СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ С1 ИНГИБИТОРА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 G01N33/535 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

C1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, С1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - ХIа, ХIIа, ХIIf и плазмина (фибринолизина). Главная биологическая роль C1 ингибитора заключается в регуляции сосудистой проницаемости, о чем свидетельствует ангионевротические отеки, наблюдающиеся у больных с дефицитом этого белка [1]. Известно, что связывание С1 ингибитора с гепарином усиливает его способность ингибировать сериновые протеиназы [2]. Способность взаимодействовать с гепарином является одной из функциональных особенностей этого белка и поэтому может быть положена в основу иммуноферментного способа его определения. Для количественного определения C1 ингибитора способность связываться с гепарином ранее не использовалась.

Задачей заявленного изобретения является создание способа и набора для иммуноферментного определения C1 ингибитора по способности связываться с гепарином.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения C1 ингибитора, который предусматривает связывание в лунках микропанели гепарина, инкубацию в лунках образцов проб, содержащих определяемый С1 ингибитор человека, и определение связавшегося C1 ингибитора с помощью конъюгата антител против C1 ингибитора комплемента человека с ферментом и субстрата для этого фермента. Для фиксации в лунках микропанели гепарина проводят сорбцию его аптечного препарата.

Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным препаратом гепарина, конъюгат фермента с антителами к C1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для C1 ингибитора.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения С 1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с гепарином с использованием аптечного препарата гепарина.

Пример 1. Определение C1 ингибитора по способности связываться с гепарином. Готовят раствор аптечного препарата гепарина в концентрации 40 мкг/мл в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺), заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят анализируемые пробы, содержащие С1 ингибитор с неизвестной концентрацией. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 изображено определение С1 ингибитора по способности связываться с гепарином методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для определения С1 ингибитора по способности связываться с гепарином. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом гепарина, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,998, что позволяет достоверно определять С1 ингибитор в концентрациях от 1 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

Кроме того, было проведено определение функциональной активности С1 ингибитора методами, разработанными ранее [3, 4], в сыворотках крови 5 больных и содержания С1 ингибитора по способности связывать гепарин, предложенным способом (рис.2).

На рис.2. изображено сравнение определения С1 ингибитора в сыворотках 5 больных по активности (ось абсцисс) и по способности связывать гепарин (ось ординат).

Результаты (рис.2) демонстрируют совпадение полученных данных с коэффициентом корреляции R²=0,998. Из этого следует, что предложенный метод отражает активность С1 ингибитора, а не его количественное содержание как белка, и что активность, проявляемая С1 ингибитором в связывании гепарина в данных случаях, соответствует его активности в классическом пути.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. III; Lu F., Mejia P. C1 inhibitor, a multi-functional serine protease inhibitor. Thrombosis and Haemostasis. 2010. V.104. №5. P.1-8.

2. Beinrohr L., Harmat V., Dobo J., Lörincz Z., Gál P., Závodszky P. Cl inhibitor serpin domain structure reveals the likely mechanism of heparin potentiation and conformational disease. J. Biol. Chem. 2007. V.282. №29. P.21100-21109.

3. Андина С.С., Козлов Л.В., Дьяков В.Л. Определение функциональной активности, количества C1 ингибитора и аутоантител к нему как инструмент дифференциальной диагностики отеков. Биомедицинская химия. 2004. Т.50. №1. С.86-91.

4. Козлов Л.В., Андина С.С., Гузова В.А., Дьяков В.Л., Баталова Т.Н. Способ определение функциональной активности С1-ингибитора комплемента человека. Патент РФ №2195662. Бюл. №36. 27.12.2002.

Способ по изобретению предусматривает сорбцию в лунках микропанели для иммуноферментного анализа аптечного препарата гепарина. Затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащей С1 ингибитор комплемента с неизвестной концентрацией. Далее проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат этого фермента. Количественное определение проводят по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор для осуществления способа содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом гепарина, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер этого фермента и стандарт для С1 ингибитора. Использование способности С1 ингибитора связываться с гепарином позволит осуществлять его количественное содержание в анализируемых пробах. 2 н.п. ф-лы, 2 ил., 2 пр.

1. Способ иммуноферментного количественного определения С1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с гепарином, характеризующийся тем, что аптечный препарат гепарина сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной концентрацией, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет содержания С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного количественного определения С1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с гепарином, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом гепарина, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека.