СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ХРОНИЧЕСКОЙ МОЛИБДЕНОВОЙ КОАГУЛОПАТИИ Российский патент 2020 года по МПК G09B23/28 A61K31/4045 A61P7/02 

Изобретение относится к экологии, медицине, токсикологии, экспериментальной биологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики молибденовой коагулопатии при длительном поступлении металла в организм.

Молибден является важным микроэлементом, необходимым для нормального осуществления процессов жизнедеятельности. Вместе с тем, длительное поступление молибдена в организм может приводить к избыточному накоплению тяжелого металла в органах и тканях человека и полиорганным структурно-функциональным нарушениям (Авцин А.П. 1991). Показано, что молибденовая интоксикация сопровождается активацией перекисного окисления липидов, формированием окислительного стресса и повреждением мембранных структур (Брин В.Б. и др. 2014). Многочисленные экспериментальные и клинические исследования позволяют считать, что при любых патологических процессах в организме одной из первых реагирует функциональная система свертывания крови, меняя параметры своего функционирования (Goodwin С.А., Wheeler-Jones СР., Namiranian S. 1995). Актуальной является проблема создания и разработки эффективных способов профилактики хронической интоксикации молибденом и его соединениями (Реутова Н.В. 2007., Pandey R., Kumar R., Singh S., Srivastava S. 2002).

Нами была поставлена задача - изучить профилактическое влияние синтетического аналога гормона эпифиза мелатонина Мелаксена на проявление коагулопатии, вызванной длительным введением парамолибдата аммония в эксперименте у крыс.

Ранее было показано, что использование мелатонина перспективно с целью профилактики патологических сдвигов показателей морфофункционального состояния почек, печени и сердца при воздействии некоторых тяжелых металлов у крыс в эксперименте (Митциев А.К., Брин В.Б., 2017). Выявлена эффективность применения мелатонина с целью профилактики токсической коагулопатии, вызванной длительным введением раствора хлорида никеля в дозе 5 мг/кг у белых крыс (RU 2683723 С1 2018 г). Показано, что применение мелатонина способствует профилактике изменений системы гемостаза (Гаглоева Э.М., Брин В.Б. RU 2706386 С1) при внутрижелудочном введении ацетата свинца в дозе 40 мг/кг массы тела. Однако в приведенных источниках ничего не говорится о возможности профилактического применения мелатонина при воздействии молибдена на систему гемостаза. Различные соединения тяжелых металлов оказывают различный органотропный эффект, имеют преимущественные органы - «мишени» повреждения. Особенностью влияния свинца на организм является цитотоксическое воздействие, разрушение эритроцитов, увеличение тромбопластической активности форменных элементов. Нарушения гемостаза начинаются с токсического влияния на мембраны тромбоцитов, что может приводить к изменению адгезивной и агрегационной активности тромбоцитов, освобождению индукторов агрегациии и вторичной активации коагуляционного гемостаза. При этом важную роль в механизмах активации системы гемостаза играют эритроцитарные, лейкоцитарные факторы гемокоагуляции и гемолиз (Подолян С.К., 1998, Бышевский А.Ш. и др., 2005). Таким образом, эффективность данного способа при воздействии свинца (вещества из первого класса опасных токсикантов) не доказывает возможность использования с целью профилактики антиоксиданта при развитии молибденовой коагулопатии (молибден необходимый для живых организмов микроэлемент).

Наиболее близким к предполагаемому изобретению является способ (Бышевский А.Ш. и соавт. Гемостаз при отсутствии, дефиците и избытке кобаламина у крыс, содержащихся на сбалансированном пищевом рационе // Известия Самарского научного центра РАН. 2009. Т. 11. №1(4). С.752-757), заключающийся в том, что животным с рационом питания вводят препарат витамин В12 в дозе 1 мкг/кг в сутки одновременно с ежедневным введением с пищей ацетата свинца в дозе 50 мг/кг в течение восьми недель. Антиоксидант кобаламин ослабляет сдвиги показателей системы гемостаза, вызванные свинцом, способствуя снижению уровня маркеров внутрисосудистого свертывания крови (ПДФ, РФМК, факторов Р3 и Р4, D-димеров,), модифицирует липопероксидацию в тромбоцитах, сдерживая их активацию. Недостатками данного способа являются: - сложность определения количества свинца вводимого в организм с пищей на единицу массы тела животного; - сложность определения количества витамина В12, вводимого с пищей на единицу массы тела животного; - избыточное количество антиоксиданта витамина В12, в качестве профилактического средства может оказывать побочные влияния.

В доступной литературе сведений о возможности профилактики изменений системы гемостаза при молибденовой коагулопатии с использованием мелатонина мы не обнаружили.

Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в разработке способа профилактики молибденовой коагулопатии у экспериментальных животных.

Решение этой задачи обеспечивает значительное уменьшение сдвигов показателей свертывающей системы крови при длительном воздействии молибдена у экспериментальных животных, что сопровождается уменьшением интенсивности липопероксидации.

Для достижения этого технического результата заявляемый способ профилактики хронической молибденовой коагулопатии у экспериментальных животных при хроническом отравлении характеризуется ежедневным введением антиоксиданта и прокоагулянта, при этом животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора парамолибдата аммония в дозе 50 мг/кг, в пересчете на металл.

Ежедневное профилактическое введение мелаксена через зонд в желудок в дозе 5 мг/кг одновременно с внутрижелудочным введением раствора парамолибдата аммония приводит к уменьшению патологических сдвигов показателей системы гемостаза, препятствует развитию тромбинемии за счет уменьшения цитотоксичности молибдена, мембранопротекторного и антиоксидантного действия мелатонина. Заявленный способ является эффективным, экономически выгодным и легко воспроизводимым.

По имеющимся у авторов сведениям совокупность существенных признаков, характеризующих сущность заявляемого изобретения, не известна, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «новизна».

По мнению авторов, сущность заявляемого изобретения не следует для специалистов явным образом из известного уровня медицины, так как из него не выявляется вышеуказанная возможность получения способа профилактики хронической молибденовой коагулопатии, характеризующегося тем, что животным вводят мелаксен один раз в сутки в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок в течение двух месяцев одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением раствора парамолибдата аммония в дозе 50 мг/кг, в пересчете на металл, что позволяет сделать вывод о соответствии критерию «изобретательский уровень».

Совокупность существенных признаков, характеризующих сущность изобретения, в принципе может быть многократно использована в медицине с получением результата, заключающегося в эффективном и легко воспроизводимом способе профилактики хронической молибденовой коагулопатии, путем уменьшения интенсивности процессов липопероксидации, восстановления ферментов антиоксидантной защиты, восстановления активности противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза, уменьшения уровня тромбинемии при длительном введении молибдена в организм крыс, что позволяет сделать вывод о соответствии изобретения критерию «промышленная применимость». Данный способ осуществляется следующим образом: для приготовления раствора соли молибдена в дистиллированной воде растворяют парамолибдат аммония таким образом, что на единицу раствора, равную 0,3 мл, приходится 5 мг молибдена, в пересчете на металл. На каждые 100 г массы крысы вводят 0,3 мл раствора, что не является чрезмерной водной нагрузкой на организм крыс. Раствор мелатонина готовят ежедневно перед внутрижелудочным введением, для чего в дистиллированной воде растворяют таблетки Мелаксена таким образом, что на единицу раствора, равную 0,2 мл, приходится 0,5 мг мелатонина.

Двум группам животных (по 10 особей) вводят раствор парамолибдата аммония через атравматичный внутрижелудочный зонд в дозе 50 мг/кг ежедневно в течение 60 дней. Одновременно с первого дня введения парамолибдата аммония одной из опытных групп каждый день вводят раствор мелаксена в дозе 5 мг/кг через зонд в желудок.

Исследуются показатели состояния системы гемостаза и процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ). Определяется количество тромбоцитов и их агрегационная активность, содержание фибриногена, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ), относительное время полимеризации фибрин-мономера (ВПФМ) для оценки состояния конечного этапа свертывания крови определяют (Момот А.П., 2009). По активности антитромбина (АТIII) судят о состоянии противосвертывающей системы, по времени спонтанного эуглобулинового лизиса исследуется состояние фибринолитического звена, по концентрации растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) и Д-димеров судят об уровне тромбинемии.

Об интенсивности процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) судят по концентрации малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах и уровню гидроперекисей в плазме крови. С целью оценки эффективности антиоксидантной защиты (АОЗ) определяют активность супероксиддисмутазы и каталазы в эритроцитах.

Результаты исследования у крыс с сочетанным введением антиоксиданта Мелаксена и парамолибдата аммония демонстрируют эффективность его применения с целью профилактики хронической молибденовой коагулопатии. Мелатонин способствует уменьшению выраженности изменений клеточного и плазменного гемостаза, восстанавливает активность противосвертывающей и фибринолитической систем, уменьшает уровень тромбинемии благодаря выраженной антиоксидантной активности при длительном воздействии молибдена.

Пример конкретного выполнения. Двум опытным группам белых крыс-самцов массой 200-300 г вводили через атравматичный зонд в желудок раствор парамолибдата аммония в дозе 50 мг/кг каждый день в течение двух месяцев. Опытной группе №2 с первого дня введения соли молибдена, каждый день интрагастрально вводился мелаксен в дозе 5 мг/кг. Контрольные животные содержались в стандартных условиях вивария (Контроль №1 - 10 крыс).

Исследовали показатели клеточного и плазменного гемостаза, состояние противосвертывающего и фибринолитического звеньев системы гемостаза, активность процессов перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. Материалом для исследования являлась цельная кровь, а также плазма крови, богатая и бедная тромбоцитами. Стабилизацию и получение образцов плазмы крови осуществляли с учетом международных стандартов по клинической лабораторной диагностике для исследований в области гемостаза (Момот А.П. и др., 2011).

Для оценки состояния системы гемостаза определяли агрегационную активность тромбоцитов турбидиметрическим методом (индуктор аденозиндифосфат -10,0 мкг/мл). Содержание фибриногена определяли по методу Клаусса; активированное частичное тромбопластиновое время; протромбиновое время, относительное время полимеризации фибрин-мономера (Момот А.П. и др., 2011), активность антитромбина III; время спонтанного эуглобулинового лизиса; концентрацию растворимых фибринмономерных комплексов определяли с использованием стандартных методик с применением диагностических наборов фирмы «Технология стандарт» (Россия). Тесты выполнялись на спектрофотометре «Solar-300», турбидиметрическом коагулометре «CGL-2110» Solar, агрегометре АР 2110 Solar (Беларусь). Уровень D-димеров определяли набором реактивов «INNOVANCE D-dimer", Siemens.

Для оценки интенсивности процессов липопероксидации (ПОЛ) и антиоксидантного потенциала (АОЗ) определяли: содержание малонового диальдегида (МДА) в эритроцитах (Asakawa Т., 1980), гидроперекиси (ГП) (диеновые конъюгаты и диеновые кетоны) в плазме крови (с исп.феррицианида калия), активность супероксиддисмутазы (СОД), активность каталазы в эритроцитах по методу Е. Beutler.

Статистический анализ проводили с помощью пакета программ Microsoft Excel и Statistica 10.0 (StatSoft, Inc.). Исходя из того, что наблюдаемые признаки не все подчинялись нормальному распределению, данные исследований представлены в виде (Me [25-75%]), где Me - медиана в выборочной совокупности, [25-75%] - 25-й и 75-й процентиль. Достоверность полученных результатов оценивали при помощи U-критерия Манна-Уитни. Для оценки статистической зависимости двух рядов наблюдений использовали коэффициент ранговой корреляции (r_s) Спирмена. Различия считались достоверными при вероятности ошибки р<0,05. Проведенные исследования показали, что внутрижелудочное введение парамолибдата аммония в дозе 50 мг/кг массы тела способствовало развитию молибденовой коагулопатии (Таблица 1). Молибденовая коагулопатия характеризовалась уменыпеним количества тромбоцитов и увеличением их агрегационной функции. Концентрация фибриногена была выше контроля. Регистрировалось укорочение АЧТВ и удлинение ПВ, ТВ достоверно не менялось, вместе с тем выявлялось укорочение более чувствительного маркера состояния конечного этапа гемокоагуляции (ВПФМ) времени полимеризации фибрин мономеров. Регистрировалось уменьшение активности АТ(Ш) и замедление времени спонтанного эуглобулинового лизиса. Достоверный рост концентрации РФМК и Д-димеров (Таблица 1) свидетельствует о наличии тромбинемии. Очевидно, что данные проведенных экспериментов демонстрируют развитие состояния тромботической готовности, определяемое Момотом и соавт. (2011) как лабораторно выявляемую гиперкоагуляцию с возрастанием содержания в крови маркеров активации гемостаза, подавлением антикоагулянтной и фибринолитической активности. Гиперкоагуляционный синдром характеризуется состоянием повышенной готовности циркулирующей крови к свертыванию, при этом не выявляться тромбообразования в сосудистом русле, но может наблюдаться ряд клинических признаков предтромботического состояния в виде повышения вязкости крови, замедления венозного кровотока, преходящих и начальных признаков органной дисфункции. Об этом может свидетельствовать развитие дистрофических и некробиотических изменений в тканях печени, почек и сердца при токсическом воздействии молибдена, что было показано ранее (Брин В.Б. и др. 2012).

Опыты показали, что изолированное внутрижелудочное введение препарата мелатонина - Мелаксен в течение двух месяцев не вызывало изменений показателей свертывающей системы крови у животных. Наблюдалась лишь незначительная тенденция к уменьшению количества тромбоцитов, степень АДФ индуцированной агрегации относительно интактного контроля не изменялась.

Внутрижелудочное введение мелатонина на фоне введения молибдена способствует стабилизации гемостазиологической картины. Выявлялось смещение гемостатического потенциала в сторону гиперкоагуляции, вместе с тем происходило восстановление активности антикоагулянтной и фибринолитической систем. Таким образом мелатонин способствовует уменьшению вероятности развития состояния тромботической готовности, о чем свидетельствовало уменьшение выраженности изменений РФМК и Д-димеров (Таблица 1). Степень АДФ-агрегации возрастала, количество тромбоцитов снижалось, но изменения были менее выражены. Содержание фибриногена статистически не отличалась от показателей у крыс с хронической интоксикацией, но и от показателей у интактных крыс достоверно не отличалось.

Внутрижелудочное введение антиоксиданта мелаксена вызывало повышение уровня активности каталазы в эритроцитах (р<0,05), уменьшение концентрации малонового диальдегида (р<0,001) и восстановление уровня гидроперекисей (р<0,01 и р<0,01) в плазме крови. При анализе полученных экспериментальных данных установлены корреляционные связи положительной динамики показателей системы гемостаза и восстановления активности процессов ПОЛ. Выявлялась достоверная положительная корреляционная связь восстановления активности каталазы с повышением активности антитромбина III (r_s=0,64; P<0,05), а также высокая степень обратной корреляции со временем спонтанного эуглобулинового лизиса (r_s=0,57; P<0,05). Тесно положительно были ассоциированы изменения концентрации Д-димеров и сдвиги МДА (r_s=0,65; Р<0,05) через два месяца под влиянием антиоксиданта мелатонина.

Таким образом, профилактическое применение мелатонина уменьшает выраженность изменений показателей сосудисто-тромбоцитарного и коагуляционного гемостаза, восстанавливает активность противосвертывающей и фибринолитической систем крови и уровня тромбинемии, способствуя восстановлению гемостатического баланса. Результаты исследования позволяют рекомендовать применение мелатонина для разработки способов коррекции нарушений гемостаза при воздействии на организм соединений молибдена.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, экологии и токсикологии и может быть использовано для экспериментальной разработки методов профилактики и патогенетической коррекции проявлений хронической молибденовой коагулопатии у экспериментальных животных при длительном воздействии парамолибдата аммония. Способ профилактики хронической молибденовой коагулопатии у экспериментальных животных включает ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла в течение двух месяцев, при этом в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента вводят через зонд в желудок 0,2 мл раствора, содержащего 0,5 мг мелатонина на каждые 100 г веса, одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением 0,3 мл раствора парамолибдата аммония, содержащего 5 мг молибдена. Изобретение обеспечивает значительное уменьшение сдвигов показателей свертывающей системы крови при длительном воздействии молибдена у экспериментальных животных. 2 табл., 1 пр.

Способ профилактики хронической молибденовой коагулопатии у экспериментальных животных, включающий ежедневное введение антиоксиданта и тяжелого металла в течение двух месяцев, отличающийся тем, что в качестве антиоксиданта животным с первого дня эксперимента вводят через зонд в желудок 0,2 мл раствора, содержащего 0,5 мг мелатонина на каждые 100 г веса, одновременно с ежедневным внутрижелудочным введением 0,3 мл раствора парамолибдата аммония, содержащего 5 мг молибдена.