СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ С1 ИНГИБИТОРА КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 G01N33/535 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

C1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как C1r, C1s-компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - ХIа, ХIIа, ХIIf и плазмина (фибринолизина). Главная биологическая роль C1 ингибитора заключается в регуляции сосудистой проницаемости, о чем свидетельствует ангионевротические отеки, наблюдающиеся у больных с дефицитом этого белка [1]. Недавно было показано, что C1 ингибитор защищает мышей от смертельной грамм-отрицательной эндотоксемии, блокируя связывание липополисахарида (ЛПС) Salmonella typhimurium с ЛПС-связывающим белком макрофагов мыши и подавляя ЛПС-индуцируемую экспрессию мРНК ТНФ. Механизмом противовоспалительного действия C1 ингибитора является взаимодействие аминоконцевой части его молекулы с ЛПС [2].

Способность взаимодействовать с ЛПС является одной из функциональных особенностей этого белка и поэтому может быть положена в основу иммуноферментного способа его определения. Для количественного определения C1 ингибитора способность связываться с ЛПС ранее не использовалась.

Задачей заявленного изобретения является создание способа и набора для иммуноферментного определения C1 ингибитора по способности связываться с ЛПС, в качестве которого может быть использован аптечный препарат пирогенал.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения C1 ингибитора, который предусматривает связывание в лунках микропанели ЛПС, инкубацию в лунках образцов проб, содержащих определяемый С1 ингибитор человека, и определение связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора комплемента человека с ферментом и субстрата для этого фермента. Для фиксации в лунках микропанели ЛПС проводят сорбцию аптечного препарата пирогенала.

Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным ЛПС, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для С1 ингибитора.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения С1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с ЛПС с использованием аптечного препарата пирогенала в качестве ЛПС.

Пример 1. Определение С1 ингибитора по способности связываться с липополисахаридом. Готовят раствор аптечного препарата пирогенала кипячением в течение 1,5 ч в концентрации 100 мкг/мл в фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl. Горячий раствор вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на 18 ч в термостате при 37°C. Три раза отмывают микропанель вероналовым буферным раствором, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Са²⁺ и 0,5 мМ Mg²+, заливая по 150 мкл в каждую лунку, затем микропанель осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят анализируемые пробы, содержащие C1 ингибитор с неизвестной концентрацией. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 изображено определение С1 ингибитора по способности связываться с ЛПС методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для определения С1 ингибитора по способности связываться с липополисахаридом. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пирогенала, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R=0,999, что позволяет достоверно определять C1 ингибитор в концентрациях от 1 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. III; Lu F., Mejia P. С1 inhibitor, a multi-functional serine pro-tease inhibitor. Thrombosis and Haemostasis. 2010. V.104. №5. P.1-8.

2. Liu D., Cai S., Gu X., Scafidi J., Wu X., Davis A.E. III. C1 inhibitor prevents endotoxin shock via a direct interaction with lipopolysaccharide. J. Immunol. 2003. V.171. P.2594-2601.

Способ по изобретению предусматривает сорбцию в лунках микропанели для иммуноферментного анализа аптечного препарата пирогенала, затем в лунки панели вносят раствор анализируемой пробы, содержащей С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной концентрацией. Далее панели инкубируют и после осушения и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат для фермента. По количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции проводят расчет содержания С1 ингибитора в анализируемой пробе. Набор для осуществления способа содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пирогенала, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер для этого фермента и стандарт для С1 ингибитора. Использование изобретения позволяет осуществлять количественное определение С1 ингибитора, используя способность последнего связываться с липополисахаридом. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ иммуноферментного количественного определения С1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с липополисахаридом, характеризующийся тем, что аптечный препарат пирогенал сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной концентрацией, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат этого фермента и проводят расчет содержания С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного количественного определения С1 ингибитора по способности связываться с липополисахаридом, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом пирогенала, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека.