Способ анализа гистологических микропрепаратов Советский патент 1992 года по МПК G01N21/76 A61B5/00 

Изобретение относится к медицине, в частности к способу определения количественного содержания органического вещества л юм и нес центн о-ми крое коническим методом, и может быть использовано в биологии, медицине и судебной медицине для исследования гистологических микропрепаратов мягких тканей биологического происхождения.

Известен способ изучения гистологических микропрепаратов для дифференциальной диагностики кровоподтеков и трупных пятен по характерной картине различного

распределения крови в посмертно измененной трупной коже.

Недостатком этого способа является невозможность определения в гистологических микропрепаратах кожи количественного содержания органического вещества в области кровоизлияний с учетом влияния аутолитического процесса, развивающегося посмертно в биологических объектах, что в совокупности делает невозможной дифференциальную диагностику прижизненно и посмертно возникающих в коже кровоподтеков

2 ю

2

Наиболее близким по технической с ущности к заявляемому является способ определения содержания нуклеиновых кислот люминесцентно-микроскопиче- ским методом, заключающийся в регистрации с помощью измерительного прибора, соединенного с фотоэлектронным умножителем, фотометрической насадки люминесцентного микроскопа, величины интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, при длине волны, соответствующей,максимальной величине интенсивности люминесценции примененного красителя. При этом толщина фотометрируемого участка гистологического микропрепарата считается величиной постоянной.

Однако известный способ имеет следующие недостатки. Практика определения содержания нуклеиновых кислот в гистологических микропрепаратах биологических объектов показывает, что на величину интенсивности люминесценции в значительной степени оказывает влияние толщина гистологического среза, которая является неравномерной, при этом увеличение толщины гистологического микропрепарата сопровождается усилением интенсивности люминесценции. Это приводит к тому, что при Измерении интенсивности люминесценции определенной структуры микропрепарата величина ее имеет различное значение, обусловленное неодинаковой толщиной среза, при одинаковом количественном содержании нуклеиновых кислот. На величину интенсивности люминесценции оказывает влияние также индивидуальная особенность стро-ения различных органов и тканей, обуславливающая различную степень интенсивности люминесценции при наличии одинакового количества в определенных структурах нуклеиновых кис- лот, и, кроме того, развитие аутолитическо- го процесса в посмертно измененной ткани уменьшает интенсивность люминесценции при прочих равных условиях. Таким образом, указанные недостатки в совокупности снижают точность и в большинстве случаев делают невозможной оценку количественного содержания нуклеиновых кислот в гистологических микропрепаратах кожи при использовании указанного метода, что затрудняет анализ полученных результатов при их сопоставлении и физиологическую трактовку изучаемых явлений, а также препятствуют установлению ха- рактерат (посмертного или прижизненного) происхождения кровоизлияний в коже головы человека.

Цель изобретения - установление характера кровоизлияний в коже волосистой

части головы человека и повышение точности анализа за счет исключения влияния аутолитического процесса в анализируемом ммкропрепарате.

Поставленная цель достигается тем, что

0 в способе определения нуклеиновых кислот алюминесцентно-микроскопическим методом, заключающемся в регистрации с помощью измерительного прибора, соединенного с фотоэлектронным умножителем.

5 фотометрической насадки люминесцентного микроскопа, величины интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки0 красителя этидиум бромида, при длине вол- ны, соответствующей максимальной величине интенсивности люминесценции Примененного красителя, устанавливают оптическую плотность исследуемого уча5 стка гистологического микропрепарата, условно принимая ее за толщину фотометрируемого участка, при этом используют монохроматическое излучение, полученное с помощью монохроматора, длина волны ко0 торого составляет 420 нм, что устанавливают по спектру поглощения использованной люминесцентной метки-красителя, для получения сопоставимых результатов при исследовании различных участков кожных

5 покровов от разных субъектов, имеющих значительные колебания величины интенсивности люминесценции, обусловленные индивидуальными особенностями строения, применяют эталон с постоянным спек0 тром люминесценции, в качестве которого используют величину части светового потока уранового стекла ЖС-19 толщиной 1,5 мм с длиной волны пропускания, равной 572 нм, нормируют величину интенсивности лю5 минесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона и. по полученному отношению рассчитывают количественное содержание нуклеиновых

0 кислот в условных единицах, устанавливают количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощью

5 визуальной микроскопии, принимают во внимание наибольшее значение из трех полученных результатов для исключения фактора влияния аутолитического процесса и повышения точности анализа, полученное значение сравнивают с данными таблицы

соответствия и решают вопрос о nocMepj- ном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека.

- Сопоставительный анализ заявляемого решения с известным показывает, что заявляемый способ анализа гистологических микропрепаратов отличается от известного тем, что определяют величину оптической плотности фотометрируемого участка гисто- логического микропрепарата, условно принимаемую за его толщину, определяют величину интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого используют урановое стекло, нормируют величину ин- тенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона и по полученному отношению рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в условных единицах, определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата с наибольшей степенью интенсивности с помощью визу- альной микроскопии, наибольшее значение из трех полученных результатов применяют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния, что исключает влияние аутолитического процесса в знали- зируемом микротфепарате и повышает точность анализа, с привлечением таблицы соответствия решают вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части го- ловы человека.

Способ реализуется следующим образом.

Гистологические микропрепарёты кожи волосистой части головы человека, сим- метричные области кровоизлияния, окрашенные с помощью люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, помещают на предметный столик люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической приставкой с объективом 10х, устанавливают зонд диаметром 0,1 мм. Возбуждают люминесценцию, находят нужный участок фотометрии, прикрывают полевую диафрагму и производят регистрацию величины интенсивности люминесценции с длиной волны 590 нм с помощью измерительного прибора, соединенного с фотоэлектронным умножителем фотометрической насадки, Регистрируют Н - ве- личину прошедшего через участок фотометрии светового потока с длиной волны 420 нм, отображенную на шкале измерительного прибора: регистрируют 10 - величину светового потока, прошедшего через участок, расположенный рядом со срезом, с длиной волны 420 нм и по известной формуле определяют величину оптической

плотности (D): D tg -р-. Регистрируют величину интенсивности люминесценции эталона - уранового стекла ЖС-19 толщиной 1,5 мм с длиной волны пропускания 572 ем. Нормируют величину интенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона и по полученному отношению рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в условных единицах. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии и наибольшее значение из трех полученных результатов используют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния и решают вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека согласно таблице соответствия.

Предлагаемый способ анализа гистологических микропрепаратов может быть реализован с помощью любого люминесцентного микроскопа, снабженного фотометрической насадкой с фотоэлектронным умножителем, соединенным с измерительным прибором (например, микроамперметром) и с применением устройства любого типа, позволяющего получать монохроматическое излучение (монохроматора).

Использование предлагаемого способа наиболее эффективно для исследования кожных покровов, полученных в первые сутки после смерти.

П р и м е р 1. Гистологический микропрепарат кожи волосистой части головы человека, симметричный области кровоизлияния, окрашенный с использованием люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, помещают на предметный столик люминесцентного микроскопа ЛЮМАМ-И, снабженного фотометрической насадкой ФМЭЛ-1 с фотоэлектронным умножителем ФЭУ-79, соединенным с микроамперметром. Возбуждают люминесценцию, находят сосочковый слой дермы кожи, прикрывают полевую диафрагму и производят регистрацию величины интенсивности люминесценции с длиной волны 590 нм с помощью микроамперметра, которая составляет 31. Величину оптической плотности определяют при использовании длины волны 420 нм.

г1рлученной с помощью монохроматорз спектрофотоколориметра СПЕКОЛ. Затем регистрируют на шкале микроамперметра И, которое составляет 79, и Jo. которое составляет 124, и по известной формуле определяют величину оптической плотности, которая составляет 0,196, Регистрируют величину интенсивности люминесценции эталона (уранового стекла ЖС-19 толщиной 1,5мм с длиной волны пропускания 572 нм), которая составляет 48. Нормируют величину интенсивности люминесценции участка сосочкового слоя дермы кожи (31) к величине оптической плотности (0.196) и величине интенсивности люминесценции эталона (48) и рассчитывают количественное содержание нуклеиновых кислот в данном участке, которое составляет 3,29 уел, ед. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот во втором участке сочкового слоя дермы кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет 31, li - 81, I0 124, величина оптической плотности - 0.185, величина интенсивности люминесценции эталона - 48). которое составляет 3,49 усл.

ед.

Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в третьем участке сосочкового слоя дермы кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет 36, И - 80, lo - 124, величина оптической плотности - 0,190, величина интенсивности люминесценции эталона - 48), которое составляет 3,95 усл. ед. Для определения количественного содержания нуклеиновых кйсТют испол ьзуют три участка сосочкового слоя дермы гистологического микропрепарата кожи с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии . Наиболее значение из трех полученных результатов (3,95 усл. ед.) используют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния, сравнивают с таблицей соответствия и устанавливают, что данное значение менее 4,68 усл. ед.. что позволяет решить вопрос о посмертном происхождении кровоизлияния в коже волосистой части головы человека.

П ри м е р 2. Гистологический микропрепарат кожи волосистой части головы человека, симметричный области кровоизлияния, окрашенный с использованием люминесцентной метки-красителя этидиум бромида, исследуют с помощью указанной установки. Производят изучение и анализ количественного содержания нуклеиновых кислот в трех участках гистологического микропрепарата из области сальных желез с наибольшей

степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в первом участке из области

сальных желез кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет 60,11 - 75, to - 95,величина оптической плотности 0,103, величина интенсивности люминес0 ценции эталона - 47), которое составляет 12,39 усл.ед. Определяют количественное содержание нуклеиновых кислот во втором участке сальных желез кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гисто5 логического микропрепарата составляет 59, И - 72, 10 - 95, величина оптической плотности - 0,120. величина интенсивности люминесценции эталона - 47). которое составляет 10,46 усл. ед.

0 Определеяют количественное содержание нуклеиновых кислот в третьем участке сальных желез кожи (при этом величина интенсивности люминесценции гистологического микропрепарата составляет 42, И - 75,

5 lo - 95, величина оптической плотности - 0,103, величина интенсивности люминесценции эталона - 47), которое составляет 8,67 усл. ед. Наибольшее значение из трех полученных результатов - 12,39 усл. ед. 0 используют в качестве критерия для установления характера кровоизлияния, сравнивают с таблицей соответствия и устанавливают, что данное значение более 11,41 уел, ед.,.что позволяет решить вопрос

5 о прижизненном развитии кровоизлияния в коже волосистой части толовый человека.

Использование предлагаемого способа анализа гистологических микропрепаратов позволяет определять количественное со0 держание нуклеиновых кислот в кожных покровах в условных единицах и обеспечивает возможность получения сопоставимых результатов при исследовании различных структур гистологического микропрепарзта,

5 повышает точность анализа за счет исключения влияния аутолитического процесса в анализируемом микропрепарате, а также позволяет устанавливать посмертный или прижизненный характер развития кровоиз0 лияний в коже волосистой части головы человека, что имеет большое значение в связи с особой важностью решения этого вопроса в экспертной практике

Формула изобретения

5 1. Способ анализа гистологических микропрепаратов, включающий определение содержания нуклеиновых кислот путем регистрации величины интенсивности люминесценции микропрепарата, окрашенного с использованием люминесцентной меткикрасителя этидиум бромида, отличающийся тем, что, с целью установления характера кровоизлияний в коже волосистой части головы человека и повышения точности анализа за счет исключения влияния аутолитического процесса в анализируемом микропрепарате, измеряют величину оптической плотности исследуемого участка гистологического микропрепарата кожи с использованием монохроматического излучения с длиной волны 420 нм, нормируют величину интенсивности люминесценции исследуемого участка к величине оптической плотности и величине интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого применяют урановое стекло ЖС-19, толщиной -1,5 мм, по полученному отношению рассчитывают количественное содержание

нуклеиновых кислот в условных единицах и. используя полученное содержание нуклеиновых кислот в качестве критерия дня установления характера кровоизлияния с привлечением таблицы соответствия, решают вопрос о посмертном или прижизненном развитии тестируемых кровоизлияний в коже волосистой части головы человека

2. Способ по п. 1,отличающийся тем, что определяют количественное содержание нуклеиновых кислот в трех участках гисхрлогического микропрепарата с наибольшей степенью интенсивности люминесценции с помощью визуальной микроскопии и для сравнения с таблицей соответствия применяют наибольшее значение из трех полученных результатов.

Изобретение относится к медицине, в частности к способу определения количественного содержания органических веществ люминесцентномикроскопическим мето дом Сущность изобретения заключается в определении количественного содержа ния нуклеиновых кислот люминесцентно микроскопическим методом с помощью регистрации максимальной величины люминесценции гистологического микропрепарата, окрашенного с использованием специфической люминесцентной метки красителя этидиум бромида Новым в способе является возможность определения посмертного или прижизненного происхождения кровоизлияний в коже волосистой части головы человека по установлению количественного содержания нуклеиновых кислот с учетом факторов, влияющих на интенсивность люминесценции - толщины гистологического среза, аутолити- ческих процессов и с учетом индивидуальных особенностей люминесценции тканей с помощью установления величины интенсивности люминесценции эталона, в качестве которого используется урановое стекло 1 з п ф-лы, 1 табл (Л С