СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ СУЛЕМОВОЙ КОАГУЛОПАТИИ У КРЫС В ЭКСПЕРИМЕНТЕ Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 A61K31/4045 A61P7/02 

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных при длительном воздействии ртути на организм.

Ртуть по степени воздействия на организм человека относится к 1-му классу опасности (ГОСТ 12.1.007.) В условиях современного состояния окружающей среды при поступлении в организм ртути токсическое воздействие затрагивает практически все органы и системы (Raj D., Maiti S. Sources, Toxicity, and Remediation of Mercury: An Essence Review. Environ. Monit. Assess. 2019; 191 doi: 10.1007/s10661-019-7743-2). Показано, что длительное воздействие ртути даже в дозах близких к ПДК приводит к увеличению образования активных форм кислорода и развитию окислительного стресса, вызывает структурно-функциональные нарушения биологических мембран, эндотелиальную дисфункцию, повышает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний, патологии почек. Является перспективным разработка методов профилактики хронического воздействия ртути на организм, с использованием средств, вызывающих подавление окислительного стресса.

Показано, что у рабочих, длительно контактирующих с соединениями ртути на производстве, выявляются изменения в системе гемостаза гиперкоагуляционой направленности (Wierzbicki, R., Prazanowski, М., Michalska, М., Krajewska, U. and Mielicki, W.P. Disorders in blood coagulation in humans occupation ally exposed to mercuric vapors. J. Trace Elem. Exp. Med., 2002, 15, 21-29. https://doi.org/10.1002/itra.1055.; Song YG. Effects of chronic mercury poisoning on blood coagulation and fibrinolysis systems. // Zhonghualaodongweishengzhiyebingzazhi (Chinese journal of industrial hygiene and occupational diseases) vol. 2005, 23,6: 405-7.). Токсическое действие Hg наформенные элементы и эндотелиальные клетки подробно исследовалось в ряде работ (Kostka B, Krajewska U, Rieske P. Platelet activation by mercuric compounds. Platelets. 1997;8(6):413-7. doi: 10.1080/09537109777104. PMID: 16793676). Экспериментально было показано повышение тромбопластической активности форменных элементов крови под влиянием ионов ртути. Методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии показано увеличение экспрессии фосфатидилсерина на наружной поверхности мембран (Maseko P.B, van Rooy M., Taute H. Wholebloodultra structuralalterationsbymercury, nickelandmanganesealoneandincombination: Anexvivoinvestigation // Toxicologyandindustrialhealth, 2021, 37(2), 98-111. https://doi.org/10.1177/0748233720983114).

Система гемостаза является важным эволюционно сложившимся защитным механизмом организма, включающим эндотелий, плазменные протеазы, тромбин, фактор ХПа. Компоненты системы свертывания связаны с работой протеолитических систем: фибринолитической, калликреин-кининовой, комплемента и др. (Петрищев Н.Н. Папаян Л.П. Гемостаз. Физиологические механизмы, принципы диагностики основных форм геморрагических заболеваний. Санкт-Петербург; 1999. 120 с.). Известно, что практически любые стрессорные воздействия отражаются на функциональной активности системы гемокоагуляции, чаще повышая ее (Момот А.П., Цывкина Л.П., Тараненко И.А. Современные методы распознавания тромботической готовности, Барнаул, Изд-во Алт. ун-та, 2011, pp. 138.). Актуальным является изучение взаимосвязи состояния системы гемостаза с развитием соматической патологии, которая в современных условиях экологии, при возрастающей токсической нагрузке на организм интенсивно продолжает расти (Raj D., Maiti S. Sources, 2019). Современные схемы лечения хронических болезней включают коррекцию системы гемостаза. Вместе с тем применение антикоагулянтов даже вне патологии почек зачастую может приводить к развитию антикоагулянт-ассоциированной нефропатии (Kalaitzidis R.G., Duni A., Liapis G. Anticoagulant-relatednephropathy: acasereportandreviewoftheliteratureofanincreasinglyrecognizedentity. IntUrolNephrol. 2017; 49: 1401-7.).

Ранее было показано, что применение гормона шишковидной железы мелатонина является эффективным при лекарственно индуцированной нефропатии (RazaZ, NaureenZ. Melatoninamelioratesthedruginducednephrotoxicity: Molecularinsights. Nefrologia (EnglEd). 2020;40(1): 12-25. doi:10.1016/j.nefro.2019.06.009), a также способствует восстановлению мочеобразовательной функции почек при токсическом воздействии хлорида ртути (Митциев А.К, Брин В.Б., Митциев К.Г. Профилактика мелатонином нефротоксических эффектов хлорида ртути в эксперименте // Вестник новых медицинских технологий. Электронное издание, 2012, (1), 56.). Вместе с тем, возможность профилактического применения мелатонина с целью коррекции системы гемостаза при токсической сулемовой интоксикации не изучалась.

Известен способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных (Способ профилактики хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных, Гаглоева Э.М., Брин В.Б. RU0002683723) при внутрижелудочном введении хлорида никеля в дозе 5 мг/кг одновременно с антиоксидантом мелаксеном в дозе 5 мг/кг в течение двух месяцев.

Недостатком данного способа является то, что с его помощью невозможна разработка способа профилактики сулемовой коагулопатии, так как в данной работе не рассматривалось профилактическое влияние мелатонина на свертывающую систему крови при длительном воздействии хлорида ртути на организм экспериментальных животных.

Разные металлы и даже соединения одного и того же металла могут иметь преимущественные органы - «мишени» повреждающего воздействия. Особенностью воздействия органических соединений ртути, как липофильных соединений является нейротоксическое, а неорганические соединения ртути в основном оказывают нефротоксическое воздействие. Показано, что ртуть может увеличивать тромбопластическую активность форменных элементов, увеличивая активность системы гемостаза. Таким образом, эффективность данного способа при никелевой коагулопатии (никельнеобходимый для живых организмов микроэлемент) не доказывает возможность профилактического использования антиоксиданта при развитии сулемовой коагулопатии(ртуть относится к первому классу опасных токсикантов).

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ профилактики коагулопатии у животных при свинцовой интоксикации с помощью витаминов-антиоксидантов (А.Ш. Бышевский, С.Л. Галян, И.В. Ральченко и др. Влияние комбинации витаминов-антиоксидантов на гемостаз при экспериментальной гипероксидации // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2005, 68(3), 34-36). Экспериментальным животным вводили с рационом препарат Компливит в дозе 1,8 мг/кг в сутки (по витамину А). Избыток витамина А на фоне влияния свинца (в дозе 0,5 мг/кг в течение 15 дней с потребляемой пищей) ослабляет сдвиги показателей системы гемостаза, вызванные металлом, сдерживает активацию тромбоцитов и вызывает снижение уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови.

Недостатками прототипа является:

сложность определения количество свинцапоступающего в организм на единицу массы тела животного с пищей;

сложно определить количество витамина, поступающего с пищей в организм на единицу массы тела животного;

избыточное количество витамина А может вызывать побочные эффекты;

опыты в течение двух недель не позволяет получить способ профилактики хронической коагулопатии.

В течение двух месяцев при хроническом эксперименте возможно более подробное изучение механизмов профилактического действия антиоксиданта на формирование нарушений звеньев системы гемостаза при токсическом воздействии ртути в разные сроки в динамике, что наиболее важное значение имеет в коагулологии.

В качестве средства профилактики коагулопатии при хронической сулемовой интоксикации мы использовали синтетический аналог гормона эпифиза мелатонина Мелаксен. Мелатонин обладает широким спектром фармакологических эффектов - антистрессовым, антитоксическим, десенсибилизирующим, противовоспалительным, антиоксидантным действием, выраженным адаптогенным и др. (Арушунян Э.Б., 2014). В отличие от применяемых в гематологии препаратов (антиагрегантов, антикоагулянтов и др.), имеющих однонаправленное действие, мелатонин является эффективным модулятором и проявляет уникальную способность к оптимизации физиологических процессов в организме, которые могут усиливаться мелатонином на фоне исходно сниженных показателей, но ограничивается их рост в случае чрезмерной активации (Арушанян Э.Б., 2014; Vacas M.I., 1991).

В доступной литературе сведений о применении мелатонина с целью профилактики нарушений системы гемостаза при хронической сулемовой коагулопатии мы не обнаружили.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики хронической токсической коагулопатии, вызванной длительным введением хлорида ртути в эксперименте у крыс.

Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение патологических сдвигов показателей системы гемостаза при хронической ртутной интоксикации у экспериментальных животных и сопровождается уменьшением интенсивности процессов перекисного окисления липидов.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической сулемовой коагулопатии у экспериментальных животных, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла, отличается тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл.

Ежедневное профилактическое введение мелатонина через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора хлорида ртути приводит к уменьшению патологических сдвигов показателей плазменного и клеточного гемостаза, уменьшение содержания маркеров внутрисосудистого свертывания крови, активности антикоагулянтного и фибринолитического звеньев системы гемостаза, за счет уменьшения цитотоксичности ртути, выраженного мембранопротекторного и антиоксидантного действия мелатонина. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым. По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической сулемовой коагулопатии, отличающегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение 60 дней одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической сулемовой коагулопатии, путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации, восстановления активности антиоксидантной системы, препятствуя патологической активации системы гемостаза и восстановления противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшения уровня маркеров тромбинемии при хроническом воздействии ртути, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость».

Данный способ осуществляется следующим образом. Для получения токсического вещества хлорид ртути растворяют в дистиллированной воде таким образом, что в единице раствора, равной 0,3 мл, содержится 0,05 мг ртути (в пересчете на металл). На каждые 100 г веса крысы вводят 0,3 мл токсического раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм экспериментального животного. Раствор мелатонина готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением, для чего в дистиллированной воде растворяют таблетки Мелаксена таким образом, что на единицу раствора, равную 1 мл, приходится 2 мг мелатонина.

Двум группам животных (по 10 особей) вводят раствор хлорида ртути в дозе 0,5 мг/ кг через атравматичный зонд в желудок ежедневно 1 раз в сутки в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения хлорида ртути одной из групп каждый день вводят раствор мелаксена в дозе 5 мг/кг через внутрижелудочный зонд.

Материалом для исследования является цельная кровь, а также богатая и бедная тромбоцитами плазма крови. Забор крови, стабилизация и получение образцов плазмы осуществляются с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. Патология гемостаза. Принципы и алгоритмы клинико-лабораторной диагностики, СПб.: Формат, 2006, 208 с).

Исследуются показатели состояния системы гемостаза и процессов перекисного окисления липидов. В пробах плазмы крови определяются следующие показатели: агрегационную активность тромбоцитов (индуктор АДФ - 10,0 мкг/мл) (Баркаган, З.С., Момот А.П., 2008), АЧТВ-активированное частичное тромбопластиновое время по Caen et al. (1968); ПВ - протромбиновое время по Quick (1935); ВПФМ - относительное время полимеризации фибрин-мономеров, Ф-ген - содержание фибриногена в плазме по Clauss (1961); активность протеина С; АТ(III) - активность антитромбина III в плазме крови по В.А. Макарову и соавт. (2002); СЭЛ - время спонтанного эуглобулинового лизиса; РФМК - количество растворимых фибрин-мономерных комплексов (Елыкомов В.А., Момот А.П. Способ определения количества растворимого комплекса фибрин-мономера в плазме крови/ Авторское свидетельство 1371219, 1987, СССР);

Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. С целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ) определяют активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах.

Опыты у крыс с введением антиоксиданта Мелаксена и хлорида ртути демонстрируют эффективность его применения с целью профилактики хронической сулемовой коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, снижает уровень тромбинемии благодаря выраженной антиоксидантной активности в условиях хронической сулемовой интоксикации.

Пример конкретного выполнения. Опыты проводились на 30 крысах самцах линии Wistar массой 300-350 г. Раствор хлорида ртути вводили через зонд в желудок в дозе 0,5 мг/кг параллельно с внутрижелудочным введением раствора мелатонина (препарат Мелаксен) в дозе 5 мг/кг в течение двух месяцев. По окончании сроков экспериментов у крыс исследовали показатели сосудисто-тромбоцитарного и плазменного гемостаза, а также активность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Определяли: агрегацию тромбоцитов (индуктор - ADP, 10,0 мкг/мл); активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ); протромбиновое время (ПВ); время полимеризации фибрин-мономеров (ВПФМ), фибриноген; антитромбин III (AT III); протеин С; время спонтанного эуглобулинового лизиса (СЭЛ), концентрацию растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) (4,1) (диагностические наборы «Технология стандарт» (Россия), агрегометр «АР2110», турбидиметрический коагулометр «CGL-2110» Solar (Беларусь). Для оценки интенсивности процессов ПОЛ определяли: малоновый диальдегид (МДА) в эритроцитах, гидроперекиси (ГП) (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) в плазме крови, активность каталазы (спектрофотометр «PV1251C», Solar (Беларусь).

При проведении опытов на животных руководствовались правилами лабораторной практики в РФ (приказ МЗ РФ от 01.04.2016 г. №199).

Статистический анализ результатов проводили с помощью программ Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.) и Microsoft Excel 2010. Данные представлены в виде медианы (Me) и интерквартильного размаха (Q25÷Q75). Для оценки достоверности различий вычисляли непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Уровнень статистической значимости р≤0,05.

Проведенные нами эксперименты у крыс с внутрижелудочным введением хлорида ртути в начальные сроки экспериментов выявили развитие прокоагулянтных тенденций с одновременной активацией противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза (Таблица 1.). У крыс через две недели интоксикации увеличивалась степень АДФ-индуцированной агрегации и концентрация фибриногена. Выявлялось укорочение протромбинового времени. Возрастала активность протеина С и антитромбина III. У крыс с профилактическим введением мелатноина сохранялась гиперкоагуляционная направленность процессов системы гемостаза, вместе с тем мелатонин препятствовал изменениям скорости образования протромбиназы, но напряжение в механизмах противосвертывающей системы сохранялось. Сохранялось увеличение уровня фибриногена в плазме крови и степени АДФ агрегации тромбоцитов. Протромбиновое время восстанавливалось до уровня контроля, наблюдалось увеличение активности протеина С, но активность антитромбина была достоверно ниже данных у опыта с ртутью, и не отличалась от уровня интактных животных.

Через один месяц происходило увеличение скорости образования протромбиназы как по внешнему, так и по внутреннему пути. Увеличивалась концентрация фибриногена, количество тромоцитов и степень их агрегации. Выявлялось укорочение ПВ, АЧТВ, времени спонтанного эуглобулинового лизиса и увеличение активности протеина С.Активность антитромбина от контроля не отличалась, но была ниже, чем у животных через две недели эксперимента. Внутрижелудочное введение мелатонина через один месяц способствовало уменьшению степени гемостатических сдвигов. У животных с введением мелаксена через один месяц выявлялось повышение активности системы гемостаза, но изменения были менее выраженные чем у крыс на фоне ртутной интоксикации. Количество тромбоцитов уменьшалось относительно данных с изолированным введением металла, и не отличалось от контроля. Длительность АЧТВ и ПВ достоверно не менялось. Время СЭЛ укорачивалось, но изменения были менее выражены чем у группы с введением ртути. Содержание фибриногена достоверно выше контроля, но его уровень был меньше, чем у крыс с введением ртути.

Данные проведенных экспериментов через два месяца введения хлорида ртути очевидно демонстрируют нарастание гемостатического потенциала. Выявлялось увеличение степени АДФ агрегации тромбоцитов, но их количество снижалось по сравнению с данными через один месяц и не отличалось достоверно от контроля. Удлинялось протромбиновое время. Время полимеризации фибринмономеров укорачивалось. Концентрация фибриногена уменьшалась достоверно относительно опыта через один месяц, достигая контрольных значений. Вместе с тем происходила депрессия противосвертывающих и фибринолитических механизмов. Активность антитромбина уменьшалась, время спонтанного эуглобулинового лизиса удлинялось. Развивалась тромбинемия, содержание растворимых фибринмономерных комплексов достоверно возрастало.

Профилактическое введение мелатонина в течение двух месяцев способствовало появлению признаков стабилизации гемостазиологической картины и снижение вероятности развития состояния тромботической готовности, описанного у крыс с изолированным введением ртути. Об этом свидетельствовало уменьшение выраженности изменений РФМК, восстановление активности физиологических антикоагулянтов и фибринолиза (Таблица 1). На фоне тромбоцитопении увеличивалась агрегационная активность тромбоцитов, но изменения были также менее выражены, чем у крыс при сулемовой интокскации.

В современной литературе широко представлена информация о взаимосвязи активности процессов свертывания крови, тромбинемии с повышением содержания продуктов ПОЛ в плазме крови, эритроцитах, лейкоцитах и тромбоцитах. По данным Бышевского А.Ш. (2006) связь между липопероксидацией и гемостазом реализуется преимущественно на уровне первой и второй фаз свертывания крови, при этом в осуществлении этой связи тромбоциты участвуют тем активнее, чем выше в них концентрация липопероксидов.

Введение ртути вызывало увеличением концентрации малоновогодиальдегида в эритроцитах (р≤0,01) и повышения уровня гидроперекисей в плазме крови (р≤0,05 и р≤0,01) (8). Вместе с тем выявлялось снижением активности супероксиддисмутазы (р≤0,01) и каталазы (р≤0,05), что связано с истощением ферментативной активности антиоксидантов.

Профилактическое применение естественного антиоксиданта мелаксена способствовало повышению уровня активности каталазы в эритроцитах (р≤0,01) с одновременным снижением концентрации МДА (р≤0,01) и восстановлением уровня гидроперекисей в плазме крови (р≤0,05 и р≤0,01), что свидетельствует о выраженном антиоксидантном действии мелаксена в условиях хронической ртутной интоксикации.

Корреляционный анализ результатов проведенных экспериментов выявил достоверные связи положительной динамики гемостазиологических показателей с восстановлением активности процессов ПОЛ у крыс на фоне профилактического введения мелатонина. Выявлялась значимая корреляционная связь восстановления активности антитромбина и времени спонтанного эуглобулинового лизиса с восстановлением активности каталазы (р≤0,05 и -р≤0,05) и супероксиддисмутазы (р≤0,01 и р≤0,05). Также выявлялась статистическая связь уменьшения активности МДА с уменьшением концентрации растворимых фибринмономерных комплексов (р≤0,01) через два месяца под влиянием антиоксиданта.

Таким образом, профилактическое применение антиоксиданта мелатонина препятствует патологической активации системы гемостаза, способствует восстановлению противосвертывающего и фибринолитического потенциала крови, уменьшает концентрацию маркеров тромбинемии путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации и восстановления активности антиоксидантных ферментов при длительном воздействии ртути.

Полученные данные могут стать экспериментальным основанием для изучения возможности применения мелатонина с целью разработки способов профилактики и лечения сулемовой коагулопатии с использованием мелаксена у населения, проживающего в районах экологически неблагополучных по загрязнению ртути.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к токсикологии и экологии, может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений хронической токсической коагулопатии у экспериментальных животных при длительном воздействии ртути на организм. Способ включает ежедневное введение антиоксиданта и хлорида ртути. В качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг. Раствор хлорида ртути вводят в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл. Способ обеспечивает уменьшение патологических сдвигов показателей системы гемостаза и интенсивности процессов перекисного окисления липидов. 2 табл., 1 пр.

Способ профилактики хронической сулемовой коагулопатии у крыс в эксперименте, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента в течение двух месяцев вводят через зонд в желудок мелаксен в дозе 5 мг/кг и раствор хлорида ртути в дозе 0,5 мг/кг в пересчете на металл.