенную сыворотку добавлял к клеткам, и для измерения гуморального ответа использовали вторичные антитела к мышиным IgG, меченные IRDye 800CW.

Для получения комплекса дендримера с ДНК из 1 мкг/мкл полученной ДНК в свободном от эндотоксинов PBS получали комплекс с дендримером или дендримером-PADRE с различными соотношениями зарядов. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре комплексы добавляли к клеточной культуре или вводили с помощью инъекции подкожно, внутрикожно или в полость стромы роговицы.

Для вакцинации мышей с опухолями меланомы B16-LU8 самкам мышей C57BL в группах по пять животных подкожно имплантировали (0,02×10⁶) клеток B16-F10. Получали различные группы: i) отсутствие воздействия (отрицательный контроль), ii) только PCDNA3.1 (векторный контроль), iii) TRP-2 в комплексе только с дендримером или iv) TRP-2 в комплексе с PADRE-дендримером, на второй и десятый день после имплантации опухоли. Опухоли измеряли дважды в неделю.

Результаты

Полученные PADRE-дендримеры были охарактеризованы. Конъюгат пептида с дендримером был получен в результате образования простой амидной связи между -СООН концом пептида и аминогруппами дендримера. В реакции использовали соотношение пептида к дендримеру 2:1 для присоединения всего нескольких пептидов к одному дендримеру, чтобы сохранить большинство свободных аминогрупп для создания большого положительного заряда на дендримере. Продукт очищали диализом против воды в течение по меньшей мере 24 часов и затем высушивали под вакуумом. Полученный продукт, прозрачное масло, характеризовали с помощью ¹Н-ЯМР, спектроскопии в УФ и видимом диапазоне и MALDI-TOF-масс-спектрометрии. На ЯМР-спектре PADRE-дендримерного конъюгата наблюдались высокие пики, соответствующие протонам дендримера и небольшой набор пиков от пептидных протонов. MALDI-TOF-масс-спектр PADRE-дендримерного конъюгата показал пик с соотношением m/z примерно на 3000 единиц выше m/z пика, наблюдаемого для самого дендримера. Эта избыточная масса соответствует приблизительно 2 пептидным эпитопам (фиг.17).

Полученные данные свидетельствовали о том, что в среднем на каждом дендримере присутствуют по два PADRE-пептида (фиг.17). Показана in vitro доставка различных нуклеиновых кислот в аутологичные АРС. Максимальная доставка/трансфекция различных нуклеиновых кислот in vitro в первичные мононуклеарные клетки периферической крови человека достигалась при соотношении зарядов 1:5 и 1:10. На фиг.2 показана доставка киРНК (~86%) с помощью PADRE-дендримеров в выделенные В-клетки человека, когда меченные Alexa Fluor киРНК в комплексе (конъюгированные) с PADRE-дендримером инкубировали с В-клетками в течение 4 часов. Клетки окрашивали антителами к CD19, меченными FITC, и в красном канале (PE, фикоэритриновая область) представлены клетки с киРНК/Alexa Fluor.

На фиг.3 показана in vivo доставка ДНК PADRE-дендримерами. Плазмиды, кодирующие GFP или TRP-2, вводили с помощью инъекций одни или в комплексе с PADRE-дендримером или дендримером (например, дендримером, не находящимся в комплексе с PADRE). На изображениях показана экспрессия GFP в коже (слева) и роговице (справа) через 24 часа и 16 часов после инъекций. Эффективная экспрессия GFP была продемонстрирована и в коже, и в роговице через 24 и 16 часов после инъекций PADRE-дендримерных комплексов. Была продемонстрирована направленная доставка в лимфатические узлы. Через восемь дней после подкожных инъекций комплексов GFP-плазмиды (всего 5 мкг плазмиды) и PADRE-дендримера прилегающий лимфатический узел удаляли и сравнивали с лимфатическими узлами мыши, которой вводили только GFP-плазмиду. Снимки измельченных лимфатических узлов получали на флуоресцентном микроскопе на 8-й день после иммунизации. Экспрессия антигена наблюдалась в лимфатическом узле, прилегающем к месту инъекции, а в контрольном лимфатическом узле экспрессия антигена не наблюдалась.

Была продемонстрирована направленная доставка in vivo в лимфатические узлы. Через восемь дней после подкожных инъекций комплексов GFP-плазмиды (всего 5 мкг плазмиды) и PADRE-дендримера прилегающий лимфатический узел удаляли и сравнивали с лимфатическими узлами мыши, которой вводили только GFP-плазмиду. Снимки измельченных лимфатических узлов получали на флуоресцентном микроскопе на 8-й день после иммунизации. Экспрессия антигена наблюдалась в лимфатическом узле, прилегающем к месту инъекции, а в контрольном лимфатическом узле экспрессия антигена не наблюдалась.

Как показано на фиг.4, специфичные иммунные ответы возникали после введения PADRE-дендримерных/плазмидных комплексов. Сильный гуморальный ответ наблюдался после одной (для GFP) или двух иммунизаций (для OVA) комплексами плазмиды с PADRE-дендримером.

Данные, показанные на фиг.5, иллюстрируют терапию сформировавшихся опухолей с использованием PADRE-дендримера. Известно, что В16-меланома является моделью агрессивной опухоли у мышей. Мышей, которым были имплантированы клетки В16-меланомы (вверху) или TSA (внизу), вакцинировали на второй или третий день после введения опухолевых клеток с последующими повторными иммунизациями через неделю. Последующие измерения размеров опухоли ясно демонстрировали, что введение PADRE-дендримеров приводит к защитному иммунному ответу, в частности, у мышей C57BL (Iab), которые имеют более высокую аффинность связывания с PADRE. Мыши C57BL также лучше отвечали на PADRE в результате индукции Т-хелперных клеток.

На фиг.5 приведены результаты, демонстрирующие заданный противоопухолевый эффект с уменьшением размера опухоли на 50% для крайне агрессивной и сформировавшейся опухоли B16/LU8. Эта агрессивная модель была выбрана преднамеренно, чтобы показать потенциальные возможности платформы в условиях, когда все остальные варианты не дают результатов. Задержка роста опухоли и уменьшение размера опухоли были беспрецедентными. Фактически, на 22-й день после имплантации опухоли опухоль не детектировалась или не пальпировалась в тестируемой группе (то есть у животных, получавших вакцину, описанную в данном документе), что значительно отличалось от всех контрольных групп. Количество ДНК, используемое для данной вакцинации (доза вакцины), было значительно меньше обычно используемого (20 мкг и всего 2 иммунизации). На фиг.5, нижние изображения относятся к отрицательному контролю, в котором использовались мыши Balb/c, у которых PADRE не связывается правильным образом; аналогичный эксперимент на мышах Balb/c с TSA-опухолевой моделью не показал никакой эффективности. Это ясно указывает на специфичность системы доставки через MHC II класса.

Эти данные ясно демонстрируют, что описанная в данном документе обладающая свойствами направленной доставки и адъювантными свойствами платформа на базе наночастиц обеспечивает доставку генов, высокую экспрессию кодируемого антигена, презентацию антигена и индукцию защитных иммунных ответов. Поэтому, описанные в данном документе PADRE-дендримерные наночастицы представляют собой новое и мощное средство (платформу) направленной доставки с адъювантными свойствами для: i) безбелкового получения антител (моноклональных), ii) иммунологического лечения/профилактики злокачественных новообразований и инфекционных заболеваний с антигенной вариабельностью и iii) доставки киРНК для многих иммунотерапевтических вмешательств.

Пример 2 - In vitro направленная доставка и эффективность трансфекции

На фиг.6 показано, что in vitro направленная доставка в РВМС приводит к 77%-й эффективности трансфекции В-клеток. Были получены РВМС человека от здоровых доноров. РВМС культивировали в концентрации 6×10⁶ клеток на мл среды RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки. 5 мкг плазмиды, кодирующей GFP, разводили в 100 мкл физиологического буфера (PBS), и к ДНК добавляли при качании 5 мкг PADRE-дендримера в 50 мкл PBS. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре смесь (комплекс) GFP-плазмиды и PADRE-дендримера добавляли к РВМС. Через 24 часа после инкубации в СО₂-инкубаторе при 37°С и 5% СО₂, РВМС окрашивали антителами к CD19, меченными PE, и клетки анализировали с помощью проточной цитометрии. Экспрессия GFP наблюдалась у 43% клеток от общего количества РВМС, в то время как при введении фильтра только на В-клетки - 77% В-клеток экспрессировали GFP. В контрольных группах, где РВМС инкубировали с таким же соотношением дендримера и GFP-плазмиды, экспрессия GFP наблюдалась примерно в 11% и 7% клеток от общего количества РВМС или В-клеток. При сравнении с РВМС, находящимися только в среде, не наблюдалось значительного изменения выживаемости клеток. Этот эксперимент являлся типовым из нескольких экспериментов. Эти эксперименты демонстрируют i) доставку GFP-плазмиды в РВМС, и в частности, к клеткам, экспрессирующим МНС II класса (В-клеткам) и ii) экспрессию GFP РВМС, и в частности, В-клетками.

Пример 3 - Доставка пептидов/белков в мышиные DC in vivo и В-клетки человека in vitro

Осуществляли доставку PDD/альбумина-FITC в выделенные В-клетки человека (фиг.7). На фиг.8 показана направленная доставка в DC мыши с помощью PADRE-дендримера и ее эффективность in vivo и временная схема для инъекций и анализа лимфатических узлов. Результаты этого эксперимента показывают, что i) (фиг.7) альбумин-FITC, белок, смешанный с PADRE-дендримером, доставлялся в В-клетки человека меньше чем за 2 часа, ii) (фиг.8) на 5-й день после подкожной инъекции PADRE, эпитоп, конъюгированный с дендримером, доставлялся в В-клетки и DC лимфатического узла in vivo (для визуализации доставки комплекса в лимфатические узлы/В-клетки/DC были получены комплексы PADRE-дендримера с GFP плазмидой), iii) (фиг.9) на 5-й день после подкожной инъекции НА-хелперный эпитоп вируса гриппа, эпитоп, конъюгированный с дендримером, доставлялся в DC лимфатического узла in vivo (для визуализации доставки комплекса в DC лимфатического узла были получены комплексы PADRE-дендримера с GFP плазмидой). Данные были типичными для нескольких экспериментов, и в некоторых из них лимфатические узлы удаляли на 3-й день после подкожной инъекции PADRE-дендримера или HA-дендримера, каждый из которых находился в комплексе с GFP-плазмидой. Эти результаты представляют собой примеры доставки к АРС, включая В-клетки и DC, белка, конъюгированного с FITC, посредством визуализации FITC, а также доставки двух пептидов, PADRE- и HA-хелперных эпитопов, конъюгированных с дендримером, в которых GFP-плазмида находилась в комплексе с пептидом-дендримером для облегчения визуализации и анализа комплекса (комплекса соединенного с дендримером пептида с плазмидой, кодирующей GFP) в клетках лимфатических узлов. Специфичная in vitro и in vivo трансфекция DC была показана in vivo анализом с помощью проточной цитометрии направленной доставки к DC и их размножения в прилегающем лимфатическом узле через 5 дней после инъекции наночастиц (PADRE-дендримера/кодирующей GFP плазмиды) относительно контролей (экспрессия GFP 78% относительно ~7%). PADRE-производное дендримера (PDD) усиливает доставку, вследствие свойства PADRE усиливать опсонизацию, который с высокой аффинностью связывается с MHC II класса, экспрессируемыми на APC. Аналогичным образом, комплекс HA-дендримера (DRHA) и GFP-плазмиды доставлялся in vivo в соседние лимфатические узлы при подкожной инъекции (фиг.9). Следует отметить, что у мышей PADRE связывается с МНС II класса IAb (мыши C57BL) (фиг.8), в то время как выбранный НА-эпитоп связывается с МНС II класса IAd (мыши Balb/c) (фиг.9). Была показана возможность доставки in vivo на двух различных линиях мышей с двумя различными эпитопами с аналогичными результатами. Дополнительным in vitro доказательством доставки пептида к РАРС с помощью описанных в данном документе композиций являются АРС-направленная доставка, приводящая к экспрессии GFP, с помощью PADRE-дендримера/GFP-плазмиды в PBMC человека (фиг.6), выделенные B-клетки человека (фиг.6) и в спленоциты мышей C57BL, а также доставка PADRE-дендримера/дцРНК в В-клетки человека (фиг.10) и РВМС обезьяны (фиг.11). Поскольку применение двух различных направленных пептидов, чьим уникальным признаком является связывание с МНС II класса, работает, как показано в описанных в данном документе экспериментах, вакцины, способы и композиции, описанные в данном документе, охватывают все пептиды, связывающие МНС II класса. В экспериментах, приведенных на фиг.9, также был получен дендример, конъюгированный с НА-хелперным пептидом вируса гриппа (HDD). HDD можно использовать у мышей balb/c. При инъекциях в мышах HDD направленно связывается с DC в прилегающем лимфатическом узле.

Пример 4 - Доставка киРНК с помощью PADRE-дендримера в В-клетки человека и РВМС приматов (кроме человека) и доставка плазмиды с помощью PADRE-дендримера в РВМС приматов (кроме человека)

На фиг.10 показана направленная доставка PADRE-дендримеров в комплексе с дц-киРНК (контрольной киРНК) in vitro. 0,1 мкг дцРНК разводили в 100 мкл PBS, и к дцРНК, меченной Alexa Fluor, при интенсивном качании добавляли 0,7 мкг PADRE-дендримера в объеме 20 мкл. После 10-минутной инкубации при комнатной температуре комплекс добавляли к одному миллиону очищенных В-клеток (в среде RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки) в лунках 24-луночного планшета. Примерно через один час после инкубации в СО₂-инкубаторе при 37°С/5% СО₂ клетки промывали и помещали обратно в лунки (в 1 мл свежей среды RPMI с 10% фетальной бычьей сыворотки) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа в красном канале. Совмещенное изображение клеток в светлом поле и красном канале демонстрирует поглощение меченной Alexa Fluor дцРНК В-клетками человека (фиг.10). Клетки инкубировали в течение ночи в СО₂-инкубаторе при 37°С/5% СО₂, а затем их окрашивали антителами к CD19 (В-клеточному маркеру) и анализировали с помощью проточной цитометрии (фиг.10). Как показано на фиг.2, более 80% В-клеток были положительными по Alexa Fluor (метке дцРНК) относительно примерно 6% в контроле, комплексе дендримера с дцРНК-Alexa Fluor. Эти результаты ясно демонстрируют высокую эффективность доставки нуклеиновых кислот к PAPC с помощью PADRE-дендримера.

Было проведено тестирование на РВМС, один образец которых был получен от бабуина (Papio hamadryas), и два различных образца были получены от макака-крабоеда (Macaca fascicularis). Типичные изображения, полученные с помощью флуоресцентного микроскопа, показаны на фиг.11, были сделаны через 2 часа после добавления PADRE-дендримера или дендримера в комплексе с киРНК/Alexa Fluor. Аналогичным образом к РВМС добавляли PADRE-дендример или дендример в комплексе с GFP-плазмидой, и анализировали через 24 часа после инкубации (фиг.12). Результаты показывают, что менее чем через 2 часа PADRE-дендример доставлял нуклеиновые кислоты в РВМС обезьян, в то время как эффективность доставки с помощью дендримера была незначительной. Эти результаты позволяют утверждать с высокой вероятностью, что PADRE-дендример работает на клетках приматов (кроме человека).

Пример 5 - Сравнение PADRE-дендримерных наночастиц и платформы IN-CELL-ART™

Описанные в данном документе PADRE-дендримеры обеспечивают специфичную направленную доставку к РАРС в отличии от неспецифичной доставки с помощью IN-CELL-ART во все типы клеток. Платформа IN-CELL-ART™ включает 704 полимера, доставляющих ДНК в клетки с помощью электропорации, которые не имеют специфичной встроенной адъювантной активности или любого лиганда для связывания АРС. В настоящий момент, in vivo электропорация известна как лучший невирусный способ генетической иммунизации. Описанные в данном документе PADRE-дендримеры обеспечивают индукцию хелперных Т-клеток, которую не обеспечивает платформа IN-CELL-ART. В описанных выше экспериментах показана эффективность PADRE-дендримеров в терапевтической опухолевой модели, в то время как не была показана эффективность IN-CELL-ART в опухолевой модели in vivo. В описанных в данном документе экспериментах в качестве робастного контроля PADRE-дендримеры сравнивали с электропорацией in vivo (фиг.13). В отличие от этого для робастного контроля IN-CELL-ART было показано только сравнение с чистой ДНК. Однократную иммунизацию PADRE-дендримерами, описанными в настоящем в изобретении, сравнивали с электропорацией in vivo по индукции гуморального ответа. Для проведения этого эксперимента PADRE-дендримеры смешивали с 5 мкг плазмиды при комнатной температуре, и через 10 минут смесь вводили мышам с помощью подкожных инъекций. Мышей, иммунизированных PADRE-дендримерами, конъюгированными с кодирующей OVA плазмидой, и контрольных мышей заражали 50 тыс. клеток B16F10, экспрессирующих OVA на 28-й день после однократной вакцинации. Все мыши, которые получили PADRE-дендримеры, конъюгированные с плазмидой, были защищены на 25-й день после имплантации опухоли относительно 40% тех мышей, которые получили только плазмиду посредством электропорации in vitro, и 0% в контрольной группе, которая получила только ДНК. Приведенные на фиг.13 результаты показывают, что однократная ДНК-вакцинация PADRE-дендримером/плазмидой (DRP-ova) превосходит доставку с помощью in vivo электропорации (ЕР) плазмиды (EP-ova) в отношении индукции анти-ova гуморального ответа.

Пример 6 - PADRE-дендримеры индуцируют сильные гуморальные ответы у мышей

Как показано на фиг.14-16, PADRE-дендримеры в комплексе с плазмидой вызывают сильные гуморальные ответы у мышей.

Пример 7 - Ликвидация B16/OVA-опухолей при профилактическом применении вакцины, содержащей PADRE-дендример/OVA-плазмиду

6-недельные самки мышей C57BL в группах по 5 на клетку получали: i) ничего, ii) по 2 иммунизации по 20 мкг OVA-плазмиды посредством «in vivo электропорации» с использованием электропоратора Derma Vax, или iii) по две иммунизации PADRE-дендримером/OVA-плазмидой (по 20 мкг каждая). Иммунизации проводили с 2-недельным интервалом. Через десять дней после иммунизаций всем мышам подкожно вводили с помощью инъекций (имплантировали) 50000 опухолевых клеток B16/OVA в 100 мкл PBS в правый бок. Опухоли измеряли дважды в неделю, и еженедельные данные откладывали на графике, приведенном на фиг.18. Две вакцинации PADRE-дендримером с 20 мкг OVA-плазмиды привели к полному исчезновению опухолей B16/OVA у всех иммунизированных мышей, в то время как у 100% (в случае отсутствия воздействия) и у 60% (в случае вакцинации «in vivo электропорацией») мышей сохранялись опухоли. Всех мышей с опухолями крупнее 15% от веса тела забивали.

Другие варианты осуществления изобретения

Можно осуществлять любые улучшения (частично или полностью) композиций, наборов и стадий способов. Все ссылки, включая публикации, патентные заявки и патенты, цитируемые в данном документе, включены таким образом путем ссылки. Использование всех без исключения примеров или ссылок на примеры (например, «такой как»), используемых в данном документе, предназначено для пояснения изобретения и не накладывает ограничение на объем изобретения, если иное не указано в формуле изобретения. Например, хотя описанные в данном документе эксперименты включают ликвидацию меланом В16 и индукцию гуморальных ответов против антигенов GFP, OVA, PCARD, CCR5, vgPCR, muPAR, CathL или p2, вакцины, композиции и способы, описанные в данном документе, могут использоваться в ряде других терапевтических и профилактических применений, включая предупреждение возникновения или ликвидацию других дополнительных типов раковых заболеваний, и индукцию иммунного ответа и, следовательно, иммунитета против любого целевого антигена (например, антигенов из инфекционных патогенов). В другом примере, вакцины, композиции и способы, описанные в данном документе, можно использовать для доставки в клетку белка или пептида, который не является антигеном. В этом примере типичная композиция для доставки пептида или белка в клетку включает по меньшей мере один заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидом или белком, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и по меньшей мере один пептид или белок, конъюгированы с внешней поверхностью по меньшей мере одного заряженного высоко разветвленного полимерного дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с клеткой. Любое утверждение в данном документе относительно природы или эффектов изобретения или предпочтительных вариантов осуществления изобретения не подразумевает ограничения изобретения, и приложенная формула изобретения не должна считаться ограниченной такими утверждениями. В более общем смысле, никакие выражения в описании не должны истолковываться как указание на любой не заявленный элемент как необходимый для осуществления изобретения на практике. Это изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта изобретения, изложенного в приложенной к данному описанию формуле изобретения, которые позволяет действующее законодательство. Более того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных вариантах входит в объем изобретения, если в документе не указано иное, или если этому прямо не противоречит контекст.

Группа изобретений раскрывает вакцину, содержащую заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, представляющий собой РАМАМ-дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, где Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью РАМАМ-дендримера таким образом, что Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, РАМАМ-дендримера и нуклеиновой кислоты способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена, а также способ доставки антигена в организм млекопитающего и индукции в организме млекопитающего продукции моноклональных антител к антигену. Вакцины и способы, описанные в данном изобретении, имеют как профилактическое, так и лечебное применение. Описанную в данном документе вакцину можно использовать для индукции иммунного ответа против любого инфекционного патогена или ракового заболевания. 2 н. и 20 з.п. ф-лы, 18 ил., 7 пр.

1. Вакцина, содержащая заряженный высоко разветвленный полимерный дендример, представляющий собой РАМАМ-дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота конъюгированы с внешней поверхностью РАМАМ-дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, РАМАМ-дендримера и нуклеиновой кислоты способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного антигена.

2. Вакцина по п. 1, в которой РАМАМ-дендример связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой.

3. Вакцина по п. 1, дополнительно содержащая фармацевтически приемлемый носитель и эмульсию «вода в масле».

4. Вакцина по п. 1, в которой по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является эпитоп Pan-DR (PADRE).

5. Вакцина по п. 4, в которой по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом являются два PADRE-эпитопа, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

6. Вакцина по п. 1, в которой нуклеиновая кислота является экспрессионным вектором, а по меньшей мере один антиген является раковым антигеном или антигеном из инфекционного патогена.

7. Вакцина по п. 1, в которой по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является НА вируса гриппа.

8. Способ доставки антигена в организм млекопитающего и индукции в организме млекопитающего продукции моноклональных антител к антигену, причем способ включает стадии: введения млекопитающему композиции, содержащей заряженный сильно разветвленный полимерный дендример, представляющий собой РАМАМ-дендример, конъюгированный по меньшей мере с одним Т-хелперным пептидом и по меньшей мере с одним пептидным или полипептидным антигеном, или с нуклеиновой кислотой, кодирующей по меньшей мере один антиген, причем по меньшей мере один Т-хелперный пептид и нуклеиновая кислота, или по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген, конъюгированы с внешней поверхностью РАМАМ-дендримера таким образом, что по меньшей мере один Т-хелперный пептид специфично связывается с профессиональными антиген-представляющими клетками, и комбинация по меньшей мере одного Т-хелперного пептида, РАМАМ-дендримера и нуклеиновой кислоты или по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена способна индуцировать иммунный ответ против по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена, причем композицию вводят в количестве, эффективном для индукции опосредованной МНС II класса активации Т-хелперных клеток, а введение композиции млекопитающему приводит к продукции моноклональных антител по меньшей мере к одному пептидному или полипептидному антигену.

9. Способ по п. 8, в котором млекопитающее имеет раковое заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген является раковым антигеном, а композиция является противораковой вакциной.

10. Способ по п. 9, в котором введение композиции не вызывает местных побочных реакций у млекопитающего.

11. Способ по п. 8, в котором млекопитающее имеет инфекционное заболевание, по меньшей мере один пептидный или полипептидный антиген относится к инфекционному патогену, а композиция представляет собой вакцину против инфекционного патогена.

12. Способ по п. 11, в котором введение композиции не вызывает местных побочных реакций у млекопитающего.

13. Способ по п. 8, в котором по РАМАМ-дендример связан с полиинозиновой-полицитидиловой кислотой.

14. Способ по п. 8, в котором композиция дополнительно содержит фармацевтически приемлемый носитель.

15. Способ по п. 8, в котором композиция дополнительно содержит эмульсию «вода в масле».

16. Способ по п. 8, в котором по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является PADRE-эпитоп.

17. Способ по п. 16, в котором по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом являются два PADRE-эпитопа, каждый из которых имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1.

18. Способ по п. 8, в котором по меньшей мере одним Т-хелперным пептидом является НА вируса гриппа.

19. Способ по п. 8, в котором РАМАМ-дендример дополнительно конъюгирован со вторым пептидным или полипептидным антигеном, который отличается от по меньшей мере одного пептидного или полипептидного антигена.

20. Способ по п. 8, в котором млекопитающим является грызун или кролик, и моноклональные антитела выделяют из млекопитающего.

21. Способ по п. 20, в котором моноклональные антитела получают с использованием следующих стадий: выделения антител из млекопитающего, титрования антител, удаления селезенки из млекопитающего и проведения слияния с миеломой.

22. Способ по п. 21, в котором антитела гуманизированы.