НОВЫЙ БЕЛКОВЫЙ КОНЪЮГАТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА, ОЖИРЕНИЯ И ДИАБЕТА Российский патент 2024 года по МПК A61K38/18 A61K38/19 A61K38/22 A61K38/26 A61K47/64 A61K47/65 

Область техники настоящего изобретения

Настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, содержащему полиубиквитин, носитель, связанный с полиубиквитином, и две или более биомолекул, связанных с полиубиквитином или носителем. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения и диабета, содержащей белковый конъюгат, содержащий две или более биомолекулы.

Предшествующий уровень техники настоящего изобретения

Неалкогольная жировая болезнь печени (NAFLD) представляет собой тип заболевания, гистологические проявления которого сходны с алкогольным гепатитом, даже при незначительном употреблении алкоголя или его отсутствии, и представляет собой тип метаболического синдрома, охватывающий неалкогольную жировую болезнь печени (NAFL), неалкогольный стеатогепатит (NASH), цирроз и рак печени (гепатоцеллюлярная карцинома). Неалкогольная жировая болезнь печени растет по мере увеличения населения с ожирением и диабетом, а годовой уровень заболеваемости в Корее составляет около 16%.

Неалкогольный стеатогепатит (NASH) в основном характеризуется аномальным накоплением или отложением жира в печени (стеатоз печени), воспалением печени и повреждением печени или повреждением ткани печени (фиброзом). Распространенность неалкогольного стеатогепатита во всем мире составляет 2-4% (3-12% взрослых в США). Хорошо известно, что неалкогольный стеатогепатит характеризуется более быстрой гистологической прогрессией и может прогрессировать до цирроза печени, в то время как простой стеатоз характеризуется медленным гистологическим прогрессированием. Примерно у 5-10% людей с диагнозом жировая дистрофия печени развивается стеатогепатит (Metabolism Clinical and Experimental 65 (2016) 1038-1048).

В настоящее время в продаже нет терапевтического средства для лечения неалкогольного стеатогепатита, и из-за отсутствия терапевтического средства для него используют другие терапевтические средства для лечения метаболического синдрома, такого как абдоминальное ожирение, гиперлипидемия и диабет, например, лекарственные препараты, улучшающие резистентность к инсулину, антиоксиданты (например, витамины С и Е), средства для лечения дислипидемии, гепатопротекторы и т.п., но их вряд ли можно рассматривать как терапевтические средства для непосредственного лечения неалкогольного стеатогепатита.

Так как неалкогольный стеатогепатит имеет природу сложного заболевания, лицензирующие органы в Соединенных Штатах, Европе и т.п. установили строгие требования к утверждению лекарственных средств для его терапевтических агентов. По этой причине в последнее время ряд терапевтических средств не прошел стадию клинической разработки, и соответственно появляются терапевтические средства на основе множественного агониста для одновременного улучшения различных показателей. Терапевтические средства для лечения неалкогольного стеатогепатита на основе множественного агониста, которые в настоящее время проходят клинические испытания, включают MEDI0382 от AstraZeneca, двойной агонист GLP-1/глюкагона (GCG), LY3298176 от Eli Lilly, двойной агонист GIP/GLP-1, HM15211 от Hanmi Pharm.Co.,Ltd., глюкагон/GIP/GLP-1 тройной агонист и т.п.

Ожирение относится к состоянию избыточного жира в организме и может быть определено как состояние риска для здоровья из-за избыточного жира в организме, которое вызывает несколько заболеваний, включая болезни сердца. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) сообщила, что во всем мире насчитывается более 106 миллионов взрослых с избыточным весом, по меньшей мере 4 миллиона страдают ожирением и более 2 из 3 американцев имеют избыточный вес или ожирение (Low et al, 2009; Cooke and Bloom, 2006). У людей с ожирением повышен риск развития ряда заболеваний, включая диабет 2 типа, гиперлипидемию, артрит и апноэ, по сравнению с людьми с нормальной массой тела, а ожирение, как известно, вызывает несколько видов рака и сердечных заболеваний.

Сахарный диабет представляет собой заболевание обмена веществ, при котором длительное время сохраняется высокий уровень глюкозы в крови вследствие недостаточной секреции инсулина или инсулинорезистентности. Поскольку уровень глюкозы в крови сохраняется длительное время, продукты гликирования проникают в сетчатку, почки, нервы или крупные и мелкие кровеносные сосуды по всему телу, вызывая хронические осложнения. Поскольку осложнения сахарного диабета более опасны, чем сам сахарный диабет, самой важной задачей лечения диабета сегодня является подавление возникновения или прогрессирования осложнений диабета. Типичные осложнения диабета включают диабетическую ретинопатию, диабетическую катаракту, диабетическую нефропатию, диабетическую невропатию, диабетическую болезнь сердца, диабетический остеопороз, диабетический атеросклероз и т.п.

При разработке терапевтических средств на основе множественного агониста, в связи с проблемой снижения активности из-за структурных ограничений, в настоящее время отсутствуют исследования терапевтических средств на основе более чем четырех-направленного агониста при неалкогольном стеатогепатите, жировой дистрофии печени, фиброзе печени, циррозе, раке печени, ожирении или диабете. Соответственно, авторы настоящего изобретения неустанно работали над созданием терапевтического средства на основе четырех-направленного агониста/антагониста для лечения неалкогольного стеатогепатита, ожирения печени, фиброза печени, цирроза, рака печени, ожирения и диабета. В результате настоящее изобретение было выполнено с использованием структуры полиубиквитина.

Документ уровня техники

Патентный документ

(Патентный документ 0001) Публикация заявки на патент Кореи № 10-2016-0032699

(Патентный документ 0002) Патент Кореи № 10-2034607

Подробное раскрытие настоящего изобретения

Техническая задача

Задача настоящего изобретения состояла в создании белкового конъюгата, содержащего полиубиквитин, носитель, связанный с полиубиквитином, и две или более биомолекул, связанных с полиубиквитином или носителем.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH), жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, содержащую белковый конъюгат, содержащий две или более биомолекул. В частности, другой задачей настоящего изобретения было создание фармацевтической композиции для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, содержащей четырех-направленный агонист/антагонист акцептора GCG/GLP-1/FGF21/GIP или GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA.

Решение задачи

Настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, отличающемуся тем, что белковый конъюгат содержит: полиубиквитин, носитель, связанный непосредственно или через линкер с полиубиквитином, и биомолекулу, связанную непосредственно или через линкер с полиубиквитином или носителем, где полиубиквитин состоит из (i) акцептора убиквитина содержащего один или несколько незамещенных лизинов, где лизины убиквитина могут быть замещены аргинином или аланином, и (ii) донора убиквитина, где все лизины убиквитина замещены аргинином или аланином, и биомолекула представляет собой две или более выбранные из группы, состоящей из GCG, GLP-1, FGF21, GIP и IL-1RA, их аналогов, GCG и GLP-1 двойного агониста акцептора, и GLP-1 и GIP двойного агониста акцептора.

Согласно одному варианту осуществления GCG и его аналог могут быть выбраны из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 1 - 3, и предпочтительно аналог GCG может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

Согласно одному варианту осуществления GLP-1 и его аналог могут быть выбраны из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 4 - 14, и предпочтительно аналог GLP-1 может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.

Согласно одному варианту осуществления GCG GLP-1 двойной агонист акцептора может быть выбран из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 15 и 16.

Согласно одному варианту осуществления FGF21 и его аналог могут быть выбраны из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 17 - 21. Предпочтительно, аналог FGF21 может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

Согласно одному варианту осуществления GIP и его аналог могут быть выбраны из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 22 - 26. Предпочтительно GIP и его аналог может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24.

Согласно одному варианту осуществления IL-1RA и его аналог могут быть выбраны из группы, состоящей из белков, состоящих из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 27 и 28. Предпочтительно IL-1RA может представлять собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.

Согласно одному варианту осуществления полиубиквитин может состоять из акцептора убиквитина, в котором 6-й, 11-й, 27-й, 29-й, 33-й и 48-й лизины с N-конца убиквитина заменены на аргинин, и донора убиквитина, в котором все лизины убиквитина заменены аргинином. Предпочтительно полиубиквитин может состоять из акцептора убиквитина, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и донора убиквитина, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31.

Согласно одному варианту осуществления линкер может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой объединены от 1 до 30 повторов GGGGS, EAAAK или VPPPPP. Предпочтительно линкер может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29.

Согласно одному варианту осуществления носитель может быть выбран из группы, состоящей из альбумина, фрагмента антитела, scFc (одноцепочечного Fc), димера scFc (одноцепочечного Fc-димера), трансферрина, XTEN (генетического слияния неточной повторяющейся пептидной последовательности), CTP (карбоксиконцевого пептида), PAS (пролин-аланин-серинового полимера), ELK (эластиноподобного пептида), HAP (гомоаминокислотного полимера), GLK (желатиноподобного белка), PEG (полиэтиленгликоля) и жирной кислоты. Предпочтительно носитель может представлять собой альбумин.

Настоящее изобретение относится к белковому конъюгату, представленному следующей формулой:

в вышеуказанной формуле W, X, Y и Z каждый может представлять собой биомолекулу, выбранную из группы, состоящей из аналога GCG, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, аналога GLP-1, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, аналога FGF21, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, аналога GIP, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и IL-1RA, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, Ub(A) может быть акцептором убиквитина, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, Ub(D) может быть донором убиквитина, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, L может независимо отсутствовать или быть линкером, A может быть носителем, и Ub(A) и Ub (D) могут быть связаны ковалентной связью.

Согласно одному варианту осуществления X может быть аналогом GCG, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, Y может быть аналогом GLP-1, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, Z может быть аналогом FGF21, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12. NO: 20, и W может быть аналогом GIP, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, или IL-1RA, состоящим из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.

Согласно одному варианту осуществления линкер может представлять собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, а носитель может представлять собой альбумин.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита (НАСГ), жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, содержащую белковый конъюгат.

Настоящее изобретение обеспечивает способ профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита (NASH), жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, включающий введение композиции субъекту, отличному от человека.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает способ получения белкового конъюгата, отличающийся тем, что способ включает стадии:

(i) получение акцепторного белка, представленного следующей формулой;

X-L-Y-L-Ub(A)-L-A-L-Z

(ii) получение донорного белка, представленного следующей формулой; и

W-L-Ub(D)

(iii) связывание Ub(A) в акцепторном белке и Ub(D) в донорном белке,

где каждый из W, X, Y и Z представляет собой биомолекулу, выбранную из группы, состоящей из аналога GCG, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, аналога GLP-1, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, аналога FGF21, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, аналога GIP, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, и IL-1RA, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27, Ub(A) представляет собой акцептор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, Ub(D) представляет собой донор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, каждый L независимо отсутствует или представляет собой линкер, а A представляет собой носитель.

Эффекты изобретения

Новый белковый конъюгат согласно настоящему изобретению содержит две или более биомолекул и ингибирует стеатоз, воспаление и фиброз в печени, оказывая, таким образом, отличный эффект на профилактику или лечение неалкогольного стеатогепатита (NASH), жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, или рак печени, и, таким образом, может также с пользой применяться для профилактики или лечения ожирения или диабета. Кроме того, белковый конъюгат может длительное время сохраняться в организме, оказывать свое действие в течение длительного времени, а также обладает отличной безопасностью посредством использования полиубиквитина и безвредного для организма человека носителя.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует результаты, полученные путем подтверждения очистки акцепторного белка с помощью SDS-PAGE.

Фиг. 2 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую процесс очистки донорного белка.

Фиг. 3 и 4 иллюстрируют результаты, полученные путем подтверждения очистки донорного белка через колонку Ni с помощью SDS-PAGE.

Фиг. 5 и 6 иллюстрируют результаты, полученные путем подтверждения очистки донорного белка путем удаления His-SUMO с помощью SDS-PAGE.

Фиг. 7 и 8 иллюстрируют результаты полирующей очистки донорного белка.

Фиг. 9 представляет собой схематическую диаграмму, показывающую способ получения конъюгата белка путем конъюгации акцепторного белка и донорного белка.

Фиг. 10 и 11 иллюстрируют результаты, полученные путем подтверждения конъюгации акцепторного белка и донорного белка с помощью SDS-PAGE.

Фиг. 12 иллюстрирует результаты, полученные при подтверждении очистки Ni конъюгата белка с помощью хроматографии.

Фиг. 13 и 14 иллюстрируют результаты, полученные путем подтверждения очистки конъюгата белка с помощью SDS-PAGE.

Фиг. 15 иллюстрирует результаты SDS-PAGE конечного белкового конъюгата.

Фигуры 16-18 представляют собой графики, показывающие результаты анализа накопления цАМФ.

Фиг. 19 представляет собой график, показывающий результаты функционального анализа FGFR/KLB.

Фиг. 20 представляет собой график, показывающий результаты анализа репортера NF-kB.

Фиг. 21 и 22 представляют собой графики, показывающие результаты, полученные путем измерения аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в крови мышей в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 23-26 иллюстрируют результаты, полученные при наблюдении стеатоза и воспаления (долькового воспаления) в ткани печени мыши в тесте эффективности in vivo, и балльные оценки в соответствии с критериями оценки NAS.

Фиг. 27 и 28 представляют собой графики, показывающие результаты, полученные путем измерения концентраций TGT-β и триглицеридов в ткани печени мыши в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 29 и 30 представляют собой графики, показывающие результаты, полученные путем измерения аланинаминотрансферазы (ALT) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в крови мышей в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 31-34 иллюстрируют результаты, полученные при наблюдении стеатоза и воспаления (долькового воспаления) в ткани печени мыши в тесте эффективности in vivo, и балльные оценки в соответствии с критериями оценки NAS.

Фиг. 35 и 36 представляют собой графики, показывающие результаты, полученные путем измерения концентраций TGT-β и триглицеридов в ткани печени мыши в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 37-41 представляют собой графики, показывающие изменения содержания триглицеридов (TG), свободных жирных кислот (NEFA), общего холестерина (T-Chol), холестерина липопротеинов низкой плотности (холестерин LDL) и холестерина липопротеинов высокой плотности (холестерин HDL) в сыворотке мышей с ожирением, вызванным диетой, в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 42 и 43 представляют собой графики, показывающие изменения уровня глюкозы в крови не натощак у мышей с диабетом 2 типа в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 44 и 45 представляют собой графики, показывающие изменения массы тела мышей с диабетом 2 типа в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 46 и 47 представляют собой графики, показывающие изменения в потреблении пищи мышами с диабетом 2 типа в тесте эффективности in vivo.

Фиг. 48 и 49 представляют собой графики, показывающие изменения в потреблении воды мышами с диабетом 2 типа в тесте эффективности in vivo.

На фиг. 50 - 52 показаны результаты теста на иммуногенность in silico для МНС класса I.

На Фиг. 53-55 показаны результаты теста на иммуногенность in silico в МНС класса II.

Наилучший способ осуществления настоящего изобретения

Далее со ссылкой на прилагаемые чертежи будут подробно описаны варианты осуществления и примеры настоящего изобретения, чтобы специалисты в области техники, к которой относится настоящее изобретение, могли легко реализовать настоящее изобретение на практике. Однако настоящее изобретение может быть реализовано в различных формах и не ограничивается описанными в настоящем документе вариантами осуществления и примерами.

В настоящем описании, когда определенная часть «включает» определенный компонент, это означает, что другие компоненты могут быть дополнительно включены, а не исключает другие компоненты, если не указано иное.

В контексте настоящего изобретения термин «профилактика» относится к любому действию по ингибированию или замедлению начала заболевания путем введения композиции, а «лечение» относится к любому действию, при котором симптомы субъекта, подозреваемого в заболевании и страдающего от него, улучшаются или благотворно изменяются введением композиции.

В контексте настоящего изобретения термин «субъект» представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека, но может быть животным, включая домашнее животное (например, собаку, кошку и т.д.), одомашненное животное (например, корову, овцу, свинью, лошадь и др.) и лабораторное животное (например, крыса, мышь, морская свинка и др.).

Фармацевтическую композицию согласно настоящему изобретению можно вводить парентерально или перорально в зависимости от желаемого способа, а дозировка может варьироваться в зависимости от массы тела пациента, возраста, пола, состояния здоровья, диеты, времени введения, способа введения, скорости экскреции, тяжесть заболевания и тому подобное. Кроме того, терапевтически эффективное количество композиции может варьироваться в зависимости от способа введения, места-мишени и состояния пациента, и при применении в организме человека дозу следует определять как подходящую с учетом обоих факторов безопасности и эффективности.

В контексте настоящего изобретения термин «GCG» может относиться к глюкагону дикого типа (нативный GCG), который представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 1.

В контексте настоящего изобретения термин «аналог GCG» означает, что некоторые аминокислоты белка глюкагона дикого типа замещены. Предпочтительно он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2 или 3. Более предпочтительно, он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, в которой аминокислоты с 16-й по 20-ю с N-конца белка глюкагона дикого типа заменены от SRRAQ на ERRAK, аминокислоты с 23-й по 24-ю заменены от VQ на IE, а аминокислоты с 27-й по 29-ю заменены с = от MNT на LSA.

В контексте настоящего изобретения термин «GLP-1» может относиться к GLP-1 дикого типа (нативный GLP-1), который представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 4.

В контексте настоящего изобретения термин «аналог GLP-1» означает, что некоторые аминокислоты белка GLP-1 дикого типа замещены. Предпочтительно он может относиться к белку, выбранному из группы, состоящей из белка, состоящего из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 5-14. Более предпочтительно, он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, в которой 2-я аминокислота с N-конца белка GLP-1 дикого типа заменена от A на G, 16-я аминокислота заменена от G на E, а 30-я аминокислота заменена от R на GG.

В контексте настоящего изобретения термин «FGF21» может относиться к FGF21 дикого типа (нативный FGF21), который представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17.

В контексте настоящего изобретения термин «аналог FGF21» означает, что некоторые аминокислоты белка FGF21 дикого типа замещены. Предпочтительно он может относиться к белку, выбранному из группы, состоящей из белка, состоящего из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 18-21. Более предпочтительно, он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20, в которой 19-я аминокислота с N-конца белка FGF21 дикого типа заменена от R на V, аминокислоты с 98-й по 100-ю заменены от LLL на DLK, аминокислоты со 167-й по 170-ю заменены от SMVG на RLVE, 174-я аминокислота заменена от G на L, а аминокислоты со 179-й по 181-ю заменены от YAS на FE.

В контексте настоящего изобретения термин «GIP» может относиться к GIP дикого типа (нативный GIP), который представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 22.

В контексте настоящего изобретения термин «аналог GIP» означает, что некоторые аминокислоты белка GIP дикого типа замещены. Предпочтительно он может относиться к белку, выбранному из группы, состоящей из белка, состоящего из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO: 23-26. Более предпочтительно, он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, в которой 2-я аминокислота с N-конца белка GIP дикого типа заменена от A на S.

В контексте настоящего изобретения термин «IL-1RA» может относиться к IL-1RA дикого типа (нативный IL-1RA), который представляет собой белок, содержащийся из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.

В контексте настоящего изобретения термин «аналог IL-1RA» означает, что некоторые аминокислоты белка IL-1RA дикого типа замещены. Предпочтительно он может относиться к белку, состоящему из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 28.

Далее настоящее изобретение будет описано более подробно с помощью примеров, но следующие примеры предназначены только для иллюстративных целей и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Акцепторный белок

В дальнейшем акцепторный белок, полученный в примерах, представляет собой полипептид, представленный следующей формулой:

X-L-Y-L-Ub(A)-L-A-L-Z

в приведенной выше формуле

X представляет собой аналог GCG, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, Y представляет собой аналог GLP-1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, и Z представляет собой аналог FGF21, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,

Ub(A) представляет собой акцептор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30,

L представляет собой линкер, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29, и

А представляет собой альбумин, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 32.

SEQ ID NO аминокислотных последовательностей каждого белка и сигнального пептида, составляющих белок-акцептор, показаны в таблице 1.

Таблица 1 Белок Аминокислотная последовательность аналог GCG SEQ ID NO: 2 аналог GLP-1 SEQ ID NO: 12 аналог FGF21 SEQ ID NO: 20 Линкер SEQ ID NO: 29 Ub(A) SEQ ID NO: 30 Альбумин SEQ ID NO: 32 HAS SEQ ID NO: 33 IgGκ SEQ ID NO: 34

Донорский белок

В дальнейшем донорный белок, полученный в примерах, представляет собой полипептид, представленный следующей формулой:

W-L-Ub(D)

в приведенной выше формуле

W представляет собой аналог GIP, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, или IL-1RA, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27,

L представляет собой линкер, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 29, и

Ub(D) является донором убиквитина, состоящим из последовательности SEQ ID NO: 31.

SEQ ID NO аминокислотной последовательности каждого белка, составляющего донорный белок, показан в таблице 2.

Таблица 2 Белок Аминокислотная последовательность GIP SEQ ID NO: 24 IL-1RA SEQ ID NO: 27 Линкер SEQ ID NO: 29 Ub(D) SEQ ID NO: 31

В контексте настоящего изобретения термины «донор-191» и «D-191» относятся к донорному белку, содержащему аналог GIP.

В контексте настоящего изобретения термины «донор-192» и «D-192» относятся к донорному белку, содержащему IL-1RA.

В контексте настоящего изобретения термины «RD-191» и «С-191» относятся к белковому конъюгату, в котором акцепторный белок и донорный белок, содержащий аналог GIP, связаны.

В контексте настоящего изобретения термины «RD-192» и «С-192» относятся к белковому конъюгату, в котором акцепторный белок и донорный белок, содержащий IL-1RA, связаны.

Пример 1

Получение плазмидной ДНК для экспрессии акцепторного белка

Последовательность акцепторного гена, которая представляет собой ген, кодирующий акцепторный белок, синтезировали и затем клонировали в pcDNA3.1(+), вектор экспрессии простой структуры, содержащий промотор CMV, ген устойчивости к ампициллину и т.п.

Было проведено быстрое клонирование для клонирования сигнального пептида, который позволяет белку секретироваться из клетки в плазмиду, в которую встроен акцепторный ген. ПЦР вектора проводили с использованием плазмидной ДНК, в которую был вставлен акцепторный ген, в качестве матрицы, чтобы сигнальный пептид мог быть вставлен при 5'-конце акцепторного белка, а ПЦР вставки проводили с использованием человеческого сывороточного альбумина (HSA), состоящего из последовательности SEQ ID NO: 33, и сигнального пептида IgGκ, состоящего из последовательности SEQ ID NO: 34, в качестве матрицы, чтобы каждый сигнальный пептид мог быть вставлен при 5'-конце акцепторного белка. Реакцию ПЦР проводили с использованием ДНК-полимеразы Phusion High-Fidelity (Thermo Fisher, кат. №: F530). В ходе первичной денатурации при 98 °С в течение 3 минут, вторичной денатурации при 98 °С в течение 10 секунд, конъюгации праймеров при 60 °С в течение 30 секунд и реакции удлинения при 72 °С в течение 3 минут, процессы от вторичной денатурации до реакции удлинения повторяли 18 раз, а затем проводили конечную реакцию удлинения при 72 °С в течение 5 минут.

После завершения реакции ПЦР подтверждали, амплифицируется ли целевой ген с помощью электрофореза в агарозном геле. После этого по 10 мкл каждого векторного продукта ПЦР и продукта вставки ПЦР добавляли при 1:1 в пробирку для ПЦР, а затем добавляли 0,5 мкл DpnI. Пробирку обрабатывали при 37°С в течение 1 часа для удаления матричной ДНК и лигировали. Лигированный продукт ПЦР добавляли к компетентным клеткам DH5α и трансформировали путем обработки тепловым шоком при 42 °C в течение 1 минуты, высевали на твердую среду LB, содержащую ампициллин, а затем стационарно культивировали при 37 °C в течение по меньшей мере 16 часов с получением колоний. Отбирали одну колонию и инокулировали в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин, а затем культивировали при 37°C и 220 об/мин в течение 16 часов. Культуральный раствор центрифугировали при 3500 об/мин в течение 20 минут с получением влажных клеток E. coli, а затем добавляли растворы S1, S2 и S3 из набора для выделения ДНК (COSMO Genetech, № по каталогу: CMP0112) для разрушения клеточной стенки и получали мутный раствор ДНК, в котором белки и ДНК были разделены. Плазмидную ДНК очищали из полученного мутного раствора ДНК с использованием колонки для очистки из набора для выделения ДНК (COSMO Genetech, кат. №: CMP0112). Компании COSMO Genetech было предложено провести секвенирование гена плазмидной ДНК, и были получены два вектора, в которых HSA, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 33, или сигнальный пептид IgGκ, состоящий из последовательности SEQ ID NO: 34, были вставлены при 5' конце акцепторного белка.

Вектор с идентифицированной последовательностью гена добавляли к компетентным клеткам DH5α и трансформировали путем обработки тепловым шоком при 42 °C в течение 1 минуты, высевали на твердую среду LB, содержащую ампициллин, а затем стационарно культивировали при 37 °C в течение по меньшей мере 16 часов с получением колоний. Одну колонию брали и инокулировали в 5 мл среды LB, а затем культивировали при 37°C и 220 об/мин в течение 16 часов. Часть этого культурального раствора снова инокулировали в 200 мл среды LB, содержащей ампициллин, и затем культивировали при 37°С и 220 об/мин в течение 16 часов. Культуральный раствор центрифугировали при 3500 об/мин в течение 30 минут с получением влажных клеток E. coli, а затем добавляли растворы P1, P2 и P3 из набора для выделения ДНК (QIAGEN, № по каталогу: 12263) для разрушения клеточной стенки, и получали мутный раствор ДНК, в котором были разделены белки и ДНК. Осадок плазмидной ДНК получали из полученного мутного раствора ДНК с использованием колонки для очистки из набора для выделения ДНК (QIAGEN, № по каталогу: 12263). Осадок растворяли в воде для культивирования клеток (Sigma Aldrich, W3500) и затем фильтровали через фильтр 0,22 мкм. Экстрагированную плазмидную ДНК использовали для экспрессии белка после измерения концентрации и чистоты ДНК с помощью нанокапельного устройства (IMPLEN, Nanodrop NP-80).

Пример 2

Экспрессия акцепторного белка в клетках ExpiCHO-S

За 24 часа до процесса трансфекции клетки ExpiCHO-S (Gibco, номер по каталогу: A29127, партия: 1974423) инокулировали в количестве 4×10⁶ клеток/мл, готовили и помещали на орбитальный шейкер в инкубаторе при 37 °C, влажность 80 % или более, 8 % CO_2, и культивировали при 95 об/мин (диаметр встряхивания 50 мм). Через 24 часа клетки фильтровали через нейлоновый фильтр 40 мкм (BD Falcon, № по каталогу: 352340) для удаления комков, а затем измеряли жизнеспособность клеток и количество клеток. Отфильтрованные клетки разбавляли экспрессионной средой ExpiCHO-S (ExpiCHO Expression Media, Gibco, номер по каталогу: A29100-01) до конечной концентрации 6×10⁶ клеток/мл и 200 мл конечных клеток добавляли в колбу, объемом 1 л.

120 мкг ДНК разбавляли в 8 мл среды OptiPRO SFM (Gibco, № по каталогу: 12309-019), а 640 мкл реагента ExpiFectamine CHO (Gibco, № по каталогу: 100033022) разводили в 7,4 мл среды OptiPRO SFM (Gibco, кат. №: 12309-019), соответственно, а затем смешивали. Смешанный раствор подвергали реакции при комнатной температуре в течение 3 минут, а затем распределяли в инокулированную колбу до 6×10⁶ клеток/мл и трансфицировали. Ее устанавливали на орбитальный шейкер в инкубаторе при 37°C, влажности 80% или более, 8% CO₂ и культивировали при 95 об/мин (диаметр встряхивания 50 мм) в течение 18 часов. Через 18 часов добавляли 1200 мкл ExpiFectamine CHO Enhancer (Gibco, номер по каталогу: 100033019) и 48 мл подпитки ExpiCHO Feed (Gibco, номер по каталогу: A29101-01) и помещали на орбитальный шейкер в инкубаторе при 37 °C, влажности 80 % или более, 8 % CO_2, и культивировании при 95 об/мин в течение 7-8 дней. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 3500 об/мин в течение по меньшей мере 30 минут для получения только культурального раствора для экспрессии акцепторного белка без клеточного осадка. Полученный культуральный раствор фильтровали через два фильтра (Satorius stedim, кат.№: DH-ST-29MDL20MC5FFV) (Satorius stedim, кат. №: DH-ST-5441307G4OOB) для удаления примесей.

Отбирали 80 мкл полученного культурального раствора, добавляли 20 мкл красителя, уменьшающего загрузку образца в 5 раз, и перемешивали, и смесь оставляли стоять при 95 °C в течение 5 минут. Чтобы сравнить уровни экспрессии на геле, добавляли и смешивали 80 мкл бычьего сывороточного альбумина, который был разбавлен до 62,5, 125 и 250 мг/мл, и 20 мкл красителя, уменьшающего загрузку образца в 5 раз, и смесь выдерживали при 95°С в течение 5 минут. Подготовленный образец и маркерный белок для проверки размера наносили на 10% гель трис-глицина. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим R при осторожном встряхивании и относительно количественно определяли концентрацию акцепторного белка на основе полосы белка бычьего сывороточного альбумина.

Пример 3

Очистка акцепторного белка

Культуральный раствор акцепторного белка, экспрессированного в примере 2, наносили на колонку со смолой Blue sepharose HP (GE, кат. №: 17-0413-01), уравновешенную равновесным буфером (20 мМ фосфат натрия, pH 7,0). Примеси удаляли с помощью предварительной элюции (20 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 0,15 М KCl), а акцепторный белок выделяли с помощью элюирующего буфера (20 мМ фосфата натрия, pH 7,0, 0,6 М KCl). Извлеченный акцепторный белок подвергали диализу с 20 мМ буфером фосфата натрия, pH 7,0, для удаления солей и проводили ультрафильтрацию, так что конечный образец составлял 5 мг/мл. Результаты очистки акцепторного белка с помощью SDS-PAGE показаны на фиг. 1.

Пример 4

Экспрессия донорного белка в клетках E. coli

Последовательность донорного гена, кодирующего донорный белок, трансформировали в вектор pET21a с меткой His-SUMO, а затем плазмиду, в которую был вставлен донорный ген, добавляли к компетентным клеткам BL21(DE3) и трансформировали путем обработки тепловым шоком при 42 °C в течение 1 минуты и высевали на твердую среду LB, содержащую ампициллин, а затем стационарно культивировали при 37 °C в течение не менее 16 часов с получением колоний. Отбирали одну колонию и инокулировали в 50 мл среды LB, а затем проводили культивирование посевного материала при 37°C и 220 об/мин в течение 16 часов.

В случае донорного белка (Донор-191, D -191), содержащего в качестве биомолекулы GIP, основное культивирование проводили путем посева посевного культурального раствора в 1 л среды LB, содержащей ампициллин в соотношении 1:100. Культивирование проводили при 37°С и 220 об/мин в течение 2 часов. После этого, когда OD600 нм достигала 0,6, добавляли 0,25 М IPTG и культивировали при 16 °C и 220 об/мин в течение 20 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 3500 об/мин в течение 30 минут с получением влажных клеток E. coli.

В случае донорного белка (Донор-192, D -192), содержащего в качестве биомолекулы IL-1RA, основное культивирование проводили путем посева посевного культурального раствора в 1 л среды LB, содержащей ампициллин в соотношении 1:100. Аутоиндукцию проводили при 37°С и 220 об/мин в течение 24 часов. После завершения культивирования проводили центрифугирование при 3500 об/мин в течение 30 минут с получением влажных клеток E. coli.

Пример 5

Очистка донорного белка в клетках E. coli

Культивированный донорский белок очищали следующим методом, и процесс очистки показан на фиг. 2.

Лизис / обработка ультразвуком

Влажные клетки, полученные путем культивирования, ресуспендировали с использованием буфера для лизиса (20 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 0,02 М имидазол, 0,1 мМ PMSF). Образцы лизиса помещали на лед и обрабатывали ультразвуком в условиях включения/выключения Pules = 5 сек/3 сек и амплитуды 45% в течение 15 минут. Лизат получали центрифугированием при 14000 об/мин в течение 30 минут с получением только супернатанта.

Очистка захватом

Лизат загружали на Ni-сефарозную смолу (QIAGEN, кат. номер: 30250). После того, как загрузка образца была завершена, неспецифический белок достаточно промывали и удаляли с использованием связывающего буфера (20 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 0,02 М имидазол). После этого меченный Hig-SUMO донорный белок извлекали с использованием буфера для элюирования (20 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 0,25 М имидазол). Извлеченный донорный белок, меченный His-SUMO, подвергали диализу с 20 мМ буфером фосфата натрия, pH 7,0, для удаления солей и имидазола. Результаты, полученные путем подтверждения очистки донорного белка через колонку с никелем с помощью SDS-PAGE, показаны на фиг. 3 и 4.

Ферментное расщепление SENP1

Меченный His-SUMO донорный белок и SENP1 подвергали расщеплению ферментом SENP1 при соотношении 100 мг: 1 мг. Концентрацию белка, извлеченного Ni-очисткой, определяли количественно, и SNEP1 (внутренний), соответствующий 1/100 мас./мас. количества (мг) меченого His-SUMO донорного белка, смешивали. Реакционной смеси давали постоять при комнатной температуре (от 15 до 25 °C) в течение 1 часа.

Удаление His-SUMO

Реакционную смесь наносили на Ni-сефарозную смолу (QIAGEN, № по каталогу: 30250), уравновешенную равновесным буфером (20 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 0,02 М имидазол). Выполняли загрузку образца, и донорному белку, в котором была расщеплена метка His-SUMO, позволяли протекать. После завершения загрузки образца оставшийся донорный белок извлекали с использованием равновесного буфера (20 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 0,5 М NaCl, 0,02 М имидазола), а извлеченный донорный белок подвергали диализу с 20 мМ фосфатом натрия, буфер с pH 7,0, для удаления солей и имидазола. Ультрафильтрацию проводили так, чтобы конечный донорный продукт составлял 10 мг/мл. Результаты, полученные путем подтверждения очистки удаления His-SUMO с помощью SDS-PAGE, показаны на фиг. 5 и 6.

Очистка

Донор, извлеченный на предыдущей стадии, загружали на колонку Capto Q ImpRes (GE, кат. №: 17-5470-15), уравновешенную равновесным буфером (20 мМ фосфата натрия, буфер pH 7,0). Донорному белку давали пройти. Извлеченные белки концентрировали до высокой концентрации. Результаты полирующей очистки донорного белка показаны на фиг. 7 и 8.

Пример 6

Конъюгирование

Как показано на фиг. 9, конъюгацию проводили с использованием акцепторного белка, полученного в примере 3, и донорного белка, полученного в примере 5. Готовили смесь условий, показанных в таблице 3 ниже, и реакцию конъюгации проводили при 30°С в течение 4 часов.

Таблица 3 Акцептор Донор ATP mUBA1 UBC13
/MMS2 Буфер Восстанавливающий агент Об. Условие 10 мкМ 15 мкМ 4 мМ 1 мкМ 10 мкМ 50 мМ Tris pH7.6,
2.5 мМ MgCl2 0.05 мМ TCEP 100 мл

10 мкг акцептора загружали на 8% SDS-PAGE и подтверждали степень конъюгации для реакции. Результаты показаны на фиг. 10 и 11.

Пример 7

Удаление фермента с помощью Ni-сефарозы

Для тог, чтобы извлечь только образец конъюгата, реакционную смесь наносили на Ni-сефарозную смолу (QIAGEN, номер по каталогу: 30250), уравновешенную равновесным буфером (20 мМ фосфат натрия, рН 8,0, 0,15 М NaCl). После завершения загрузки образца примеси удаляли с помощью уравновешивающего буфера (20 мМ фосфата натрия, рН 8,0, 0,5 М NaCl). После этого конъюгат извлекали с использованием буфера для элюирования (25 мМ Трис, рН 8,0, 0,15 М NaCl, 0,01 М имидазол). Извлеченный белковый конъюгат (С-191 и С-192) подвергали диализу с 20 мМ буфером фосфата натрия, рН 7,0, для удаления солей и имидазола. Результаты, полученные путем подтверждения очистки Ni с помощью хроматографии, показаны на фиг. 12.

Пример 8

Очистка

Конъюгат, полученный на предыдущей стадии, наносили на колонку Capto Q ImpRes (GE, кат. №: 17-5470-15), уравновешенную равновесным буфером (25 мМ фосфата натрия, буфер pH 7,0). Конъюгат извлекали с использованием буфера для элюирования (25 мМ фосфата натрия, рН 7,0, 158 мМ буфера NaCl). Извлеченный белковый конъюгат подвергали диализу с 20 мМ буфером фосфата натрия, рН 7,0, для удаления солей и имидазола. Ультрафильтрацию проводили так, чтобы конечный продукт конъюгата составлял 5 мг/мл. Результаты показаны на фиг. 13 и 14.

Пример 9

Составление

Белковый конъюгат, извлеченный из AEX, подвергали диализу с буфером для составления (4,6 мМ гистидина, 5,7 мМ трис, pH 7,5, 10 мМ аргинина, 0,1 г/мл трегалозы) для удаления солей и имидазола. Ультрафильтрацию проводили так, чтобы конечный продукт конъюгата составлял 5 мг/мл. Результаты показаны на фиг. 15.

Тестовый пример

Анализ накопления цАМФ

Для тестирования белковых конъюгатов C-191 и C-192, которые представляют собой четырех-направленные (тетра) агонисты/антагонисты акцептора GCG/GLP-1/FGF21/GIP или GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, приготовленные в примерах 1 - 9, для уровня активности агонистов GLP-1, GCG и GIP на клеточном уровне (in vitro), анализ накопления цАМФ проводили в клеточной линии, в которой акцептор GLP-1, акцептор GIP и акцептор GCG подвергали сверхэкспрессии временно или стабильно, соответственно, с использованием набора Cisbio cAMP Gs Dynamic #62AM4PEC следующим образом.

Получение клеток (временное)

Клетки НЕК293 инкубировали в течение 2-3 дней в инкубаторе при 37 °С и 5% СО₂ так, чтобы концентрация клеток НЕК293 в колбе Т-75 составляла от 70 до 80%. Среду удаляли и обрабатывали 2 мл TryPLE Express, а затем инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 3-5 минут и клетки открепляли. Их разбавляли добавлением 6 мл культуральной среды (MEM, 10 % FBS, 1 % Anti-anti) и переносили в пробирку на 15 мл, а затем центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут. Супернатант отбрасывали и выливали в 5 мл среды. Подсчитывали количество клеток и доводили концентрацию до 3×10⁵ клеток/мл. 2 мл помещали в 6-луночный планшет и инкубировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в течение 24 часов. Культуральную среду удаляли и вносили 1,7 мл среды без антибиотика. FuGENE6 и каждую акцепторную плазмиду добавляли к Opti-MEM в соответствующем количестве и культивировали при комнатной температуре в течение 5 минут, соответственно. Каждую смесь перемешивали и культивировали при комнатной температуре в течение 15 минут. Смешанный раствор вносили в соответствующие лунки и инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов. Среду удаляли, клетки промывали 2 мл предварительно подогретого PBS. Вносили по 0,5 мл аккутазы на лунку и инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 5 минут, после чего клетки отделяли. В это время проверяли под микроскопом, полностью ли отслоились клетки, и пластину ударяли, чтобы предотвратить отслоение клеток. Добавляли по 2,5 мл предварительно нагретого до 37 °C буфера для анализа (0,5% BSA, 2 мМ IBMX в PBS) на лунку, переносили в пробирку на 15 мл и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, а затем снова высвобождали в 2 мл буфера для анализа. Подсчитывали количество клеток и доводили концентрацию до 400000 клеток/мл в буфере для анализа.

Получение клеток (стабильное)

Клетки, в которых акцептор GLP-1 (Genscript, кат. № M00451), акцептор GIP (Genscript, кат. № M00486) и акцептор GCG (Genscript, кат. № M00345) были сверхэкспрессированы, культивировали таким образом, что концентрация клеток в колбе Т-75 составляла от 70 до 80%. Среду удаляли, клетки промывали 2 мл предварительно нагретого до 37°С PBS. Вносили 1 мл аккутазы и инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 5 минут, после чего клетки отделяли. В это время проверяли под микроскопом, полностью ли отслоились клетки, и пластину ударяли, чтобы предотвратить отслоение клеток. Добавляли по 3 мл предварительно нагретого до 37 °C буфера для анализа на лунку, переносили в пробирку на 15 мл и центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, а затем снова высвобождали в 2 мл буфера для анализа. Подсчитывали количество клеток и доводили концентрацию до 400000 клеток/мл в буфере для анализа.

Процедура

5 мкл подготовленных клеток распределяли в 96-луночный белый планшет малого объема. По 5 мкл каждого из эталона и образца (2Х), приготовленных путем 4-кратного серийного разведения, дозировали с двумя повторениями и инкубировали в инкубаторе при 5% СО₂ в течение 30 минут. В это время в контрольную и пустую лунки добавляли по 5 мкл буфера для анализа. Вносили 5 мкл 1 х раствора цАМФ-d2. В это время в пустую лунку добавляли 5 мкл буфера для лизиса и детекции. Вносили 5 мкл 1X раствора анти-цАМФ-криптата и культивировали в течение 1 часа при комнатной температуре в состоянии, когда свет был заблокирован, а затем измеряли флуоресценцию с помощью планшет-ридера.

Измерение и анализ

Флуоресценцию образца в планшете измеряли с помощью прибора Synergy Neo2 (длина волны возбуждения: 330 нм, длина волны испускания: 665 нм и 620 нм).

Соотношение HTRF рассчитывали следующим образом:

Кроме того, коэффициент дельты (Δ R) рассчитывали следующим образом.

Δ R = Отношение_{Образец} – Отношение_фон = Сигнал - фоновая флуоресценция

Значения EC50 были получены в виде значений графика соотношения HTRF с использованием GraphPad Prism 8 (подгонка кривой log (агонист) относительно нормализованного ответа - уравнение с переменным наклоном).

Графики соотношения HTRF для GLP-1R (акцептор GLP-1), GIPR (акцептор GIP) и GCGR (акцептор GCG) показаны на фиг. 16-18, а значения EC50 были рассчитаны и показаны в таблице 4 ниже.

Таблица 4 EC50
(пМ) GLP-1R GIPR GCGR 1 2 Среднее SD 1 2 Среднее SD 1 2 Среднее SD Лираглутид 40.7 36.7 38.7 2.83 - - - - - - - - Дулаглутид 1.23 0.9 1.07 0.23 - - - - - - - - GIP(1-39) - - - - 15.4 14.1 14.8 0.92 - - - - GCG - - - - - - - - 39.3 30.4 34.9 6.29 C-191 25.4 36.5 31.0 7.85 110 85 97.5 17.7 4487 3832 4160 463 C-192 13.2 15.9 14.6 1.91 - - - - 286 251 269 24.7

Как показано в Таблице 4, было подтверждено, что С-191 обладал активностью в отношении каждого из акцептора GLP-1, акцептора GIP и акцептора GCG. Кроме того, было подтверждено, что С-192 также обладал активностью в отношении каждого из акцептора GLP-1 и акцептора GCG.

В частности, было подтверждено, что с точки зрения активности в отношении акцептора GLP-1 С-191 и С-192 проявляли более высокую активность, чем лираглутид, использованный в качестве контрольной группы. Кроме того, было подтверждено, что С-192 обладал более высокой активностью примерно в 2 раза, чем С-191, с точки зрения активности в отношении акцептора GLP-1, и имел более высокую активность, примерно в 15 раз, чем С-191, с точки зрения активности в отношении акцептора GCG

Тестовый пример 2

Функциональный анализ FGFR1/KLB

Для тестирования белковых конъюгатов C-191 и C-192, которые представляют собой четырех-направленные (тетра) агонисты/антагонисты акцептора GCG/GLP-1/FGF21/GIP или GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, приготовленных в примерах 1 - 9, для уровня активности агониста FGF21 на клеточном уровне (in vitro), функциональный анализ FGFR1/KLB проводили на клеточной линии (Discover X, кат. № 93-118C3), в которой FGFR1/KLB был сверхэкспрессирован, с помощью комплекта обнаружения PathHunter (Discover X, номер по каталогу 93-0001) следующим образом.

Высевание клеток

Клетки культивировали до 70-80% заполнения в колбе Т-75. Среду удаляли и промывали 5 мл предварительно подогретого PBS. PBS удаляли и добавляли 2 мл реагента для отделения клеток AssayComplete, а затем инкубировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂ в течение 3 минут, после чего прикрепленные клетки отделяли. Их смешивали с 6 мл реагента для культивирования клеток AssayComplete 0, смесь переносили в пробирку на 15 мл, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, а затем снова высвобождали в 5 мл реагента для культивирования клеток. Подсчитывали количество клеток и доводили концентрацию до 500000 клеток/мл. Их переносили в резервуар и по 40 мкл на лунку вносили в белый 96-луночный планшет для культивирования клеток половинной площади с помощью многоканальной пипетки (20 000 клеток/лунка). В пустую лунку вносили только 40 мкл реагента для культивирования клеток. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов для прикрепления.

Процедура

По 10 мкл каждого из rhFGF21 (5X) и тестируемого образца (5X), приготовленных путем 4-кратного серийного разведения, распределяли при двух повторениях и культивировали при комнатной температуре в течение 4 часов. 10 мкл реагента для культивирования клеток AssayComplete 0 добавляли в контрольную и пустую лунки. После завершения культивирования среду удаляли и добавляли 50 мкл реагента для культивирования AssayComplete 0. Вносили 30 мкл реагента для обнаружения и проводили реагирование в состоянии, когда свет был заблокирован, при комнатной температуре в течение 1 часа, а затем измеряли люминесценцию с помощью планшет-ридера.

Измерение и анализ

Люминесценцию образца в пластине измеряли на приборе Synergy Neo2.

Дельта RLU (относительная единица люминесценции) (Δ RLU) рассчитывали следующим образом.

Δ RLU = RLU_{образца} - RLU_фона = сигнал - фоновая люминесценция

Кроме того, кратность индукции по сравнению с контрольной группой рассчитывали следующим образом.

Значения EC50 были получены на основе значений кратности индукции для каждой концентрации с использованием GraphPad Prism 8 следующим образом (подгонка кривой log (агонист) относительно нормализованного ответа - уравнение с переменным наклоном).

Графики показаны на фиг. 19, а значения EC50 были рассчитаны и показаны в таблице 5 ниже.

Таблица 5 EC50 (нМ) rhFGF21 C-191 C-192 1 0.75 92.2 42.2 2 0.88 45.1 40.5 Среднее 0.82 68.7 41.4 SD 0.09 33.3 1.20

Как показано в Таблице 5 выше, было подтверждено, что как C-191, так и C-192 обладают активностью в отношении акцептора FGFR1/KLB. Кроме того, было подтверждено, что с точки зрения активности в отношении акцептора FGFR1/KLB С-192 обладал более высокой активностью примерно на 40%, чем С-191.

Тестовый пример 3

Люциферазный анализ репортерного гена NF-κB (анализ репортерного)

Для тестирования белковый конъюгат C-192, который представляет собой четырех-направленный (тетра) агонист/антагонист акцептора GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, приготовленный в примерах 1-9, на способность IL-1RA ингибировать активность NF-κB с помощью IL-1β на клеточном уровне (in vitro), анализ люциферазы выполняли в репортерной клеточной линии NF-κB (Luc) (BPS Bioscience, кат. № 60650) следующим образом.

Высевание клеток

Клетки культивировали до 70-80% заполнения в колбе Т-75. Среду удаляли и один раз промывали 5 мл предварительно подогретого PBS. PBS удаляли, добавляли 1 мл TryPLE Express и инкубировали в течение 5 минут в инкубаторе при 37°C и 5% CO₂, после чего клетки отделяли. Их смешивали с 4 мл среды для анализа (10 % FBS, 1 % антибиотика в DMEM) и смесь переносили в пробирку на 15 мл, центрифугировали при 1000 об/мин в течение 3 минут, а затем снова добавляли в 5 мл среды для анализа. Подсчитывали количество клеток и доводили концентрацию до 500000 клеток/мл. Их переносили в резервуар и по 40 мкл на лунку вносили в белый 96-луночный планшет для культивирования клеток половинной площади с помощью многоканальной пипетки (20 000 клеток/лунка). В пустую лунку вносили только 40 мкл среды для анализа. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37°С и 5% СО₂ в течение 24 часов для прикрепления.

Процедура

По 5 мкл каждого из эталона (10Х) и образца (10Х), приготовленных 4-кратным серийным разведением, распределяли при двух повторениях. После этого вносили 5 мкл 50 пМ IL-1β (10X) и инкубировали в инкубаторе при 5% CO₂ в течение 4 часов. Распределяли по 50 мкл реагента ONE-Glo (Promega, № по каталогу E6120) и культивировали при комнатной температуре в течение 5 минут, а затем измеряли люминесценцию с помощью прибора Synergy Neo2. В это время перед обработкой реагентом ONE-Glo планшет вынимали из инкубатора на 15 минут и давали ему достичь комнатной температуры.

Дельта RLU (относительная единица люминесценции) (Δ RLU) рассчитывали следующим образом.

ΔRLU = RLU _{образца} - RLU _фона = сигнал - фоновая люминесценция

Значения IC50 получали как ΔRLU для каждой концентрации с использованием GraphPad Prism 8 следующим образом (подгонка кривой log (антагонист) относительно нормализованного ответа - уравнение с переменным наклоном).

Графики показаны на фиг. 20, а значения IC50 были рассчитаны и показаны в таблице 6 ниже.

Таблица 6

IC50 (пМ) rhIL-1RA C-192 1 39.9 561 2 51.5 594 3 46.6 708 4 51.9 568 Среднее 47.5 607 SD 4.85 68.4

Как показано в Таблице 6 выше, было подтверждено, что C-192 ингибирует активность NF-κB под действием IL-1β.

Тестовый пример 4

Тест эффективности in vivo: оценка эффективности в отношении неалкогольного стеатогепатита

Эффективность in vivo белкового конъюгата C-192, который представляет собой четырех-направленный (тетра) агонист/антагонист рецептора GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, полученный в примерах 1-9, в отношении неалкогольного стеатогепатита была подтверждена на мышах C57BL/ 6J, у которых жировая дистрофия печени была вызвана кормлением MCD (диета с дефицитом L-аминокислот с дефицитом метионина и холина). Мышиная модель MCD является наиболее часто используемым методом для тестирования эффективности против неалкогольного стеатогепатита, и известно, что гистологический вид индуцированной ткани печени со 2-й по 4-ю неделю гистологически аналогичен таковому при неалкогольном стеатогепатите человека. Есть много прецедентов, когда ряд фармацевтических компаний и научных кругов проводили испытания с различными веществами.

Жирную печень индуцировали путем кормления MCD самцов мышей C57BL/6J в течение 8 недель, а затем мышей разделили на 6 групп, показанных в Таблице 7 ниже, и вводили лекарственное средство в течение 4 недель. В качестве сравнительного вещества использовали два коммерчески доступных в настоящее время препарата: лираглутид (Saxenda) и дулаглутид (Trulycity). Вводимую композицию повторно вводили подкожно с помощью одноразового шприца в соответствии с каждым циклом введения. В течение 8-недельного периода диеты массу тела измеряли один раз в неделю, а через 8 недель значительное разделение на группы проводили по массе тела. Нормальная контрольная группа получала MCS (диета L-аминокислот с достаточным содержанием метионина и холина).

Таблица 7 № Группа Диета Вводимая композиция Вводимая доза Цикл введения Число введений 1 Группа нормального контроля MCS - - - - 2 Группа отрицательного контроля MCD эксципиент - - - 3 Экспериментальная группа A MCD C-192 5 нмоль/кг 1 раз/2 дня 14 раз 4 Экспериментальная группа B MCD C-192 40 нмоль/кг 1 раз/2 дня 14 раз 5 Сравнительная группа A MCD Лираглутид 50 нмоль/кг 2 раза/1 день 56 раз 6 Сравнительная группа B MCD Дулаглутид 2 нмоль/кг 1 раз/2 дня 14 раз

В течение 4-недельного периода введения наблюдали общие симптомы и поведение, а массу тела измеряли один раз в неделю после начала введения и в день извлечения ткани. Забор крови и выделение ткани печени производили в день окончания наблюдения, кровь подвергали гематолого-биохимическому исследованию, а извлеченную ткань печени подвергали гистопатологическому исследованию.

Аланинаминотрансферазу (ALT), которая используется в качестве основного индикатора заболевания печени, измеряли с помощью гематолого-биохимического теста, и результаты показаны в Таблице 8 ниже и на фиг. 21.

Таблица 8 № Группа ALT 1 Группа нормального контроля 18.3 2 Группа отрицательного контроля 230.6 3 Экспериментальная группа A 178.3 4 Экспериментальная группа B 126.3 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 223.0 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 220.5

Как показано в Таблице 8 выше, было обнаружено, что значение ALT практически не снижалось в группе, получавшей лираглутид, и в группе, получавшей дулаглутид (сравнительные группы А и В), но значение ALT было значительно снижено в группе, получавшей С-192.

Поскольку ALT указывает на степень повреждения печени, можно видеть, что при введении белкового конъюгата согласно настоящему изобретению степень повреждения печени снижается.

Кроме того, значения ALT/AST показаны в таблице 9 ниже и на фиг. 22.

Таблица 9 № Группа ALT/AST значение 1 Группа нормального контроля 1.77 2 Группа отрицательного контроля 0.98 3 Экспериментальная группа A 1.35 4 Экспериментальная группа B 1.53 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 0.99 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 0.79

Как показано в Таблице 9 выше, было подтверждено, что значение ALT/AST было меньше 1,0 в группе, получавшей лираглутид, и в группе, получавшей дулаглутид (сравнительные группы А и В), но было обнаружено, что значение ALT/AST было выше 1,0 в группе, получавшей С-192.

Поскольку значение ALT/AST часто составляет менее 1 при заболевании печени, можно видеть, что при введении белкового конъюгата согласно настоящему изобретению степень поражения печени снижается.

Кроме того, гистопатологический тест был выполнен путем наблюдения посредством окрашивания H&E и трихромом по Массону, и результаты показаны на фиг. 23. В случае неалкогольного стеатогепатита возникает стеатоз и воспаление в дольках, а воспалительные клетки могут быть идентифицированы путем окрашивания тканей. Как показано на фиг. 23, можно видеть, что группа, которой вводили белковый конъюгат в дозе 40 нмоль/кг (экспериментальная группа B), показала улучшение жировых и воспалительных клеток до значений группы нормального контроля, по сравнению с группой отрицательного контроля.

Кроме того, на основании критериев оценки, показанных в Таблице 10 ниже, оценивали показатель стеатоза, показатель лобулярного воспаления и NAS (показатель активности NAFLD).

Таблица 10 Объект Определение Оценка Стеатоз Оценка поражения паренхимы стеатозом от низкой до средней степени <5% 0 5~33% 1 >33~66% 2 >66% 3 Дольковое воспаление Общая оценка всех очагов воспаления Нет очагов 0 <2 очагов на 200 мкм поля 1 2~4 очагов на поле 200 мкм 2 >4 очага на 200мкм поля 3 Баллонирование нет 0 Несколько баллонных клеток 1 Баллонирование множества клеток/выпуклостей 2

Результаты оценки показаны в таблицах 11 - 13 ниже и на фиг. 24 - 26.

Таблица 11 № Группа Оценка стеатоза (стеатоз) 1 Группа нормального контроля 0 2 Группа отрицательного контроля 2.1 3 Экспериментальная группа A 1.7 4 Экспериментальная группа B 0.9 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 1.6 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 1.9

Таблица 12 № Группа Оценка лобулярного воспаления
(Дольковое воспаление) 1 Группа нормального контроля 0.3 2 Группа отрицательного контроля 1.3 3 Экспериментальная группа A 1.2 4 Экспериментальная группа B 0.2 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 0.5 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 1.5

Таблица 13 № Группа NAS (оценка активности NAFLD) 1 Группа нормального контроля 0.3 2 Группа отрицательного контроля 3.4 3 Экспериментальная группа A 2.9 4 Экспериментальная группа B 1.2 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 2.2 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 3.4

Как показано в таблицах 11-13 выше, все группы, которым вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, продемонстрировали отличные результаты, и, в частности, группа, которой вводили белковый конъюгат в дозе 40 нмоль/кг (экспериментальная группа В), показала значительно более отличные результаты оценки, чем группа, которой вводили лираглутид, и группа, которой вводили дулаглутид.

Ткань печени анализировали с помощью ELISA на TGF-β, маркер фиброза печени, и результаты показаны в таблице 14 ниже и на фиг. 27.

Таблица 14 № Группа Печеночный TGF-β 1 Группа нормального контроля 74.40 2 Группа отрицательного контроля 164.10 3 Экспериментальная группа A 135.50 4 Экспериментальная группа B 98.70 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 136.40 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 159.60

Как показано в Таблице 14 выше, группа, которой вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, демонстрировала пониженное значение TGF-β, и, в частности, группа, которой вводили белковый конъюгат в дозе 40 нмоль/кг (экспериментальная группа В), демонстрировала почти подобное значение по сравнению с обычной контрольной группой.

Кроме того, накопление триглицеридов в ткани печени анализировали с использованием набора для анализа триглицеридов, и результаты показаны в таблице 15 ниже и на фиг. 28. Количество триглицеридов в ткани печени почти не снижалось в группе, получавшей лираглутид, и в группе, получавшей дулаглутид, но группа, которой вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, демонстрировала значение, почти такое же, как и у нормальной контрольной группы.

Таблица 15 № Группа Печеночный триглицерид 1 Группа нормального контроля 17.76 2 Группа отрицательного контроля 40.31 3 Экспериментальная группа A 25.69 4 Экспериментальная группа B 24.43 5 Сравнительная группа A (Группа введения лираглутида) 40.69 6 Сравнительная группа B (Группа введения дулаглутида) 40.78

В результате было обнаружено, что группа, которой вводили белковый конъюгат С-192 согласно настоящему изобретению, демонстрировала значительно более превосходный эффект во всех экспериментах по сравнению с группой, которой вводили лираглутид, и группой, которой вводили дулаглутид.

Тестовый пример 5

Тест эффективности in vivo: оценка эффективности в отношении неалкогольного стеатогепатита

Эффективность in vivo белкового конъюгата C-191, который представляет собой четырех-направленный (тетра) агонист/антагонист акцептора GCG/GLP-1/FGF21/GIP, полученный в примерах 1-9, в отношении неалкогольного стеатогепатита была проверена на мышах C57BL/6J, у которых ожирение печени было вызвано кормлением MCD (диета L-аминокислот с достаточным содержанием метионина и холина).

Мышей разделили на 4 группы, как показано в Таблице 16 ниже, и эксперимент проводили так же, как в тестовом примере 4 выше. В качестве сравнительного вещества использовали коммерчески доступный в настоящее время дулаглутид (Trulycity).

Таблица 16 № Группа Диета Вводимая композиция Вводимая доза Цикл введения Число введений 1 Группа нормального контроля MCS - - - - 2 Группа отрицательного контроля MCD Эксципиент - - - 3 Экспериментальная группа A MCD C-191 10 нмоль/кг 1 раз/2 дня 14 раз 4 Сравнительная группа B MCD Дулаглутид 2 нмоль/кг 1 раз/2 дня 14 раз

В течение 4-недельного периода введения наблюдали общие симптомы и поведение, а массу тела измеряли один раз в неделю после начала введения и в день извлечения ткани. Забор крови и выделение ткани печени производили в день окончания наблюдения, кровь подвергали гематолого-биохимическому исследованию, а извлеченную ткань печени подвергали гистопатологическому исследованию.

Аланинаминотрансферазу (ALT), которая используется в качестве основного индикатора заболевания печени, измеряли с помощью гематолого-биохимического теста, и результаты показаны в таблице 17 ниже и на фиг. 29.

Таблица 17 № Группа ALT 1 Группа нормального контроля 19.1 2 Группа отрицательного контроля 312.4 3 Экспериментальная группа A 151.9 4 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 246.8

Как показано в Таблице 17 выше, было подтверждено, что значение ALT почти не снижалось в группе, которой вводили дулаглутид, но значение ALT было значительно снижено в группе, которой вводили С-191.

Поскольку ALT указывает на степень повреждения печени, можно видеть, что при введении белкового конъюгата согласно настоящему изобретению степень повреждения печени снижается.

Кроме того, значения AST/ALT показаны в таблице 18 ниже и на фиг. 30.

Таблица 18 № Группа AST/ALT значение 1 Группа нормального контроля 1.84 2 Группа отрицательного контроля 0.82 3 Экспериментальная группа A 0.98 4 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 0.76

Как показано в таблице 1 8 выше, было подтверждено, что значение ALT/AST составляло 0,76 в группе, получавшей дулаглутид, но было подтверждено, что значение ALT/AST составляло 0,98 в группе, получавшей С-191, что выше, чем в группе, получавшей дулаглутид.

Поскольку значение ALT/AST часто составляет менее 1 при заболевании печени, можно видеть, что при введении белкового конъюгата настоящему изобретению степень поражения печени снижается.

Кроме того, гистопатологический тест был выполнен путем наблюдения посредством окрашивания H&E и трихромом по Массону, и результаты показаны на фиг. 31. В случае неалкогольного стеатогепатита возникает стеатоз и воспаление в дольках, а воспалительные клетки могут быть идентифицированы путем окрашивания тканей. Как показано на фиг. 31, можно видеть, что группа, которой вводили белковый конъюгат в дозе 10 нмоль/кг, показала улучшение жировых и воспалительных клеток до значений группы нормального контроля, по сравнению с группой отрицательного контроля.

Кроме того, на основании критериев оценки, показанных в Таблице 10 выше, оценивали показатель стеатоза, показатель лобулярного воспаления и NAS (показатель активности NAFLD).

Результаты оценки показаны в таблицах 19 - 21 ниже и на фиг. 32 - 34.

Таблица 19 № Группа Оценка стеатоза (стеатоз) 1 Группа нормального контроля 0 2 Группа отрицательного контроля 2.4 3 Экспериментальная группа A 1.4 4 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 1.8

Таблица 20 № Группа Оценка лобулярного воспаления
(Дольковое воспаление) 1 Группа нормального контроля 0.2 2 Группа отрицательного контроля 1.6 3 Экспериментальная группа A 1.0 4 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 1.6

Таблица 21 № Группа NAS (оценка активности NAFLD) 1 группа нормального контроля 0.2 2 группа отрицательного контроля 4.0 3 Экспериментальная группа A 2.4 6 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 3.4

Как показано в таблицах 19-21 выше, все группы, которым вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, продемонстрировали отличные результаты и показали значительно более отличные результаты оценки, чем группа, которой вводили дулаглутид.

Ткань печени анализировали с помощью ELISA на TGF-β, маркер фиброза печени, и результаты показаны в таблице 22 ниже и на фиг. 35.

Таблица 22 № Группа Печеночный TGF-β 1 Группа нормального контроля 77.3 2 Группа отрицательного контроля 177.9 3 Экспериментальная группа A 117.4 4 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 165.3

Как показано в Таблице 22 выше, было подтверждено, что группа, которой вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, демонстрировала пониженное значение TGF-β, и это значение было значительно снижено по сравнению с группой, которой вводили дулаглутид.

Кроме того, накопление триглицеридов в ткани печени было проанализировано с использованием набора для анализа триглицеридов, и результаты показаны в таблице 23 ниже и на фиг. 36. Количество триглицеридов в ткани печени практически не уменьшилось в группе, получавшей дулаглутид, но группа, которой вводили белковый конъюгат согласно настоящему изобретению, показала значение, почти подобное нормальной контрольной группы.

Таблица 23 № Группа Печеночный триглицерид 1 Группа нормального контроля 17.13 2 Группа отрицательного контроля 40.09 3 Экспериментальная группа A 24.02 6 Сравнительная группа A (Группа введения дулаглутида) 36.08

В результате можно видеть, что группа, которой вводили белковый конъюгат С-191 согласно настоящему изобретению, демонстрировала значительно более превосходный эффект во всех экспериментах по сравнению с группой, которой вводили дулаглутид.

Тестовый пример 6

Тест эффективности in vivo: оценка эффективности в отношении ожирения

Для того, чтобы подтвердить эффект конъюгата белка C-192, который представляет собой четырех-направленный (тетра) агонист/антагонист акцептора GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, полученный в примерах 1-9, на снижение уровня липидов в крови, для оценки использовали мышей с индуцированным ожирением. Чтобы вызвать ожирение диетическим методом, 5-недельных мышей C57BL/6J приобретали в Central Lab. Animal Inc., и после того, как период акклиматизации продолжительностью около 7 дней был завершен, в течение 16 недель кормили западной диетой, чтобы вызвать у мышей ожирение. Как показано в Таблице 24 ниже, животных без аномалий отбирали с учетом средней массы тела и изменения массы тела, и разделение на группы проводили по 6 животных на группу, так что средняя масса тела в каждой группе была одинаковой. Что касается способа введения, подкожное введение осуществляли так же, как и запланированный клинический путь применения, а частота введения составляла 1 раз/2 дня в течение 8 недель, т.е. всего 28 раз.

Таблица 24 № Группа Средняя масса тела (г) Диета Вводимая композиция Вводимая доза Цикл введения Число введений 1 Группа нормального контроля 27.1 ± 1.3 Твердые корма для экспериментальных животных эксципиент - 1 раз/2 дня 28 раз 2 Группа отрицательного контроля 44.7 ± 2.3 RD западная диета эксципиент - 1 раз/2 дня 28 раз 3 Экспериментальная группа A 43.9 ± 1.1 RD западная диета C-192 10 нмоль/кг 1 раз/2 дня 28 раз 4 Экспериментальная группа B 42.1 ± 4.1 RD западная диета C-192 30 нмоль/кг 1 раз/2 дня 28 раз 5 Экспериментальная группа C 41.7 ± 4.4 RD западная диета C-192 60 нмоль/кг 1 раз/2 дня 28 раз

Для вводимой композиции эксципиент вводили группе нормального контроля и группе отрицательного контроля, а С-192 вводили в дозе 10, 30 и 60 нмоль/кг экспериментальной группе. В течение 8-недельного периода введения общие симптомы, такие как внешний вид, поведение и экскреция, наблюдали один раз в день. В день окончания введения отбирали кровь из брюшной полой вены, помещали в пробирку SST и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 15 минут для отделения сыворотки, а затем гематолого-биохимический анализатор (7180, HTTACHI, Япония) использовали для измерения биомаркеров, показанных в Таблице 25 ниже.

Таблица 25 Липидный биомаркер Единицы Способ измерения Триглицерид
(TG) мг/дл GPO-HMMPS бланкирование глицерином Свободная жирная кислота
(неэтерифицированная жирная кислота, NEFA) мкэкв/л ACS ACOD Общий холестерин
(T-Chol) мг/дл Холестериноксидаза -HMMPS Холестерин липопротеинов низкой плотности
(LDL- холестерин) мг/дл Селективный защитный ферментативный Холестерин липопротеинов высокой плотности
(HDL- холестерин) мг/дл Прямой

Чтобы оценить влияние C-192 на улучшение липидов, триглицериды (TG), свободные жирные кислоты (NEFA), общий холестерин (T-Chol), холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL) и холестерин липопротеинов высокой плотности (HD) в сыворотке измеряли, и результаты показаны в Таблице 26 ниже и на Фиг. 37-41.

Таблица 26 № группа TG
(мг/дл) NEFA
(мкэквив./л) T-Chol
(мг/дл) LDL
(мг/дл) HDL
(мг/дл) 1 Группа нормального контроля 14.7 1.2 105.3 2.9 62.8 2 Группа отрицательного контроля 26.0 1.5 241.8 21.7 99.2 3 Экспериментальная группа A 24.2 1.3 227.0 19.9 102.8 4 Экспериментальная группа B 18.0 1.1 162.0 13.6 74.7 5 Экспериментальная группа C 16.0 1.2 167.2 12.7 79.8

Как показано в Таблице 26 выше и на Фиг. 37-41, было подтверждено, что уровни связанных с липидами биомаркеров в крови были снижены в группе, которой вводили С-192. В частности, было подтверждено, что в случае группы, получавшей С-192 в дозе 60 нмоль/кг (экспериментальная группа С), триглицериды (TG) снижались на 38,5%, свободные жирные кислоты (NEFA) снижались на 20%, общий холестерин (Т- Chol) был снижен на 30,9%, холестерин липопротеинов низкой плотности (LDL- Chol) был снижен на 41,5%, а холестерин липопротеинов высокой плотности (HDL - Chol) был снижен на 19,6% по сравнению с группой отрицательного контроля. Кроме того, наблюдалась статистически значимая разница во всех биомаркерах, кроме холестерина липопротеинов высокой плотности, по сравнению с группой отрицательного контроля. Следовательно, можно видеть, что белковый конъюгат согласно настоящему изобретению снижает уровень липидов в крови у мышей с ожирением, вызванным диетой.

Тестовый пример 7

Тест эффективности in vivo: оценка эффективности в отношении диабета

Для подтверждения антидиабетической эффективности белкового конъюгата C-192, который представляет собой четырех-направленный (тетра) агонист/антагонист акцептора GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, приготовленный в примерах 1 - 9, мышей db/db, которые являются модельными мышами с диабетом 2 типа, использовали для проведения оценки. Мыши db/db являются животной моделью, у которой индуцируют ожирение и сахарный диабет 2 типа, потому что у мышей db/db имеется мутация в Lepr, гене-акцепторе лептина на хромосоме 4, что приводит к отсутствию передачи сигнала лептина, гормона, секретируемого адипоцитами. Мышей C57BL/6J использовали как нормальных животных, а самцов мышей 7-недельного возраста приобретали у Japan SLC и подвергали карантину и акклиматизации в течение 7 дней для получения 8-недельных мышей, которых использовали в качестве экспериментальных животных.

Как показано в Таблице 27 ниже, состав экспериментальной группы был разделен на группу нормального контроля, группу отрицательного контроля, группу, которой вводили тестируемое вещество, и группу положительного контроля. После завершения карантина и акклиматизации проводили разделение групп по 5 животных на группу так, чтобы масса тела и уровень глюкозы в крови были равными. Что касается способа введения, то подкожное введение осуществляли так же, как запланированный путь клинического применения, и введение осуществляли в течение 8 дней. Частота введения составляла 1 раз/1 день для группы нормального контроля, группы отрицательного контроля и экспериментальной группы и 1 раз/2 дня для группы положительного контроля.

Таблица 27 № Происхождение и виды Группа Вводимая композиция Вводимая доза Цикл введения Число введений 1 C57BL/6J мышь Группа нормального контроля эксципиент - 1 раз/1 день 8 раз 2 db/db мышь Группа отрицательного контроля эксципиент - 1 раз/1 день 8 раз 3 Экспериментальная группа A C-192 10 нмоль/кг 1 раз/1 день 8 раз 4 Экспериментальная группа B C-192 60 нмоль/кг 1 раз/1 день 8 раз 5 Группа положительного контроля Семаглутид 10 нмоль/кг 1 раз/2 дня 4 раз

Для вводимой композиции эксципиент вводили группе нормального контроля и группе отрицательного контроля, а C-192 вводили в дозе 10 и 60 нмоль/кг экспериментальной группе. В течение 8-дневного периода введения общие симптомы наблюдали один раз в сутки. Для подтверждения антидиабетического эффекта у мышей db/db измеряли уровень глюкозы в крови, массу тела, пищу и воду. Что касается уровня глюкозы в крови, измеряли уровень глюкозы в крови не натощак, и кровь брали из хвостовой вены 1 раз/2 дня перед введением, и уровень глюкозы в крови измеряли с помощью глюкометра (G-Doctor). Чтобы подтвердить изменения в массе тела, пище и воде, измерения проводили в 1-й день введения, 4-й день введения и 8-й день введения, и результаты показаны в таблице 28 ниже и на фиг. 42-49.

Таблица 28 № Группа Глюкоза
(мг/дл) Масса
(грамм) Еда
(грамм) Вода
(мл) 1 Группа нормального контроля 161.0 23.6 15.4 33.1 2 Группа отрицательного контроля 561.9 33.2 26.6 97.2 3 Экспериментальная группа A 409.6 33.7 20.4 61.5 4 Экспериментальная группа B 216.8 30.6 16.7 48.6 5 Группа положительного контроля 444.5 32.3 21.9 41.3

Как показано в Таблице 28 выше и на Фиг. 42-49, было подтверждено, что уровень глюкозы в крови, потребление пищи и потребление воды были снижены в группе, которой вводили С-192. В частности, в случае группы, получавшей С-192 в дозе 60 нмоль/кг (экспериментальная группа B), было подтверждено, что уровень глюкозы в крови на 9-й день достоверно снижался на 61,4 %, масса тела на 8-й день значительно сократилась на 7,8 %, потребление пищи значительно уменьшилось на 37,1 %, а потребление воды значительно уменьшилось на 50,0 % по сравнению с группой отрицательного контроля. Таким образом, можно видеть, что белковый конъюгат согласно настоящему изобретению проявляет антидиабетическое действие.

Тестовый пример 8

Анализ иммуногенности in silico

Анализ иммуногенности in silico проводили для каждого акцептора и донора, входящих в состав белковых конъюгатов C-191 и C-192, которые представляют собой четырех-направленный агонисты/антагонисты (тетра) акцептора GCG/GLP-1/FGF21/GIP или GCG/GLP-1/FGF21/IL-1RA, полученные в примерах 1-9. Иммуногенность относится к свойству, которое вызывает иммунный ответ при введении лекарственного средства в организм человека, и является фактором, влияющим не только на эффективность лекарственного средства, но и на его безопасность. Анализ in silico проводили с использованием базы данных последовательностей, индуцирующих иммуногенность, и программы компьютерного анализа, а оценку иммуногенности in vitro проводили с использованием PBMC человеческого происхождения.

В результате, как показано на фиг. 50-55, уровень индукции иммуногенности был предсказан в отношении 27 типов HLA, показанных в таблице 29 ниже, которые являются наиболее распространенными во всем мире.

Таблица 29 № последова-тельности HLA тип № последова-тельности HLA тип 1 HLA-DRB1*01:01 15 HLA-DRB5*01:01 2 HLA-DRB1*03:01 16 HLA-DQA1*05:01/DQB1*02:01 3 HLA-DRB1*04:01 17 HLA-DQA1*05:01/DQB1*03:01 4 HLA-DRB1*04:05 18 HLA-DQA1*03:01/DQB1*03:02 5 HLA-DRB1*07:01 19 HLA-DQA1*04:01/DQB1*04:02 6 HLA-DRB1*08:02 20 HLA-DQA1*01:01/DQB1*05:01 7 HLA-DRB1*09:01 21 HLA-DQA1*01:02/DQB1*06:02 8 HLA-DRB1*11:01 22 HLA-DPA1*02:01/DPB1*01:01 9 HLA-DRB1*12:01 23 HLA-DPA1*01:03/DPB1*02:01 10 HLA-DRB1*13:02 24 HLA-DPA1*01/DPB1*04:01 11 HLA-DRB1*15:01 25 HLA-DPA1*03:01/DPB1*04:02 12 HLA-DRB3*01:01 26 HLA-DPA1*02:01/DPB1*05:01 13 HLA-DRB3*02:02 27 HLA-DPA1*02:01/DPB1*14:01 14 HLA-DRB4*01:01

Было предсказано, что белковые последовательности каждого акцептора и донора имеют низкую вероятность связывания с антигенсвязывающими сайтами MHC I и MHC II для каждого из 27 типов HLA. Было предсказано, что безопасность будет высокой, поскольку каждый акцептор и донор обладают низкой иммуногенностью.

Тестовый пример 9

Скрининг API

Скрининг агонистов акцептора GLP-1

Чтобы протестировать уровни активности нативного GLP-1 и аналога GLP-1 на клеточном уровне (in vitro), анализ накопления цАМФ проводили таким же образом, как и в тестовом примере 1.

Значения EC50 для одиночных агонистов акцептора GLP-1 были рассчитаны и показаны в Таблице 30 ниже.

Таблица 30 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) комментарий SEQ ID NO Лираглутид Временная 43.0 ± 10.6 n=11 - Стабильная 50.3 ± 21.9 n=8 Дулаглутид Стабильная 1.45 ± 0.45 n=6 - GLP-1(7-36)_нативный Временная 4.00 n=1 SEQ ID NO: 4 GLP#1 Временная 159 n=1 SEQ ID NO: 5 GLP#3 Временная 2.25 ± 0.19 n=2 SEQ ID NO: 6 GLP#4 Временная 3.19 ± 0.74 n=2 SEQ ID NO: 7 GLP#5 Временная 7.52 n=1 SEQ ID NO: 8 GLP#6 Временная 1.50 ± 0.06 n=2 SEQ ID NO: 9 GLP#7 Временная 23.0 n=1 SEQ ID NO: 10 GLP#8 Временная 1.95 ± 0.03 n=2 SEQ ID NO: 11 GLP#9 Временная 0.71 ± 0.37 n=3 SEQ ID NO: 12 Стабильная 2.08 ± 1.60 n=4 GLP#10 Временная 8.26 ± 4.02 n=2 SEQ ID NO: 13 GLP#11 Временная 6.05 n=1 SEQ ID NO: 14 GLP#12 Временная 559 n=1 - GLP#13 Временная 31.9 ± 7.28 n=2 - GLP#14 Временная >5000 n=1 - GLP#15 Временная >5000 n=1 -

Значения EC50 для двойных агонистов акцептора GLP-1/GCG были рассчитаны и показаны в Таблице 31 ниже.

Таблица 31 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) комментарий SEQ ID NO GCG#2 Временная 52.0 ± 27.4 n=2 SEQ ID NO: 2 Стабильная 10.1 ± 1.23 n=2 GCG#3 Временная 43.9 ± 28.3 n=2 SEQ ID NO: 3 Стабильная 25.6 ± 26.9 n=3 GLP/GCG#1 Временная 588 n=1 - GLP/GCG#2 Временная 201 n=1 - GLP/GCG#3 Временная 13 n=1 SEQ ID NO: 15 GLP/GCG#4 Временная 15.0 ± 7.00 n=2 - GLP/GCG#5 Временная 165 n=1 - GLP/GCG#6 Временная 129 n=1 - GLP/GCG#7 Временная 3860 n=1 - GLP/GCG#8 Временная 12.5 n=1 - GLP/GCG#9 Временная 1589 n=1 - GLP/GCG#10 Временная 9742 n=1 - GLP/GCG#11 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#12 Временная 80.1 n=1 - GLP/GCG#13 Временная 604 n=1 - GLP/GCG#14 Временная 221 n=1 - GLP/GCG#15 Временная 16 n=1 SEQ ID NO: 16

Значения EC50 для двойных агонистов акцептора GLP-1/GIP были рассчитаны и показаны в Таблице 32 ниже.

Таблица 32 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) комментарий SEQ ID NO GLP/GIP#2 Временная 57.8 n=1 - GLP/GIP#3 Временная >5000 n=1 - GLP/GIP#4 Временная >5000 n=1 -

Скрининг агонистов акцептора GIP

Чтобы протестировать уровни активности нативного GIP и аналога GIP на клеточном уровне (in vitro), анализ накопления цАМФ проводили таким же образом, как и в тестовом примере 1.

Были рассчитаны значения EC50 для одиночных агонистов акцептора GIP и двойных агонистов акцептора GLP-1/GIP, которые показаны в таблице 33 ниже.

Таблица 33 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) Комментарий SEQ ID NO GIP нативный-Ub Временная 8.93 ± 5.77 n=4 SEQ ID NO: 22 Стабильная 35.0 n=1 GIP#1 Временная 17.5 ± 10.6 n=3 SEQ ID NO: 23 GIP#2 Временная 6.63 ± 3.87 n=3 SEQ ID NO: 24 Стабильная 12.0 ± 5.73 n=2 GIP#3 Временная 171 n=1 - GIP#4 Временная >5000 n=1 - GIP#5 Временная 81.9 n=1 SEQ ID NO: 25 GIP#6 Временная 398 n=1 - GIP#7 Временная 76.9 n=1 SEQ ID NO: 26 GIP#8 Временная 560 n=1 - GLP/GIP#2 Временная 128 n=1 - GLP/GIP#3 Временная 566 n=1 - GLP/GIP#4 Временная 1283 n=1 -

Скрининг агонистов акцептора GCG

Чтобы протестировать уровни активности нативного GCG и аналога GCG на клеточном уровне (in vitro), анализ накопления цАМФ проводили таким же образом, как и в тестовом примере 1.

Значения EC50 одиночных агонистов акцептора GCG были рассчитаны и показаны в Таблице 34 ниже.

Таблица 34 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) Комментарий SEQ ID NO GCG нативный-Ub Временная 41.7 ± 29.9 n=3 SEQ ID NO: 1 Стабильная 35.3 ± 32.7 n=2 GCG#1 Временная >5000 n=1 - GCG#2 Временная 41.7 ± 5.51 n=3 SEQ ID NO: 2 Стабильная 68.5 ± 41.8 n=2 GCG#3 Временная 47.8 ± 21.9 n=3 SEQ ID NO: 3 Стабильная 21.1 ± 12.3 n=3 GCG#4 Временная >5000 n=1 - GCG#5 Временная 661 ± 193 n=3 - GCG#6 Временная 8400 n=1 - GCG#7 Временная 956 n=1 - GCG#8 Временная 761 ± 73.5 n=2 - GCG#9 Временная 1073 n=1 - GCG#10 Временная >5000 n=1 - GCG#11 Временная >5000 n=1 -

Значения EC50 для двойных агонистов акцептора GLP-1/GCG были рассчитаны и показаны в Таблице 35 ниже.

Таблица 35 Объект Клеточная линия EC50 (пМ) комментарий SEQ ID NO GLP/GCG#1 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#2 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#3 Временная >5000 n=1 SEQ ID NO: 15 GLP/GCG#4 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#5 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#6 Временная >6250 n=1 - GLP/GCG#7 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#8 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#9 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#10 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#11 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#12 Временная 321 n=1 - GLP/GCG#13 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#14 Временная >5000 n=1 - GLP/GCG#15 Временная 424 n=1 SEQ ID NO: 16

Скрининг агонистов акцептора FGF21

Для проверки уровней активности нативного FGF21 и аналога FGF21 на клеточном уровне (in vitro) проводили функциональный анализ FGFR1/KLB таким же образом, как и в тестовом примере 2.

Значения EC50 для одиночных агонистов акцептора FGF21 были рассчитаны и показаны в Таблице 36 ниже.

Таблица 36 Объект EC50 (нМ) Комментарий SEQ ID NO rhFGF21 (нативный) 1.17 ± 0.56 n=4 SEQ ID NO: 17 FGF#1 21.0 ± 0.49 n=2 SEQ ID NO: 18 FGF#5 22.3 ± 0.71 n=2 SEQ ID NO: 19 FGF#7 17.7 ± 2.55 n=2 SEQ ID NO: 20 FGF#9 19.1 ± 0.49 n=2 SEQ ID NO: 21 FGF#11 > 5000 n=1 - FGF#12 > 5000 n=1 - FGF#13 > 5000 n=1 - FGF#14 > 5000 n=1 - FGF#15 > 5000 n=1 -

Скрининг антагонистов акцептора IL-1RA

Чтобы проверить способность нативного IL-1RA и аналога IL-1RA ингибировать активность NF-kB с помощью IL-1β на клеточном уровне (in vitro), люциферазный анализ репортерного гена NF-κB проводили тем же способом, как в тестовом примере 3.

Были рассчитаны значения IC50 одиночных антагонистов акцептора IL-1RA, которые показаны в Таблице 37 ниже.

Таблица 37 Объект IC50 (пМ) Комментарии SEQ ID NO rhIL-1RA (нативный) 68.6 ± 7.71 n=2 SEQ ID NO: 27 IL-1RA-Ub (донор) 236 ± 43.8 n=2 SEQ ID NO: 28

В результате скрининга вышеуказанных различных агонистов и антагонистов для получения белкового конъюгата согласно настоящему изобретению были отобраны биомолекулы, обладающие превосходными эффектами. В результате было подтверждено, что белковый конъюгат согласно настоящему изобретению оказывает превосходное действие при профилактике и лечении неалкогольного стеатогепатита (NASH), ожирения печени, фиброза печени, цирроза, рака печени, ожирения или диабета, а также обладает отличной стабильностью.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Уанджин Байотекнолоджи Инк.

<120> НОВЫЙ БЕЛКОВЫЙ КОНЪЮГАТ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ

ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕАЛКОГОЛЬНОГО СТЕАТОГЕПАТИТА, ОЖИРЕНИЯ И ДИАБЕТА

<130> OGB20P-0001-KR

<160> 34

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 29

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCG нативный

<400> 1

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser

1 5 10 15

Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 2

<211> 29

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCG№2

<400> 2

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Arg Arg Ala Lys Asp Phe Ile Glu Trp Leu Leu Ser Ala

20 25

<210> 3

<211> 29

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GCG№3

<400> 3

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Arg Arg Ala Lys Asp Phe Val Glu Trp Leu Leu Ser Ala

20 25

<210> 4

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1 нативный

<400> 4

His Ala Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 5

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№1

<400> 5

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 6

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№3

<400> 6

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Glu Tyr Leu Glu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Asn Gly Arg

20 25 30

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№4

<400> 7

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№5

<400> 8

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 9

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№6

<400> 9

His Ser Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Glu Tyr Leu Glu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№7

<400> 10

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Glu Tyr Leu Glu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№8

<400> 11

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Arg Gly Arg Gly

20 25 30

<210> 12

<211> 31

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№9

<400> 12

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly

20 25 30

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№10

<400> 13

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Glu Tyr Leu Glu Lys

1 5 10 15

Gln Ala Ala Gln Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP-1№11

<400> 14

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Gly

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Arg

20 25 30

<210> 15

<211> 29

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP/GCG№3

<400> 15

His Gly Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 16

<211> 29

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GLP/GCG№15

<400> 16

His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Met Asn Thr

20 25

<210> 17

<211> 181

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21 нативный

<400> 17

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Leu Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Gly Pro Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Ala Ser

180

<210> 18

<211> 182

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21№1

<400> 18

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Arg Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Glu Ile Arg Pro Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Thr Gly Leu Glu Ala Asn Arg

165 170 175

Ser Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 19

<211> 181

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21№5

<400> 19

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Gly Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 20

<211> 180

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21№7

<400> 20

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Asp Leu Lys Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Arg Leu Val Glu Pro Ser Gln Leu Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Phe Glu

180

<210> 21

<211> 181

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> FGF21№9

<400> 21

His Pro Ile Pro Asp Ser Ser Pro Leu Leu Gln Phe Gly Gly Gln Val

1 5 10 15

Arg Gln Val Tyr Leu Tyr Thr Asp Asp Ala Gln Gln Thr Glu Ala His

20 25 30

Leu Glu Ile Arg Glu Asp Gly Thr Val Gly Gly Ala Ala Asp Gln Ser

35 40 45

Pro Glu Ser Leu Leu Gln Leu Lys Ala Leu Lys Pro Gly Val Ile Gln

50 55 60

Ile Leu Gly Val Lys Thr Ser Arg Phe Leu Cys Gln Arg Pro Asp Gly

65 70 75 80

Ala Leu Tyr Gly Ser Leu His Phe Asp Pro Glu Ala Cys Ser Phe Arg

85 90 95

Glu Arg Leu Leu Glu Asp Gly Tyr Asn Val Tyr Gln Ser Glu Ala His

100 105 110

Gly Leu Pro Leu His Leu Pro Gly Asn Lys Ser Pro His Arg Asp Pro

115 120 125

Ala Pro Arg Gly Pro Ala Arg Phe Leu Pro Leu Pro Gly Leu Pro Pro

130 135 140

Ala Leu Pro Glu Pro Pro Gly Ile Leu Ala Pro Gln Pro Pro Asp Val

145 150 155 160

Gly Ser Ser Asp Pro Leu Ser Met Val Glu Gly Ser Gln Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Tyr Glu Ser

180

<210> 22

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GIP нативный

<400> 22

Tyr Ala Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 23

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GIP№1

<400> 23

Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 24

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GIP№2

<400> 24

Tyr Ser Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 25

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GIP№5

<400> 25

Phe Ser Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile His Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 26

<211> 42

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> GIP№7

<400> 26

Tyr Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Tyr Ser Ile Ala Met Asp Lys

1 5 10 15

Ile Arg Gln Gln Asp Phe Val Asn Trp Leu Leu Ala Gln Lys Gly Lys

20 25 30

Lys Asn Asp Trp Lys His Asn Ile Thr Gln

35 40

<210> 27

<211> 152

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL-1RA нативный

<400> 27

Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile Trp

1 5 10 15

Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val Ala

20 25 30

Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp Val

35 40 45

Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly Lys

50 55 60

Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln Leu

65 70 75 80

Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp Lys

85 90 95

Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe Glu

100 105 110

Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala Asp

115 120 125

Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val Thr

130 135 140

Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu

145 150

<210> 28

<211> 153

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IL-1RA

<400> 28

Met Arg Pro Ser Gly Arg Lys Ser Ser Lys Met Gln Ala Phe Arg Ile

1 5 10 15

Trp Asp Val Asn Gln Lys Thr Phe Tyr Leu Arg Asn Asn Gln Leu Val

20 25 30

Ala Gly Tyr Leu Gln Gly Pro Asn Val Asn Leu Glu Glu Lys Ile Asp

35 40 45

Val Val Pro Ile Glu Pro His Ala Leu Phe Leu Gly Ile His Gly Gly

50 55 60

Lys Met Cys Leu Ser Cys Val Lys Ser Gly Asp Glu Thr Arg Leu Gln

65 70 75 80

Leu Glu Ala Val Asn Ile Thr Asp Leu Ser Glu Asn Arg Lys Gln Asp

85 90 95

Lys Arg Phe Ala Phe Ile Arg Ser Asp Ser Gly Pro Thr Thr Ser Phe

100 105 110

Glu Ser Ala Ala Cys Pro Gly Trp Phe Leu Cys Thr Ala Met Glu Ala

115 120 125

Asp Gln Pro Val Ser Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Gly Val Met Val

130 135 140

Thr Lys Phe Tyr Phe Gln Glu Asp Glu

145 150

<210> 29

<211> 15

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Linker

<400> 29

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 30

<211> 77

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ub(A)

<400> 30

Met Gln Ile Phe Val Arg Thr Leu Thr Asp Arg Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp

20 25 30

Arg Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Lys Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Pro Arg Val Val Asp

65 70 75

<210> 31

<211> 76

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Ub(D)

<400> 31

Met Gln Ile Phe Val Arg Thr Leu Thr Asp Arg Thr Ile Thr Leu Glu

1 5 10 15

Val Glu Pro Ser Asp Thr Ile Glu Asn Val Arg Ala Arg Ile Gln Asp

20 25 30

Arg Glu Gly Ile Pro Pro Asp Gln Gln Arg Leu Ile Phe Ala Gly Arg

35 40 45

Gln Leu Glu Asp Gly Arg Thr Leu Ser Asp Tyr Asn Ile Gln Arg Glu

50 55 60

Ser Thr Leu His Leu Val Leu Arg Pro Arg Gly Gly

65 70 75

<210> 32

<211> 585

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Albumin

<400> 32

Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu

1 5 10 15

Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln

20 25 30

Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu

35 40 45

Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys

50 55 60

Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu

65 70 75 80

Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro

85 90 95

Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu

100 105 110

Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His

115 120 125

Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg

130 135 140

Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg

145 150 155 160

Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala

165 170 175

Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser

180 185 190

Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu

195 200 205

Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro

210 215 220

Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys

225 230 235 240

Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp

245 250 255

Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser

260 265 270

Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His

275 280 285

Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser

290 295 300

Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala

305 310 315 320

Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg

325 330 335

Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr

340 345 350

Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu

355 360 365

Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro

370 375 380

Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu

385 390 395 400

Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro

405 410 415

Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys

420 425 430

Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys

435 440 445

Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His

450 455 460

Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser

465 470 475 480

Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr

485 490 495

Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp

500 505 510

Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala

515 520 525

Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu

530 535 540

Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys

545 550 555 560

Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val

565 570 575

Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu

580 585

<210> 33

<211> 18

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> HSA

<400> 33

Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala

1 5 10 15

Tyr Ser

<210> 34

<211> 20

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> IgGk

<400> 34

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly

20

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены белковые конъюгаты, содержащие полиубиквитин, носитель, связанный через линкер с полиубиквитином, и четыре биомолекулы, связанные через линкер с полиубиквитином и носителем. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей белковый конъюгат, и способу для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета. Изобретение обеспечивает повышенную активность и улучшенное терапевтическое действие биомолекул. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 55 ил., 37 табл., 9 пр.

1. Белковый конъюгат для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, отличающийся тем, что белковый конъюгат содержит:

полиубиквитин,

носитель, связанный через линкер с полиубиквитином, и

четыре биомолекулы, связанные через линкер с полиубиквитином и носителем,

где полиубиквитин состоит из акцептора убиквитина, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30, и донора убиквитина, состоящего из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31, и

биомолекула выбрана из группы, состоящей из GCG, GLP-1, FGF21, GIP и IL-1RA, их аналогов.

2. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что аналог GCG представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2.

3. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что аналог GLP-1 представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12.

4. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что аналог FGF21 представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20.

5. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что GIP и его аналог представляют собой белок, выбранный из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24.

6. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что IL-1RA представляет собой белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27.

7. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что линкер представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности, в которой объединены от 1 до 30 повторов GGGGS, EAAAK или VPPPPP.

8. Белковый конъюгат по п. 7, отличающийся тем, что линкер представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29.

9. Белковый конъюгат по п. 1, отличающийся тем, что носитель выбран из группы, состоящей из альбумина, фрагмента антитела, scFc (одноцепочечного Fc), димера scFc (одноцепочечного Fc-димера), трансферрина, XTEN (генетического слияния неточных повторяющихся пептидных последовательностей), CTP (карбоксиконцевого пептида), PAS (пролин-аланин-серинового полимера), ELK (эластиноподобного пептида), HAP (гомоаминокислотного полимера), GLK (желатиноподобного белка), PEG (полиэтиленгликоля) и жирной кислоты.

10. Белковый конъюгат по п. 9, отличающийся тем, что носителем является альбумин.

11. Белковый конъюгат для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, представленный следующей формулой:

в приведенной выше формуле

W представляет собой аналог GIP, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, или IL-1RA, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27,

X представляет собой аналог GCG, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, Y представляет собой аналог GLP-1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, Z представляет собой аналог FGF21, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,

Ub(A) представляет собой акцептор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30,

Ub(D) представляет собой донор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31,

L каждый независимо представляет собой линкер,

А представляет собой носитель, и

Ub(A) и Ub(D) связаны ковалентной связью.

12. Белковый конъюгат по п. 11, отличающийся тем, что линкер представляет собой полипептид, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 29.

13. Белковый конъюгат по п. 11, отличающийся тем, что носителем является альбумин.

14. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, содержащая белковый конъюгат по любому из пп. 1-13 и один или несколько эксципиентов.

15. Способ профилактики или лечения неалкогольного стеатогепатита, жировой дистрофии печени, фиброза печени, цирроза печени, рака печени, ожирения или диабета, включающий введение композиции по п. 14 субъекту, отличному от человека.

16. Способ получения белкового конъюгата, отличающийся тем, что способ включает стадии:

(i) получение акцепторного белка, представленного следующей формулой

X-L-Y-L-Ub(A)-L-A-L-Z

(ii) получение донорного белка, представленного следующей формулой

W-L-Ub(D), и

(iii) связывание Ub(A) в акцепторном белке и Ub(D) в донорном белке,

W представляет собой аналог GIP, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 24, или IL-1RA, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 27,

X представляет собой аналог GCG, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 2, Y представляет собой аналог GLP-1, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 12, Z представляет собой аналог FGF21, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 20,

Ub(A) представляет собой акцептор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 30,

Ub(D) представляет собой донор убиквитина, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 31,

L каждый независимо представляет собой линкер, и

А представляет собой носитель.