МИКРОСПЕКТРАЛЬНЫЙ СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ФАРМАКОТЕРАПИИ В РАННИЕ СРОКИ ЛЕЧЕНИЯ КЛЕБСИЕЛЛЕЗА ПТИЦ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМИ ПРЕПАРАТАМИ Российский патент 2014 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к области ветеринарии и предназначено для определения степени эффективности фармакотерапии в ранние сроки лечения клебсиеллеза птиц.

Серьезную угрозу для птицеводческих хозяйств до настоящего времени представляет острая желудочно-кишечная форма клебсиеллеза, которая вызывает массовый падеж птиц и приводит к значительным экономическим потерям. Их гибель наступает, как правило, в ранние сроки заболевания несмотря на использование для его лечения широкого спектра антибактериальных средств, поскольку возбудители клебсиеллеза обладают высокой устойчивостью к большинству широко применяемых в ветеринарной практике лекарственных препаратов. Важным фактором, определяющим выбор необходимого лекарственного средства, является оценка эффективности фармакотерапии, сделанная на ранних этапах лечения заболевания. Поскольку возбудители клебсиеллеза воздействуют на клетки внутренних органов и в первую очередь железистого желудка, в них развиваются глубокие патологические метаболические процессы, сопровождающиеся нарушением внутриклеточного обмена органических веществ, в основном белков и нуклеиновых кислот. Данные органические вещества обеспечивают процессы организации функциональных механизмов защиты клеток от воздействия на них различных неблагоприятных факторов, включая и возбудителей клебсиеллеза, поэтому внутриклеточные изменения количественного содержания белков и нуклеиновых кислот, возникающие при лечении заболевания антибактериальными препаратами, служат одним из основных показателей эффективности фармакотерапии. Различные лекарственные препараты по-разному влияют на снижение патогенности возбудителей заболевания, что отражается на интенсивности восстановления внутриклеточного обмена органических веществ, в том числе количественного содержания в клетках белков и нуклеиновых кислот. При этом эффективность фармакотерапии определяется степенью внутриклеточных изменений количественного содержания данных органических веществ.

Известен способ оценки эффективности фармакотерапии антибактериальными препаратами, заключающийся в определении процента падежа голов птиц в разные периоды лечения клебсиеллеза (О.П. Ольховик. Клебсиеллез бройлеров. - Канд. дисс. вет. наук. - Краснодар, 2009, с.85, таблица 18).

Недостатком данного способа является невозможность оценки эффективности фармакотерапии антибактериальными препаратами в ранние сроки лечения данного заболевания, так как процент падежа голов птиц устанавливается не ранее, чем на 14-й день (1-й период) от начала лечения.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ методом люминесцентного спектрального анализа с помощью определения соотношения белков и нуклеиновых кислот в гистологических срезах биологических объектов (В.Н. Карнаухов. Люминесцентный спектральный анализ клетки. М.: Наука, теоретическая и прикладная биофизика. - 1978, с.93-97). Способ включает двухволновый метод люминесцентного спектрального анализа клеток головного мозга крысы при изучении гистологических срезов, окрашенных специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, с регистрацией в спектре люминесценции двух полос излучения при длинах волн 527 и 610 нм, характерных для белков и нуклеиновых кислот соответственно.

Недостатком такого способа является невозможность определения состояния внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке птиц с оценкой эффективности фармакотерапии в ранние сроки антибактериального лечения клебсиеллеза, так как способ-прототип

- устанавливает в спектре люминесценции полосы излучения при длинах волн 527 и 610 нм, характерных для белков и нуклеиновых кислот ткани головного мозга крысы, но не отражает спектральные особенности люминесценции ткани железистого желудка птиц;

- не позволяет определять количественное содержание органических веществ (белков и нуклеиновых кислот) в ткани железистого желудка птиц;

- не исключает влияния индивидуальных особенностей функционального состояния клеток, присущих биологическим объектам, в том числе железистому желудку, и заключающихся в неравнозначном содержании в них белков и нуклеиновых кислот на разных участках определенных структур.

Техническим результатом изобретения является повышение точности диагностики состояния внутриклеточного обмена органических веществ (белков и нуклеиновых кислот) в железистом желудке птиц, позволяющего оценивать эффективность фармакотерапии клебсиеллеза в ранние сроки лечения антибактериальными препаратами, посредством учета спектральных особенностей люминесценции исследуемой ткани, определения количественного содержания в ней белков и нуклеиновых кислот и исключения влияния индивидуальных особенностей функционального состояния ее клеток.

Технический результат достигается тем, что микроспектральный способ оценки эффективности фармакотерапии в первые 7 суток лечения клебсиеллеза птиц антибактериальными препаратами включает двухволновый метод люминесцентного спектрального анализа при изучении гистологических срезов, окрашенных специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, в котором согласно изобретению проводят исследование гистологических срезов ткани железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют пять участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и спектр оптической плотности и проводят их цифровую обработку: в спектре люминесценции регистрируют величину интенсивности люминесценции полосы излучения при длине волны, характерной для белков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 528 нм, и при длине волны, характерной для нуклеиновых кислот зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 624 нм, в спектре оптической плотности регистрируют величину оптической плотности при длине волны 648 нм, которую используют в качестве толщины фотометрируемого участка, затем в каждом участке определяют количество белков по формуле $$B=\frac{I_b}{D\times Э}$$ и нуклеиновых кислот по формуле $$N=\frac{I_n}{D\times Э}$$ , где B - количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, I_b - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 528 нм, N - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 624 нм, D - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины; Э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, затем вычисляют среднее значение количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах из пяти полученных по каждому из них результату, по которым, в свою очередь, рассчитывают показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы путем вычитания из среднего значения количества белков в условных единицах контрольной здоровой птицы среднего значения количества белков в условных единицах обследуемой птицы, а также рассчитывают показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы путем вычитания из среднего значения количества нуклеиновых кислот в условных единицах контрольной здоровой птицы среднего значения количества нуклеиновых кислот в условных единицах обследуемой птицы и при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков более 0,95 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот более 0,87 устанавливают низкую эффективность фармакотерапии обследуемой птицы, при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков 0,95-0,25 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот 0,87-0,21 - среднюю эффективность фармакотерапии обследуемой птицы, а при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков менее 0,25 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот менее 0,21 - высокую эффективность фармакотерапии обследуемой птицы.

Технический результат достигается тем, что среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

;

где B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

B_n - общее количество белков в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Технический результат достигается тем, что среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

;

где N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

N_n - общее количество нуклеиновых кислот в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Технический результат достигается тем, что показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы рассчитывают по формуле:

K_b=B_c-B_zc;

где K_b - показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы;

B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;

B_zc - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.

Технический результат достигается тем, что показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы рассчитывают по формуле:

K_n=N_c-N_zc

где K_n - показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы;

N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;

N_zc - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.

На фигуре 1 показана кривая спектра люминесценции зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки гистологического среза, изготовленного из ткани железистого желудка контрольной здоровой птицы и окрашенного специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, где I - величина интенсивности люминесценции, I_b - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество белков, I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество нуклеиновых кислот. На фигуре 2 показана кривая спектра люминесценции зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки гистологического среза, изготовленного из ткани железистого желудка обследуемой птицы и окрашенного специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, где I - величина интенсивности люминесценции, I_zb - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество белков, I_zn - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, отражающая количество нуклеиновых кислот.

Способ осуществляют следующим образом. Для оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке обследуемой птицы, которое позволяет судить об эффективности фармакотерапии в ранние сроки (в первые пять суток) лечения клебсиеллеза антибактериальными препаратами, следует установить средние значения количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки в гистологическом срезе железистого желудка контрольной здоровой птицы соответствующей породы и возрастной категории; полученные при этом результаты используют в дальнейшей работе. Для этого в гистологическом срезе железистого желудка контрольной здоровой птицы, окрашенном специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, определяют зону эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при помощи, например, микроскопа-спектрофотометра МСФУ-К, в которой методом визуальной микроскопии находят пять участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции. В каждом участке зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки получают спектр люминесценции и спектр оптической плотности и проводят их цифровую обработку. Концентрация (количество) каждого из двух органических веществ, изучаемых с помощью двухволнового метода люминесцентного спектрального анализа, определяется величинами интенсивности люминесценции (I) каждой полосы излучения в спектре люминесценции гистологического среза, окрашенного двумя специфическими люминесцентными метками-красителями, при длинах волн, соответствующих максимальным величинам интенсивности люминесценции примененных красителей. При использовании в качестве меток-красителей дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеина-1, количественно связывающегося с белком, и этидиума бромида, количественно связывающегося с нуклеиновыми кислотами, в спектре люминесценции определяют две полосы излучения, которые соответствуют концентрации (количеству) белков и нуклеиновых кислот в исследуемом объекте. При окрашивании гистологических срезов железистого желудка птиц метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида в спектре люминесценции зоны эпителия глубоких альвеолярных желез его слизистой оболочки максимальные величины интенсивности люминесценции регистрируются при длинах волн - 528 нм, которая соответствует концентрации белков, и 624 нм, которая соответствует концентрации нуклеиновых кислот. Поэтому количество белков и нуклеиновых кислот определяют по величине интенсивности люминесценции полос излучения при указанных длинах волн. Данные спектральные особенности люминесценции ткани железистого желудка птиц установлены автором изобретения при исследовании спектров люминесценции зоны эпителия глубоких альвеолярных желез его слизистой оболочки. Вместе с тем величина интенсивности люминесценции зависит не только от количества содержащихся в исследуемом участке органических веществ, но и от толщины фотометрируемого участка гистологического среза, которая является неравномерной, и от параметров режима работы, при котором регистрируют спектры люминесценции. Поэтому для получения сопоставимых результатов количественного содержания белков и нуклеиновых кислот оно должно быть выражено в условных единицах, что достигается с помощью учета толщины фотометрируемого участка и эталона. В качестве толщины фотометрируемого участка используют величину оптической плотности, которая находится в прямой пропорциональной зависимости от толщины поглощающего слоя, при длине волны, равной 648 нм. Данная длина волны установлена автором изобретения при исследовании спектров оптической плотности фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез. В качестве эталона используют величину интенсивности люминесценции при длине волны 548 нм промышленно изготавливаемого и имеющего постоянный спектр люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм.

Количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

;

где B - количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_b - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 528 нм;

D - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины;

Э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, используемая в качестве эталона.

Количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

;

где N - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 624 нм;

D - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины;

Э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, используемая в качестве эталона.

Учитывая, что биологические объекты имеют индивидуальные особенности функционального состояния клеток, расположенных на разных участках определенных структурных зон, обусловленного неравнозначным количественным содержанием в них органических веществ, для получения объективной картины необходимо определение среднего значения нескольких показателей содержания органических веществ, полученных с различных участков зоны определенной структуры при прочих равных условиях. Поэтому для исключения влияния индивидуальных особенностей функционального состояния клеток на объективное отражение количественного содержания белков и нуклеиновых кислот в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки принимают во внимание среднее значение от общего количества данных органических веществ из пяти полученных результатов. В связи с этим среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

;

где B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

B_n - общее количество белков в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:

,

где N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

N_n - общее количество нуклеиновых кислот в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Полученные средние значения количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы используют для получения показателей состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот и оценки эффективности фармакотерапии обследуемой птицы.

Аналогичным способом с гистологического среза ткани железистого желудка обследуемой птицы, окрашенного специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеинм-1 и этидиумом бромида, получают спектр люминесценции и спектр оптической плотности в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и проводят их цифровую обработку следующим образом.

На спектре оптической плотности устанавливают величину D_z при длине волны 648 нм («D_z» подставляют в формулу вместо «D»).

Рассчитывают количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, каждое из которых устанавливают по формуле $$B=\frac{I_b}{D\times Э}$$ (где «B_z» подставляют в формулу вместо «B», «I_zb» - вместо «I_b», «D_z» - вместо «D», «Э_z» - вместо «Э») при помощи следующих величин:

B_z - количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_zb - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 528 нм;

D_z - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины;

Э_z - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, используемая в качестве эталона.

Устанавливают среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле (где «B_zc» подставляют в формулу вместо «B_c», «B_zn» - вместо «B_n») при помощи следующих величин:

B_zc - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

B_zn - общее количество белков в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Рассчитывают количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, каждое из которых устанавливают по формуле при помощи следующих величин (где «N_z» подставляют в формулу вместо «N», «I_zn» - вместо «I_n», «D_z» - вместо «D», «Э_z» - вместо «Э»):

N_z - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 624 нм;

D_z - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины;

Э_z - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, используемая в качестве эталона.

Устанавливают среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки по формуле при помощи следующих величин (где «N_zc» подставляют в формулу вместо «N_c», «N_zn» - вместо «N_n»):

где N_zc - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

N_zn - общее количество нуклеиновых кислот в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;

n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

Определяют показатель показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы по формуле K_b=B_c-B_z при помощи следующих величин:

K_b - показатель степени нарушения внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы;

B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителии глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;

B_zc - среднее значение количества белков в условных единицах в эпителии глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.

Определяют показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы по формуле K_n=N_c-N_z при помощи следующих величин:

K_n - показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы;

N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;

N_z - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.

По полученным показателям состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот в железистом желудке контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы оценивают эффективность фармакотерапии обследуемой птицы.

Исходя из вышеизложенного предлагаем следующую классификацию эффективности фармакотерапии на ранних этапах лечения клебсиеллеза птиц антибактериальными препаратами по показателям состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка (таблица 1).

Данный способ позволяет надежно определить состояние внутриклеточного обмена органических веществ (белков и нуклеиновых кислот) в стенке железистого желудка птиц, больных клебсиеллезом, в ранние сроки (в первые пять суток) антибактериальной терапии с учетом спектральных особенностей люминесценции ткани, количественного содержания в ней белков и нуклеиновых кислот и исключения влияния индивидуальных особенностей функционального состояния ее клеток. При этом обязательным является условие, согласно которому гистологические срезы должны быть получены при одинаковых условиях их изготовления, а все спектры люминесценции и оптической плотности фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, а также уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм - при одинаковых параметрах режима работы.

Предложенный способ проиллюстрирован на следующем экспериментально-клиническом примере: при проведении опыта использовали группу (80 голов) цыплят породы Хайсекс коричневый, заражение которых проводили per os (в ротовую полость) на вторые сутки жизни смывами культуры Klebsiella pneumoniae, при этом использовали полевой штамм. Лечение цыплят проводили лекарственным средством «Энрофлон» в соответствии с инструкцией к препарату путем дачи в разведении с водой.

Для определения состояния внутриклеточного обмена органических веществ в ткани железистого желудка обследуемой птицы отбирали по одному цыпленку из группы зараженных птиц. Микроспектральное исследование гистологических срезов железистого желудка цыплят проводили по следующей схеме: до начала лечения: появления клинических признаков заболевания на пятые сутки после заражения и в процессе лечения: в течение первых, вторых, четвертых, пятых и седьмых суток (таблица 2).

При оценке эффективности фармакотерапии клебсиеллеза птиц при лечении антибактериальным препаратом «Энрофлон» учитывали показатели состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной птицы данной породы Хайсекс коричневый и соответствующей возрастной категории.

Из таблицы видно, что до лечения средние значения количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы были низкими, а показатели состояния внутриклеточного обмена данных органических веществ этой зоны (белков>0,95, нуклеиновых кислот>0,87) имели высокие значения. В процессе лечения внутриклеточные обменные процессы постепенно восстанавливались, средние значения количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки повышались, и, как следствие, уменьшались показатели состояния внутриклеточного обмена данных органических веществ. Уже в период со вторых по пятые сутки лечения выявленные показатели состояния внутриклеточного обмена белков (0,77-0,29) и нуклеиновых кислот (0,68-0,24) указывали на среднюю эффективность фармакотерапии клебсиеллеза, а на седьмые сутки лечения эти показатели составили 0,22 для белков и 0,19 для нуклеиновых кислот, что согласно предложенной классификации свидетельствует о восстановлении внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке обследуемых птиц и соответственно о высокой эффективности фармакотерапии клебсиеллеза птиц при лечении антибактеральным препаратом «Энрофлон». Предлагаемый микроспектральный способ позволил выявить показатели состояния внутриклеточного обмена органических веществ (белков и нуклеиновых кислот) в железистом желудке больных клебсиеллезом птиц и проследить динамику его значений в процессе лечения данного заболевания антибактериальным препаратом «Энрофлон». Это, в свою очередь, позволило оценить эффективность фармакотерапии уже в ранние сроки лечения клебсиеллеза и своевременно решить вопрос о целесообразности дальнейшего применения этого лекарственного средства.

Таким образом, предложенный микроспектральный способ оценки состояния внутриклеточного обмена органических веществ в железистом желудке птиц при ранних сроках антибактериальной терапии клебсиеллеза позволяет повысить точность диагностики состояния внутриклеточного обмена органических веществ (белков и нуклеиновых кислот) посредством учета спектральных особенностей люминесценции исследуемой ткани, определения количественного содержания в ней белков и нуклеиновых кислот и исключения влияния индивидуальных особенностей функционального состояния ее клеток.

Изобретение относится к ветеринарии и может быть использовано для оценки эффективности фармакотерапии в первые 7 суток лечения клебсиеллеза птиц антибактериальными препаратами. Для чего методом двухволнового люминесцентного спектрального анализа изучают гистологические срезы ткани железистого желудка птиц, окрашенных специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида. При этом проводят исследование гистологических срезов ткани железистого желудка здоровой и обследуемой птицы. На каждом гистологическом срезе определяют зону эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют пять участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции. Получают спектр люминесценции и спектр оптической плотности каждого участка. Проводят их цифровую обработку: в спектре люминесценции регистрируют величину интенсивности люминесценции при длине волны, характерной для белков 528 нм, и при длине волны, 624 нм, характерной для нуклеиновых кислот. В спектре оптической плотности регистрируют величину оптической плотности при длине волны 648 нм, которую используют в качестве толщины фотометрируемого участка, затем в каждом участке определяют количество белков по формуле $$B=\frac{I_b}{D\times Э}$$ и нуклеиновых кислот по формуле $$N=\frac{I_n}{D\times Э}$$ , где B - количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия, Ib - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия при длине волны 528 нм, N - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия, In - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка, D - величина оптической плотности фотометрируемого участка; Э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла. Затем вычисляют среднее значение количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах. Рассчитывают показатели состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы. И при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков более 0,95 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот более 0,87 устанавливают низкую эффективность фармакотерапии. При значениях показателей состояния внутриклеточного обмена белков 0,95-0,25 и нуклеиновых кислот 0,87-0,21 - среднюю эффективность фармакотерапии. При значениях показателей состояния внутриклеточного обмена белков менее 0,25 и нуклеиновых кислот менее 0,21 - высокую эффективность фармакотерапии обследуемой птицы. Способ позволяет повысить точность диагностики состояния внутриклеточного обмена белков и нуклеиновых кислот в железистом желудке птиц. 2 табл., 2 ил.

1. Микроспектральный способ оценки эффективности фармакотерапии в первые 7 суток лечения клебсиеллеза птиц антибактериальными препаратами, включающий двухволновый метод люминесцентного спектрального анализа при изучении гистологических срезов, окрашенных специфическими люминесцентными метками-красителями дихлор-симм-триазиниламинофлуоресцеином-1 и этидиумом бромида, отличающийся тем, что проводят исследование гистологических срезов ткани железистого желудка контрольной здоровой птицы и обследуемой птицы, на каждом гистологическом срезе с помощью визуальной микроскопии определяют зону эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, в которой выделяют пять участков с наибольшей степенью интенсивности люминесценции, с каждого участка получают спектр люминесценции и спектр оптической плотности и проводят их цифровую обработку: в спектре люминесценции регистрируют величину интенсивности люминесценции полосы излучения при длине волны, характерной для белков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 528 нм, и при длине волны, характерной для нуклеиновых кислот зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки и равной 624 нм, в спектре оптической плотности регистрируют величину оптической плотности при длине волны 648 нм, которую используют в качестве толщины фотометрируемого участка, затем в каждом участке определяют количество белков по формуле $$B=\frac{I_b}{D\times Э}$$ и нуклеиновых кислот по формуле $$N=\frac{I_n}{D\times Э}$$ , где B - количество белков в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, I_b - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 528 нм, N - количество нуклеиновых кислот в условных единицах в каждом из пяти участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки, I_n - величина интенсивности люминесценции исследуемого участка зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки при длине волны 624 нм, D - величина оптической плотности фотометрируемого участка при длине волны 648 нм, используемая в качестве его толщины; Э - величина интенсивности люминесценции уранового стекла ЖС-19 толщиной ~1,5 мм при длине волны 548 нм, затем вычисляют среднее значение количества белков и нуклеиновых кислот в условных единицах из пяти полученных по каждому из них результату, по которым, в свою очередь, рассчитывают показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы путем вычитания из среднего значения количества белков в условных единицах контрольной здоровой птицы среднего значения количества белков в условных единицах обследуемой птицы, а также рассчитывают показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы путем вычитания из среднего значения количества нуклеиновых кислот в условных единицах контрольной здоровой птицы среднего значения количества нуклеиновых кислот в условных единицах обследуемой птицы и при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков более 0,95 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот более 0,87 устанавливают низкую эффективность фармакотерапии обследуемой птицы, при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков 0,95-0,25 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот 0,87-0,21 - среднюю эффективность фармакотерапии обследуемой птицы, а при значениях показателя состояния внутриклеточного обмена белков менее 0,25 и показателя состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот менее 0,21 - высокую эффективность фармакотерапии обследуемой птицы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:
;
где B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
B_n - общее количество белков в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки рассчитывают по формуле:
;
где N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
N_n - общее количество нуклеиновых кислот в условных единицах всех фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки;
n - количество фотометрируемых участков зоны эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы рассчитывают по формуле:
K_b=B_c-B_zc;
где K_b - показатель состояния внутриклеточного обмена белков в железистом желудке обследуемой птицы;
B_c - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;
B_zc - среднее значение количества белков в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы рассчитывают по формуле:
K_n=N_c-N_zc
где K_n - показатель состояния внутриклеточного обмена нуклеиновых кислот в железистом желудке обследуемой птицы;
N_c - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка контрольной здоровой птицы;
N_zc - среднее значение количества нуклеиновых кислот в условных единицах в зоне эпителия глубоких альвеолярных желез слизистой оболочки железистого желудка обследуемой птицы.