АКТИВИРУЮЩИЙ ЛЮМИНЕСЦЕНЦИЮ БЕЛКА ГИДРИДНЫЙ КОМПЛЕКС Российский патент 2013 года по МПК C07K2/00 G01N33/533 

Изобретение относится к биосенсорике и может быть использовано для изучения белков методом люминесценции, для маркирования белков, в качестве клеточного маркера при люминесцентной визуализации клеток и различных их компартментов (митохондрий, клеточных белков и ядер), а также для изучения процессов миграции энергии при моделировании природного фотосинтеза.

Белки в водных растворах обладают собственной люминесценцией, которую используют при структурных и физико-химических исследованиях белков. Главными люминесцирующими группами в белках являются ароматические аминокислотные остатки триптофана, тирозина и фенилаланина. Эти три аминокислоты имеют сильно перекрывающиеся полосы поглощения и люминесценции. В результате люминесцентного резонансного переноса энергии (ЛРПЭ) внутри молекулы белка практически вся световая энергия возбуждения переносится на ароматические аминокислоты, которые и являются основными репортерными группами в белке [Э.Бурштейн, Г. Зимина, Ю. Владимиров. Применение люминесцентного метода для определения состояния ароматических аминокислот (тирозина и триптофана) в белках и ферментных системах. // Ж. прикладной спектроскопии, 1966. 4(2), с.142-146; Э.Бурштейн. Собственная люминесценция белка. // ВИНИТИ, сер. Итоги науки и техники, 1977, т.7 ("Биофизика"), с.10-25]. Интенсивность этой люминесценции чувствительна к окружению белка, что позволяет изучать структурные и физико-химические изменения в биомолекуле. [Ю.Владимиров. О люминесценции ароматических аминокислот в молекуле белка. // ДАН СССР, 1961, 136(4), с.960-963; Ю.Владимиров, Л.Чиньго. Спектры люминесценции белков и ароматических аминокислот при различных рН. // Биофизика, 1962, 7(3), с.270-280]. Метод ЛРПЭ широко используют в различных схемах иммуно- и биоанализа с использованием ряда маркеров, в частности, имеющих в своем составе различные редкоземельные ионы (РЗИ). В таких схемах иммуноанализа каналы переноса энергии от донора к акцептору формируются исследователями, а люминесценцию фиксируют в видимом или ближнем ИК-диапазонах [Г.Чудинова, И.Наговицын. Иммуносенсорные системы с флуоресцентной регистрацией на основе ленгмюровских пленок. // Квантовая электроника, 2003, т.33, с.765-770].

Наиболее близким к заявляемому изобретению является гибридный комплекс, состоящий из донорно-акцепторной пары, образованной альбумином, маркированным иттербиевым мезотетрафенилпорфирином (акцептор) в водном растворе, и иммуноглобулином, маркированным бутилтрифторацетонатом (донор) в наноразмерной ленгмюровской пленке, повышающий люминесценцию иттербия при контакте пленки с раствором в ближнем ИК-диапазоне (линия 975 нм), по сравнению с люминесценцией в отсутствие донора [И.Наговицын, Г.Чудинова. Иммуносенсор на основе пленок Ленгмюра-Блоджетт с ИК-флуоресцентной регистрацией. // ДАН, 2002, т.382, с.267-269]. Основными недостатками известного комплекса являются: 1) раздельность и трудоемкость процедур маркирования белков (альбумина и иммуноглобулина); 2) высокая технологичность процесса приготовления ленгмюровских пленок, предполагающая: а) наличие «чистой» комнаты с ламинарными потоками обеспыленного воздуха и снабженной антивибрационными устройствами; б) использование сверхчистых воды и химических реактивов; в) высокую квалификацию персонала; 3) ограниченность класса белков, используемых для получения донорно-акцепторных пар, только белками, комплиментарными друг к другу; 4) сравнительно низкая эффективность люминесценции, недостаточная для выполнения надежного иммунного анализа.

Технический результат изобретения направлен на повышение люминесценции исследуемого белка, а также - на снижение трудоемкости процедуры маркирования белка, расширение класса исследуемых методом люминесценции белков и снижение технологического уровня процесса получения донорно-акцепторных пар в активирующем люминесценцию белка гибридном комплексе.

Технический результат достигается тем, что активирующий люминесценцию белка гибридный комплекс содержит донорно-акцепторные пары, сформированные на молекулах белка при обработке ультразвуком смеси, содержащей белок, включающий остатки ароматических аминокислот и фосфор в массовом соотношении 10:1 в физиологическом растворе.

Все перечисленные выше задачи изобретения достигаются тем, что в качестве донора используется неорганический люминофор - фосфор, обладающий высокой химической стабильностью и сильной люминесценцией порошка в видимом спектральном диапазоне [J.DeLuca. An introduction to luminescence in inorganic solids. // J. Chem. Education, 1980, v.57, p.541-545]. Исследуемый белок солюбилизирует фосфор, формируя искомые донорно-акцепторные пары (фосфор-белок). Это исключает необходимость использования ленгмюровской пленки из процесса получения пар. Кроме того, как установлено нами, фосфор солюбилизируется любыми белками вследствие их амфотерности [А. Ленинджер. Основы биохимии. // - М.: Мир, 1985, т.1, с.210-251], не денатурируя белок, что позволяет сохраняться образованному гибридному комплексу «белок-фосфор» в физиологическом растворе хлорида натрия (0,9%), не выпадая в осадок. Экспериментально нами также установлено, что связанный белками фосфор более эффективно (по сравнению с бутилтрифторацетонатом) преобразует энергию возбуждающего света в энергию люминесцентного излучения. Отметим также, что применение фосфора в качестве донора позволяет снизить трудоемкость и стоимость процесса формирования донорно-акцепторных пар за счет уменьшения числа его стадий по сравнению с прототипом: в случае применения фосфоров такой процесс происходит в одну стадию - путем сонифицирования раствора смеси белка и фосфора, а в прототипе - в четыре стадии: маркирование одного белка донором, маркирование специфического белка акцептором в растворе, формирование пленки из белка-донора и формирование донорно-акцепторных пар на границе «пленка-раствор».

Пример 1. Получение гибридного материала белок - Y_0,95Er_0,05VO₄ (КС-1)

Навеску Y_0,95Er_0,05VO₄ массой 1,0 мг заливали 5 мл раствора сывороточного альбумина человека, с концентрацией 0,1 мг/мл (10^-5 М) в физиологическом растворе 0,9% NaCl таким образом, чтобы концентрация фосфора при условии его полного растворения составила бы в среднем 0,6 мг/мл. Полученную смесь в течение 40 минут обработали ультразвуком на сонификаторе Branson-1510 при комнатной температуре, а затем полученную взвесь отфильтровали (фильтр «синяя лента»). Концентрацию белка в гибридном материале определяли по полосе поглощения белка в УФ-области (280 нм), которая оказалась равной 0,069 мг/мл, следовательно, осадок, который образуется после сонифицирования, содержит белок и фосфор. УФ-спектры поглощения полученного гибридного материала и белка измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800. Полученные спектры поглощения полностью идентичны и достигают максимума на длине волны 280 нм, но спектры люминесценции гибридного комплекса и белка с ароматическими кислотами, измеренные на спектрофлуориметре Shimadzu-RF 5300pc, имеют максимумы на длине волны 340 нм, которые различаются (в пользу гибридного комплекса) по величине в десять раз. Выполненные нами эксперименты позволили установить, что: 1) усиление интенсивности люминесценции в полученном гибридном комплексе происходит за счет кооперативной антистоксовой люминесценции, возникающей в результате резонансной миграции энергии от двух или более центров (фосфор) к одному аккумулирующему центру (белок). Фосфор обладает люминесценцией в видимом диапазоне (540-700 нм), а собственная люминесценция белка в ультрафиолетовой области - 300-340 нм; 2) соотношение донор: акцептор = 10:1 является оптимальным соотношением, которое было установлено нами экспериментально для других систем [Г. Чудинова. Оптические свойства ленгмюровских пленок органических красителей и белков, глава 4. Перенос энергии в системе пленки Ленгмюра - раствор. // Докторская диссертация, 2005, с.343], поскольку различие весовых соотношений акцептора (белок) и донора (фосфор) сказывается на интенсивности полосы люминесценции акцептора в донорно-акцепторной паре и при соотношении донор: акцептор = 10:1 - эта интенсивность максимальна; 3) осадок, который образуется после обработки ультразвуком, состоит из белка и фосфора, взятых изначально в избытке, при этом концентрация белка снижается и составляет величину 0,069 мг, при фиксированной конечной концентрации фосфора - 0,6 мг, считая на 1 мл раствора подробно см. [Г.Чудинова. Оптические свойства ленгмюровских пленок органических красителей и белков, глава 4. Перенос энергии в системе пленки Ленгмюра - раствор. // Докторская диссертация, 2005, с.343].

Пример 2. Получение гибридного материала белок - Y_0,95Er_0,05VO₃Cl (KC-2). Навеску Y_0,95Er_0,05VO₃Cl массой 0,08 мг заливали 5 мл раствора сывороточного альбумина человека с концентрацией 0,8 мг в физиологическом растворе 0,9% NaCl таким образом, чтобы концентрация фосфора при условии его полного растворения составила бы в среднем 0,6 мг/мл. Полученную смесь в течение 40 минут обработали ультразвуком на сонификаторе Branson-1510 при комнатной температуре, а затем полученную взвесь отфильтровали (фильтр «синяя лента»). Концентрацию белка в гибридном материале определяли по полосе поглощения белка в УФ-области (280 нм), которая оказалась равной 0,058 мг/мл, следовательно, осадок, который образуется после сонифицирования, содержит белок и фосфор. УФ-спектры поглощения полученного гибридного материала и белка измеряли на спектрофотометре Shimadzu UV-1800. Полученные спектры поглощения полностью идентичны и достигают максимума на длине волны 280 нм, но спектры люминесценции данного гибридного материала и белка, измеренные на спектрофлуориметре Shimadzu-RF 5300 pc, имеют максимумы на длине волны 340 нм, которые различаются (в пользу гибридного материала) по величине в семь раз. Такая разница в эффектах увеличения интенсивности люминесценции между примерами 1 и 2 происходит за счет присутствия атома хлора в структуре фосфора из примера 2. Это согласуется с известным фактом, состоящим в том, что ион хлора является достаточно сильным тушителем люминесценции [Дж.Лакович. Основы флуоресцентной спектроскопии. // - М.: Мир, 1986, с.262-301]. Выполненные нами эксперименты позволили также установить, что: 1) усиление интенсивности люминесценции в полученном гибридный комплексе основано на процессе кооперативной антистоксовой люминесценции, возникающей в результате резонансной миграции энергии от двух или более центров (фосфор) к одному аккумулирующему центру (белок). Фосфор обладает люминесценцией в видимом диапазоне (540-700 нм), а собственная люминесценция белка в ультрафиолетовой области - 300-340 нм; 2) соотношение донор: акцептор = 10:1 является оптимальным соотношением, которое было установлено нами экспериментально для других систем, поскольку различие весовых соотношений акцептора (белок) и донора (фосфор) сказывается на интенсивности полосы люминесценции акцептора в донорно-акцепторной паре и при соотношении донор: акцептор = 10:1 - эта интенсивность максимальна; 3) осадок, который образуется после обработки ультразвуком, состоит из белка и фосфора, взятых изначально в избытке, при этом концентрация белка снижается и составляет величину 0,058 мг, при фиксированной конечной концентрации фосфора - 0,6 мг, считая на 1 мл раствора подробно см.

Приведенные примеры подтверждают решение поставленных в основу изобретения задач - разработку нового активирующего люминесценцию белка наноразмерного гибридного комплекса, позволяющего: 1) получать донорно-акцепторные пары с использованием одного белка; 2) устранить необходимость использования ленгмюровской пленки из процесса получения донорно-акцепторных пар; 3) расширить класс используемых белков, а также - существенно повысить люминесценцию маркированного белка.

Для понимания структуры получаемого гибридного материала нами были проведены эксперименты по определению размера полученных частиц методом динамического рассеяния с использованием спектрометра динамического рассеяния Photocor Complex (США) после удаления осадка. Анализ спектров проводили на основании модели, адаптированной для сферических частиц [Kaszuba M., McKnight D. Connah M.T. et al. // J. Nanopart. Res. 2008, v.10, p.823-829], и он показал наличие в растворе альбумина фракции со средним диаметром 6 нм, в растворе гибридного материала КС-1 - 10 нм, КС-2 - 7 нм. [Чудинова Г.К., Наговицын И.А., Никитин А.К., Курилкин В.В., Конов В.И. Усиление собственной люминесценции белка в нано-размерном комплексе // Доклады Академии наук, 2012, том 444, №5, с.1-2]. Окисление хлором соединения Y_0,95Er_0,05VO₄ для получения хлорванадата уменьшает исходные размеры дисперсной фазы.

Кроме того, предлагаемый гибридный комплекс может быть использован:

1) в качестве клеточного маркера, т.к. необходимость применения белка в этом случае объясняется его способностью доставлять наночастицы (в частности, фосфора) на поверхность клетки и внутрь нее через клеточные мембраны;

2) в качестве биологически активного соединения, поскольку ванадаты, присутствующие в фосфоре, способны мимикрировать (копировать) свойства исходных биологических систем, а также катализировать (ингибировать) отдельные реакции в организме;

3) для визуализации клеток и клеточных компартментов в флуоресцентной микроскопии.

4) как модельная система для изучения миграции энергии в природных, в том числе фотосинтетических мембранах, в которых гибрый материал является фотохимическим аналогом наноразмерного кластера природных пигментов.

Изобретение относится к области биосенсорики и может быть использовано для изучения белков методом люминесценции. Обработкой ультразвуком белка, содержащего ароматические аминокислоты, в физиологическом растворе в присутствии фосфора Y_0,95Hr_0,05VO₄ или Y_0,95Еr_0,05YО₃Сl, получают активирующий люминесценцию белка гибридный комплекс. Комплекс содержит донорно-акцепторные пары. Применение изобретения позволяет повысить люминесценцию исследуемого белка, а также снизить трудоемкость процедуры маркирования белка, расширить класс белков, исследуемых методом люминесценции, и снизить технологический уровень процесса получения донорно-акцеиторных в активирующем люминесценцию белка гибридном комплексе. 2 пр.

Активирующий люминесценцию белка гибридный комплекс, содержащий донорно-акцепторные пары, сформированные на молекулах белка при обработке ультразвуком смеси, состоящей из белка, включающего остатки ароматических кислот, и фосфора Y_0,95Er_0,05VO₄ или Y_0,95Er_0,05VO₃Cl в массовом соотношении 10:1, в физиологическом растворе.