ИССЛЕДОВАНИЕ N-ГЛИКАНОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭКЗОГЛИКОЗИДАЗ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/68 

Перекрестная ссылка на связанные заявки

По настоящей заявке испрашивается приоритет предварительной заявки Соединенных Штатов, серийный номер 60/923,688, поданной 16 апреля 2007 года, полное содержание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Уровень техники

Характер гликозилирования гликопротеина часто играет важную роль в его функции. При рассмотрении лишь нескольких примеров видно, что характер гликозилирования гликопротеина может влиять на способность его молекул правильно складываться, на его устойчивость (например, устойчивость к протеолитическому и/или другому виду расщепления), каталитическую активность, фармакодинамические и/или фармакокинетические свойства и/или на способность гликопротеина должным образом взаимодействовать с другими молекулами. Альтернативно или дополнительно, характер гликозилирования гликопротеина может влиять на перенос и нацеливание гликопротеина. Например, характер гликозилирования гликопротеина может влиять на то, останется ли гликопротеин внутриклеточным (в том числе, например, правильное нацеливание гликопротеина в надлежащие субклеточный компартмент или компартменты), будет ли он мембранно-связанным и/или секретируемым из клетки.

Современные способы часто не в состоянии обнаружить те виды гликанов, которые присутствуют на низких уровнях популяции гликанов. Основные виды гликанов могут препятствовать обнаружению и идентификации видов тех гликанов, которые присутствуют на низких уровнях. Более того, современные способы обычно не могут дать точное количественное определение относительных уровней отдельных видов гликанов в пределах их популяции. Современные способы могут оказаться не в состоянии обнаружить нестандартные связи в пределах популяции гликанов. Соответственно, существует необходимость в способах обнаружения гликанов, которые присутствуют на низких уровнях популяции гликанов. Нужны способы количественного определения относительных уровней отдельных видов гликанов в их популяции.

Сущность изобретения

В настоящем описании раскрыты способы анализа композиции и/или структуры N-связанных гликанов. Способы, описанные в настоящем изобретении, можно использовать для анализа препарата N-гликанов (например, смеси N-гликанов) и для измерения относительных уровней в препарате специфических структурных групп и/или необычных модификаций (например, коровая или антеннальная фукоза, продукты удлинения фрагментом лактозамина, манноза высокого уровня и гибридные гликаны, продукты сульфатирования и фосфорилирования). Способы, описанные в изобретении, обычно могут включать стадии получения препарата N-гликана; расщепления N-связанных гликанов ферментами экзогликозидазы для отделения особым образом моносахаридов из невосстанавливающихся концевых участков и для анализа продуктов расщепления. Сравнение результатов множественных обработок с использованием ферментов экзогликозидазы (например, одновременные и последовательные различные обработки) может обеспечить получение удивительной информации о структуре гликанов, например, идентифицировать те виды гликанов, которые присутствуют на очень низких уровнях в препарате N-гликанов.

Препарат гликана можно получить любым доступным способом, известным из уровня техники. В общем случае получение препарата N-гликана включает стадии (1) получения препарата гликопротеина или другого гликоконъюгата и (2) получения препарата N-гликана из препарата гликоконъюгата. Препарат гликоконъюгата (например, гликопротеин) может быть получен из любого источника, включая, но ими не ограничиваясь, медицинские препараты, доступные в продаже биологические продукты и биологические образцы.

В некоторых вариантах изобретения препарат N-гликана получают с помощью популяции гликопротеинов и удаления N-гликанов из гликопротеинов, входящих в популяцию гликопротеинов. В некоторых вариантах осуществления изобретения N-гликаны могут быть объединены с обнаруживаемой меткой (например, с флуоресцентным и/или радиоактивным соединением).

В некоторых вариантах осуществления изобретения популяции N-гликанов расщепляются с использованием одной или нескольких экзогликозидаз, после чего осуществляют анализ структуры и/или композиции продуктов расщепления. В некоторых вариантах осуществления изобретения экзогликозидазы, используемые по настоящему изобретению, распознают и расщепляют только один определенный тип гликозидной связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения экзогликозидазы по настоящему изобретению распознают и расщепляют несколько определенных типов гликозидной связи. Показательные типы экзогликозидазы, которые можно использовать в настоящем изобретении, включают, но ими не ограничиваются, салидазу, галактозидазу, гексозаминидазу, фукозидазу и маннозидазу.

Согласно настоящему изобретению популяция N-гликана может расщепляться любой экзогликозидазой. В определенных вариантах осуществления изобретения N-гликаны могут расщепляться при подвергании популяции N-гликанов воздействию множества экзогликозидаз. Например, популяция N-гликанов может быть подвергнута воздействию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более экзогликозидаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество экзогликозидаз вводят одновременно. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество экзогликозидаз вводят последовательно. В некоторых вариантах осуществления изобретения изменение идентичности введенных экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения изменение последовательности введения множества экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательное расщепление с помощью множества экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликанов, которая отличается от информации, выявленной в результате расщепления с помощью одновременного введения этого же набора экзогликозидаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательное расщепление с помощью множества экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликанов, которая оказывается аналогичной информации, выявленной при одновременном расщеплении с помощью того самого набора экзогликозидаз.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, если обработка с помощью экзогликозидазы была полностью завершена, то выполняется анализ структуры и/или идентичности расщепленных гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один образец может быть удален из препарата гликана в процессе обработки с помощью экзогликозидазы (например, в любой момент времени до завершения обработки с помощью экзогликозидазы). В некоторых вариантах осуществления изобретения выполняется анализ структур и/или идентичностей расщепленных гликанов по меньшей мере в одном из отделенных образцов. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия анализа включает сравнение структуры и/или функции расщепленных гликанов из одного или нескольких отделенных образцов со структурой и/или функцией расщепленных гликанов из по меньшей мере одного другого отделенного образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия проведения анализа включает сравнение структуры и/или функции расщепленных гликанов из одного или нескольких отделенных образцов со структурой и/или функцией расщепленных гликанов эталонного образца.

Структуру и композицию расщепленных N-гликанов можно проанализировать любым доступным способом (например, способами хроматографии, масс-спектрометрии, ядерно-магнитного резонанса, капиллярного электрофореза и т.д.). В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, позволяют обнаружить виды N-гликана, которые присутствуют на низких уровнях в пределах популяции N-гликанов. Например, согласно настоящему изобретению, способы, описанные в описании, позволяют обнаружить виды N-гликана, уровень которых составляет менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25% или менее чем 0,1% в популяции N-гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы позволяют обнаружить особые связи, которые присутствуют на низких уровнях в популяции N-гликанов. Например, согласно настоящему изобретению, описанные способы позволяют обнаружить определенные связи, которые присутствуют на уровнях, составляя менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, 0,025% или менее чем 0,01% в популяции N-гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы позволяют обнаружить относительные уровни отдельных видов N-гликана в популяции N-гликанов. Например, область под каждым пиком, полученным на жидкостном хроматографе, может быть измерена и выражена в виде процента от целого. Такой анализ обеспечивает определение относительного процентного количества каждого вида N-гликана в популяции N-гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы можно использовать для анализа характера гликозилирования гликопротеинов, которые используют в качестве терапевтических средств (например, интерфероны, колоние-стимулирующие факторы, факторы свертывания крови и т.д.). Средним специалистам в данной области следует обратить внимание на тот факт, что характер гликозилирования таких лечебных гликопротеиновых средств потенциально может влиять на их терапевтические свойства. По существу важно в точности исследовать характер гликозилирования представленного и представляющего интерес гликопротеина. В определенных вариантах осуществления изобретения способы по изобретению могут использоваться для точного анализа характера гликозилирования такого терапевтического гликопротеина.

В определенных вариантах осуществления изобретения представляющий интерес лечебный гликопротеин создается в клетке и выделяется из нее после получения. Для прогнозирования характера гликозилирования такого выделенного лечебного гликопротеина можно использовать способы по изобретению.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы по изобретению можно использовать для мониторинга характера гликозилирования гликопротеинов в процессе их образования клетками. Например, получение гликопротеина (например, коммерческое производство) может включать стадии (1) выращивания клеток, которые продуцируют гликопротеин, (2) получение образцов через постоянные или непостоянные промежутки времени в процессе культивирования клеток и (3) анализа характера гликозилирования выращенных гликопротеинов в каждом полученном образце. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления изобретения такие способы могут дополнительно включать стадию сравнения характера гликозилирования полученных гликопротеинов для каждого полученного образца с характером другого образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие способы могут дополнительно включать стадию сравнения характера гликозилирования полученных гликопротеинов для каждого полученного образца с характером гликозилирования эталонного образца.

В определенных вариантах осуществления изобретения представляющим интерес лечебным гликопротеином является доступный на рынке гликопротеин (например, антитела, полипептиды, интерлейкины, аналоги рецепторов, антагонисты рецепторов и т.д., и/или их характерные дозы, которые используются для лечения болезни, укрепления физического состояния или подавления душевного расстройства). Для определения характера гликозилирования таких доступных в продаже гликопротеинов можно использовать способы по изобретению.

Краткое описание фигур

Фигура 1: Иллюстративные структуры N-гликанов.

Фигура 2: Смесь 2AB-меченных N-гликанов подверглась обработке с использованием ферментов сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы и фукозидазы. Образцы были внесены в колонку с амидной фазой и элюированы с помощью обычной фазовой хроматографии. (A) Смесь N-гликанов разделена в колонке с амидной фазой. (B) Получение N-гликанов после их постадийной обработки ферментами. Как показано на хроматограмме, растянутые лактозамином гликаны не полностью расщепляются до M3N2 в результате этой обработки. Идентичность пиков была подтверждена с помощью масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS).

Фигура 3: Хроматограмма смеси N-гликанов после полного расщепления смеси за счет одновременной обработки такими ферментами как сиалидаза, галактозидаза, гексозаминидаза и фукозидаза. Образцы были внесены в колонку с амидной фазой и элюированы с помощью обычной фазовой хроматографии. Вставка: крупный план хроматограммы, на получение которой ушло примерно 30-70 минут, отмасштабирован до визуального отображения пиков меньшего размера.

Фигура 4: Иллюстративная популяция N-гликанов, которая последовательно расщепляется сиалидазой, галактозидазой, гексозаминидазой и фукозидазой широкой специфичности (обработка Rx05-C). Показана популяция различных продуктов расщепления.

Фигура 5: Сравнение продуктов расщепления, полученных в результате последовательного (слева) и одновременного (справа) расщепления популяции гликанов (представленной двумя гликанами, показанными в верхней части фигуры) с помощью α-2/3,6,8,9-сиалидазы, β-1/3,4,6-галактозидазы и β-1,4-гексозаминидазы. Одновременное расщепление приводит к получению того же самого продукта реакции (ядра маннозы) для обоих гликанов из популяции гликанов. Последовательное расщепление приводит к получению двух различных продуктов расщепления. В этом примере показано, как последовательное расщепление может выявить информацию, которую нельзя получить по результатам одновременного расщепления.

Фигура 6: Фукозилирование (представленное треугольником) компонента glcNAc (квадраты) делает гексозаминидазу неспособной к расщеплению конечной glcNAc (нуклеиновой кислоты гликана). На этой фигуре показаны два вида гликанов - один с антеннально фукозилированным компонентом glcNAc (справа), а второй без этого компонента (слева). После расщепления с помощью сиалидазы, галактозидазы и гексозаминидазы виды гликанов, указанные с левой стороны, расщепляются до своего ядра маннозы. В противоположность этому фукозилированный компонент glcNAc не может быть расщеплен в результате идентичной обработки с использованием экзогликозидазы.

Фигура 7: Одновременная и последовательная обработка с использованием экзогликозидазы для выявления гибридных и полилактозаминных структур. Смеси гликанов были обработаны с использованием экзогликозидазы и помечены. Сравнение структур гликанов, которые остаются после сравнительного проведения одновременного и последовательного расщепления, проиллюстрировано с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии - ВЭЖХ (А). Препараты гликанов были одновременно или последовательно обработаны с помощью сиалидазы, галактозидазы (верхний график), сиалидазы, галактозидазы и гексозаминидазы (средний график) или сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы и фукозидазы (нижний график). Сравнение структур гликанов, которые остаются после сравнительного проведения одновременного и последовательного расщепления, проиллюстрировано с помощью масс-спектрометрии (MS) (В). Полилактозаминные структуры, которые остаются после последовательного расщепления, помечены как на ВЭЖХ-хроматограмме, так и на соответствующей MS-спектрограмме.

Фигура 8: Быстрая идентификация гликанов, содержащих полилактозамин, с помощью непосредственного сравнения хроматограмм, получены в результате последовательной и одновременной обработки ферментами одинакового образца гликана. Для ферментных реакций были использованы сиалидаза, галактозидаза, гексозаминидаза и фукозидаза. Последовательная и одновременная обработки указаны стрелками.

Фигура 9: Быстрая идентификация гликанов, содержащих полилактозамин, с помощью непосредственного сравнения спектров, полученных с помощью MALDI-MS в результате последовательной (верхний график) и одновременной (нижний график) ферментных обработок того же самого образца гликана. Для ферментных реакций были использованы сиалидаза, галактозидаза, гексозаминидаза и фукозидаза.

Определения

Приблизительно, около, примерно: Использованные в описании термины “приблизительно”, “около” или “примерно”, применительно к одному или нескольким представляющим интерес значениям, относятся к значению, которое соответствует установленному контрольному значению. В определенных вариантах осуществления изобретения термины “приблизительно”, “около” или “примерно” ссылаются на диапазон значений, которые оказываются в пределах 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или величины меньше установленного контрольного значения.

Биологический образец: В данном случае термин “биологический образец” относится к любому твердому или жидкому образцу, полученному, выделенному или секретированному любой живой клеткой или организмом, включая, но ими не ограничиваясь, тканевую культуру, образец ферментера, ткань человека или животного, растения, фрукты, овощи, одноклеточные микроорганизмы (такие как бактерии и дрожжи) и многоклеточные организмы. Например, биологический образец может быть биологической жидкостью, полученной, например, из крови, плазмы, сыворотки, мочи, желчи, семенной жидкости, спинномозговой жидкости, водянистой влаги или эндолимфы, либо любой секреции организма человека, отечной жидкости, экссудата (например, жидкости абсцесса или жидкости, полученной из любого другого инфицированного или воспаленного участка тела), или жидкостью сустава (например, здорового сустава или сустава, пораженного такой болезнью, как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит). Биологический образец также может быть, например, образцом, полученным из любого органа или ткани (включая образчики, полученные в результате биопсии или аутопсии), может содержать клетки (либо эмбриональные или культивируемые), быть средой, кондиционированной любой клеткой, тканью либо органом, тканевой культурой.

Гликопротеин клеточной поверхности: Термин “гликопротеин клеточной поверхности”, как используется в настоящем изобретении, относится к гликопротеину, по меньшей мере часть которого присутствует на внешней поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения гликопротеин клеточной поверхности представляет собой белок, который располагается на поверхности клетки так, что по меньшей мере одна из структур гликанов находится на внешней поверхности клетки.

Гликан клеточной поверхности: “Гликан клеточной поверхности” представляет собой гликан, который присутствует на внешней поверхности клетки. В некоторых вариантах осуществления изобретения гликан клеточной поверхности ковалентно связан с пептидом в качестве части гликопротеина клеточной поверхности. Гликан клеточной поверхности также может быть связан с липидом клеточной мембраны.

Гликан: На основании того, что известно из уровня техники и используется в настоящем описании, «гликаны» являются сахарами. Гликаны могут быть мономерами или полимерами сахарных остатков, однако они обычно содержат по меньшей мере три вида сахаров и могут иметь линейную или разветвленную структуру. Гликан может содержать остатки натурального сахара (например, глюкозу, N-ацетилглюкозамин, N-ацетил нейраминовую кислоту, галактозу, маннозу, фукозу, гексозу, арабинозу, рибозу, ксилозу и т.д.) и/или модицифированные сахара (например, 2'-фторорибозу, 2'-дезоксирибозу, фосфоманнозу, 6'-сульфо-N-ацетилглюкозамин и т.д.). Термин “гликан” включает гомополимеры и гетерополимеры сахарных остатков. Термин “гликан” также включает гликанный компонент гликоконъюгата (например, гликопротеин, гликолипид, протеогликан и т.д.). Этот термин также включает свободные гликаны, в том числе и те гликаны, которые были расщеплены или иным образом освобождены от гликоконъюгата.

Препарат гликана: Термин “препарат гликана”, как используется в настоящем документе, относится к набору гликанов, полученных в соответствии с конкретным способом получения. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат гликана относится к набору гликанов, полученных из препарата гликопротеина (смотрите ниже определение препарата гликопротеина).

Гликоконъюгат: Термин "гликоконъюгат", как используется в настоящем документе, включает все молекулы, в которых по меньшей мере одна составляющая сахара ковалентно связана по меньшей мере с одной другой составляющей. Этот термин конкретно включает все биомолекулы с ковалентно присоединенными составляющими сахара, в том числе, например, N-связанными гликопротеинами, О-связанными гликопротеинами, гликолипидами, протеогликанами и т.д.

Гликоформа: Термин «гликоформа», как используется в настоящем документе, относится к конкретной форме гликоконъюгата. То есть, если составляющая остова (например, полипептида, липида и т.д.), которая является частью гликоконъюгата, может быть связана с другими гликанами или наборами гликанов, то для любого другого варианта гликоконъюгата (то есть, тогда, когда остов связан с конкретным набором гликанов) указана ссылка как на "гликоформу".

Гликолипид: Термин "гликолипид", как используется в настоящем документе, указывает на липид, содержащий один или несколько ковалентно связанных составляющих сахара (то есть гликанов). Составляющая (составляющие) сахара может быть представлена в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или гликанов. Составляющая (составляющие) сахара может включать отдельную неразветвленную цепь сахарных остатков или состоять из одной или нескольких разветвленных цепей. В определенных вариантах осуществления изобретения сахарные составляющие могут содержать группы сульфатов и/или фосфатов. В определенных вариантах осуществления изобретения гликопротеины содержат O-связанные составляющие сахара; а в определенных вариантах осуществления изобретения - N-связанные составляющие сахара.

Гликопротеин: Термин "гликопротеин", как используется в настоящем документе, относится к белку, который содержит пептидный остов, ковалентно связанный с одной или несколькими составляющими сахара (то есть, гликанами). Специалистам в данной области понятно, что пептидный остов обычно состоит из линейной цепи остатков аминокислот. В определенных вариантах осуществления изобретения пептидный остов распространяется в клеточной мембране так, что включает трансмембранную и внеклеточную часть. В определенных вариантах осуществления изобретения пептидный остов гликопротеина пересекает клеточную мембрану так, что включает ее трансмембранную и внеклеточную часть. В определенных вариантах осуществления изобретения способы изобретения включают расщепление гликопротеина клеточной поверхности с помощью протеазы для высвобождения внеклеточной части гликопротеина или ее доли, причем такое воздействие незначительно разрушает клеточную мембрану. Составляющая (составляющие) сахара может быть представлена в форме моносахаридов, дисахаридов, олигосахаридов и/или гликанов. Составляющая (составляющие) сахара может включать отдельную неразветвленную цепь сахарных остатков или состоять из одной или нескольких разветвленных цепей. В определенных вариантах осуществления изобретения сахарные составляющие могут содержать группы сульфатов и/или фосфатов. Альтернативно или дополнительно, составляющие сахара могут содержать ацетил, гликолил, пропил или другие модификации алкильной группы. В определенных вариантах осуществления изобретения гликопротеины содержат О-связанные составляющие сахара; а в определенных вариантах осуществления изобретения - N-связанные составляющие сахара. В определенных вариантах осуществления изобретения способы включают стадию анализа любого или всех гликопротеинов клеточной поверхности высвобожденных фрагментов (например, гликопептидов) гликопротеинов клеточной поверхности, гликанов клеточной поверхности, присоединенных к гликопротеинам клеточной поверхности, пептидных остовов гликопротеинов клеточной поверхности, фрагментов таких гликопротеинов, гликанов и/или пептидных остовов, а также комбинаций этих соединений.

Гликозидаза: Термин "гликозидаза", как используется в настоящем документе, относится к средству, которое расщепляет ковалентную связь между последовательно расположенными сахарами в гликане или между сахаром и составляющей остова (например, между сахаром и пептидным остовом гликопротеина). В некоторых вариантах осуществления изобретения гликозидаза является ферментом. В определенных вариантах осуществления изобретения гликозидаза является белком (например, белковым ферментом), состоящим из одной или нескольких полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления изобретения гликозидаза является средством химического расщепления.

Характер гликозилирования: Термин “характер гликозилирования”, как используется в настоящем документе, относится к набору структур гликанов, присутствующему в конкретном образце. Например, конкретный гликоконъюгат (например, гликопротеин) или набор гликоконъюгатов (например, набор гликопротеинов) может иметь характер гликолизирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения делается ссылка на характер гликолизирования гликанов клеточной поверхности. Характер гликозилирования может быть охарактеризован, например, как идентичность гликанов, количеством (в абсолютных или относительных единицах) отдельных гликанов или гликанами конкретного типа, степенью заполнения сайтов гликолизирования и т.д., или комбинациями таких параметров.

Препарат гликопротеина: Термин “препарат гликопротеина”, как используется в настоящем документе, относится к набору отдельных молекул гликопротеина, каждая из которых содержит полипептид, в который входит последовательность конкретных аминокислот (которая включает по меньшей мере один сайт гликолизирования), и по меньшей мере один гликан, ковалентно связанный по меньшей мере с одним сайтом гликозилирования. Отдельные молекулы конкретного гликопротеина в пределах препарата гликопротеина обычно представляют собой идентичные последовательности аминокислот, которые, тем не менее, могут отличаться содержанием по меньшей мере одного сайта гликозилирования и/или идентичностью гликанов, связанных по меньшей мере с одним сайтом гликолизирования. То есть, препарат гликопротеина может содержать только одну гликоформу конкретного гликопротеина, однако в нем обычно содержится множество гликоформ. Различные препараты одного и того же гликопротеина могут отличаться идентичностью присутствующих гликоформ (например, гликоформа, присутствующая в одном препарате, может отсутствовать в другом) и/или относительными количествами различных гликоформ.

N-гликан: Термин “N-гликан”, как используется в настоящем документе, относится к полимеру сахаров, который высвобожден из гликоконъюгата, однако ранее был связан с ним с помощью связывания через азот (ниже смотрите определение N-связанного гликана).

N-связанные гликаны: N-связанные гликаны представляют собой гликаны, которые связаны с гликоконъюгатом с помощью связи через азот. Существует разнообразный набор N-связанных гликанов, однако он обычно основан на типичном пентасахаридном ядре (Man)₃(GlcNAc)(GlcNAc).

O-гликан: Термин “O-гликан”, как используется в настоящем документе, относится к полимеру сахаров, который высвобожден из гликоконъюгата, однако ранее был связан с ним с помощью связывания через кислород (ниже смотрите определение O-связанного гликана).

O-связанные гликаны: O-связанные гликаны представляют собой гликаны, которые связаны с гликоконъюгатом с помощью связывания через кислород. O-связанные гликаны обычно присоединяются к гликопротеинам через N-ацетил-D-галактозамин (GalNAc) или же через N-ацетил-D-глюкозамин (GlcNAc), связываясь с гидроксильной группой L-серин (Ser) либо L-треонин (Thr). Некоторые O-связанные гликаны также имеют такие модификации, полученные после ацетилирования и сульфатирования. В некоторых случаях O-связанные гликаны присоединяются к гликопротеинам через фукозу или маннозу, связываясь с гидроксильной группой L-серин (Ser) либо L-треонин (Thr).

Фосфорилирование: Как используется в настоящем документе, термин «фосфорилирование» указывает на процесс ковалентного добавления одной или нескольких фосфатных групп к молекуле (например, к гликану).

Протеаза: Термин “протеаза”, как используется в настоящем документе, указывает на средство, которое расщепляет пептидную связь между последовательными аминокислотами в полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления изобретения протеаза является ферментом (то есть, протеолитическим ферментом). В определенных вариантах осуществления изобретения протеаза является белком (например, белковым ферментом), состоящим из одной или нескольких полипептидных цепей. В определенных вариантах осуществления изобретения протеаза представляет собой средство химического расщепления.

Белок: В общем случае «белок» представляет собой полипептид (то есть, нить по меньшей мере двух аминокислот, связанных друг с другом пептидными связями). Белки могут включать составляющие, отличные от аминокислот (например, это могут быть гликопротеины), и/или подвергаться иной обработке или модификации. Среднему специалисту в данной области следует обратить внимание на то, что “белок” может быть полностью полипептидной цепью в том виде, в каком его образовала клетка (с сигнальной последовательностью или без нее), или функциональной частью этого. Специалистам в данной области также следует обратить внимание на то, что иногда белок может включать более одной полипептидной цепи, которая, например, присоединяется с помощью одной или нескольких дисульфидных связей или посредством других средств.

Сиаловая кислота: Термин “сиаловая кислота”, как используется в настоящем документе, является родовым термином N- или O-замещенных производных соединений нейраминовой кислоты, то есть 9-углерод моносахаридом. Аминовая группа нейраминовой кислоты обычно привносит либо ацетиловую или гликолильную группу в сиаловую кислоту. Гидроксильные заместители, которые присутствуют в сиаловой кислоте, могут быть модицированы ацетилированием, метилированием, сульфатированием и фосфорилированием. Доминирующая сиаловая кислота представляет собой N-ацетилнейроминовую кислоту (Neu5Ac). Сиаловые кислоты наделяют гликаны отрицательным зарядом, потому что карбоксильная группа имеет тенденцию диссоциировать протон физиологического водородного показателя pH. Характерные лишенные протонов сиаловые кислоты представлены ниже:

По существу: Как используется в настоящем описании, термин “по существу” указывает на качественное условие проявления в полной или почти полной мере или степени представляющей интерес характеристики или свойства. Среднему специалисту в области биологических технологий будет понятно, что биологические или химические процессы редко, если вообще когда-либо, завершаются полностью и/или продолжаются до полного завершения либо достигают или отклоняются от абсолютного результата. Следовательно, термин “по существу” используется в настоящем описании для того, чтобы учесть возможное отсутствие завершенности, присущее многим биологическим или химическим явлениям. В качестве конкретного примера, а можно указать случай, когда сообщается, что обработка “по существу” не разрушает клеточные мембраны, и это указывает на то, что все или большинство клеточных мембран остаются невредимыми во время и после обработки, вследствие чего, например, внутриклеточные гликопротеины или гликопептиды не высвобождаются из клеток. В определенных вариантах осуществления изобретения термин “по существу” используется в отношении невредимых клеточных мембран, указывает на условие, когда 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% или меньшее число клеток, подвергнутых конкретной обработке, демонстрируют измеримое количество поврежденных клеточных мембран. В определенных вариантах осуществления изобретения термин “по существу” относится к невредимым клеточным мембранам, указывает на состояние дел, когда ни одна из клеток, подвергнутых конкретной обработке, не демонстрируют измеримое количество поврежденных клеточных мембран.

Подробное описание определенных вариантов осуществления изобретения

В описании настоящего изобретения раскрыты способы анализа композиции N-связанных гликанов. Согласно настоящему изобретению описанные способы можно использовать для анализа смеси N-гликанов и для измерения относительных уровней в смеси конкретных структурных групп и необычных модификаций (например, фукоза ядра или антеннальная фукоза, продукт удлинения фрагментом лактозамина, манноза высокого уровня и гибридные гликаны, продукты сульфатирования и фосфорилирования и т.д.). Например, на Фигуре 6 показано, как антеннальное фукозилирование предотвращает расщепление glcNAc с помощью гексозаминидазы. Во многих вариантах осуществления изобретения настоящее изобретение относится к способам, включающим стадии получения препарата N-гликанов, расщепления N-связанных гликанов с помощью ферментов экзогликозидазы для выделения особым образом моносахаридов из невосстанавливающихся конечных участков и анализа расщепленных продуктов.

N-связанные гликаны

В общем случае гликаны относятся к углеводной составляющей, которая в некоторых вариантах осуществления изобретения ковалентно подсоединена к гликопротеину. Углеводные составляющие (например, цепочки олигосахаридов) связываются с гликопротеинами в эндоплазматическом ретикулюме и в комплексе Гольджи посредством либо N- или O-связываний. Обычно цепочки N-связанного олигосахарида добавляют к гликопротеинам в полости эндоплазматического ретикулюма (см., Alberts et al., журнал Molecular Biology of the Cell (Молекулярная биология клетки), 1994, приведенную в настоящем описании в качестве ссылки). Углеводные составляющие добавляются в аминогруппу к боковой цепи остатка аспарагина, которая входит в состав целевой консенсусной последовательности Asn-X-Ser/Thr, где X может быть любой аминокислотой, за исключением пролина. Первоначальная цепочка олигосахарида обычно урезается посредством особых ферментов гликозидазы в эндоплазматическом ретикулюме, что приводит к получению олигосахарида с коротким разветвленным ядром, состоящим из двух остатков N-ацетилглюкозамина и трех остатков маннозы.

N-гликаны могут быть подразделены на три отдельные группы, названные «маннозным типом высокого уровня», «гибридным типом» и «комплексным типом», с общим ядром пентасахарида (Manp(α1,6)-(Manp(α1,3))-Manp(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn), которое встречается во всех трех группах. К модификациям ядра относятся, например, дополнительное гликозилирование, обеспечивающее разделение GlcNAc пополам, присоединение остатка фукозила к самой дальней GlcNAc и образование необычных структур в конце цепи (кэппирование) за счет остатков сиаловой кислоты (Neu). Типичные N-гликаны показаны на Фигуре 1. Как можно заметить, структурное изменение N-гликанов происходит, главным образом, за счет появления (до) 4 антенн, которые расположены на левой стороне N-гликанов, показанных на Фигуре 1. N-связанные гликаны обычно оказываются компонентами пептидов (то есть, гликопептида) и белков (то есть, гликопротеина).

После начальной обработки в эндоплазматическом ретикулюме гликопротеины вносятся в комплекс Гольджи, где происходит их дальнейшая обработка. Подрезанные цепочки N-связанного олигосахарида могут быть модифицированы посредством добавления нескольких остатков маннозны, что приводит к образованию «высокоманнозного олигосахарида». Для образования «сложных олигосахаридов» в качестве альтернативы или в дополнение к маннозным субъединицам ядра можно добавить одну или несколько моносахаридных единиц N-ацетилглюкозамина. К субъединицам N-ацетилглюкозамина можно добавит галактозу, а субъединицы сиаловой кислоты - к субъединицам галактозы, что приведет к получению цепей, оканчивающихся молекулами любого соединения сиаловой кислоты, галактозы или N-ацетилглюкозаминового остатка. К N-ацетилглюкозаминовому остатку олигосахаридного ядра можно добавить остаток фукозы. Каждая из этих добавок катализируется посредством особых гликозиловых трансфераз.

N-связанные гликаны участвуют во множестве клеточных процессов. Например, N-гликаны способствуют правильной укладке белка в эукариотические клетки. Шапероны, которые находятся в эндоплазматическом ретикулюме (например, калнексин и калретикулин), подсоединяются к трем глюкозным остаткам, присутствующим в ядре N-гликана. Шапероны обычно способствуют укладыванию белка, к которому присоединяется гликан. После правильного укладывания отделяются три глюкозных остатка, и гликан может подвергнуться дальнейшим реакциям обработки. Если белок не укладывается должным образом, то происходит повторное присоединение трех глюкозных остатков, что позволяет белку повторно соединиться с шаперонами. Этот цикл может повторяться несколько раз, пока у белка не появится соответствующая конформация (структура). Если белок повторно не укладывается должным образом, то он обычно выделяется из эндоплазматического ретикулюма и разлагается под воздействием цитоплазматических протеаз.

Альтернативно или дополнительно, N-гликаны способствуют укладыванию белка за счет пространственного эффекта. Например, остатки цистеина в составе пептида можно временно заблокировать для предотвращения формирования дисульфидных связей с другими остатками цистеина по причине размера смежного гликана. Следовательно, присутствие N-связанного гликана может позволить клетке выбирать, какие из остатков цистеина будут образовывать дисульфидные связи.

N-гликаны могут быть вовлечены в межклеточные взаимодействия. Например, опухолевые клетки часто создают анормальные структуры N-гликанов, которые распознаются с помощью рецептора CD337 на клетке-убийце и служат сигналом превращения рассматриваемой клетки в раковую.

N-гликаны могут участвовать в нацеливании деструктивных лизосомальных ферментов на лизосому. В частности, модификация N-гликанов с помощью остатка маннозы-6-фосфата может служить сигналом нацеливания белка, к которому присоединен данный гликан, на лизосому.

Таким образом, настоящее описание раскрывает процесс распознавания, который важен для определения характера гликозилирования N-гликанов (например, N-гликанов, которые конъюгированы с гликопротеинами). Способы, описанные в настоящем описании, могут быть использованы для анализа характеристик (например, композиция и/или структура) любого N-гликана.

Препараты N-гликанов

Описание настоящего изобретения относится к способам анализа структуры и/или композиции отдельных гликанов в препарате гликана. Препарат гликана может быть получен любым способом, известным в области техники. В общем случае получение препарата N-гликана состоит из стадий (1) получения препарата гликопротеина; и (2) получения препарата N-гликана из препарата гликопротеина. В некоторых вариантах осуществления изобретения получение препарата N-гликана необязательно включает выполняемую стадию мечения препарата N-гликана с помощью обнаруживаемой метки.

Препараты гликопротеина

Препарат гликопротеина может быть получен из любого источника, включая, но ими не ограничиваясь, терапевтические композиции (например, эритропоэтин, инсулин, гормон человеческого роста и т.д.), коммерческие биологические продукты (например, те, что представлены в таблице 3) и биологические образцы. Как используется в настоящем документе, термин “биологический образец” относится к любому твердому или жидкому образцу, полученному, выделенному или секретированному из любой живой клетки или организма, включая, но ими не ограничиваясь, тканевую культуру, ткань человека или животного, растение, фрукты, овощи, одноклеточные микроорганизмы (такие как бактерии и дрожжи) и многоклеточные организмы. Например, биологический образец может быть биологической жидкостью, полученной, например, из крови, плазмы, сыворотки, мочи, желчи, семенной жидкости, спинномозговой жидкости, водянистой влаги или эндолимфы, либо любой секреции человеческого тела, отечной жидкости, экссудата (например, жидкости, полученной из абсцесса или любого другого инфицированного или воспаленного участка тела), или жидкостью, полученной из сустава (например, здорового сустава или сустава, пораженного болезнью, такой как ревматоидный артрит, остеоартрит, подагра или септический артрит). Биологический образец также может быть, например, образцом, полученным из любого органа или ткани (включая образчики, полученные в результате биопсии или аутопсии), может содержать клетки (либо эмбриональные или культивируемые клетки), быть средой, кондиционированной любой клеткой, тканью либо органом, тканевой культурой.

Препарат гликопротеина может быть получен с помощью любого прибора, человека или объекта. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат гликопротеина может быть получен с помощью прибора, который в состоянии выполнить один или несколько тестов, технологических процессов или улучшений качества препарата гликопротеина. В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат гликопротеина может быть получен физическим лицом. В некоторых вариантах осуществления препарат гликопротеина может быть получен из находящегося извне подразделения. В некоторых других вариантах осуществления изобретения препарат гликопротеина может быть получен физическим или юридическим лицом, которые предоставляют исследовательские услуги второму физическому или юридическому лицу. Например, к работе может быть привлечено юридическое лицо, которое получает препараты гликопротеина, прошедшие исследование у других юридических лиц или в лабораториях. Препарат гликопротеина может быть предварительно обработан любым образом. Например, препарат гликопротеина может быть предварительно обработан для выделения одной или нескольких гликоформ.

Препарат N-гликана

В некоторых вариантах осуществления изобретения препарат N-гликана получают предоставлением популяции гликопротеинов и удалением N-гликанов из вышеуказанных гликопротеинов, образующих популяцию.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N-гликаны отделяются из гликопротеинов с помощью расщепления. Как правило, гликаназы следует использовать согласно реакции разъединения остатков ядра GlcNAc-Asn, GlcNAc-GlcNAc или Man-GlcNAc, указанного в настоящем изобретении. Характерные ферменты, которые можно использовать для удаления N-гликанов из гликопротеинов, включают, но ими не ограничиваются, N-гликаназу F и/или N-гликаназу-A, O-гликаназу и/или фуксиновый агар H.

В некоторых вариантах осуществления изобретения N-гликаны отделяются из гликопротеинов с помощью химического расщепления. Если рассмотреть только несколько примеров, то для удаления гликанов из гликопротеина можно использовать гидразин, борогидрид натрия и/или трифторометансульфоновую кислоту (TFMS).

Мечение N-гликанов

В некоторых вариантах осуществления изобретения N-гликаны (например, N-гликаны, которые были удалены из популяции гликопротеинов) могут быть связаны с одной или несколькими обнаруживаемыми метками. Обнаруживаемые метки обычно связаны с восстанавливающимися концевыми частями цепи N-гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения обнаруживаемые метки являются флуоресцентными соединениями. Характерные флуорофоры, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, 2-аминобензойную кислоту (2AA), 2-аминобензамид (2AB) и/или 2-аминопурин (2AP). В общем случае флуорофоры, предназначенные для использования по настоящему изобретению, характеризуются реакционной способностью по отношению к восстанавливающейся концевой части цепи олигосахарида и/или моносахарида в условиях, которые не приводят к повреждению и/или разрушению гликана. В некоторых вариантах осуществления изобретения флуоресцентные соединения непосредственно присоединяются к восстанавливающимся концевым частям цепи. Например, такое непосредственное соединение может осуществляться с помощью прямого конъюгирования за счет понижающего аминирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения флуоресцентные соединения непрямым образом присоединяются к восстанавливающимся концевым частям цепи. Например, непрямое присоединение может быть осуществлено с помощью плеча реакционно-способного линкера.

В некоторых вариантах осуществления изобретения обнаруживаемые метки содержат радиоактивные компоненты или молекулы, помеченные изотопами. Характерные радиоактивные компоненты, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, тритий (³H), дейтерий (²H) и/или ³⁵S. Как правило, такие компоненты непосредственно присоединяются или иным образом связываются с флуорофором. Для получения лишь одного примера скажем, что радиоактивного флуорофора субстанцию 2АР можно модифицировать так, чтобы все составляющие водорода были дейтерированы.

Расщепление N-связанных гликанов

В настоящем описании раскрыты улучшенные способы определения характера гликозилирования гликопротеинов. Такие способы обычно включают подвергание воздействию одной или нескольких экзогликозидаз на популяции N-гликанов и анализ структуры и/или композиции расщепленных продуктов. В некоторых вариантах осуществления изобретения экзогликозидазы, используемые по настоящему изобретению, распознают и расщепляют только один определенный тип гликозидной связи. В некоторых вариантах осуществления изобретения экзогликозидазы, используемые по настоящему изобретению, распознают и расщепляют более одного определенного типа гликозидной связи.

Экзогликозидазы

Экзогликозидазы - это ферменты, которые расщепляют концевые гликозидные связи из невосстанавливающейся конечной части цепи гликанов. Они, как правило, отличаются высокой спецификой по отношению к конкретным связям моносахаридов и к конфигурации связывания остатка (anomericity) (α/β). В некоторых вариантах осуществления изобретения смежные конфигурации разветвленности смогут оказать влияние на специфичность экзогликозидаз. Обработка экзогликозидазами обычно приводит к получению гликанов, стандартные антеннальные связи которых расщеплены до коровой части пентасахарида (M3N2), которая содержит 3 остатка маннозы и 2 остатка glcNAc. Однако необычно модифицированные виды (например, антеннальные или те, ядро которых фукозилировано, высокоманнозные или гибридные гликаны, гликаны, цепи которых растянуты за счет лактозамина, сульфатированные гликаны, фосфорилированные гликаны и т.д.) не поддаются обработке экзогликозидазами и могут быть представлены с нужным размешением и определены количественно на хроматограмме относительно пентасахарида M3N2.

Типичные экзогликозидазы, которые можно использовать по настоящему изобретению, включают, но ими не ограничиваются, сиалидазу, галактозидазу, гексозаминидазу, фукозидазу и маннозидазу. Экзогликозидазы можно получить из любого источника, включая коммерческие организации (например, у компаний QA-Bio, ProZyme, Roche, Sigma, NEB, EMD, Glyko и т.д.). В качестве альтернативы или в дополнение экзогликозидазы могут быть выделены и/или очищены от источника клеточного строения (например, от бактерий, дрожжей, растений и т.д.).

В некоторых вариантах осуществления изобретения экзогликозидазы (например, сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы и маннозидазы) могут быть разделены на многочисленные категории или «подмножества». В некоторых вариантах осуществления изобретения различные подмножества проявляют различные возможности в процессе расщепления различных типов связей. В таблице 1 представлены некоторые характерные экзогликозидазы, специфичность их связей и организм, из которого они были получены. Среднему специалисту в данной области техники следует обратить внимание на то, что этот список экзогликозидаз представляет собой характерные примеры и не является всеобъемлющим, а любая экзогликозидаза с любой специфичностью связи может быть использована согласно раскрытию сущности настоящего изобретения.

Согласно настоящему изобретению, популяция N-гликанов может быть расщеплена с помощью любой экзогликозидазы или любого набора экзогликозидаз. В общем случае реакции экзогликозидазы проходят в условиях, которые совместимы с ферментной активностью. Например, pH, температура, компоненты и концентрация реакционного сиропа (например, соль, детергент и т.д.), а также длительность реакции могут быть оптимизированы для достижения нужного уровня действия экзогликозидазы.

В общем случае реакции экзогликозидазы проходят в условиях нейтральной и кислой среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в условиях, по существу, нейтральной среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 6-8. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 7,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия нейтральной среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 8.

В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы далее проходят в условиях кислой среды. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно менее 7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 1-7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 2-7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 3-7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 4-7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 5-7. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 6-7.

В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 2-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 3-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 4-6. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 5-6.

В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 1-2. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 2-3. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют диапазону изменения pH приблизительно 4-5.

В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 6,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 6. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 4,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 4. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 3,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 3. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 2,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 2. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 1,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 1. В некоторых вариантах осуществления изобретения условия кислой среды соответствуют величине pH, равной приблизительно 0,5.

В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в диапазоне изменения pH приблизительно 5-6. В определенных вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят при величине pH, равной приблизительно 5,5. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в диапазоне изменения pH приблизительно 6-8.

В общем случае реакции экзогликозидазы проходят в диапазоне изменения температуры приблизительно 20-45ºC, например, приблизительно от 30ºC и приблизительно до 40ºC. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в диапазоне изменения температуры приблизительно 25-40ºC. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят при температуре приблизительно 20ºC, приблизительно 25ºC, приблизительно 30ºC, приблизительно 35ºC, приблизительно 36ºC, приблизительно 37ºC, приблизительно 38ºC, приблизительно 39ºC, приблизительно 40ºC, приблизительно 42°C или приблизительно 45ºC. В определенных вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в температурном диапазоне приблизительно от 35°C приблизительно до 40°C. В определенных вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в температурном диапазоне приблизительно от 36°C и до приблизительно 38°C. В определенных вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят при температурах приблизительно 37°C.

В общем случае длительность реакций экзогликозидазы изменялась в диапазоне приблизительно от 10 минут до приблизительно 20 часов. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы длились приблизительно 10 минут, приблизительно 30 минут, приблизительно 1 час, приблизительно 2 часа, приблизительно 5 часов, приблизительно 10 часов, приблизительно 12 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 18 часов, приблизительно 20 часов,, приблизительно 24 часа, приблизительно 36 часов или приблизительно 48 часов. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы длились всю ночь.

В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии детергента, например, в концентрации 25%. К типичным детергентам, которые можно использовать в реакциях экзогликозидазы по изобретению, относятся додецилсульфат натрия (SDS), лаурилсульфат натрия (SLS), сложные эфиры сорбитановых жирных кислот (например, Tween, Span, Myrj и т.д.), сложные эфиры жирных кислот полиэтилен-гликоля (например, кремофор), Brij, Triton, нонил феноксилполиэтоксилэтанол (NP-40). В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии детергента в концентрации приблизительно 0,1%, приблизительно 0,5%, приблизительно 1%, приблизительно 5%, приблизительно 10%, приблизительно 15%, приблизительно 20%, приблизительно 25% или более 25%. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в отсутствие какого-либо детергента.

В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии соли. Характерные детергенты, которые можно использовать в реакции экзогликозидазы по изобретению, включают, но ими не ограничиваются, хлористый натрий, хлористый кальций, фосфат натрия, уксуснокислый натрий, бикарбонат натрия, хлористый магний, хлористый марганец и/или комбинацию этих веществ. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии приблизительно от 1 мМ до приблизительно 500 мМ соли. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии приблизительно 1 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 5 мМ, приблизительно 10 мМ, приблизительно 25 мМ, приблизительно 50 мМ, приблизительно 100 мМ, приблизительно 150 мМ, приблизительно 200 мМ, приблизительно 250 мМ, приблизительно 300 мМ, приблизительно 400 мМ или приблизительно 500 мМ соли. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в присутствии приблизительно 100 мМ соли. В некоторых вариантах осуществления изобретения реакции экзогликозидазы проходят в отсутствие какой-либо соли.

В определенных вариантах осуществления изобретения N-гликаны могут расщепляться путем подвергания популяции N-гликанов воздействия множества экзогликозидаз. Например, популяция N-гликанов может быть подвергнута воздействию 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или более экзогликозидаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция N-гликанов расщепляется с помощью экзогликозидаз, которые повсеместно, по существу, используются в равных количествах. В некоторых вариантах осуществления изобретения популяция N-гликанов расщепляется с помощью экзогликозидаз, которые повсеместно, по существу, не используются в равных количествах. В качестве примера скажем, что популяция N-гликанов может быть расщеплена с помощью экзогликозидаз А, В и С в пропорции 1:2:1. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество экзогликозидаз применяется одновременно. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество экзогликозидаз применяется последовательно.

Одновременное расщепление с помощью множества экзогликозидаз

В некоторых вариантах осуществления изобретения одновременное расщепление с помощью множества экзогликозидаз может быть использовано для анализа структуры и/или функции гликанов. В некоторых случаях одновременное расщепление может быть проведено для определения присутствия конкретных типов связей и/или модификаций гликанов. В качестве примера ниже показана структура гипотетического гликана:

Одновременная обработка с помощью галактозидазы и гексозаминидазы по прогнозам оставит только те антенны, которые первоначально содержали концевые остатки сиаловой кислоты. Затем эти остатки сиаловой кислоты по желанию можно удалить и проанализировать получившийся в результате гликан с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для выявления профиля видов моно-, ди-, три- и тетра-сиализированных антенн, которые присутствовали в первоначальной смеси. Примеры подходов к осуществлению одновременного расщепления и анализы результатов таких подходов описаны в примере 2.

Последовательное расщепление с помощью множества экзогликозидаз

В качестве другого неограничивающего примера N-гликаны можно расщепить, подвергнув популяцию N-гликанов воздействию первой экзогликозидазы в течение первого периода времени, после чего популяция N-гликанов подвергается воздействию второй экзогликозидазы в течение второго периода времени. Перед обработкой с помощью второй экзогликозидазы первая экзогликозидаза может быть необязательно удалена и/или инактивирована. В качестве примера первая экзогликозидаза может быть инактивирована путем инкубирования при температуре за время, достаточное для ее инактивации. Альтернативно или дополнительно, первая экзогликозидаза может быть инактивирована инкубированием с помощью ингибитора, который специфичен в отношении такой экзогликозидазы (например, антитело или другая молекула, которая особым образом связывает первую экзогликозидазу и тормозит ее каталитическое действие). Другие способы инактивации первой экзогликозидазы должны быть известны средним специалистам в данной области. В случае, когда первая экзогликозидаза инактивируется с помощью инкубирования специфическим ингибитором у следует обратить внимание на то, что присутствие ингибитора, по существу, не будет тормозить действие второй экзогликозидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы инактивации и удаления первой экзогликозидазы перед добавлением второй экзогликозидазы включают нагрев реакционной смеси, ее охлаждение, добавление органических растворителей, добавление протеазы и/или комбинацию этих операций. В некоторых вариантах осуществления изобретения первая экзогликозидаза удаляется из процесса реакции до добавления второй экзогликозидазы, например, с использованием хроматографии, кассет для выделения твердой фазы, фильтров молекулярного веса, центрифугирования, формирования осадков и/или комбинаций этих средств. Среднему специалисту в данной области будет понятно, что эти одинаковые принципы подходят для третьей, четвертой, пятой, шестой и т.д. экзогликозидаз.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательное расщепление с помощью множества экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликана, которая отличается от информации, выявленной в процессе одновременного расщепления с использованием такого же набора экзогликозидаз.

В некоторых вариантах осуществления изобретения последовательное расщепление с помощью множества экзогликозидаз выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликана, которая носит такой же характер, что и информация, выявленная в процессе одновременного расщепления с использованием такого же набора экзогликозидаз.

В некоторых вариантах осуществления изобретения изменение последовательности введения экзогликозидаз также выявляет информацию о структуре и/или композиции N-гликана. Для предоставления только одного примера, подвергание конкретного N-гликана воздействия (1) сиалидазой, (2) галактозидазой, (3) гексозаминидазой, (4) фукозидазой и (5) маннозидазой в указанной конкретной последовательности могла бы привести к появлению набора продуктов расщепления, которые отличаются от продуктов расщепления, полученных в результате подвергания того же самого N-гликана воздействию (1) гексозаминидазой, (2) маннозидазой, (3) сиалидазой, (4) фукозидазой и (5) сиалидазой, вводимых в указанном порядке. Выполнение обеих серий последовательных расщеплений, анализ различных наборов продуктов расщепления, полученных в результате обоих последовательных расщеплений, и сравнение разных наборов продуктов расщеплений (например, друг с другом и/или с эталонным образцом) может обеспечить информацию о структуре и/или композиции N-гликана, которая не была бы получена в результате проведения только одной серии последовательных расщеплений и анализа продуктов расщепления, полученных в результате только одной серии последовательных расщеплений. Примеры подходов к выполнению последовательных расщеплений и анализ таких подходов описаны в примере 3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения отдельные ферменты, образующие набор, предназначенный для применения при последовательном и/или одновременном расщеплении, выбираются для максимизации объема информации, которую можно получить в процессе проведения расщепления. Результаты обработки, показанные в Таблице 2, служат примером выбора ферментных обработок для идентификации специфической модификации гликана среди сиализированных гликанов.

Таблица 2
Характерные ферментные обработки для идентификации модификаций сиализированных гликанов Примеры подлежащей идентификации модификации гликана Примеры ферментных обработок, применимые для идентификации выбранной модификации гликана* Полилактозамин Сравнение результатов последовательной и одновременной реакций с использованием сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы без сиалидазы и N-ацетилгексозаминидазы. Антеннальное фукозилирование Сравнение результатов последовательной и одновременной обработок с использованием сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы и фукозидазы.
Сравнение результатов обработок (например, последовательной и/или одновременной) с использованием α-1,3 фукозидазы и α-1,6,3 фукозидазы.
Сравнение результатов обработок (например, последовательной и/или одновременной) с использованием фукозидазы, после которой следует включение в реакцию галактозидазы или галактозидазы и потом снова фукозидазы.
Сравнение результатов обработок (например, последовательной и/или одновременной) с использованием фукозидазы или без нее.

Гибридный гликан Сравнение результатов последовательной и одновременной реакций с использованием сиалидазы, галактозидазы и N-ацетилгексозаминидазы, гексозаминидазы и маннозидазы. Сульфатированные гликаны Сравнение результатов последовательной и одновременной реакций с использованием сиалидазы, галактозидазы, галактозидазы, гексозаминидазы без сиалидазы, и N-ацетилгексозаминидазы. Фосфорилированные гликаны Сравнение результатов обработок (например, последовательной и/или одновременной) с использованием маннозидазы и без нее. Сиаловая кислота, связанная с GlcNAc Сравнение результатов последовательной и одновременной реакций с использованием сиалидазы, галактозидазы, галактозидазы, гексозаминидазы без сиалидазы и N-ацетилгексозаминидазы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения ферментные обработки для идентификации модификаций среди несиализированных гликанов можно выполнять так, как описано в таблице 2, за исключением неприменения сиалидазы в реакциях, приведенных в качестве примера в таблице 2.

Анализ структуры гликанов

В общем случае, способы по изобретению включают подвергание препарата гликана воздействию экзогликозидазой. В некоторых вариантах осуществления изобретения после завершения обработки препарата гликана экзогликозидазой анализируется структура и/или идентичность расщепленных гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения в процессе обработки препарата гликана экзогликозидазой образец может быть удален из препарата гликана. В некоторых вариантах осуществления изобретения множество образцов, участие которых в обработке разделено во времени (например, через постоянные или непостоянные промежутки времени), может быть удалено из препарата гликана в процессе его обработки экзогликозидазой (например, в любой момент времени до завершения обработки препарата экзогликозидазой). В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка экзогликозидазой включает участие в ней по меньшей мере одной экзогликозидазы, а стадия отделения - отделение по меньшей мере одного образца в процессе введения по меньшей мере одной экзогликозидазы в реакцию (например, после добавления экзогликозидазы к препарату гликана, однако до инактивации и/или удаления экзогликозидазы из препарата гликана). В некоторых вариантах осуществления изобретения обработка экзогликозидазой включает последовательное введение по меньшей мере первой и второй экзогликозидазы в реакцию (например, первой, второй, третьей, четвертой, пятой, шестой, седьмой и/или большего числа экзогликозидаз), а стадия отделения - (i) отделение по меньшей мере первого образца после введения первой экзогликозидазы, однако до момента применения второй экзогликозидазы; и (ii) отделение по меньшей мере второго образца после введения второй экзогликозидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и/или идентичность расщепленного гликана анализируется по меньшей мере в одном из отделенных образцов. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия анализа включает сравнение структуры и/или функции расщепленных гликанов в одном или в нескольких отделенных образцах со структурой и/или функцией расщепленных гликанов по меньшей мере одного иного отделенного образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения стадия анализа включает сравнение структуры и/или функции расщепленных гликанов в одном или в нескольких отделенных образцах со структурой и/или функцией расщепленных гликанов эталонного образца.

Структура и композиция N-гликанов может быть проанализирована любым доступным способом. В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована с применением способов хроматографии, масс-спектрометрии (MS), хроматографии с последующим применением MS, электрофореза, электрофореза с последующим применением MS, ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и комбинаций вышеуказанных способов.

Структура и композиция N-гликана может быть проанализирована любым доступным способом. В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована способами хроматографии, включая, но ими не ограничиваясь, жидкостную хроматографию (LC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ультравысокую жидкостную хроматографию (UPLC), тонкослойную хроматографию (ТСХ), хроматографию с применением амидной колонки и комбинации вышеуказанных способов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована с применением способов хроматографии, масс-спектрометрии (MS) и связанных с нею способов, включая, но ими не ограничиваясь, MS, LC-MS, LC-MS/MS, масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрию с преобразованием Фурье (FTMS), спектрометрию ионной подвижности и масс-спектрометрию (IMS-MS), разделение переноса электронов (ETD-MS) и комбинации вышеуказанных способов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована с помощью электрофоретических способов, включая, но ими не ограничиваясь, капиллярный электрофорез (CE), капиллярный электрофорез и масс-спектрометрию CE-MS, гель-электрофорез, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в акриламидном геле, электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом на основе антител, которые распознают специфические структуры гликана и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована с использованием ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и связанных с ним способов, включая, но ими не ограничиваясь, одномерный ЯМР (1D-ЯМР), двумерную спектроскопию ЯМР (2D-ЯМР), корреляционную спектроскопию ЯМР (COSY-ЯМР), полную корреляционную спектроскопию ЯМР (TOCSY-ЯМР), двумерную гетероядерную одноквантовую спектроскопию ЯМР (HSQC-ЯМР), двумерную гетероядерную многоквантовую спектроскопию ЯМР (HMQC-ЯМР), спектроскопию ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат (ROESY-ЯМР), спектроскопию ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY-ЯМР) и комбинации вышеуказанных способов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, позволяют обнаружить виды N-гликана, которые присутствуют на низких уровнях в популяции N-гликанов. Например, используемые способы позволяют обнаружить виды N-гликана, уровень которых в популяции N-гликанов составляет менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, менее 0,025% или менее 0,01%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, позволяют обнаружить особые связи, которые присутствуют на низких уровнях в пределах популяции N-гликанов. Например, используемые сейчас способы позволяют обнаружить особые связи, уровень которых в популяции N-гликанов составляет менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, менее 0,025% или менее 0,01%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения описанные способы позволяют обнаружить относительные уровни отдельных видов N-гликанов в пределах их популяции. Например, область под каждым пиком графика, полученного с помощью жидкостной хроматографии, может быть измерена и выражена как процентное отношение от общей величины. Такой анализ обеспечивает получение относительной процентной величины каждого вида N-гликана в пределах их популяции.

Варианты применения

Настоящее изобретение относится к способам для анализа структуры и/или композиции любого гликана. В качестве одного из примеров скажем, что изобретение относится к способам анализа характера гликозилирования гликопротеина. Описание настоящего изобретения включает множество потенциальных коммерческих, промышленных и/или врачебных практических вариантов применения процедуры определения характера гликозилирования гликопротеина.

Способы по изобретению можно использовать к отношению к гликанам, полученным из широкого набора источников, включая, но ими не ограничиваясь, лекарственные рецепты (например, эритропоэтин, инсулин, гормон человеческого роста и т.д.), коммерческие биологические продукты (например, те, что представлены в таблице 3) и биологические образцы. Биологический образец может проходить одну или несколько стадий анализа и/или очистки перед или после проведения анализа согласно настоящему раскрытию сущности изобретения. В качестве нескольких примеров скажем, что в некоторых вариантах осуществления изобретения биологический образец обрабатывают с применением одной или нескольких протеаз и/или экзогликозидаз (например, так, чтобы высвобождались гликаны); в некоторых вариантах осуществления изобретения гликаны в составе биологического образца метят одним или несколькими обнаруживаемыми маркерами или другими химическими средствами, которые могут облегчить проведение анализа, например, с помощью масс-спектрометрии или ядерно-магнитного резонанса ЯМР. Согласно настоящему изобретению в отношении биологического образца можно применить любое разнообразие стадий отделения и/или выделения.

Способы по настоящему изобретению могут быть использованы для анализа гликанов, находящихся в любом из многочисленных состояний, включая, например, свободные гликаны, гликоконъюгаты (например, гликопептиды, гликолипиды, протеогликаны и т.д.), связанные с клетками гликаны (например, связанные с ядром, цитоплазмой, клеточной мембраной гликаны и т.д.); гликаны, связанные с клеточными, внеклеточными, межклеточными и/или внутриклеточными компонентами (например, белками); гликаны, находящиеся во внеклеточном пространстве (например, в культуральной среде клетки) и т.д.

Способы по изобретению можно использовать на одной или нескольких стадиях разработки способа получения терапевтического гликопротеина или другого коммерчески значимого гликопротеина. Неограничивающие примеры, касающиеся стадий разработки такого процесса получения, в которых могут задействоваться способы по изобретению, включают выбор клетки, выбор клонов, оптимизацию сред, условия культивирования, режимы производственного процесса и/или процедуру очистки. Средним специалистам в данной области будут понятны и другие стадии разработки производственного процесса.

Изобретение также может быть использовано для контроля степени и/или типа гликозилирования, происходящего в отношении конкретной клеточной культуры, посредством чего осуществляется регулирование и возможное завершение развития этой культуры, например, для получения конкретного желательного характера гликозилирования или во избежание развития конкретного нежелательного характера гликозилирования.

Настоящее изобретение также можно использовать для оценки характера гликозилирования клеток или линий клеток, которые рассматриваются для получения конкретного желательного гликопротеина (например, даже до момента создания клеток или линий клеток, предназначенных для получения гликопротеина, или для получения гликопротеина на коммерчески значимом уровне).

Например, если целевой гликопротеин относится к лечебному гликопротеину, например, к прошедшему регуляторное обследование в одной или нескольких странах, как правило, желательно следить за развитием культур для оценки возможности создания с их помощью продукта с характером гликозилирования, приближенным как можно ближе к установленному характеру гликозилирования фармацевтического продукта, независимо от его производства по точно такой же технологии. В использованном смысле “близкий” указывает на характер гликозилирования, который по меньшей мере примерно на 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% или 99% коррелируется с установленным характером гликозилирования фармацевтического продукта. В таких вариантах осуществления изобретения образцы полученной культуры бактерий обычно многократно выбираются в разные моменты времени и сравниваются с установленным стандартом или контрольной культурой бактерий для оценки относительного уровня гликозилирования.

Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения способы контроля получения гликопротеина могут включать стадии (i) получения гликопротеина, отделения по меньшей мере первого и второго содержащих гликан образцов, из производственной системы; ii) подвергания как первого, так и второго содержащих гликан образцов процедуре применения экзогликозидазы для специфического отделения моносахаридов из невосстанавливающихся конечных участков цепи N-связанных гликанов, входящих в образцы, содержащие гликан; и (iii) сравнения продуктов расщепления, полученных из первого содержащего гликан образца, с продуктами расщепления второго содержащего гликан образца с тем, чтобы выявить отличия и, следовательно, проконтролировать прогресс в области получения гликопротеина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы контроля за получением гликопротеина включают отделение по меньшей мере одного содержащего гликан образца в некоторый момент времени в течение реакции с участием экзогликозидазы (например, процедура обработки образца экзогликозидазой). В некоторых вариантах осуществления изобретения способы контроля за получением гликопротеина включают отделение по меньшей мере одного содержащего гликан образца до завершения реакции с участием экзогликозидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения способы контроля за получением гликопротеина включают отделение по меньшей мере одного содержащего гликан образца после завершения реакции с участием экзогликозидазы. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется в момент, когда процедура обработки образца экзогликозидазой завершена полностью примерно на 10%, примерно на 20%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95%, примерно на 99%, почти на 100%, по существу на 100% или полностью на 100%. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется в момент, когда реакция с участием экзогликозидазы завершается почти на 100%. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется в момент, когда реакция с участием экзогликозидазы завершается на 100%. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется до завершения реакции с участием экзогликозидазы на 100%.

В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы включают гликоконъюгаты (например, гликопротеины). В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется до расщепления 100% гликоконъюгатов. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется при расщеплении 100% гликоконъюгатов. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется, когда гликоконъюгаты были расщеплены полностью примерно на 10%, примерно на 20%, примерно на 25%, примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70%, примерно на 75%, примерно на 80%, примерно на 90%, примерно на 95%, примерно на 99%, почти на 100%, по существу на 100% или полностью на 100%. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется, когда были расщеплены 100% гликоконъюгатов. В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере один содержащий гликан образец удаляется до расщепления 100% гликоконъюгатов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через постоянные периоды времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через примерно 30 секунд, примерно 1 минуту, примерно 2 минуты, примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 30 минут, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов или примерно через 18 часов либо даже через более продолжительные периоды времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через непостоянные периоды времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через периоды времени длительностью 5 часов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования может быть более всесторонним. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования показывает высокое содержание (например, больше, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более этого) сайтов гликозилирования; в некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования показывает высокую степень разветвленности (например, выше примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более при использовании три- или тетра-антеннальных структур).

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет менее всесторонним. Например, В некоторых вариантах осуществления изобретения гликозилирование желательного характера клеточной поверхности указывает на низкое содержание (например, меньше примерно 50%, примерно 45%, примерно 40%, примерно 35%, примерно 30%, примерно 25%, примерно 20%, примерно 15%, примерно 15%, примерно 5%, примерно 1% или еще менее) сайтов гликозилирования; и/или низкую степень разветвленности (например, меньше, чем примерно 20%, примерно 15%, примерно на 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее при использовании три- или тетра-антеннальных структур).

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования может быть более всесторонним в некоторых аспектах и менее всесторонним - в других. Например, может оказаться желательным применить линейку клеток, которые характеризуются тенденцией выращивания гликопротеинов с длинными неразветвленными цепями олигосахаридов. В качестве альтернативы желательно использовать линию клеток, которые характеризуются тенденцией выращивания гликопротеинов с короткими существенно разветвленными цепями олигосахаридов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет улучшен для получения определенной структуры гликана. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования может иметь низкие уровни (например, менее примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или еще менее) высоких маннозных или гибридных структур, высокие уровни (например, больше, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99%, или более) высоких маннозных структур, высокие уровни (например, больше, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более; например, по меньшей мере одну на гликопротеин) фосфорилированной высокоманнозы; или низкие уровни (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или еще менее) фосфорилированной высокоманнозы.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования содержит по меньшей мере примерно одну сиаловую кислоту. В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования содержит высокий уровень (например, более чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более) концов цепи, которые сиализируются. В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования, который включает сиализирование, продемонстрирует присутствие по меньшей мере примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более содержимого N-ацетилнейраминовой кислоты и/или менее примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее содержимого N-гликолилнейраминовой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования проявляет специфичность в удлинении цепи (например, выше, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или большее удлинение разветвлений α-1,6-маннозы либо выше, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или большее удлинение разветвлений α-1,3-маннозы).

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет проявлять низкий уровень (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее) или высокий уровень (например, более, чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или больше) фуколизирования ядра.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет проявлять низкий уровень содержания (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее) или высокий уровень (например, более чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более) сульфатированного гликана.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет проявлять низкий уровень содержания (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее) или высокий уровень (например, более чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более) фосфорилированного гликана.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет проявлять низкий уровень содержания (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее) или высокий уровень (например, более чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более) сиаловой кислоты, связанной с N-ацетилглюкозамином.

В некоторых вариантах осуществления изобретения желательный характер гликозилирования будет проявлять низкий уровень содержания (например, менее чем примерно 20%, примерно 15%, примерно 10%, примерно 5%, примерно 1% или менее) или высокий уровень (например, более чем примерно 60%, примерно 65%, примерно 70%, примерно 75%, примерно 80%, примерно 85%, примерно 90%, примерно 95%, примерно 98%, примерно 99% или более) ацетилированного гликана.

Независимо от мониторинга получения конкретного целевого белка для регулирования качеством, изобретение может быть использовано, например, для контроля процесса гликозилирования на определенных стадиях разработки или при определенных условиях выращивания выходного продукта.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, можно использовать для исследования и/или регуляции или сравнения качества лечебных продуктов. В качестве одного примера скажем, что могут быть использованы современные методологии с целью оценки гликозилирования в клетках, производящих лечебный белковый продукт. В высокой степени из-за того, что гликозилирование часто может оказывать влияние на активность, биологическую ценность и прочие характеристики лечебного белкового продукта, особо необходимы способы оценки клеточного гликозилирования во время производства такого лечебного белкового продукта. Среди всего прочего раскрытие сущности настоящего изобретения может облегчить анализ гликозилирования в системах производства лечебного белка, который проводится в реальном времени.

Характерные лечебные продукты на основе гликопротеина, чье получение и/или качество можно проконтролировать по настоящему изобретению, включают, например, любое из широкого набора гематологических лечебных средств (включая, например, эритропоэтин, факторы для свертывания крови и т.д.), интерфероны, колониестимулирующие факторы, антитела, ферменты и гормоны.

К типичным доступным в продаже продуктам на основе гликопротеина относятся, например, те, что представлены в таблице 3:

В некоторых вариантах осуществления изобретение относится к способам, в которых гликаны, полученные из различных источников, или образцы сравниваются друг с другом. В некоторых таких примерах многочисленные образцы из одного и того же источника получают в течение времени, причем изменения в характере гликозилирования (и, в частности, в характере гликозилирования клеточной поверхности) отслеживаются. В некоторых вариантах осуществления изобретения один из образцов представляет собой исторический образец или запись исторического образца. В некоторых вариантах осуществления изобретения один из образцов является эталонным.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гликаны, полученные из различных образцов культур клеток, выращенных при условиях, которые отличаются одним или несколькими выбранными параметрами (например, тип клетки, тип культуры [например, непрерывная подача фермента вместо периодической и т.д.], условия содержания культуры [например, тип среды, наличие или концентрация определенной составляющей определенной среды (сред), осмотическая концентрация раствора, pH, температура, тайминг или степень смещения одного или нескольких параметров, таких как осмотическая концентрация раствора, pH, температура и т.д.], время развития культуры, стадии выделения и т.д.), однако во всем остальном идентичны, сравниваются таким образом, чтобы определить влияние выбранного параметра на характере N- гликозилирования. В определенных вариантах осуществления изобретения гликаны из разных образцов культур клеток, выращенных при условиях, которые отличаются одним выбранным параметром, сравниваются, чтобы определить влияние такого выбранного параметра на характере гликозилирования. Следовательно, использование способов так, как описано в описании, в других практических приложениях может облегчить определение влияния определенных параметров на характер гликозилирования в клетках.

В некоторых вариантах осуществления изобретения выполняется сравнение гликанов, взятых из различных партий представляющих интерес гликопротеинов (например, терапевтический гликопротеин), независимо от их получения - тем же или другим способом, одновременно или отдельно. В таких вариантах осуществления настоящее изобретение позволяет облегчить контроль качества получения препарата гликопротеина. Альтернативно или дополнительно некоторые такие варианты осуществления изобретения облегчают мониторинг развития конкретной культуры, которая продуцирует представляющий интерес гликопротеин (например, если образцы выделяют из культуры в различные моменты времени и анализируют, после чего сравнивают друг с другом). В некоторых примерах многочисленные образцы из одного и того же источника берут в течение времени, причем изменения в характере гликозилирования отслеживаются. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через примерно 30 секунд, примерно 1 минуту, примерно 2 минуты, примерно 5 минут, примерно 10 минут, примерно 30 минут, примерно 1 час, примерно 2 часа, примерно 3 часа, примерно 4 часа, примерно 5 часов, примерно 10 часов, примерно 12 часов или примерно через 18 часов или даже через более продолжительные периоды времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через непостоянные периоды времени. В некоторых вариантах осуществления изобретения содержащие гликан образцы отделяются через периоды времени длительностью 5 часов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы по изобретению могут использоваться для контроля характера гликозилирования гликопротеинов во время их продукции клетками. Например, продукция гликопротеина (например, коммерческое производство) может включать стадии (1) культивирования клеток, продуцирующих гликопротеин, (2) получения образцов через постоянные или непостоянные периоды времени в процессе культивирования клеток и (3) анализа характера гликозилирования выращенного гликопротеина(ов) в полученном образце(ах). В некоторых вариантах осуществления изобретения такие способы могут включать стадию сравнения характера гликозилирования выращенного гликопротеина(ов) в полученном образце(ах) друг с другом. В некоторых вариантах осуществления изобретения такие способы могут включать стадию сравнения характера гликозилирования выращенного гликопротеина(ов) в полученном образце(ах) с характером гликозилирования эталонного образца.

В любом из этих вариантов осуществления изобретения можно зарегистрировать свойства анализа гликанов, например, сделать это в журнале по управлению качеством. Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения сравнение проводится со сделанной давно записью результатов предыдущего анализа или с результатами анализа для стандартной партии и/или справочного образца гликопротеина.

В некоторых вариантах осуществления изобретения гликаны из различных партий представляющего интерес гликопротеина (например, лечебный гликопротеин) независимо от приготовления тем самым способом или различными способами, и независимо от режима обработки - одновременного или раздельного, сравниваются с другим и/или эталонным образцом. В некоторых вариантах осуществления изобретения сравнение партий может включать стадии (i) получения первого препарата гликана из первой партии гликопротеина; (ii) получения второго препарата гликана из второй партии гликопротеина; (iii) обработки первого и второго препаратов гликана с помощью процедуры применения экзогликозидазы (например, последовательная и/или одновременная обработка с помощью 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или более экзогликозидаз) для специфического отщепления моносахаридов от невосстанавливающихся концов N-связанных гликанов в препаратах гликана; и (iv) сравнение продуктов расщепления, полученных из первого препарата гликана с продуктами расщепления, полученными из второго препарата, с тем, чтобы оценить совместимость двух партий. В некоторых вариантах осуществления изобретения препараты гликана могут быть получены путем отделения по меньшей мере одного N-гликана, по меньшей мере из одного гликопротеина, входящего в состав партии, и по желанию с помощью выделения отделенных N-гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения препараты гликана могут быть помечены так, как описано в настоящем описании (например, флуоресцентным и/или радиоактивным веществом; например, до и/или после выделения).

В некоторых вариантах осуществления изобретения настоящее изобретение относится к управлению качеством препарата гликопротеина. Свойства анализа гликанов можно зарегистрировать, например, в журнале по управлению качеством. Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения сравнение проводится со сделанной давно записью результатов предыдущего анализа или с результатами анализа для стандартной партии. В некоторых вариантах осуществления изобретения сравнение выполняется с эталонным образцом гликопротеина.

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение может быть использовано в исследованиях по модификации характеристик гликозилирования клетки, например, для установления линии клеток и/или условий для роста культур с помощью одной или несколько желательных характеристик гликозилирования. После этого такая линия клеток и/или такие условия роста культуры в случае необходимости могут быть использованы для производства конкретного целевого гликоконъюгата (например, гликопротеина), применительно к которому такая характеристика (характеристики) гликозилирования, как ожидается, будут полезными.

В определенных вариантах осуществления изобретения способы по изобретению используются в отношении гликанов, которые присутствуют на поверхности клеток. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения анализируемые гликаны, по существу, являются гликанами, не расположенными на клеточной поверхности. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения анализируемые гликаны, находясь на клеточной поверхности, присутствуют в контексте проявления одного или нескольких гликоконъюгатов клеточной поверхности (например, гликопротеинов или гликолипидов). В определенных вариантах осуществления изобретения характер гликозилирования связанного с мембранной или трансмембранной гликопротеина клеточной поверхности может быть определен (1) высвобождением гликопротеина в результате его обработки одной или несколькими протеазами; (2) выделением популяции гликанов за счет расщепления высвобожденного гликопротеина с помощью гликаназы; (3) расщепления популяции гликанов с помощью экзогликозидазы согласно любому из способов, описанных в настоящем описании; и (4) анализом продуктов расщепления с помощью любого способа, доступного среднему специалисту в данной области.

В некоторых определенных вариантах осуществления изобретения, гликаны клеточной поверхности анализируются для оценки гликозилирования одного или нескольких представляющих интерес целевых гликопротеинов, в частности, там, где такие целевые гликопротеины не являются гликопротеинами клеточной поверхности. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно контролировать гликозилирование целевого гликопротеина без выделения самого гликопротеина. В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к способам применения гликанов клеточной поверхности в качестве объекта для снятия характеристик или примера для представления структур гликана в отображаемом и представляющем интерес гликопротеине. В определенных вариантах осуществления изобретения такие способы включают, но ими не ограничиваются, последующую обработку, формирование партии, сортировку или “находящиеся под контролем” измерения качества продукта. Такие способы могут обеспечить независимое измерение характера гликозилирования для полученного и представляющего интерес гликопротеина без использования побочного продукта реакции создания (например, клеток) и без необходимости применения разрушения любого полученного гликопротеина. К тому же, применение способов по изобретению поможет избежать усилий, требуемых для выделения продукта и возможного выбора гликоформ продукта, которые могут возникнуть во время выделения.

В определенных вариантах осуществления изобретения способы относятся к гликанам, которые выделяются из клеток. В некоторых таких вариантах осуществления изобретения анализируемые гликаны образуются в клетках в контексте проявления гликоконъюгатов (например, гликопротеина или гликолипида).

Согласно настоящему изобретению способы, описанные в описании, могут быть использованы для обнаружения желательных или нежелательных гликанов, например, для обнаружения и количественного определения присутствия одной или нескольких загрязняющих примесей в продукте или для обнаружения и количественного определения присутствия одного или нескольких активных или желательных видов.

В различных вариантах осуществления изобретения можно использовать способы для обнаружения биологических маркеров, указывающих, например, на наличие болезни до появления ее симптомов и/или на ее развитие до такого состояния, когда она полностью не поддается лечению или поддается лечению в меньшей степени, что происходит в результате обнаружения одного или нескольких специфических гликанов, чье присутствие или уровень (абсолютный или относительный) могут быть скоррелированы относительно состояния конкретной болезни (включая восприимчивость к определенной болезни) и/или в результате изменения концентрации таких гликанов по прошествию длительного времени.

В определенных вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, облегчают обнаружение гликанов, которые присутствуют на очень низких уровнях в источнике (например, биологический образец, препарат гликана и т.д.). В таких вариантах осуществления изобретения можно обнаружить и/или по желанию количественно определить уровни гликанов, которые присутствуют на уровнях, примерно менее чем 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1,5%, 1%, 0,75%, 0,5%, 0,25%, 0,1%, 0,075%, 0,05%, 0,025%, или 0,01% в пределах популяции гликанов. В некоторых вариантах осуществления изобретения можно обнаружить и/или по желанию количественно определить уровни гликанов в диапазоне 0,1-5%, например, 0,1-2%, например, 0,1-1% препарата гликана. В определенных вариантах осуществления изобретения можно обнаружить и/или по желанию количественно определить уровни гликанов в диапазоне примерно 0,1-1 ммол.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, позволяют обнаружить определенные связи, которые присутствуют на низких уровнях в пределах популяции гликанов. Например, рассматриваемые способы позволяют обнаружить определенные связи, которые присутствуют на уровнях менее 10%, менее 5%, менее 4%, менее 3%, менее 2%, менее 1,5%, менее 1%, менее 0,75%, менее 0,5%, менее 0,25%, менее 0,1%, менее 0,075%, менее 0,05%, менее 0,025%, или менее 0,01% в пределах популяции гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в настоящем описании, позволяют обнаружить относительные уровни отдельных видов гликанов в пределах популяции гликанов. Например, область под каждым пиком хроматограммы, полученной на жидкостном хроматографе, может быть измерена и выражена в виде процента от целого. Такой анализ обеспечивает определение относительного процентного количества каждого вида гликанов в пределах популяции гликанов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы, описанные в этом описании, могут быть скомбинированы с одной или несколькими другими технологиями обнаружения, анализа и/или выделения гликанов или гликоконъюгатов. Например, в определенных вариантах осуществления изобретения гликаны анализируются по настоящему изобретению с помощью одного или нескольких доступных способов (для предоставления лишь нескольких примеров, обратитесь к Anumula, Anal. Biochem. 350(1):1, 2006; Klein et al., Anal. Biochem., 179:162, 1989; и/или Townsend, R.R. Carbohydrate Analysis «High Performance Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis», Ed. Z. El Rassi, стр. 181-209, 1995, каждый из которых учитывается полностью в настоящем описании ссылкой). Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения гликаны исследуются с помощью одного или нескольких способов хроматографии, электрофореза, ядерно-магнитного резонанса и посредством комбинаций этих способов. К таким типичным способам относятся, например, ядерный магнитный резонанс, масс-спектрометрия, жидкостная хроматография, 2-мерная хроматография, SDS-PAGE, окрашивание антител, окрашивание лектина, количественное определение моносахаридов, капиллярный электрофорез, углеводный электрофорез с помощью флуорофора (FACE), мицеллярная электрокинетическая хроматография (MEKC), обработка с помощью экзогликозидазы или эндогликозидазы и комбинации вышеприведенных способов. Средние специалисты в данной области должны знать и другие способы, которые можно использовать для исследования гликанов вместе с другими способами IMAC, описанными в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция N-гликана может быть проанализирована способами хроматографии, включая, но ими не ограничиваясь, жидкостную хроматографию (LC), высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), ультравысокую жидкостную хроматографию (UPLC), тонкослойную хроматографию (ТСХ), хроматографию с применением колонки с амидной фазой и комбинации вышеуказанных способов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция гликана может быть проанализирована с применением масс-спектрометрии (MS) и связанных с нею способов, включая, но ими не ограничиваясь, MS, LC-MS, LC-MS/MS, масс-спектрометрию с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрию с преобразованием Фурье (FTMS), спектрометрию ионной подвижности и масс-спектрометрию (IMS-MS), разделение переноса электронов (ETD-MS) и комбинации вышеуказанных способов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция гликана может быть проанализирована с применением электрофоретических способов, включая, но ими не ограничиваясь, капиллярный электрофорез (CE), CE-MS, гель-электрофорез, электрофорез в агарозном геле, электрофорез в акриламидном геле, электрофорез в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом на основе антител, которые распознают конкретные структуры гликана и их комбинации.

В некоторых вариантах осуществления изобретения структура и композиция гликана может быть проанализирована с применением ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) и связанных с ним способов, включая, но ими не ограничиваясь, одномерный ЯМР (1D-ЯМР), двумерный ЯМР двумерной спектроскопией ЯМР (2D-ЯМР), корреляционную спектроскопию ЯМР (COSY-ЯМР), полную корреляционную спектроскопию ЯМР (TOCSY-ЯМР), двумерную гетероядерную одноквантовую спектроскопию ЯМР (HSQC-ЯМР), двумерную гетероядерную многоквантовую спектроскопию ЯМР (HMQC-ЯМР), спектроскопию ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат (ROESY-ЯМР) и спектроскопию ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY-ЯМР) и комбинации вышеуказанных способов.

Раскрытие сущности настоящего изобретения будет более конкретно проиллюстрировано ссылками на следующие примеры. Однако следует понимать, что раскрытие сущности настоящего изобретения никоим образом не ограничивается этими примерами.

Примеры

Пример 1: Пошаговое расщепление N-гликанов с помощью экзогликозидазы

Материалы и способы

Препарат образца

N-гликаны были высвобождены из очищенного образца гликопротеина с помощью N-гликаназы F, затем последовала стадия очистки для удаления солей, детергентов, белков и материала, не относящегося к гликанам. Белки вначале были денатурированы теплом и затем обработаны излишком N-гликаназы F в течение ночи при температуре 37ºC с участием додецилсульфат натрия. Высвобожденные гликаны были изолированы от солей и фермента с помощью колонки, наполненной графитированным углеродом (например, марки EnviCarb). N-гликаны были помечены флуоресцентным составом на восстанавливающемся конце структуры (N-гликан-2AB), а излишки вещества-маркера удалены во время дополнительной стадии очистки. Вещество-маркер 2-AB было вначале растворено в 30%-ной уксусной кислоте из раствора диметилсульфоксида, а к полученной конечной концентрации в 1,2 M был добавлен цианборогидрид натрия. Для завершения маркирования примерно 5-10 мкл этого маркирующего раствора было добавлено к высушенным гликанам и подогрето до 65°C в течение 3 часов. Затем помеченные гликаны изолируются от свободного вещества-маркера и солей с помощью обработки образца кассетой, содержащей гликоклин S, промывки их ацетонитрилом концентрации 96% и элюирования водой.

Реакции с участием экзогликозидазы

Смеси гликанов (0,25-0,5 нмол/мкл) были подвергнуты постадийной обработке по меньшей мере двумя экзогликозидазами (1-2 мкл последовательно подаваемой гликозидазы на 20-40 мкл предназначенного для реакции раствора), выбранными из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы и фукозидазы. Обычно реакции проходили при pH ~5,5. После каждой стадии постадийного анализа используемый фермент инактивировался до добавления следующего фермента.

Анализ продуктов расщепления

При использовании жидкостной хроматографии (LC) продукты расщепления были растворены в колонке с амидной фазой, которая была подключена к прибору масс-спектрометрии (MS). Структурная идентификация пиков гликанов была выполнена с помощью масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS). Периоды отстаивания гликана сравнивались с периодами известных стандартов и периодами глюкозной цепи.

Результаты

После всесторонней постадийной обработки с помощью экзогликозидаз большинство N-гликанов были расщеплены до ядра сохраненного M3N2, некоторые малые пики которого на хроматограмме позднее были размыты (Фигура 2B). Масс-спектрометрия (MS) подтвердила, что малые пики соответствовали лактозамину (Фигура 2B). На Фигуре 2A показана хроматограмма N-гликана до его расщепления.

Пример 2: Одновременное расщепление N-гликана с помощью множества экзогликозидаз

Материалы и способы

Препарат образца и анализ продуктов расщепления

N-гликаны были приготовлены, а продукты расщепления проанализированы так, как описано в примере 1.

Реакции с участием экзогликозидазы

Смеси гликана (0,25-0,5 нмол/мкл) были подвергнуты одновременной обработке по меньшей мере двумя экзогликозидазами (1-2 мкл последовательно подаваемой гликозидазы на 20-40 мкл предназначенного для реакции раствора), выбранными из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы и фукозидазы. Обычно реакции проходили при pH ~5,5.

Результаты

Когда N-гликаны были одновременно обработаны с помощью двух или более экзогликозидаз, большинство структур N-гликана сплющились до сохраненного ядра (M3N2). Фрагменты удлинения лактозамином были устранены одновременным воздействием галактозидазы и гексозаминидазы. Как показано на Фигуре 3, существуют некоторые виды, стойкие к воздействию всех используемых экзогликозидаз, время сохранения которых согласно жидкостной хроматографии составляли 30-70 минут. Тот факт, что эти виды не поддаются обработке обычной экзогликозидазой, указывает на наличие в них необычных модификаций, которые могут быть идентифицированы масс-спектрометрическим анализом и количественно определены с помощью замера областей пиков как процентное отношение от целого.

Пример 3: Определение присутствия групп лактозамина в N-гликане с помощью одновременного и последовательного расщепления экзогликозидазой

Протоколы результатов расщепления экзогликозидазой при ее сравнительном применении в последовательном и одновременном режимах можно использовать для получения примерной информации о структуре и/или композиции N-гликанов в препарате гликана. Например, присутствие групп лактозаминов может быть определено сравнением продуктов расщепления, полученных в результате операции последовательного и одновременного расщепления так, как схематически представлено в таблице 4 для гипотетической структуры N-гликана:

Все экзогликозидазы, показанные в таблице 4, представляют собой широкую специфичность подложек, то есть они будут отделять конечный сахар от невосстанавливающегося конца, невзирая на тип связи. Сравнение последовательной (Q) и одновременной (S) обработок Rx04 или Rx05 позволяет подтвердить присутствие групп полилактозамина в препарате гликана.

Таблица 4
Сравнение последовательного и одновременного расщепления с помощью экзогликозидаз Фермент Rx01 Rx02
S или Q Rx03
S или Q Rx04
S Rx04
Q Rx05
S Rx05
Q α-2/3,6,8,9-сиалидаза --- X X X X X X β-1/3,4,6-галактозидаза --- --- X X X X X β-1,4-гексозаминидаза --- --- --- X X X X α-1/3,4,6-фукозидаза --- --- --- --- --- X X Продукты расщепления

Как показано в таблице 4, каждая из обработок Rx04 (S) и Rx04 (Q) представляет расщепление одного и того же N-гликана с помощью одинаковых наборов ферментов (сиалидаза, галактозидаза и гексозаминидаза широкой специфичности). Однако, одновременное (S) и последовательное (Q) расщепления генерируют отличные друг от друга продукты расщепления. Подобно этому каждая из обработок Rx05 (S) и Rx05 (Q) представляет расщепление одного и того же N-гликана с помощью одинаковых наборов ферментов (сиалидаза, галактозидаза, гексозаминидаза и фукозидаза широкой специфичности). Однако, одновременное (S) и последовательное (Q) расщепления генерируют отличные друг от друга продукты расщепления. Этот пример демонстрирует один из подходов, при использовании которого сравнение продуктов расщепления, генерируемых процессами одновременного и последовательного расщепления, может предоставить приблизительную информацию о структуре и/или композиции гликана.

Вышеуказанный пример далее представлен на Фигуре 7, которая показывает, как структуры полилактозамина могут быть интерпретированы в результате сравнения результатов последовательного и одновременного расщепления. На Фигуре 7 показан образец, который содержит популяцию гликана. После одновременного расщепления популяции гликанов с помощью сиалидазы, галактозидазы и гексозаминидазы большинство гликанов расщепляется до структур ядра Man3Gn2, на что указывают результаты жидкостной хроматографии (LC; Фигура 7A) и масс-спектрометрии (MS; Фигура 7B). Несколько выбранных пиков с более продолжительными периодами сохранения соответствуют структурам высокоманнозного типа. Однако после последовательного расщепления с помощью сиалидазы, галактозидазы и гексозаминидазы в добавление к пикам, которые соответствуют структурам высокоманнозного типа, остаются дополнительные пики. Эти дополнительные пики, которые соответствуют гликанам с лактозой, присоединенной к ядру Man3Gn2, не исчезают согласно данным масс-спектрометрии. Присутствие этих пиков (при последовательной, а не одновременной обработке) соответствует присутствию структур типа полилактозамина в первоначальном образце.

Пример 4: Идентификация связей сиаловой кислоты в N-гликане с помощью одновременного и последовательного расщепления экзогликозидазой

Протоколы результатов расщепления экзогликозидазой при ее сравнительном применении в последовательном и одновременном режимах можно использовать для получения примерной информации о структуре и/или композиции N-гликанов в препарате гликана. Например, присутствие и/или тип связей сиаловой кислоты могут быть определены сравнением продуктов расщепления, полученных в результате операции последовательного и одновременного расщепления так, как схематически представлено в таблице 5 для гипотетической структуры N-гликана:

В таблице 5 представлена группа сиалидаз, каждая из которых обладает широкой специфичностью подложек. Настоящий пример демонстрирует как конечные связи α-2,3 сиаловой кислоты могут отличаться от α-2,6-связей.

Таблица 5
Определение связей сиаловой кислоты в N-гликанах Фермент Rx11 Rx12
S Rx12
Q Rx13
S Rx13
Q Rx14
S или Q Rx15
S Rx15
Q Rx16
S или Q α-2/3,6,8,9-сиалидаза --- X X --- --- X --- --- --- α-2/3-сиалидаза --- --- --- X X --- --- --- X β-1/3,4,6-галактозидаза --- X X X X X X X X β-1,4-гексозаминидаза --- X X X X --- X X --- Продукты расщепления

Как показано в таблице 5, каждая из обработок Rx12 (S) и Rx12 (Q) представляет расщепление одного и того же N-гликана с помощью идентичного набора ферментов (α-2/3,6,8,9-сиалидаза, β-1/3,4,6-галактозидаза, и β-1,4-гексозаминидаза). Однако, одновременное (S) и последовательное (Q) расщепления генерируют отличные друг от друга продукты расщепления. Как показано, сравнение результатов последовательного и одновременного расщепления объясняет появление структур полилактозамина, а 2,6-связанная сиаловая кислота присутствует на фрагменте удлинения полилактозамина, тогда как 2,3-связанная сиаловая кислота располагается на плече цепи вместе с только одним лактозамином. Этот пример демонстрирует один из подходов, при использовании которого сравнение продуктов расщепления, генерируемых процессами одновременного и последовательного расщепления, может предоставить приблизительную информацию о структуре и/или композиции гликана.

Помимо этого, как показано в таблице 5, обработка Rx15 (Q) расщепляет все несиализированные антенны в популяции гликанов до гликана ядра триманнозила. В состав продуктов расщепления входят моно-, би-, три- и тетра-антеннуальные виды, характеристики которых могут быть определены с помощью хроматографии. Такой анализ профиля обеспечивает считывание данных об антеннальной композиции первоначальной смеси гликана. В частности, такой анализ профиля обеспечивает считывание данных об антеннальной композиции сиализированных разветвлений. При использовании множества образцов и после осуществления такой обработки с помощью гликозидазы каждый отдельный гликан будет насчитывать столько разветвлений, сколько их было сиализировано, с последующим разделением хроматографическим способом. Это в дальнейшем показано на Фигуре 4, которая представляет типичную структуру N-гликана, подвергнутую условиям расщепления обработки Rx05 (Q) так, как показано в таблице 5. Для популяции N-гликанов, представленных на Фигуре 4, этот пример показывает, как последовательная обработка может привести к формированию популяции продуктов расщепления. Продукты расщепления могут быть проанализированы, а их структуры и/или композиции определены.

Пример 5: Идентификация связей фукозила в N-гликане с использованием одновременного и последовательного расщепления экзогликозидазой

Протоколы результатов одновременного расщепления экзогликозидазой можно использовать для получения примерной информации о структуре и/или композиции N-гликанов в препарате гликана. Например, расщепление с помощью различных комбинаций экзогликозидаз можно использовать для различения фукозилирования плеча (антеннального) α-1/3,4 от фукозилирования ядра α-1,6 ранее десиализированного N-гликана. Результаты каждой обработки, показанные в Таблице 6, проиллюстрированы в случае использования следующей типичной структуры гликана:

Таблица 6
Определение связей фукозила Фермент Rx01 Rx02 Rx03 Rx04 Rx05 Rx06 Rx07 β-1/3,4,6-галактозидаза --- X X --- X X X α-1/3,4,6-фукозидаза --- X --- --- --- X --- α-1/3,4-фукозидаза --- --- X --- --- --- X β-1,4-гексозаминидаза --- X X X X --- --- Продукты расщепления

Как показано в таблице 6, расщепление экзогликозидазой с использованием различных комбинаций ферментов генерирует различные продукты расщепления. В представленном здесь примере анализ, основанный только на исследовании масс, указывает на присутствие двух фукозных остатков. Однако с помощью вышеуказанного подхода можно определить местоположение двух фукозных остатков (например, одна фукоза располагается в ядре, а вторая - на ответвлении в противоположность расположению обеих фукозных остатков на ответвлениях). Этот пример демонстрирует один из подходов, при использовании которого сравнение продуктов расщепления, генерируемых процессом одновременного расщепления, может предоставить приблизительную информацию о структуре и/или композиции гликана.

Пример 6: Быстрая идентификация содержащих полилактозамин гликанов

N-связанные гликаны были высвобождены из взятого в качестве модели гликопротеина с помощью пептида: N-гликозидазы F (PNGase-F), формирующий образец гликана. PNGase-F представляет собой амидазу, которая между остатками высокой маннозы самой дальней GlcNAc и аспарагина отделяет гибридные и сложные олигосахариды от N-связанных гликопротеинов (Maley et al., 1989, Anal. Biochem., 180:195; включено в настоящее описание в качестве ссылки). Гликозидаза PNGase F может гидролизировать почти все типы цепочек N-гликанов из гликопептидов и/или гликопротеинов. Полученный в результате образец гликана был очищен с помощью кассет с экстракцией твердой фазы активированного графитированного углерода. После этого смесь гликана была флуоресцентно помечена с помощью 2-бензамида. Образец гликана был разделен на две равные части, каждая из которых вступила в реакцию с набором экзогликозидаз (например, сиалидазы, галактозидазы и N-ацетилгексозаминидазы) в одновременном и последовательном режиме соответственно. Продукты реакции были впоследствии проанализированы с помощью обычной фазовой флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием колонки с амидной фазой или MALDI-MS. Результаты анализа представлены на Фигуре 8 (хроматограммы) и на Фигуре 9 (MALDI-MS).

Эквиваленты и область применения

Средние специалисты в данной области на основе обычного экспериментирования должны распознавать или мочь установить многие эквиваленты конкретных вариантов исполнения изобретения согласно раскрытию описанной здесь его сущности. Область применения, связанная с раскрытием сущности настоящего изобретения, не подлежит ограничению вышеуказанным Описанием, а подразумевается так, как изложено в прилагаемых пунктах формулы изобретения.

Средние специалисты в данной области, используя ничего свыше обычного экспериментирования, должны распознавать или мочь установить многие эквиваленты конкретных вариантов исполнения изобретения согласно раскрытию описанной здесь его сущности. Область применения, связанная с раскрытием сущности настоящего изобретения, не подлежит ограничению вышеуказанным описанием, а подразумевается так, как изложено в прилагаемых пунктах формулы изобретения.

Единственное число в пунктах формулы изобретения может означать один или более чем один, если не указано иное, или очевидное иным образом не вытекает из контекста. Таким образом, например, ссылка на “наночастицу” включает множество таких наночастиц, а ссылка на “клетку” - ссылку на одну или несколько клеток, известным среднему специалисту в данной области, и так далее. Пункты формулы изобретения или описания, которые включают “или” между одним или несколькими членами группы, считаются соответственными, если один, несколько или все члены группы присутствуют, используются или иным образом значимы по отношению к данному продукту или химическому процессу, если не указано иное, или очевидное иным образом не вытекает из контекста. Раскрытие сущности изобретения включает такие его варианты осуществления, в которых присутствует, используется или иным образом значим по отношению к данному продукту или химическому процессу ровно один член группы. Раскрытие сущности изобретения включает такие варианты осуществления изобретения, в которых присутствуют, используются или иным образом существенны по отношению к данному продукту или химическому процессу более чем один или все члены группы. К тому же, следует понимать, что раскрытие сущности изобретения включает все изменения, комбинации и перестановки, при которых одно или несколько ограничений, элементов, условий, описательных терминов и т.д., взятых из одного или нескольких пунктов формулы изобретения, вносятся в другой пункт формулы изобретения. Например, любой пункт формулы изобретения, который зависит от другого пункта, может быть модифицирован для учета одного или более ограничений, содержащихся в любом другом пункте, который зависит от такого же базового пункта формулы изобретения. К тому же там, где в формуле изобретения излагается композиция, следует понимать, что способы использования композиции для любой из раскрытых здесь целей учтены, а способы приготовления композиции согласно любому из раскрытых здесь способов ее приготовления или других способов, известных специалистам из уровня техники, также учтены, если не указано иное или же среднему специалисту в данной области не становятся очевидными возникновения противоречия и несовместимости.

Там, где элементы представлены как списки, например, в формате формулы изобретения Маркуша, следует понимать, что при этом также раскрывается каждая подгруппа элементов, и любой элемент(ы) может быть удален из группы. Следует понять, что в общем случае там, где на раскрытие сущности изобретения или на аспекты по изобретению ссылаются как на аспекты, содержащие конкретные элементы, особенности и т.д., определенные варианты осуществления изобретения согласно раскрытию его сущности или аспекты по изобретению состоят или значимо состоят из таких элементов, особенностей и т.д. С целью упрощения такие варианты осуществления изобретения не были изложены конкретно словесно в настоящем описании. Отметим, что термин “включающий” предполагается открытым для применения и позволяет включение дополнительных элементов или шагов.

Там, где даются диапазоны, включены конечные точки. К тому же, следует понять, что если не указано иное, или очевидное иным образом не вытекает из контекста и понимания средним специалистом в данной области, то значения, которые выражены как диапазоны, могут принимать любое конкретное значение или оказаться в поддиапазоне в пределах установленных диапазонов в разных вариантах осуществления изобретения согласно раскрытию сущности изобретения до десятых единиц нижнего предела диапазона, если контекст явно не указывает на иное.

Помимо этого следует понять, что любой конкретный вариант осуществления настоящего изобретения из раскрытия его сущности, которое оказывается среди предшествующих технологий, может быть однозначно исключено из любого или нескольких пунктов формулы изобретения. Поскольку такие варианты осуществления изобретения полагаются известными среднему специалисту в данной области, они могут быть исключены даже в том случае, если это исключение не изложено в явной форме в этой работе. Любой конкретный вариант осуществления изобретения по композициям согласно раскрытию сущности изобретения (например, любая экзогликозидаза, любое гликозидное связывание, любое условие проведения реакции, любой способ очистки, любой способ анализа продукта и т.д.) может быть исключено из любого или нескольких пунктов формулы изобретения по любой причине, которая может иметь или не иметь отношение к существованию предшествующих технологий.

Обсужденные выше и представленные по тексту публикации обеспечиваются исключительно для раскрытия с их помощью сущности изобретения до даты регистрации настоящей заявки. В настоящем описании нет ничего, что может быть истолковано как допущение того факта, что изобретатели не имеют права датировать задним числом такое раскрытие сущности изобретения на основании предшествующего раскрытия его сущности.

Настоящее изобретение относится к способам анализа структуры и/или композиции гликанов. Способы включают расщепление препарата гликанов с помощью многочисленных экзогликозидаз. В некоторых вариантах осуществления изобретения гликаны обрабатывают с помощью многочисленных экзогликозидаз одновременно и последовательно с дальнейшим сравнением характеристик образованных продуктов расщепления. В некоторых вариантах осуществления способы по настоящему изобретению включают сравнение продуктов расщепления N-гликанов, которые были расщеплены с помощью многочисленных экзогликозидаз одновременно, с N-гликанами, которые были расщеплены многочисленными экзогликозидазами последовательно. 5 н. и 19 з.п. ф-лы, 6 табл., 9 ил., 6 пр.

1. Способ сравнения результатов множественных отдельных обработок ферментом экзогликозидазой препарата гликана для того, чтобы определить одну или более характеристик гликозилирования препарата гликана, причем способ включает стадии:
обеспечения препарата гликана,
подвергания препарата гликана множественным отдельным обработкам ферментом экзогликозидазой, причем множественные отдельные обработки экзогликозидазой включают:
a) последовательную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую последовательное воздействие на препарат гликана каждой из первой и второй экзогликозидаз с получением результатов последовательного расщепления; и
(b) одновременную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую одновременное воздействие на препарат гликана как первой, так и второй экзогликозидаз с получением результатов одновременного расщепления, и сравнения результатов последовательного расщепления с результатами одновременного расщепления для того, чтобы выявить различия, таким образом определяя по меньшей мере одну характеристику гликозилирования препарата.

2. Способ по п.1, где по меньшей мере одна характеристика гликозилирования содержит информацию о структуре гликана.

3. Способ по п.2, где по меньшей мере одна характеристика гликозилирования содержит идентификацию по меньшей мере одного вида гликанов, который присутствует на очень низких уровнях в препарате.

4. Способ по п.3, где стадия сравнения содержит:
характеризацию продуктов последовательной обработки экзогликозидазой;
характеризацию продуктов одновременной обработки экзогликозидазой; и
сравнение охарактеризованных продуктов последовательной обработки экзогликозидазой с охарактеризованными продуктами одновременной обработки экзогликозидазой для того, чтобы определить продукты, присутствующие в одном из указанных и не присутствующие в другом из указанных.

5. Способ характеризации одной или более характеристик гликозилирования препарата гликана, включающий стадии:
обеспечения препарата гликана;
разделения препарата гликана на две или более частей;
подвергания первой части препарата гликана первой процедуре обработки экзогликозидазой, где первая процедура обработки экзогликозидазой включает последовательную обработку первой части по меньшей мере двумя экзогликозидазами, где на первую часть воздействуют каждой экзогликозидазой согласно первой процедуре по отдельности;
подвергания второй части препарата гликана второй процедуре обработки экзогликозидазой, где вторая процедура обработки экзогликозидазой включает одновременную обработку второй части по меньшей мере двумя экзогликозидазами, где на вторую часть воздействуют каждой экзогликозидазой согласно второй процедуре по отдельности;
характеризации продуктов расщепления первой и второй процедуры обработки экзогликозидазой; и
сравнения результатов характеристики продуктов расщепления согласно первой процедуре обработки экзогликозидазой с результатами характеристики продуктов расщепления согласно второй процедуре обработки экзогликозидазой для того, чтобы определить по меньшей мере одну характеристику гликозилирования препарата гликана.

6. Способ по п.5, где препарат гликана получают из препарата гликопротеина, содержащего гликаны, ковалентно связанные с пептидным остовом.

7. Способ по п.6, где препарат гликопротеина расщепляют с высвобождением гликанов.

8. Способ по п.7, где препарат гликопротеина расщепляют с высвобождением N-связанных гликанов.

9. Способ по п.6, где препарат гликана является флуоресцентно меченным.

10. Способ по п.5, где стадия сравнения включает сравнение результатов характеристики продуктов расщепления согласно первой или второй процедуре обработки экзогликозидазой с продуктами расщепления эталонного образца.

11. Способ по п.5, где первая или вторая процедура обработки экзогликозидазой включает обработку образца препарата гликана одной или более экзогликозидазами, выбранными из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы, маннозидазы и их комбинаций.

12. Способ по п.5, где по меньшей мере один продукт расщепления содержит сульфатированный гликан, фосфорилированный гликан, сиаловую кислоту, связанную с N-ацетилглюкозамином, ацетилированный гликан, продукт антеннального фуколизирования, одноцепочечный участок лактозамина или ядро пентасахарида, состоящее из трех остатков маннозы и 2 остатков N-ацетилглюкозамина.

13. Способ по п.5, где стадия обеспечения препарата гликана включает:
a) обеспечение множества гликопротеинов, причем каждый гликопротеин содержит меньшей мере один N-гликан, связанный с гликопротеином из этого множества,
b) удаление по меньшей мере одного N-гликана из по меньшей мере одного гликопротеина,
c) необязательно, выделение удаленных N-гликанов.

14. Способ по п.5, где стадия характеризации включает подвергание продуктов расщепления процедуре, выбранной из группы, состоящей из хроматографических методов, жидкостной хроматографии (LC), высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC), тонкослойной хроматографии (ТСХ), хроматографии с применением колонки с амидной фазой, масс-спектрометрии (MS), тандемной масс-спектрометрии, сочетания жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии (LC-MS), сочетания жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (LC-MS/MS), масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из матрицы (MALDI-MS), масс-спектрометрии с преобразованием Фурье (FTMS), спектрометрии ионной подвижности и масс-спектрометрии (IMS-MS), диссоциации при переносе электронов и масс-спектрометрии (ETD-MS), электрофоретических способов, капиллярного электрофореза (СЕ), капиллярного электрофореза и масс-спектрометрии (CE-MS), гель-электрофореза, электрофореза в агарозном геле, электрофореза в акриламидном геле, электрофореза в полиакриламидном геле с использованием додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) с последующим вестерн-блоттингом на основе антител, которые распознают конкретные структуры гликана, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), одномерной спектроскопии ЯМР (ID-ЯМР), двумерной спектроскопии ЯМР (2D-ЯМР), корреляционной спектроскопии ЯМР (COSY-ЯМР), полной корреляционной спектроскопии ЯМР (TOCSY-ЯМР), двумерной гетероядерной одноквантовой спектроскопии ЯМР (HSQC-ЯМР), двумерной гетероядерной многоквантовой спектроскопии ЯМР (HMQC-ЯМР), спектроскопии ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера во вращающейся системе координат (ROESY-ЯМР) и спектроскопии ЯМР ядерного эффекта Оверхаузера (NOESY-ЯМР) и комбинаций вышеуказанных способов.

15. Способ по п.5, дополнительно включающий оценку наличия модификаций в препарате N-гликана, выбранных из группы, состоящей из фосфорилирования, сульфатирования, удлинения фрагментом лактозамина и антеннального фукозилирования.

16. Способ характеризации препарата гликана, содержащего множество N-гликанов, связанных с белком для того, чтобы определить одну или более характеристик препарата гликана, включающий стадии:
a) обеспечения препарата гликана, содержащего множество гликопротеинов, причем каждый гликопротеин содержит по меньшей мере один N-гликан, который связан с гликопротеином из этого множества, где характер гликозилирования по меньшей мере одного элемента множества отличается от характера гликозилирования по меньшей мере другого элемента множества;
b) удаления по меньшей мере двух N-гликанов по меньшей мере из одного гликопротеина этого множества;
c) необязательно, выделения удаленных N-гликанов;
d) подвергания удаленных N-гликанов множественным отдельным обработкам ферментом экзогликозидазой, при этом множественные отдельные обработки ферментом экзогликозидазой включают:
1) последовательную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую последовательное воздействие на препарат гликанов каждой из первой и второй экзогликозидаз с получением результатов последовательного расщепления;
2) одновременную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую одновременное воздействие на препарат гликанов как первой, так и второй экзогликозидазами с получением результатов одновременного расщепления; и
e) характеризации продуктов расщепления из каждой обработки экзогликозидазой; и
f) необязательно, сравнения результатов характеризации продуктов расщепления с эталонным образцом.

17. Способ сравнения партий гликопротеина, включающий стадии:
обеспечение первого препарата гликана из первой партии гликопротеина;
обеспечение второго препарата гликана из второй партии гликопротеина;
подвергания каждого из первого и второго препаратов гликана множественным отдельным обработкам ферментом экзогликозидазой, при этом множественные отдельные обработки экзогликозидазой включают:
a) последовательную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую последовательное воздействие на препарат гликана каждой из первой и второй экзогликозидаз с получением результатов последовательного расщепления;
b) одновременную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую одновременное воздействие на препарат гликана как первой, так и второй экзогликозидазами с получением результатов одновременного расщепления; и
сравнения результатов последовательного расщепления с результатами одновременного расщепления для того, чтобы выявить различия, таким образом определяя совместимость этих двух партий.

18. Способ по п.17, где процедура обработки экзогликозидазой включает обработку первого и второго препаратов гликана по меньшей мере одной экзогликозидазой, выбранной из группы, состоящей из сиалидазы, галактозидазы, гексозаминидазы, фукозидазы, маннозидазы и их комбинаций.

19. Способ по п.17, где по меньшей мере один продукт расщепления включает гликоформу, выбранную из группы, состоящей из
ядра пентасахарида, включающего три остатка маннозы и 2 остатка N-ацетилглюкозамина;
продукта антеннального фукозилирования;
продукта удлинения фрагментом лактозамина;
сульфатированного гликана;
фосфорилированного гликана;
сиаловой кислоты, связанной с N-ацетилглюкозамином; и
ацетилированного гликана.

20. Способ по п.17, где стадия обеспечения препарата гликана включает:
a) удаление по меньшей мере одного N-гликана по меньшей мере из одного гликопротеина первой или второй партии;
b) необязательно, выделение удаленных N-гликанов.

21. Способ контроля получения гликопротеина, включающий стадии:
отделения во время получения гликопротеина по меньшей мере первого и второго гликансодержащих образцов из производственной системы;
подвергания первого и второго гликансодержащих образцов множественным отдельным обработкам ферментом экзогликозидазой, причем множественные отдельные обработки ферментом экзогликозидазой включают:
a) последовательную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую последовательное воздействие на препарат гликана каждой из первой и второй экзогликозидаз с получением результатов последовательного расщепления;
b) одновременную обработку ферментом экзогликозидазой, включающую одновременное воздействие на препарат гликана как первой, так и второй экзогликозидазами с получением результатов одновременного расщепления; и
сравнения результатов последовательного расщепления с результатами одновременного расщепления из первого и второго гликансодержащих образцов для того, чтобы выявить различия и, следовательно, контролировать ход получения гликопротеина.

22. Способ по п.21, где по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют при завершении процедуры обработки экзогликозидазой примерно на 10%.

23. Способ по п.21, где по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют до завершения процедуры обработки экзогликозидазой почти на 100%.

24. Способ по п.21, где по меньшей мере один гликансодержащий образец отделяют до расщепления гликанов на 100%.