СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ШТАММОВ Helicobacter pylori МЕТОДОМ МУЛЬТИЛОКУСНОГО VNTR-ТИПИРОВАНИЯ Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/68 C12N15/10 G01N33/53 A61K39/02 

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов Helicobacter pylori.

Широкая распространенность хеликобактериоза среди различных групп населения и пути его передачи позволяют рассматривать хеликобактериоз как инфекционное заболевание, носящее характер эпидемии. Инфицированность взрослого населения России, по результатам выборочных исследований, колеблется от 50 до 80%, а в некоторых регионах она приближается к 100%, в связи с чем на федеральном и региональном уровнях уделяется большое внимание внедрению современных методов диагностики Н.pylori - ассоциированных заболеваний и мониторинга инфекции.

Эрадикация Н.pylori является одним из основных направлений в терапии язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, однако даже после интенсивной терапии Н.pylori вновь обнаруживается в биоптатах слизистой оболочки желудка. По данным [1], частота повторного выявления Н.pylori в течение года после успешной эрадикационной терапии варьирует от 0 до 41.5%. Повторное выявление Н.pylori, как полагают, происходит посредством двух различных механизмов: реинфекции и рецидивирования. Подтверждением факта реинфекции является наличие геномных различий между прежним и новым штаммами Н.pylori. Для изучения путей передачи хеликобактериоза также необходим простой, надежный и воспроизводимый метод молекулярного генотипирования Н.pylori.

Для молекулярного типирования Н.pylori в последнее время стали применять современные методы, такие как гель-электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) [2], полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (RFLP) [3], приемы, направленные на определение межгенных повторяющихся (ERIC-PCR) и внегенных палиндромных последовательностей у энтеробактерий (REP-PCR) [4, 5], применение универсальных (случайных) праймеров в системе RAPD-PCR [6]. Однако практическое использование многих из них ограничивается как сложностью методического характера, так и проблемами с воспроизводимостью и оценкой результатов [7].

Одним из универсальных методов молекулярного генотипирования является определение кратности вариабельных тандемных повторов того или иного локуса (VNTR-анализ, variable number tandem repeats analysis) на хромосоме хозяина. Прием хорошо зарекомендовал себя при типировании различных микроорганизмов, включая возбудители лептоспироза, чумы и туляремии [8-10].

Известен способ диагностики Helicobacter pylori-инфекции (см. патент RU №2265219, кл. G01N 33/53, от 25.06.2003 г.), заключающийся в том, что исследуют мононуклеарные клетки периферической крови, регистрируя методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) специфические участки генома, характерные для Helicobacter pylori. Однако этот способ не дает возможности выявления вариабельных участков генома Helicobacter pylori и, следовательно, непригоден для дифференциации штаммов Н.pylori.

За прототип выбран способ выявления генетической гетерогенности штаммов Н.pylori методом гель-электрофореза в пульсирующем поле (PFGE) (см. Takami S., Т.Hayashi, Н.Akashi, Т.Shimoyama and Т.Tamura. 1994. Genetic heterogeneity of Helicobacter pylori by pulse-field gel electrophoresis and re-evaluation of DNA homology. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. Suppl. 1: S53-S60) [2]. Метод предусматривает выделение хромосомной ДНК из колонии Н.pylori, залитой в легкоплавкую агарозу, уравновешивание буфером для рестриктаз, проведение рестрикции хромосомной ДНК в течение 12 часов различными рестриктазами с последующим гель-электрофорезом в пульсирующем поле в течение 24 часов и окрашиванием геля бромистым этидием.

Недостатками данного метода являются невозможность подбора рестриктаз, подходящих для анализа разных штаммов Н.pylori, большие затраты времени и трудности воспроизведения применяемых методов в разных лабораториях.

Цель предполагаемого изобретения заключалась в поиске в геноме Helicobacter pylori VNTR-содержащих локусов, использование которых позволяет проводить дифференциацию штаммов Н.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе дифференциации Н.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования, включающем выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение ПЦР с амплификацией генов и последующим анализом результатов, однако при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на VNTR-содержащие локусы Н.pylori - НрА, HpD, HpE и HpF, имеющие следующие последовательности:

НрА F: 5-TGGGGAACAAAACGAAGTTAAAAGG-3   R: 5-TCTTATTCGCCCATTTTCCAACG-3 HpD F: 5-CGTTTCTATCAACGCCCCTATTTC-3   R: 5-AAAAGGCGAAATACTGGGATAGCTT-3 HpE F: 5-ACCGCTCAAATCCCACCAACC-3   R: 5-ATGATGCTATAATCACTAATCACT-3 HpF F: 5-GGTAATATTCATATTGCTTTTTGCGCG-3   R: 5-AGATCGTTAAGATTTTGGACGCTTTC-3

дифференциацию штаммов Н.pylori проводят по числу повторов в амплифицированных фрагментах по каждому VNTR-содержащему локусу Н.pylori - HpA, HpD, HpE и HpF, что дает возможность определять генотипы изучаемых штаммов.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма Н.pylori проводят методом кипячения взвеси бактерий в физрастворе в течение 15 мин (1). Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов VNTR-содержащих локусов HpA, HpD, HpE и HpF осуществляют по следующим программам: локус HpA - 1-й цикл - 95°C, 5 мин; затем 35 циклов - 95°C, 45 сек; 57°C, 45 сек; 72°C, 1 мин и завершающий цикл 72°C - 5 мин; локусы HpD, HpE и HpF - 1-й цикл - 95°C, 5 мин; затем 35 циклов - 95°C, 45 сек; 60°C, 45 сек; 72°C, 1 мин и завершающий цикл 72°C - 5 мин. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для амплификации в ПЦР фрагментов VNTR-содержащих локусов HpA, HpD, HpE и HpF рассчитаны на основе нуклеотидных последовательностей этих генов у штамма Н.pylori J99 и 11637, представленных в базе данных NCBI GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.). Продукты амплификации анализируют в 7% полиакриламидном геле (ПАГ) и определяют размер амплифицированных фрагментов по стандарту молекулярных размеров. Число повторов в данном фрагменте определяют как разность между его размером и минимальным размером фрагмента без повторов, деленную на длину повтора. Для установления генотипа исследуемого штамма число повторов для каждого VNTR-локуса заносится в определенную ячейку матрицы для каждого штамма и является его уникальной характеристикой, дифференцирующей один штамм от другого.

Пример 1. Определение числа повторов для штамма Н.pylori J99

По нуклеотидной последовательности штамма Н.pylori J99, представленной в базе данных NCBI GenBank, определяем виртуальный размер фрагмента, амплифицированного с помощью праймеров для локуса HpA. Он равен 245 п.н. и содержит 6 повторов длиной 9 н., следовательно, минимальный размер фрагмента без повторов равен 245-6.9=191 п.н. Для локуса HpD фрагмент равен 302 п.н. и содержит 14 повторов длиной 8 н., следовательно, минимальный размер фрагмента без повторов равен 302-14.8=190 п.н. Для локуса НрЕ фрагмент оказывается равен 131 п.н. и содержит 13 повторов длиной 7 н., следовательно, минимальный размер фрагмента без повторов равен 131-13.7=40 п.н. Для локуса HpF фрагмент равен 102 п.н. и содержит 4 повтора длиной 12 н., следовательно, минимальный размер фрагмента без повторов равен 102-4.12=54 п.н. Число повторов по каждому VNTR-локусу заносится в таблицу.

Пример 2. Определение числа повторов для штамма Н.pylori NCTC 11637

Выделение ДНК Н.pylori проводят методом кипячения взвеси бактерий в физрастворе в течение 15 мин. Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1×буфер (10×ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмол, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 7% полиакриламидном геле (ПАГ) с добавлением этидиум бромида и просматриваются в УФ свете и определяют размер амплифицированных фрагментов по стандарту молекулярных размеров. Число повторов в данном фрагменте определяют как разность между его размером и минимальным размером фрагмента без повторов, деленную на длину повтора. Для локуса НрА обнаружен фрагмент размером 218 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (218-191)/9=3. Для локуса HpD обнаружен фрагмент размером 374 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (374-190)/8=23. Для локуса НрЕ обнаружен фрагмент размером 82 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (82-40)/7=6. Для локуса HpF обнаружен фрагмент размером 102 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (102-54)/12=4. Для установления генотипа исследуемого штамма число повторов для каждого VNTR-локуса заносится в определенную ячейку таблицы для каждого штамма.

Пример 3. Определение числа повторов для клинического изолята Н.pylori

Выделение ДНК, полимеразную цепную реакцию, гель-электрофорез и учет результатов проводят так же, как в примере 2. Для локуса НрА обнаружен фрагмент размером 218 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (218-191)/9=3. Для локуса HpD обнаружен фрагмент размером 390 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (390-190)/8=25. Для локуса НрЕ обнаружен фрагмент размером 61 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (61-40)/7=3. Для локуса HpF обнаружен фрагмент размером 102 п.н. Определяем число повторов по данному локусу: (102-54)/12=4. Для установления генотипа исследуемого штамма число повторов для каждого VNTR-локуса заносится в определенную ячейку таблицы для каждого штамма.

Таблица Штаммы Н.pylori VNTR-локус НрА VNTR-локус HpD VNTR-локус НрЕ VNTR-локус HpF Штамм J99 6 14 7 4 Штамм NCTC 11637 3 23 3 7 Клинический изолят Н.pylori 3 25 3 4

Результаты примеров 1, 2, 3 сведены в таблицу. Из таблицы видно, что дифференциация штаммов Н.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования позволяет определить генотипы изученных штаммов:

Штамм J99 - генотип: НрА 6, HpD 14, НрЕ 7, HpF 4

Штамм NCTC 11637 - генотип: НрА 3, HpD 23, НрЕ 3, HpF 7

Клинический изолят - генотип: НрА 3, HpD 25, НрЕ 3, HpF 4

Таким образом, заявленный способ дифференциации штаммов Н.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования, основанный на определении числа повторов в амплифицированных фрагментах VNTR-содержащих локусов Н.pylori - НрА, HpD, НрЕ и HpF, позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Н.pylori.

Использование предлагаемого изобретения позволяет осуществлять дифференциацию штаммов Н.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования, которая может быть применена в клинической лабораторной диагностике хеликобактериоза у больных для дифференциации случаев рецидива и реинфекции, для выявления путей передачи инфекции в случаях семейного хеликобактериоза и для мониторинга Н.pylori-ассоциированных заболеваний. Заявляемый способ позволяет быстро, эффективно и надежно проводить дифференциацию штаммов Н.pylori, создавать унифицированные базы данных и проводить сравнительное изучение штаммов Н.pylori, выделенных в разных регионах.

Источники информации

1. Xia H.X., Talley N.J, Keane C.T., O'Morain C.F. Reccurence of Helicobacter pylori infection after successful eradication: nature and possible causes // Dig. Dis. Sci. - 1997. - Vol. 42. - №9. - Р.1821-1834.

2. Takami, S., Т.Hayashi, H.Akashi, T.Shimoyama, and T.Tamura. 1994. Genetic heterogeneity of Helicobacter pylori by pulse-field gel electrophoresis and re-evaluation of DNA homology. Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. Suppl. 1: S53-S60.

3. Salaun, L., C.Audibert, G.Le Ley, C.Burucoa, J.L.Fauchere, and B.Picard. 1998. Panmictic structure of Helicobacter pylori demonstrated by the comparative study of six genetic markers. FEMS Microbiol. Lett. 161: 231-239.

4. Ann-Catrin, E.Т., N.Hosseini, A.M.Svennerholm, and I.Bo^..lin. 2000. Different Helicobacter pylori strains colonize the antral and duodenal mucosa of duodenal ulcer patients. Helicobacter 5: 69-78.

5. Miehlke, S., R.Thomas, O.Gutierrez, D.Y.Graham, and M.F.Go. 1999. DNA fingerprinting of single colonies of Helicobacter pylori from gastric cancer patients suggests infection with a single predominant strain. J. Clin. Microbiol. 37: 245-247.

6. Akopyantz, N., N.O.Bukanov, T.U.Westblom, S.Kresovich, and D.E.Berg. 1992. DNA diversity among clinical isolates of Helicobacter pylori detected by PCR-based RAPD fingerprinting. Nucleic Acids Res. 20: 5137-5142.

7. Van Belkum A., Struelens M., de Visser H. et al. Role the genomic typing in taxonomy, evolutionary genetics and microbial epidemiology // J. Clin. Microbiol. Rev. - 2001. - Vol.14(3). - P.547-560.

8. Adair D.M., Worsham P.L., Hill K.K. et al. Diversity in variable number tandem repeat Yersinia pestis // J. Clin. Microbiol. - 2000. - Vol.38(4). - P.1516-1519.

9. Farlow J., Smith K.L., Wong J. et al. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus variable number tandem repeat analysis // J. Clin. Microbiol. - 2001. - Vol.39(9). - P.3186-3192.

10. A.T.Slack*, M.F Dohnt, M.L Symonds and L.D Smythe. Development of a Multiple-Locus Variable number of tandem repeat Analysis (MLVA) for Leptospira interrogans and its application to Leptospira interrogans serovar Australis isolates from Far North Queensland, Australia.

http://www.ann-clinmicrob.com/content/4/1/10.

Предлагаемое изобретение относится к области медицинской микробиологии, в частности к молекулярно-генетическому типированию штаммов Helicobacter pylori. Предложен способ дифференциации штаммов H.pylori методом мультилокусного VNTR-типирования, причем при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на VNTR-содержащие локусы H.pylori - HpA, HpD, HpE и HpF; дифференциацию штаммов H.pylori проводят по числу повторов в амплифицированных фрагментах по каждому VNTR-содержащему локусу H.pylori - HpA, HpD, HpE и HpF, что дает возможность определять генотипы изучаемых штаммов. 1 табл., 3 пр.

Способ дифференциации штаммов Helicobacter pylori методом мультилокусного VNTR-типирования, включающий выделение хромосомной ДНК исследуемого штамма, проведение полимеразной цепной реакции с амплификацией фрагментов генов и последующим анализом результатов, отличающийся тем, что при проведении ПЦР используют олигонуклеотидные праймеры на VNTR-содержащие локусы Н. pylori - HpA, HpD, HpE и HpF, имеющие следующие последовательности:
НрА F: 5-TGGGGAACAAAACGAAGTTAAAAGG-3
R: 5-TCTTATTCGCCCATTTTCCAACG-3
HpD F: 5-CGTTTCTATCAACGCCCCTATTTC-3
R: 5-AAAAGGCGAAATACTGGGATAGCTT-3
HpE F: 5-ACCGCTCAAATCCCACCAACC-3
R: 5-ATGATGCTATAATCACTAATCACT-3
HpF F: 5-GGTAATATTCATATTGCTTTTTGCGCG-3
R: 5-AGATCGTTAAGATTTTGGACGCTTTC-3,
дифференциацию штаммов Н. pylori проводят по числу повторов в амплифицированных фрагментах по каждому VNTR-содержащему локусу Н. pylori - НрА, HpD, HpE и HpF, что дает возможность определять генотипы изучаемых штаммов.