СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ ТОКСИЧЕСКОЙ ГЕПАТОПАТИИ Российский патент 2012 года по МПК G09B23/28 A61K31/4045 A61P1/16 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной биологии, экологии, токсикологии и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности кобальта, на функциональное состояние печени.

Являясь одним из многочисленных микроэлементов, кобальт относится к группе химических веществ, необходимых для нормального осуществления процессов жизнедеятельности целостного организма. Однако при избыточном поступлении в организм кобальт приводит к формированию токсических эффектов, что характеризуется увеличением апоптоза, активацией процессов перекисного окисления липидов, приводящих к формированию окислительного стресса и повреждению мембранных структур. Основными путями экскреции поступившего в организм кобальта являются печень и почки, этим и объясняется выраженность повреждений этих органов мишеней в условиях кобальтового отравления [Орджоникидзе Э.К., Рощин А.В. / Кобальт - токсичность, биологический контроль. Гигиена труда и проф. заболевания. - 1991. - № 12. - С. 1-4].

Постоянное увеличение концентрации кобальта в окружающей среде приводит к прогрессирующему ухудшению экологической обстановки, что делает актуальной проблему поиска эффективных средств профилактики токсического влияния кобальта на организм человека.

Известно множество детоксикантов, способных снижать токсические эффекты тяжелых металлов при чрезмерном поступлении их в организм. К ним относятся тиоловые соединения - тиосульфат натрия, унитиол, тетацин кальций, различные комплексообразующие соединения - пентацин, динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, дефероксамин и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства: в 2 томах. Т.2. - Харьков, «Торсинг», 1998. С.212-220]. Однако длительное применение этих препаратов способно вызвать различные побочные эффекты: расстройства деятельности ЖКТ, аллергические реакции, изменение количества форменных элементов крови, острый некроз проксимальных канальцев нефронов и др. Также наряду с токсинами они повышают экскрецию из организма важных микроэлементов, таких как: железо, кальций, цинк и др., и вызывают тем самым нарушения обменных процессов, что препятствует их длительному профилактическому применению.

В качестве профилактического средства в условиях хронической кобальтовой интоксикации нами был выбран синтетический аналог гормона эпифиза - Мелаксен. Мелаксен оказывает выраженное адаптогенное действие, снижает стрессовые реакции, оказывает иммуностимулирующее действие, регулирует нейроэндокринные функции. Наличие у Мелаксена выраженного мембранопротекторного свойства обусловлено его мощным антиоксидантным действием [Лилица Г.А., Заславская P.M., Калинина Е.В. Эффективность метаболических препаратов в комплексом лечении пожилых больных постинфарктным кардиосклерозом и недостаточностью кровообращения / Клиническая медицина. - 2005. - №3. - С.54-57; Попов С.С. Клиническая эффективность мелатонина и его воздействие на свободнорадикальный гомеостаз при токсическом поражении печени. Автореферат диссертации на соискание ученой степени к.м.н. - Воронеж, 2008].

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической токсической гепатопатии у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное снижение токсического действия кобальта при хроническом отравлении у экспериментальных животных путём снижения повреждающего действия кобальта на клетки печени.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической токсической гепатопатии отличается тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 10 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг, в пересчете на металл.

Ежедневное профилактическое введение мелаксена через зонд в желудок в дозе 10 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора хлорида кобальта приводит к снижению проявлений хронической токсической гепатопатии. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической токсической гепатопатии, отличающегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 10 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической токсической гепатопатии, путем снижения токсического действия тяжелого металла при хроническом отравлении, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом.

Для получения токсического вещества хлорид кобальта растворяют в стерильной дистиллированной воде таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2 мг кобальта, в пересчете на металл. На каждые 100 г веса крысы вводят 0,1 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор мелаксена приготавливают таким образом, что на каждую единицу раствора, равную 2 мл, приходится 10 мг мелаксена. Раствор мелаксена готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением. Раствор хлорида кобальта вводят через атравматичный зонд в желудок в дозировке 2 мг/кг, ежедневно 1 раз в сутки в течение 30 дней двум группам животных (№1 и №2). Одновременно с первого дня введения хлорида кобальта группе №2 каждый день внутрижелудочно вводят мелаксен в дозировке 10 мг/кг через атравматичный зонд.

По истечении времени эксперимента (30 дней) исследовали функциональное состояние печени, что включало определение активности в плазе крови аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), определение содержания холестерина, концентрации общего и прямого билирубина, анализ активности щелочной фосфатазы. Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. Определение активности каталазы в плазме крови производилось с целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ). По истечении срока эксперимента крысы забивались с использованием тиопентала натрия. Для гистологических исследований образцы тканей (печень) фиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего подвергали заливке в парафин с последующим приготовлением срезов толщиной 7-8 микрон. Срезы окрашивались гематоксилином и эозином. Изучение срезов проводилось в проходящем свете при помощи микроскопа Микмед-1 под увеличением 80×200×400.

Сущность способа подтверждается морфологически. Фиг.1 иллюстрирует морфологические признаки гепатопатии. При гистологическом исследовании печени у экспериментальных животных, получавших внутрижелудочное введение хлорида кобальта, выявлялись: выраженная гидропическая (а), белковая (б) и жировая дистрофии гепатоцитов с явлениями фокального некроза (кариопикноз, кариорексис) (в), значительные клеточные инфильтраты вблизи полнокровных центральных сосудов, отечная строма, отдельный некроз гепатоцитов с нарушением балочной структуры (г), определялось также диффузное геморрагическое пропитывание ткани печени.

На Фиг. 2 при морфологическом исследовании почек в группе №2 гистологическая картина характеризовалась наличием менее выраженных дистрофических изменений (а) с отсутствием очагов некроза паренхимы печени.

Пример. Двум группам крыс-самцов линии Вистар массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг каждый день в течение 30 дней. Одновременно, с первого дня введения хлорида кобальта, группе №2 каждый день внутрижелудочно вводился мелаксен в дозировке 10 мг/кг. Через 30 дней исследовали функциональное состояние печени и активность систем ПОЛ-АОЗ, что включало в себя определение: активности в плазме крови аланинаминотрансферазы (АЛТ), аспартатаминотрансферазы (ACT), содержания холестерина, концентрации общего и прямого билирубина, активности щелочной фосфатазы, концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах, уровня гидроперекисей в плазме крови и активности каталазы в плазме крови.

Определение активности трансаминаз проводилось с помощью биохимического диагностического набора фирмы «LaChema» по методу Райтмана-Френкеля, по специальной формуле (соотношение активности аспартатаминотрансферазы и аланинаминотрансферазы) рассчитывали коэффициент де Ритиса. Определение содержания холестерина в плазме крови проводилось с помощью диагностического биохимического набора фирмы «Витал Диагностикс СПб» энзиматическим колориметрическим методом. Определение концентрации общего и прямого билирубина проводилось с помощью диагностического биохимического набора фирмы «Витал Диагностикс СПб» по методу Маллой-Эвелина. Для исследования активности щелочной фосфатазы использовали биохимический набор фирмы «LaChema». Все биохимические анализы проводились с использованием автоматического биохимического анализатора ChemWell (США). Определение активности каталазы в эритроцитах проводили спектрофотометрически по методу Е.Beutler. Определение концентрации гидроперекисей проводили спектрофотометрически по методу Гаврилова В.Б. Определение концентрации малонового диальдегида в эритроцитах проводили спектрофотометрически по методу Камышникова B.C. Результаты всех серий опытов обработаны статистически с применением критерия «t» Стьюдента на ПЭВМ Pentium-4 с использованием программы Prizma 4.0.

Результаты исследования показали, что у крыс с внутрижелудочным введением хлорида кобальта происходило достоверное повышение концентрации общего билирубина, относительно фоновых значений, тогда как концентрация прямого билирубина не имела достоверных отличий от показателей интактного контроля. Внутрижелудочное введение хлорида кобальта приводило к достоверному снижению активности как щелочной фосфатазы (ЩФ), так и аспартатаминотрансферазы относительно значений интактного контроля. Внутрижелудочное введение хлорида кобальта приводило к повреждению гепатоцитов, что подтверждалось повышением активности аланинаминотрансферазы и как следствие снижением коэффициента де Ритиса относительно фоновых значений, что свидетельствует о поражении печени (Табл.1).

Профилактическое введение мелаксена в условиях хронической интоксикации хлоридом кобальта способствовало снижению концентрации общего билирубина относительно значений группы животных, изолированно получавших хлорид кобальта, тогда как концентрация прямого билирубина не имела достоверных отличий. Активность щелочной фосфатазы и аспартатаминотрансферазы в группе животных, получавших профилактическое введение мелаксена, была достоверно выше значений 1 группы животных, но оставалась ниже значений интактного контроля. Профилактическое введение мелаксена практически нивелировало повреждающее действие хлорида кобальта на ткань печени, что подтверждалось снижением активности аланинаминотрансферазы и как следствие снижением коэффициента де Ритиса относительно значений группы животных, изолированно получавших хлорид кобальта (Табл.1).

Таблица 2 Активность каталазы, концентрация малонового диальдегида (МДА) и гидроперекисей у экспериментальных животных на фоне хронической интоксикации хлорида кобальта Условия опыта Стат. показат. МДА (мкмоль/л) Гидроперекиси (мкмоль/л) Каталаза (МЕ/гНb) Фон М±m 70,97±2,96 2,16±0,15 382,2±7,313 CoCl₂ в/ж (месяц) (группа №1) М±m 86,37±1,252 3,69±0,146 313±6,267 p *) *) *) CoCl₂ в/ж (30 дней) + Мелаксен в/ж (30 дней) М±m 79,79±0,77 2,53±0,15 350,1±8,931 p *)**) **) ***) Примечание: (*) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с фоном; (**) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с группой №1; (***) - достоверное (р≤0,001) изменение по сравнению с группой №1.

Снижение активности каталазы в эритроцитах у животных, внутрижелудочно получавших хлорид кобальта (группа №1), сочеталось с увеличением концентрации МДА в эритроцитах и повышением уровня гидроперекисей в плазме крови относительно фоновых значений, что свидетельствует об активации процессов липопероксидации (Табл.2).

Профилактическое применение мелаксена способствовало повышению уровня активности каталазы в эритроцитах с одновременным снижением концентрации МДА в эритроцитах и уровня гидроперекисей в плазме крови, что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии мелаксена в условиях хронической кобальтовой интоксикации.

Таким образом, из вышеизложенного следует, что профилактическое применение мелаксена в условиях хронической кобальтовой интоксикации является эффективным способом профилактики хронической токсической гепатопатии.

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной биологии, экологии и токсикологии, и может быть использовано при исследовании методов профилактики хронического токсического действия тяжелых металлов, в частности кобальта, на функциональное состояние печени. Для профилактики хронической токсической гепатопатии животным в эксперименте вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 10 мг/кг через зонд в желудок. При этом одновременно ежедневно осуществляют внутрижелудочное введение раствора хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг, в пересчете на металл, для создания в организме кобальтовой интоксикации. Способ обеспечивает эффективную профилактику кобальтовой гепатопатии в условиях выбранных режимов моделирования патологии и введения мелаксена. 2 табл., 2 ил., 1 пр.

Способ профилактики хронической токсической гепатопатии, отличающийся тем, что экспериментальным животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 10 мг/кг через зонд в желудок одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида кобальта в дозе 2 мг/кг, в пересчете на металл.