СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СУБСТАНЦИИ L-ЛИЗИН-АЛЬФА-ОКСИДАЗЫ Российский патент 2013 года по МПК C12N9/02 C12N9/04 C12N9/00 C12R1/885 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине (а именно, к онкологии) и может быть использовано для создания современной технологии получения противоопухолевого средства и для химиотерапии злокачественных новообразований.

Опухолевые клетки в связи с высокой скоростью роста и деления не успевают самостоятельно обеспечивать себя мономерными молекулами для процессов биосинтеза белков и нуклеиновых кислот и нуждаются в доставке готовых аминокислот и нуклеотидов. L-лизин является незаменимой аминокислотой, т.е. он не синтезируется в тканях организма, а должен поступать извне с пищей. Поэтому истощение пула свободного L-лизина может существенно тормозить рост опухолевых клеток, которые делятся и растут интенсивнее, чем клетки здоровых тканей и более чувствительны к отсутствию незаменимых факторов роста.

L-лизин-альфа-оксидаза (ЛО) (КФ 1.4.3.14.) является типичной оксидазой L-аминокислот и преимущественно катализирует реакцию окислительного дезаминирования альфа-аминогруппы только одной аминокислоты L-лизина, причем в ходе реакции образуются альфа-кето-епсилон-аминокапроновая кислота, пероксид водорода и ионы аммония. Именно это свойство ЛО и определяет ее противоопухолевое действие. При введении ЛО в организм человека происходит снижение почти до нулевого уровня концентрации L-лизина в крови и в целом в тканевом пуле аминокислот. Следствием этого является ингибирование синтеза белка и нуклеиновых кислот и, в конечном счете, гибель раковых клеток.

Единственным ферментом, используемым в онкологической практике для терапии злокачественных новообразований, является L-аспарагиназа [«Вопросы онкологии», 2011. Т.57. №2. С.155-164]. К настоящему времени накоплена обширная информация, которая указывает на необходимость использования субстанций этого фермента, полученных из различных штаммов-продуцентов. Это связано с тем, что препараты фермента из различных источников отличаются по своим биологическим свойствам, причем их иммунологическая реактивность чаще всего не совпадает.

Для расширения спектра противоопухолевых ферментов и, в частности, для расширения спектра L-лизин-альфа-оксидаз существенным является получение ферментов из различных источников.

Впервые гомогенный препарат ЛО был получен с выходом 8% и удельной активностью 66 Е/мг японскими учеными из Trichoderma viride Y-244. Метод очистки был 8-стадийный, очень трудоемкий, недостаточно эффективный и, соответственно, дорогой, не позволяющий производить фермент в больших количествах из-за использования метода гель-фильтрации, который предполагает использование очень длинных хроматографических колонок и нанесение небольших количеств разделяемой смеси [Патент США 4234691, 18.11.1980]. Затем российскими исследователями была разработана 4-стадийная очистка с выходом 56% и удельной активностью 31,5 Е/мг. Метод был более простым и экономичным, но не позволял получать субстанцию ЛО, характеризующуюся высокой удельной активностью [«Вопросы медицинской химии», 1985, т.31, №5, с.130-134).

Немецкими исследователями [Journal of Basic Microbiology, Volume 34, Issue 4, pages 265-276, 1994] был предложен эффективный метод очистки ЛО, обеспечивающий 60%-ный выход фермента, экскретируемого грибом Trichoderma viride i4, степень очистки составляла 300, а удельная активность препарата - 90 Е/мг. Но этот метод осуществлялся с использованием большого количества ацетона - до 60% от объема реакционной среды. При применении ацетона в производственных условиях возникают проблемы как экологического характера, так и техники безопасности на производстве.

Наиболее близким к предлагаемому способу - прототипом является способ получения ЛО путем культивирования штамма гриба Trichoderma harzianum Rifai F-180 на содержащей источники азота, фосфата и пшеничные отруби среде и последующего выделения фермента из культуральной жидкости, включающего осаждение примесей сульфатом аммония 15%-ного насыщения и их удаление, осаждение ЛО сульфатом аммония 70%-ного насыщения, диализ с целью перевода ЛО в растворимое состояние и удаления сульфата аммония, последующую ионообменную хроматографию (элюпия в 0,3-0,8 М градиенте концентраций NaCl) и доочистку гель-фильтрацией на сефадексе [Патент РФ №2233171, A61K 38/44, 27.07.2004].

Недостатками способа являются недостаточно высокая продуктивность указанного штамма; использование при выделении фермента высоких концентраций сульфата аммония (до 70% насыщения), который затем приходится выбрасывать в окружающую среду, что приводит к ее загрязнению; большое количество стадий, низкий выход из культуральной жидкости целевого продукта - субстанции ЛО (4,5% при использовании 9-стадийного метода очистки; 8% при использовании 5-стадийного метода) и неудовлетворительное качество полученного препарата (из-за его недостаточной очистки на электрофореграмме имеются дополнительные полосы). Способ позволяет получать лишь небольшие количества целевого продукта (0,4 мг; 1,4 мг), поскольку стадия доочистки ЛО гель-фильтрацией нетехнологична (не позволяет разделять большие количества веществ, требует использования очень длинных хроматографических колонок) и плохо подходит для масштабирования процесса. Максимальная удельная активность ЛО - 200 Е/мг белка при 37°С. Следует также отметить, что удовлетворительная биологическая активность композиций ЛО из гриба Trichoderma harzianum Rifai F-180 отмечается только в присутствии усилителей биологической активности (антиоксиданты, витаминный препарат, иммуномодуляторы, липополисахариды, пирогены, противогельминтные средства и др.).

Задача настоящего изобретения - усиление биосинтеза, создание экологичного метода, пригодного для получения больших количеств высокоочищенной конечной субстанции ЛО, увеличение выхода субстанции ЛО в процессе выделения и очистки, а также достижение ее более высокой удельной активности.

Задача решается путем биосинтеза ЛО с помощью депонированного во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН штамма гриба Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D, проведения выделения и очистки фермента, используя следующий порядок стадий: диализ культуральной жидкости, обработка адсорбентами, осаждение примесей сульфатом аммония 20% степени насыщения, гидрофобная и ионообменная хроматография.

Нижеприведенные примеры иллюстрируют предлагаемое изобретение.

Пример 1. В биосинтезе использовали гриб Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН. Для поддержания штаммов была использована среда на основе сусло-агара.

В качестве инокулята использовали культуру, выращенную на твердом субстрате (пшеничные отруби). Среда роста инокулята содержала 7 г отрубей и 10 мл дистиллированной воды. После 5-6 суток роста отруби заливали 100 мл стерильной дистиллированной воды, инкубировали при перемешивании (на качалке 220 об/мин) в течение 2 час. Жидкую фазу использовали для засева реакционной среды в ферментере в количестве 5% к объему реакционной среды.

Процесс ферментации (биосинтеза) проводили в следующих условиях: отруби пшеничные - 5-20%, аммоний азотнокислый - 5-20%, K₂HPO₄, 25 мМ (0,4%); pO₂ - 70-80%, pH не выше 6,0-6,5, при температуре 29°С. Время ферментации - до 10-12 суток.

Использовали биореакторы усовершенствованной конструкции на основе АНКУМ (общий объем -10 л, рабочий объем - 5 л), снабженные датчиками пены, pH, температуры и pO₂, что позволяло проводить процесс в контролируемых условиях с использованием средств, предотвращающих пенообразование. В ходе процесса следили за его стерильностью и динамикой накопления ЛО в культуральной жидкости.

Определение активности L-лизин-α-оксидазы проводили по скорости образования пероксида водорода в 20 мМ трис-фосфатном буфере (pH 8,0) в присутствии o-дианизидина (0,2 мМ), пероксидазы (5 мкг/мл) и L-лизина (2,0 мМ) на спектрофотометре «Shimadzu» (E₄₃₆=8,3 мМ^-1 см^-1). За единицу активности принимали количество фермента, катализирующего окисление 1 мкмоля лизина в мин при 37°С.

Концентрацию белка как в процессе ферментации, так и при процедурах очистки, определяли по методу Бредфорда. Кумасси бриллиантовый синий G-250 (100 мг) растворяли в 50 мл 95%-ного этанола. Добавляли 100 мл 85%-ной фосфорной кислоты. Разбавляли водой до 1 л. Образец (разбавленный в случае необходимости), содержащий 10-100 мкг белка в 0,1 мл, добавляли к 3 мл реагента-красителя, хорошо перемешивали и измеряли оптическую плотность при 595 нм относительно чистого реагента. Содержание белка определяли по калибровочному графику, полученному с использованием бычьего сывороточного альбумина известной концентрации.

После окончания процесса ферментации культуральную жидкость из ферментера (~3,7 л) сливали в стеклянную бутыль. Ферментер промывали дистиллированной водой (0,5 л). Промывные воды сливали в ту же бутыль, объединяя их с основной культуральной жидкостью. Для отделения от отрубей и мицелия грибов культуральную жидкость фильтровали. Осадок также промывали дистиллированной водой и отбрасывали. Фильтраты объединяли и центрифугировали. По окончании процесса ферментации в культуральной жидкости содержалось около 17 Е/мл ЛО. Ферментации были проведены еще 3 раза, стабильность результатов биосинтеза ЛО отражена в табл.1

Культуральную жидкость диализировали против дистиллированной воды (10 л) в течение 24 часов при 0-4°С. В результате этой процедуры происходит частичное (до 50%) удаление пигмента без изменения ферментативной активности ЛО. К диализату добавляли сефадекс QAE-A25 (Sigma) и тщательно перемешивали в течение 15-20 минут, затем сефадекс QAE-A25 удаляли декантацией, центрифугированием или фильтрованием. Активность ЛО в супернатанте при этом снижалась всего на 5-10%. С целью многократного использования сефадекс QAE-A25 регенерировали.

Осветленную культуральную жидкость переливали в новый стакан, добавляли (50 мл) DEAE-Toyepearl и перемешивали в течение 15-20 мин, в результате чего практически вся ЛО сорбировалась на носителе. Надосадочную жидкость сливали, а осадок промывали водой. С DEAE-Toyepearl дважды смывали ЛО порциями 0,5 М NaCl. Получали 250-300 мл раствора ЛО (DEAE-Toyepearl регенерировали). К полученному раствору ЛО (250-300 мл) добавляли сульфат аммония до 20% насыщения, в результате чего выпадал не содержащий ЛО осадок примесей, который удаляли центрифугированием.

Раствор наносили на колонку с октил-сефарозой (2×30 см), предварительно уравновешенную трис-HCl буфером (50 мМ, pH 8,0), содержащим сульфат аммония (20% насыщения). Затем колонку промывали тем же раствором. Элюцию фермента проводили буферным раствором, содержащим сульфат аммония в концентрации 5% насыщения.

Активные фракции ЛО после гидрофобной хроматографии диализировали против воды. Затем фермент наносили на колонку (2×30 см) с DEAE Toyepearl и промывали водой. Раствором NaCl проводили элюцию конечного продукта - ЛО, удельная активность которой составляла 270 Е/мг. Гомогенность субстанции ЛО проверяли методом SDS электрофореза в полиакриламидном геле. Выход процесса выделения и очистки ЛО составил 67%. Субстанция ЛО может быть получена в лиофилизированном виде с потерей не более 5% ферментативной активности. Результаты получения гомогенной субстанции L-лизин-альфа-оксидазы из Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D представлены в табл.2.

Физико-химические и каталитические характеристики ЛО по изобретению и прототипу практически совпадают. Молекулярная масса равна 115-116 кДа (определена с помощью гель-фильтрации и нативного электрофореза). По данным SDS-электрофореза ЛО является димером с одинаковыми субъединицами (57-58 кДа). Спектр оптического поглощения ЛО соответствует спектру флавопротеина с максимумами при 278, 390 и 465 (плечо 490) нм. Простетической группой фермента является ФАД, причем на каждую субъединицу приходится 1 молекула ФАД. Полученная субстанция ЛО гомогенна по данным электрофореза в полиакриламидном геле и по данным гель-фильтрации.

ЛО проявляет максимальную активность в отношении L-лизина (100%) и лишь в незначительной степени - в отношении его структурных аналогов L-орнитина и L-аргинина, не действует на D-изомеры аминокислот. В результате лизиноксидазной реакции выделяется альфа-кето-эпсилон-аминокапроновая кислота, аммиак и пероксид водорода. pH-оптимум каталитической активности по отношению к L-лизину 7,4, а Км=1,79±0,07 10^-5 М; изоэлектрическая точка - 4,25.

В лиофилизованном виде субстанция ЛО может храниться в холодильнике 2 года практически без потери каталитической активности.

Пример 2. Субстанцию ЛО проверяли на антимикробное действие на аэробные тест-микроорганизмы при их инкубации на жидкой тиогликолевой среде в течение 3-х суток при 32,5±2,5°С в присутствии 3,0 Е/мл ЛО. Результаты приведены в табл.3.

Пример 3. Фунгицидное действие субстанции ЛО проверяли путем инкубации грибов на жидкой среде Сабуро и жидкой соево-казеиновой среде в течение 5-ти суток при 22,5±2,5°С и концентрации ЛО 3 Е/мл. Результаты приведены в табл.4.

Пример 4. Цитотоксическую активность субстанции ЛО исследовали на клетках лимфомы Беркита, полученных из Коллекции опухолевых штаммов человека РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Клетки выращивали в среде RPMI 1640 с 25 мМ HEPES (Gibco) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco), 80 мкг/мл гентамипина. Для оценки цитотоксичности ЛО был использован МТТ-тест, основанный на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать водорастворимую форму МТТ-реагента до голубых кристаллов формазана, растворимых в ДМСО. Оптическое поглощение окрашенных растворов ДМСО измеряли на счетчике оптической плотности Titertek Multiskan MS при длине волны 540 нм. Опухолевые клетки высевали в 96-луночные планшеты в концентрации 10 тыс. на лунку и выращивали при 37°С и 5% CO₂. Через 24 часа в среду с клетками вносили ЛО в различных концентрациях и клетки инкубировали при 37°С и 5% CO₂ в течение 72 часов. На основании полученных данных методом наименьших квадратов рассчитывали средне-эффективную концентрацию тестируемого вещества (IC₅₀), минимальный критерий IC₅₀≤10 мкг/мл. ЛО проявляет высокую и значимую цитотоксичность в культуре клеток лимфомы Беркитта человека, IC₅₀=1,0 мкг/мл (10^-4 Е/мл). Таким образом, доказано выраженное антипролиферативное действие ЛО.

Пример 5. Цитотоксическую активность субстанции ЛО исследовали на линиях клеток опухолей человека: рака толстой кишки Colon L6174T и Colo МТ, рака молочной железы MCF 7, рака яичников SCOV 3 и рака предстательной железы РС3.

Постановка экспериментов была аналогична тому, как это описано в примере 4. Использован диапазон концентраций ЛО 10-10^-7 мкг/мл. Процент жизнеспособных клеток по отношению к контролю определяли через 48 часов инкубации с использованием витального красителя МТТ. Контрольными образцами служили клетки без добавления ЛО. На основании полученных данных методом наименьших квадратов рассчитывали средне-эффективную концентрацию тестируемого вещества (IC₅₀).

ЛО обладает высоким цитотоксическим потенциалом по отношению к опухолевым клеткам различного гистогенеза, при этом более чувствительными к цитопатогенному действию ЛО были клетки рака толстой кишки Colon L6174T. В максимальной из испытанных концентраций (10 мкг/мл) ЛО вызывала практически 100% гибель клеток линии Colon L6174T, при концентрации 10^-2 мкг/мл отмечалась гибель ≥70% клеток, а 50% лизис опухолевых клеток линии Colon L6174T наблюдался при воздействии ЛО в концентрации 10^-4 мкг/мл (табл.5).

Помимо лимфомы Беркитта человека ЛО проявляет высокое и значимое антипролиферативное действие по отношению к другим 4-м линиям культур клеток рака толстой кишки человека Colon L6174T и Colo МТ, рака молочной железы MCF 7, рака яичников SCOV 3, рака предстательной железы РС3 человека, входящим в сигнальный набор прескрининга потенциальных противоопухолевых агентов (табл.5). ЛО оказывает цитотоксическое действие без каких-либо добавок (антиоксидантов, витаминных препаратов, иммуномодуляторов, липополисахаридов, пирогенов, противогельминтных средств и др.).

Таким образом, предлагаемый способ получения субстанции ЛО обеспечивает усиление биосинтеза, увеличение выхода на стадии выделения и очистки (67% против 8% по прототипу), получение чистого продукта, повышение экологичности процесса за счет значительного уменьшения количества сульфата аммония, используемого на стадии выделения, создание возможности масштабирования процесса за счет исключения процедуры гель-фильтрации. Полученная по предлагаемому способу субстанция ЛО обладает широким спектром биологической активности: антимикробной, фунгицидной и антипролиферативной.

Таблица 1 № ферментации Объем КЖ в конце ферментации, л Содержание ЛО в КЖ, Е/мл* 1 4,0 16,88 2 4,1 17,55 3 4,0 18,23 4 3,9 16,88 * активность измеряли при 37°

Таблица 2   Стадия очистки Общий белок, мг Общая активность, Е Удельная активность Е/мг белка при 37°С Выход, %   Исходная культуральная жидкость 11000 10125 0,9   1. Очистка от пигмента в объеме с помощью QAE -А25 8000 9620 1,2 95 2. Очистка от примесей в объеме с помощью DEAE - Toyepearl 600 9113 15,2 90 3. Октил-сефароза (колонка 2×30 см) 100 8440 84,4 87 4. DEAE-Toyeperl (колонка 2×30 см) 25 6750 270,0 67

Таблица 3 Питательные среды Тест-микроорганизмы Наличие роста культуры Жидкая тиогликолевая среда Bacillus subtilis ATCC 6633 + Bacillus subtilis ATCC 6633+ЛО - Staphylococcus ATCC 6538-P + Staphylococcus ATCC 6538-P+ЛО - Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 + Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 +ЛО -

Таблица 4 Питательные среды Тест-микроорганизмы Наличие роста культуры Жидкая соево-казеиновая среда Aspergillus niger ATCC 9642 + Aspergillus niger ATCC 9642+ЛО - Жидкая среда Сабуро Aspergillus niger ATCC 9642 + Aspergillus niger ATCC 9642+ЛО -

Таблица 5 № Линия клеток IC₅₀, мкг/мл 1 Colon L6174T 1,3×10^-4 2 Colo MT 5,6×10^-4 3 MCF7 8,4×10^-4 4 SCOV3 9,9×10^-4 5 РС3 2,6×10^-3

Изобретениео тносится к биотехнологии и медицине, а именно к онкологи. Предложен способ получения субстанции L-лизин-альфа-оксидазы (ЛО) с использованием штамма-продуцента Trichoderma cf. aureoviride Rifai BKMF-4268D. Проводят ферментацию на содержащей источники азота, фосфата и пшеничные отруби среде. Затем осуществляют выделение и очистку фермента при следующей последовательности операций: диализ культуральной жидкости, обработка адсорбентами, осаждение примесей сульфатом аммония 20% степени насыщения, гидрофобная и ионообменная хроматография. Получают L-лизин-альфа-оксидазу, имеющую молекулярную массу 115-116 кДа, изоэлектрическую точку 4,25, оптимум рН - 7,4. Предлагаемый способ обеспечивает увеличение выхода ЛО до 67%. 5 табл., 5 пр.

Способ получения субстанции L-лизин-альфа-оксидазы из гриба рода Trichoderma путем культивирования гриба на содержащей источники азота, фосфата и пшеничные отруби среде с последующим выделением и очисткой фермента, включающими осаждение примесей сульфатом аммония, диализ и ионообменную хроматографию, отличающийся тем, что биосинтез осуществляют с помощью штамма-продуцента гриба, депонированного во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН Trichoderma cf.aureoviride Rifai BKMF-4268D, выделение и очистку проводят при следующей последовательности операций: диализ культуральной жидкости, обработка адсорбентами, осаждение примесей сульфатом аммония 20% насыщения, гидрофобная и ионообменная хроматография с получением L-лизин-альфа-оксидазы, имеющей молекулярную массу 115-116 кДа, изоэлектрическую точку 4,25, оптимум рН 7,4.