СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ С1 ИНГИБИТОРА ПО СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ТРОМБИНОМ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/53 C12Q1/37 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

С1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, C1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - XIa, XIIa, XIIf и плазмина (фибринолизина) [1]. В работе [2] была показана способность индивидуальных очищенных препаратов тромбина и С1 ингибитора образовывать комплекс. Однако далее было показано, что в плазме крови не обнаруживается образование соответствующего комплекса. Вероятно поэтому использование такого взаимодействия для определения функциональной активности С1 ингибитора в крови считалось проблематичным.

Необходимость определения функциональной активности С1 ингибитора в крови больных диктуется тем обстоятельством, что дефицит этого белка приводит к периодическим отекам, затрагивающим главным образом конечности, лицо, гортань и слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта [1, 3].

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. В патенте США [4] использован модифицированный метод определения активности С1-ингибитора, основанный на тест-системе производства Cycotech (Сан Диего, Калифорния, США). Способ предусматривает следующие этапы: 1 - на микропанели сорбируют авидин, 2 - получают высокоочищенный ферментативно активный препарат субкомпонента C1s, 3 - синтезируют биотинилированный препарат C1s, 4 - образцы проб, содержащих определяемый функционально активный С1-ингибитор, инкубируют с биотинилированным препаратом C1s, 5 - образующийся комплекс функционально активного С1-ингибитора с C1s сорбируют в лунках микропанели, покрытых авидином, 6 - количество связавшегося в лунках С1-ингибитора определяют с помощью конъюгата козьих антител против С1-ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. К недостаткам метода можно отнести его многостадийность (использование дополнительной стадии взаимодействия биотин-авидин, а также необходимость получения биотинилированного C1s и трудности в приобретении ферментативно активного C1s (присутствует в сыворотке крови в проферментной форме в количестве 30 мг/л, коммерчески недоступен).

Ранее был разработан способ определения функциональной активности С1 ингибитора [5], который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели фибринолизина (аптечный препарат плазмина), образцы проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, вносят в лунки микропанели и проводят инкубацию, во время которой происходит ковалентное связывание С1 ингибитора с фибринолизином, количество связавшегося в лунках С1 ингибитора определяют с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора с пероксидазой хрена и хромогенного субстрата для пероксидазы. Способ основан на способности функционально активного С1 ингибитора ковалентно связываться с фибринолизином. К недостаткам метода можно отнести высокую протеолитическую активность плазмина и его склонность к автолизу, что обусловливает низкую стабильность плазмина при хранении и возможность нежелательного гидролиза ингибитора.

Таких недостатков лишен тромбин, который обладает более ограниченной специфичностью, стабилен при хранении, коммерчески доступен, тем более что можно использовать препарат животного происхождения: тромбин быка.

Задачей заявленного изобретения является снижение затрат на проведение определения функциональной активности С1 ингибитора комплемента человека на основе иммуноферментного метода, повышение надежности определения и использование более стабильных коммерчески доступных препаратов.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином, который предусматривает: сорбцию в лунках микропанели тромбина, внесение в лунки микропанели образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, проведение инкубации, во время которой происходит ковалентное связывание С1 ингибитора с тромбином, определение количества связавшегося в лунках С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора с ферментом и хромогенного субстрата для этого фермента. Способ основан на способности функционально активного С1 ингибитора ковалентно связываться с тромбином.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка упрощенного способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора комплемента человека, использующего доступные и стабильные препараты.

Пример 1. Иммуноферментное определение функциональной активности препарата С1 ингибитора по способности связываться с тромбином. Растворяют препарат тромбина быка в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, с конечной концентрацией 15-50 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), пo 200 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В каждую лунку планшета вносят по 100 мкл VBS²⁺. В лунки планшета каждого ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего определяемый С1 ингибитор в VBS²⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, трехкратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 представлено определение активности С1 ингибитора методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом тромбина, конъюгат пероксидазы с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной активностью С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,99, что позволяет достоверно определять функциональную активность С1 ингибитора заявленным способом в концентрациях от 1 нг/мл с использованием описанного набора.

Кроме того, для проверки адекватности метода было проведено сравнение активностей С1 ингибитора в сыворотках крови 5 пациентов заявленным способом и аналогичным методом с использованием сорбированного на микропанели естественного фермента для этого ингибитора: субкомпонента C1s. На рис.2 приведено графическое сопоставление результатов определения функциональной активности С1 ингибитора в пяти сыворотках пациентов с использованием иммуноферментного метода со связанным C1s и со связанным тромбином. Видно хорошее соответствие этих определений с коэффициентом корреляции R²=0,99, что позволяет говорить об адекватности предложенного метода.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. 3rd. С1 inhibitor and hereditary angioneurotic edema. Ann. Rev. Immunol. 1988. V.66. P.595-628.

2. Cugno M., Bos I., Lubbers Y., Hack C.E., Agostoni A. In vitro interaction of C1-inhibitor with thrombin. Blood Coagul. Fibrinolysis. 2001. V.12. P.253-260.

3. Андина С.С., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества С1 ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков. Биомедицинская химия. 2004. Т.50. №1. С.86-91.

4. Pilatte Y.M., Hammer C.H., Frank M.M., Fries L.F. Process for the purification of C1-inhibitor. Patent USA US5030578. July 9, 1991.

5. Козлов Л.В., Андина С.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н. Способ определения функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека. Патент РФ №2195662. Бюл. №36. 27.12.2002.

Предложенная группа изобретений относится к медицинской иммунологии. Предложены способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели тромбина, внесение образцов проб, содержащих определяемый функционально активный С1 ингибитор, проведение инкубации, во время которой происходит связывание С1 ингибитора с тромбином, и определение количества связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата фермента с антителами и субстрата этого фермента. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом тромбина, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для расчета активного С1 ингибитора. Предложенная группа изобретений обеспечивает новый способ и набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Способ иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином, характеризующийся связыванием с сорбированной в лунках микропанели протеиназой С1 ингибитора определяемого образца с неизвестной активностью, определением количества связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрата этого фермента и последующего расчета ингибирующей тромбин активности С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции, отличающийся тем, что в лунках микропанели для иммуноферментного анализа в качестве лиганда связывания сорбируют коммерческий препарат тромбина.

2. Набор для иммуноферментного определения функциональной активности С1 ингибитора по способности связываться с тромбином, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом тромбина, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для расчета активности С1 ингибитора.