РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPicZαA/BChE-14, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН МОДИФИЦИРОВАННОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS ДЛЯ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ Российский патент 2020 года по МПК C12N15/11 C12N15/52 C12N15/63 C12N9/16 

Описание патента на изобретение RU2711939C2

Изобретение относится к биотехнологии, а именно: к соданю генетических конструкций для получения рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (БуХЭ) и может быть использовано в медицине в терапии отравлений фосфорорганическими токсинами.

Объектом исследования является фермент бутирилхолинэстераза, которая является естественным аналогом фермента ацетилхолинэстеразы по механизму действия. Фермент ацетилхолинэстераза является мишенью для большого спектра нервнопаралитических токсинов, наркотических средств. Введение обезьянам (М. mulatto) больших дозировок фермента бутирилхолинэстеразы (30 мг/кг) значимых отклонений от нормы в поведенческой активности и физико-химических показателях крови выявлено не было в течение 4-х недель наблюдения [Lockridge О., Masson P. Neurotoxicology. 2000]. Аналогичные результаты получены и для морских свинок [Saxena A. et al. Biochem Pharmacol. 2011].

Фермент бутирилхолинэстераза является стехиометрическим антидотом, что означает, что один эквивалент фермента необратимо взаимодействует с одним эквивалентом отравляющего вещества. Ранее, рациональным дизайном был создан мутантный вариант бутирилхолинэстеразы - G117H, для которого показана способность гидролизовать субстрат экотиофат [Millard СВ, Lockridge О, Broomfield СА. Biochemistry. 1995]; параоксон [Lockridge О, Blong RM, Masson Р, Froment МТ, Millard СВ, Broomfield СА, Biochemistry. 1997]; метил параоксон и диизопропилфосфат [Schopfer LM et al., J Med Chem Def. 2004]; зарин, зоман, Vx [Millard CB, Lockridge O, Broomfield CA. Biochemistry. 1998].

Известны мутантные формы фермента бутирилхолинэстеразы также способные гидролизовать экотиофат, а именно L286H, L286GHG, L286HG, L286GH, G117E, G117D, W231A, G117H/E197Q, E197Q, G117H/E197D, G117H/E197G, G117H/W82F, G117H/A328G [Schopfer LM et al., J Med Chem Def 2004].

Недостатками всех перечисленных мутантов является резкое падение уровня гидролиза аналогов природных эфирных субстратов ацетилтиохолина и бутирилтиохолина [Wang Y. et al. Toxicol Appl Pharmacol. 2004]. А также все перечисленные мутанты обладают способностью к необратимой инактивации после взаимодействия с фосфатами, называемой «старением» [Millard СВ, Lockridge О, Broomfield СА. Biochemistry. 1998]. Таким образом, наиболее эффективным признан мутант эффективным считается G117H/E197D, обладающий наименьшим эффектом старения.

Известен способ получения бутирилхолинэстеразы человека очисткой плазмы крови. Современный протокол, опубликованный в 2005 г., рассчитан на обработку 100 литров плазмы крови человека за один цикл очистки. Протокол промышленной очистки БуХЭ из плазмы крови защищен патентом US 20060194301 A1. Широкомасштабная очистка БуХЭ из плазмы крови человека по данному протоколу занимает от 14 дней, требует специально подготовленных реактивов и посуды и имеет не более, чем 50%-ный выход, однако позволяет получать чБуХЭ 80%-ной чистоты, а также препарат особой чистоты (>95%), используя дополнительные циклы очитки с помощью ВЭЖХ [Jbilo О. et al. Eur J Biochem. 1994].

Недостатками этого метода являются высокая цена исходного материала. Повышенные требования к качеству сырья вследствие высокой опасности заражения образца опасными вирусами.

Известен способ получения рекомбинантной низкогликозилированной БуХЭ в нелимфоидных клетках линии СНО [Nachon F. et al. Eur J Biochem. 2002]. При наращивании клеток в роллере в течение длительного времени удалось получить 3-5 мг белка на литр ростовой среды.

Недостатком этого способа является крайне низкий уровень продукции, так как для обеспечения рентабельности производства требуется увеличить уровень продукции до 50-100 мг на литр ростовой среды.

Известен способ получения рекомбинантной БуХЭ в трансгенных животных. Ген БуХЭ был помещен под контроль β-казеинового промотора козы. Полученная генетическая конструкция была введена методом микроинъекции в пронуклеосы выращенных in vitro зигот коз. Проведенные исследования показали, что в литре молока трансгенных коз обнаруживается от 1 до 5 грамм активной БуХЭ. Проект оказался перспективным [Yang X., Carter M.G. Proc Natl Acad Sci USA. 2007]. Компания PharmAthene, Inc. анонсировала выпуск препарата Protexia®; в 2009 году трансгенный препарат прошел первую стадию предклинических испытаний (NCT00333528 and NCT00744146), однако позже проект был закрыт в связи с нерентабельностью производства.

Недостатком этого способа является получение фермента с недостаточным гликозилирование, что снижает его фармакологические показатели.

Известен способ получения активной БуХЭ из трансгенных растений табака Бентхама (N. benthamiana) [Geyer B.C. et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2010]. Так как представительность кодирующих кодонов в геномах человека и растений различаются, исследователи модифицировали последовательность ДНК БуХЭ человека, заменив часть непредпочтительных кодонов и изменив участки гена, влияющие на эффективность транскрипции и стабильность иРНК. Также было уменьшено количество сайтов моделирования [Geyer B.C. et al. Plant Biotechnol. J. 2010]. В результате исследователям удалось получить трансгенные растения с уровнем экспрессии БуХЭ до 1,3% от общей фракции растворимых белков (около 100 мг на килограмм сырой биомассы).

Недостатками данного способа является измененный профиль гликозилирования, что снижает его фармакологические свойства.

Экспрессии рекомбинантной БуХЭ в клетках Escherichia coli приводила к получению неактивного фермента вследствие отсутствия необходимых посттрансляционных модификаций рекомбинантных полипептидных цепей и образования нерастворимых телец включения [Myers Т.М. et al. Neurotoxicol Teratol. 2012].

Ближайшим аналогом заявленного изобретения является патент US 2015184138 A1 (Д1) (дата публикации 02.07.2015), из которого известен рекомбинантный вектор, кодирующий бутирилхолинэстеразу и предназначенный для ее экспрессии в клетках дрожжей (см. Д 1, claims 15, 16, 19). Однако заявленное изобретение отличается от ближайшего аналога тем, что плазмидная ДНК pPicZαA/BChE-14 состоит из плазмиды pPicZaA, содержащей промотор гена алкогольоксидазы АОХ 1 дрожжей P. pastoris дикого типа, нативный терминатор и сигнал полиаденилирования АОХ 1 гена, последовательность гена BleoR, нуклеотидную последовательность сигнального пептида альфа-фактора из S.cerevisiae, нуклеотидную последовательность пролинбогатого пептида PRAD, нуклеотидную последовательность самопроцессирующегося пептида F2A, находящийся в единой рамке считывания с геном модифицированной бутирилхолинэстеразы и нуклеотидной последовательности синтетического гена модифицированной бутирилхолинэстеразы человека.

Изобретение решает задачу получения рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека в клетках дрожжей.

Поставленная задача решается за счет создания генетической конструкции - рекомбинантная плазмидная ДНК pPicZαA/BChE, кодирующая БуХЭ человека, состоящая из плазмиды pPicZαA, содержащая:

1) индуцибельный промотор гена алкогольоксидазы АОХ1 дрожжей P. pastoris дикого типа, нативный терминатор и сигнал полиаденилирования АОХ1 гена,

2) последовательность гена BleoR, продукт которого обеспечивает устойчивость трансформантов к антибиотику зеоцину,

3) нуклеотидную последовательность сигнального пептида альфа-фактора из S. cerevisiae, необходимую для секреции экспрессируемых продуктов в культуральную среду,

4) нуклеотидную последовательность пролинбогатого пептида PRAD, обеспечивающего получения тетрамерной формы фермента модифицированной бутирилхолинэстеразы,

5) нуклеотидную последовательность самопроцессирующегося пептида F2A, находящийся в единой рамке считывания с геном модифицированной бутирилхолинэстеразы и нуклеотидной последовательности пролинбогатого пептида PRAD, обеспечивающую одновременную экспрессию генов фермента бутирилхолинэстеразы и пролинбогатого пептида PRAD,

6) нуклеотидную последовательность синтетического гена модифицированной бутирилхолинэстеразы человека, кодирующую вариант фермента бутирилхолинэстеразы с заменой последовательности 284-TPLSV-288 на последовательность 284-HTIHG-288, обеспечивающую продукцию модифицированного фермента rhBChE-14, способного к реактивации после ковалентного ингибирования параоксоном и не подверженного старению

Изобретение иллюстрируют следующими графическими материалами:

Фиг. 1. Схема генетической конструкции - рекомбинантной плазмидной ДНК pPicZαA/BChE-14.

Фиг. 2. Аналитическая экспрессия клонов, полученных после трансформации дрожжей Р. pastoris. Представлена активность фермента в культуральной жидкости лучших клонов из серии трансформации.

Фиг. 3. Анализ олигомерного состава продукции модифицированной бутирилхолинэстеразы.

Таблица 1. Кинетический анализ фермента модифицированной бутирилхолинэстеразы rhBChE-14.

Изобретение иллюстрируют следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Создание генетической конструкции pPicZαA/BChE.

Последовательность гена модифицированной бутирилхолинэстеразы получают из генетической конструкции pBudCE/EF/BCHE Ilyushin D.G. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 с использованием ПЦР с перекрывающихся праймеров и набора олигонуклеотидов atctcgaggatagcaaagtcacaatcatatgcat, gtcccctatgggcacaccatccacggt, cacaccatccacggtaactttggtccgac, aagcggccgctcagagacccacacaactttctttct и последующим клонированием в вектор pPicZαA/F2A-PRAD с использованием эндонуклеаз рестрикции NotI и XhoI, с получением генетической конструкции pPicZαA/BChE-14 (Фиг. 1).

Вектор pPicZαA/F2A-PRAD получают из генетической конструкции pFUSE MAR PRAD-F2A-BChE [Terekhov et al., Biochimie 2015] методом ПЦР и набора олигонуклеотидов - aggtcgacaaaagagaagcatggtctcaccct и tcgagcgggcccggggttggactcgacgtca и последующим клонированием в вектор pPicZαA с использованием эндонуклеаз рестрикции SalI и XhoI, и обязательной проверкой гена секвенированием последовательности целевой плазмиды.

ПРИМЕР 2

Трансформация и аналитическая экспрессия генетической конструкции pPicZαA/BChE-14.

Полученную конструкцию pPicZαA/BChE линеаризуют и используют для серии трансформаций клеток штамма GS115 P. pastoris. Селекцию проводят с использованием антибиотика зеоцина в концентрации 1.5 мг/мл. Для отбора клонов штамма-продуцента клетки выращивают в среде BMGY, осаждают центрифугированием, меняют среду на BMMY и культивируют 96 ч, добавляя в культуральную среду метанол до 0.5% каждые 24 ч. По окончании экспрессии аликвоты культуральной жидкости анализируют методом Эллмана (Фиг. 2).

Было установлено, что наибольший уровень экспрессии рекомбинантной БуХЭ, полученной в дрожжах P. pastoris, показал клон С4 - 2.3 ОЕ/мл.

ПРИМЕР 3

Анализ олигомерного состава модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14.

Электрофоретическое разделение белков в ПААГ в не денатурирующих условиях проводили по стандартной методике. Пробы, контрольный образец и образец модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14, наносили в буфере: 10%-ный глицерин, 0.2 М Трис-HCl, рН 7.5. Электрофорез в концентрирующем геле проводили при силе тока 8-10 мА на 1 пластину геля, а в разделяющем геле при 15-20 мА. По окончании электрофоретического разделения белков в не денатурирующем ПААГ пластина с гелем переносилась в раствор, содержащий 125 мМ NaOH, 125 мМ малеиновой кислоты, 11.6 мМ цитрата натрия, 10мМ CuS04, 550 мкМ гексацианоферрата(III) калия и 2-мМ бутирилтиохолин йодида. Гель инкубировали в растворе в течение 3-8 ч при комнатной температуре на орбитальном шейкере. Оценку олигомерного состава проводили методом денситометрии полиакриламидного геля использование программного обеспечения TotalLab TL120. Анализ результатов свидетельствует о том, что синтезированный целевой продукт модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14 активен и соотношение мономерной :димерной:тетрамерной форм равно 17:14:69 процентов, соответственно (Фиг. 3).

ПРИМЕР 4

Анализ кинетических параметров.

Для оценки реакционной способности полученных препаратов по отношению к параоксону проводили кинетические измерения по следующей схеме: образец модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14 в концентрации 2 нМ прединкубировали с параоксоном в концентрации 6 мкМ в течение 5 мин в 0,1 М фосфатном буфере (рН = 7.4) при 25°С. После инкубации проводили исследования остаточной активности по стандартной методике Элмана с 1 мМ бутирилтиохолин йодида (ВТС) и 0,5 мМ DTNB в качестве субстрата в 0.1 М калий-фосфатном буфере рН 7.2. Для измерений использовали плашечный спектрофотометрофлуориметр Varioscan (Thermo Scientific, США, ЦКП «Технопарк ИБХ»). Измерения вели при длине волны 405 нм в течении 60 мин Полученные данные анализировали в программе SigmaPlot (ver. 11.0, SYSTAT Software). Количество активных центров БуХЭ определяли титроваванием с диизопропилфторфосфатом (ДФФ) по стандартной методике Элмана. Наблюдаемые константы ингибирования рассчитывали, как угол наклона линейного участка кривой на графике Ln(E/E0) от времени (Таблица 1)

Приложение 1.

Нуклеотдная последовательность рекомбинантной плазмидной ДНК pPicZαA/BChE-14

Приложение 1.

Нуклеотдная последовательность рекомбинантной плазмидной ДНК

pPicZαA/BChE-14

AGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAATGAAACCTTTTTGCCATCCGAC

ATCCACAGGTCCATTCTCACACATAAGTGCCAAACGCAACAGGAGGGGATAC

ACTAGCAGCAGACCGTTGCAAACGCAGGACCTCCACTCCTCTTCTCCTCAAC

ACCCACTTTTGCCATCGAAAAACCAGCCCAGTTATTGGGCTTGATTGGAGCTC

GCTCATTCCAATTCCTTCTATTAGGCTACTAACACCATGACTTTATTAGCCTGT

CTATCCTGGCCCCCCTGGCGAGGTTCATGTTTGTTTATTTCCGAATGCAACAA

GCTCCGCATTACACCCGAACATCACTCCAGATGAGGGCTTTCTGAGTGTGGG

GTCAAATAGTTTCATGTTCCCCAAATGGCCCAAAACTGACAGTTTAAACGCT

GTCTTGGAACCTAATATGACAAAAGCGTGATCTCATCCAAGATGAACTAAGT

TTGGTTCGTTGAAATGCTAACGGCCAGTTGGTCAAAAAGAAACTTCCAAAAG

TCGGCATACCGTTTGTCTTGTTTGGTATTGATTGACGAATGCTCAAAAATAAT

CTCATTAATGCTTAGCGCAGTCTCTCTATCGCTTCTGAACCCCGGTGCACCTG

TGCCGAAACGCAAATGGGGAAACACCCGCTTTTTGGATGATTATGCATTGTC

TCCACATTGTATGCTTCCAAGATTCTGGTGGGAATACTGCTGATAGCCTAACG

TTCATGATCAAAATTTAACTGTTCTAACCCCTACTTGACAGCAATATATAAAC

AGAAGGAAGCTGCCCTGTCTTAAACCTTTTTTTTTATCATCATTATTAGCTTAC

TTTCATAATTGCGACTGGTTCCAATTGACAAGCTTTTGATTTTAACGACTTTTA

ACGACAACTTGAGAAGATCAAAAAACAACTAATTATTCGAAACGATGAGATT

TCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCC

AGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTC

ATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTC

CAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTG

CTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAAGCATGGTCTCACCC

TCAGTTCGAAAAGCAACCTTCTCCGCCTCTTCCCCCGCCTCCGCCCCCACCAC

CTCCTCCTCCGCCTCCGCCCCCTCCACCTCCACCGCCGCTTCCATCTCAATCTG

CACCATCTGCCGGTTCTGCTGCACCGCGGGACTACAAAGACCATGACGGTGA

TTATAAAGATCATGACATCGATTACAAGGATGACGATGACAAGACTAGTGAA

GCCAGACACAAACAGAAAATTGTGGCTCCGGTGAAACAGACTTTGAATTTTG

ACCTTCTCAAGTTGGCGGGTGACGTCGAGTCCAACCCCGGGCCCCTCGAGGA

TAGCAAAGTCACAATCATATGCATCAGATTTCTCTTTTGGTTTCTTTTGCTCTG

CATGCTTATTGGGAAGTCACATACTGAAGATGACATCATAATTGCAACAAAG

AATGGAAAAGTCAGAGGGATGAACTTGACAGTTTTTGGTGGCACGGTAACAG

CCTTTCTTGGAATTCCCTATGCACAGCCACCTCTTGGTAGACTTCGATTCAAA

AAGCCACAGTCTCTGACCAAGTGGTCTGATATTTGGAATGCCACAAAATATG

CAAATTCTTGCTGTCAGAACATAGATCAAAGTTTTCCAGGCTTCCATGGATCA

GAGATGTGGAACCCAAACACTGACCTCAGTGAAGACTGTTTATATCTAAATG

TATGGATTCCAGCACCTAAACCAAAAAATGCCACTGTATTGATATGGATTTAT

GGTGGTGGTTTTCAAACTGGAACATCATCTTTACATGTTTATGATGGCAAGTT

TCTGGCTCGGGTTGAAAGAGTTATTGTAGTGTCAATGAACTATAGGGTGGGT

GCCCTAGGATTCTTAGCTTTGCCAGGAAATCCTGAGGCTCCAGGGAACATGG

GTTTATTTGATCAACAGTTGGCTCTTCAGTGGGTTCAAAAAAATATAGCAGCC

TTTGGTGGAAATCCTAAAAGTGTAACTCTCTTTGGAGAAAGTGCAGGAGCAG

CTTCAGTTAGCCTGCATTTGCTTTCTCCTGGAAGCCATTCATTGTTCACCAGA

GCCATTCTGCAAAGTGGTTCCTTTAATGCTCCTTGGGCGGTAACATCTCTTTA

TGAAGCTAGGAACAGAACGTTGAACTTAGCTAAATTGACTGGTTGCTCTAGA

GAGAATGAGACTGAAATAATCAAGTGTCTTAGAAATAAAGATCCCCAAGAA

ATTCTTCTGAATGAAGCATTTGTTGTCCCCTATGGGCACACCATCCACGGTAA

CTTTGGTCCGACCGTGGATGGTGATTTTCTCACTGACATGCCAGACATATTAC

TTGAACTTGGACAATTTAAAAAAACCCAGATTTTGGTGGGTGTTAATAAAGA

TGAAGGGACAGCTTTTTTAGTCTATGGTGCTCCTGGCTTCAGCAAAGATAACA

ATAGTATCATAACTAGAAAAGAATTTCAGGAAGGTTTAAAAATATTTTTTCC

AGGAGTGAGTGAGTTTGGAAAGGAATCCATCCTTTTTCATTACACAGACTGG

GTAGATGATCAGAGACCTGAAAACTACCGTGAGGCCTTGGGTGATGTTGTTG

GGGATTATAATTTCATATGCCCTGCCTTGGAGTTCACCAAGAAGTTCTCAGAA

TGGGGAAATAATGCCTTTTTCTACTATTTTGAACACCGATCCTCCAAACTTCC

GTGGCCAGAATGGATGGGAGTGATGCATGGCTATGAAATTGAATTTGTCTTT

GGTTTACCTCTGGAAAGAAGAGATAATTACACAAAAGCCGAGGAAATTTTGA

GTAGATCCATAGTGAAACGGTGGGCAAATTTTGCAAAATATGGGAATCCAAA

TGAGACTCAGAACAATAGCACAAGCTGGCCTGTCTTCAAAAGCACTGAACAA

AAATATCTAACCTTGAATACAGAGTCAACAAGAATAATGACGAAACTACGTG

CTCAACAATGTCGATTCTGGACATCATTTTTTCCAAAAGTCTTGGAAATGACA

GGAAATATTGATGAAGCAGAATGGGAGTGGAAAGCAGGATTCCATCGCTGG

AACAATTACATGATGGACTGGAAAAATCAATTTAACGATTACACTAGCAAGA

AAGAAAGTTGTGTGGGTCTCTGAGCGGCCGCCAGCTTTCTAGAACAAAAACT

CATCTCAGAAGAGGATCTGAATAGCGCCGTCGACCATCATCATCATCATCAT

TGAGTTTGTAGCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACG

AGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAAGAGGATGTCAGAATGCCATTTG

CCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGT

ATAGGATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAG

CCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGGTAGGGGTTTGGGAAAATCATTCG

AGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTA

AGTGAGACCTTCGTTTGTGCGGATCCCCCACACACCATAGCTTCAAAATGTTT

CTACTCCTTTTTTACTCTTCCAGATTTTCTCGGACTCCGCGCATCGCCGTACCA

CTTCAAAACACCCAAGCACAGCATACTAAATTTTCCCTCTTTCTTCCTCTAGG

GTGTCGTTAATTACCCGTACTAAAGGTTTGGAAAAGAAAAAAGAGACCGCCT

CGTTTCTTTTTCTTCGTCGAAAAAGGCAATAAAAATTTTTATCACGTTTCTTTT

TCTTGAAATTTTTTTTTTTAGTTTTTTTCTCTTTCAGTGACCTCCATTGATATTT

AAGTTAATAAACGGTCTTCAATTTCTCAAGTTTCAGTTTCATTTTTCTTGTTCT

ATTACAACTTTTTTTACTTCTTGTTCATTAGAAAGAAAGCATAGCAATCTAAT

CTAAGGGGCGGTGTTGACAATTAATCATCGGCATAGTATATCGGCATAGTAT

AATACGACAAGGTGAGGAACTAAACCATGGCCAAGTTGACCAGTGCCGTTCC

GGTGCTCACCGCGCGCGACGTCGCCGGAGCGGTCGAGTTCTGGACCGACCGG

CTCGGGTTCTCCCGGGACTTCGTGGAGGACGACTTCGCCGGTGTGGTCCGGG

ACGACGTGACCCTGTTCATCAGCGCGGTCCAGGACCAGGTGGTGCCGGACAA

CACCCTGGCCTGGGTGTGGGTGCGCGGCCTGGACGAGCTGTACGCCGAGTGG

TCGGAGGTCGTGTCCACGAACTTCCGGGACGCCTCCGGGCCGGCCATGACCG

AGATCGGCGAGCAGCCGTGGGGGCGGGAGTTCGCCCTGCGCGACCCGGCCG

GCAACTGCGTGCACTTCGTGGCCGAGGAGCAGGACTGACACGTCCGACGGCG

GCCCACGGGTCCCAGGCCTCGGAGATCCGTCCCCCTTTTCCTTTGTCGATATC

ATGTAATTAGTTATGTCACGCTTACATTCACGCCCTCCCCCCACATCCGCTCT

AACCGAAAAGGAAGGAGTTAGACAACCTGAAGTCTAGGTCCCTATTTATTTT

TTTATAGTTATGTTAGTATTAAGAACGTTATTTATATTTCAAATTTTTCTTTTT

TTTCTGTACAGACGCGTGTACGCATGTAACATTATACTGAAAACCTTGCTTGA

GAAGGTTTTGGGACGCTCGAAGGCTTTAATTTGCAAGCTGGAGACCAACATG

TGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTG

GCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTC

AAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCC

CCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATA

CCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCT

GTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCAC

GAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGA

GTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAAC

AGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGT

GGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCT

GAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAA

ACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAG

AAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCT

CAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATC

Похожие патенты RU2711939C2

название год авторы номер документа
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFUSE-MARX-29-PRAD-F2A/BChE-14, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН МОДИФИЦИРОВАННОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ 2016
  • Габибов Александр Габибович
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Степанова Анастасия Валерьевна
  • Терехов Станислав Сергеевич
RU2688729C1
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМИЧЕСКИ ПОЛИСИАЛИРОВАННОЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА 2012
  • Илюшин Денис Григорьевич
  • Белогуров Алексей Анатольевич
  • Эртле Оксана Михайловна
  • Габибов Александр Габибович
  • Сурков Кирилл Геннадиевич
  • Пономаренко Наталья Александровна
  • Патрик Массон
  • Смирнов Иван Витальевич
RU2645458C2
Рекомбинантная плазмидная ДНК pFUSE/scFv47Fc, предназначенная для получения одноцепочечного антитела, слитого с константным фрагментом иммуноглобулина человека, инактивирующего пестицид параоксон 2019
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Пипия София Онисеевна
  • Головин Андрей Викторович
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Габибов Александр Габибович
RU2732835C1
СИСТЕМА ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ FAB-ФРАГМЕНТОВ АНТИТЕЛ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIAPASTORIS, НА ОСНОВЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ПЛАЗМИДНЫХ ДНК Ab-HCh-HIS/pPICZ_α_A И Ab-LCh-LAMBDA/pPICZα_A, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ ВАРИАБЕЛЬНЫХ ДОМЕНОВ ТЯЖЕЛОЙ И ЛЕГКОЙ ЦЕПЕЙ АНТИТЕЛ, СООТВЕТСТВЕННО 2015
  • Бобик Татьяна Владимировна
  • Мокрушина Юлиана Анатольевна
  • Пономаренко Наталья Александровна
  • Смирнов Иван Витальевич
  • Степанова Анастасия Валерьевна
RU2683549C1
Рекомбинантный слитый белок 2019
  • Максимяк Сергей Петрович
  • Аль-Шехадат Руслан Исмаилович
RU2732795C1
Получение гена фосфолипазы А2 с измененным оптимумом рН путем удаления сайтов гликозилирования 2019
  • Филькин Сергей Юрьевич
  • Чертова Наталья Вячеславовна
  • Липкин Алексей Валерьевич
  • Федоров Алексей Николаевич
RU2766448C2
ИНТЕГРАТИВНЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В ДРОЖЖАХ 2008
  • Борщевская Лариса Николаевна
  • Гордеева Татьяна Леонидовна
  • Бавыкина Наталья Борисовна
  • Синеокий Сергей Павлович
RU2388823C1
Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов HEXA и HEXВ, и фармацевтическая композиция для лечения болезни Тея-Сакса 2019
  • Шаймарданова Алиса Алмазовна
  • Чулпанова Дарья Сергеевна
  • Соловьева Валерия Владимировна
  • Ризванов Альберт Анатольевич
RU2723187C1
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOK-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ ОСТ4 И KLF4 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕНАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Медведев Сергей Петрович
  • Шевченко Александр Игоревич
  • Покушалов Евгений Анатольевич
  • Закиян Сурен Минасович
RU2495125C2
РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pOL-DsRed2, КОДИРУЮЩАЯ БЕЛКИ OCT4 И LIN28 ЧЕЛОВЕКА И ФЛУОРЕСЦЕНТНЫЙ БЕЛОК DsRed2, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ИНДУЦИРОВАННЫХ ПЛЮРИПОТЕНТНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА 2011
  • Медведев Сергей Петрович
  • Шевченко Александр Игоревич
  • Покушалов Евгений Анатольевич
  • Закиян Сурен Минасович
RU2495126C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 711 939 C2

Реферат патента 2020 года РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pPicZαA/BChE-14, СОДЕРЖАЩАЯ ГЕН МОДИФИЦИРОВАННОЙ БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БУТИРИЛХОЛИНЭСТЕРАЗЫ В МЕТИЛОТРОФНЫХ ДРОЖЖАХ PICHIA PASTORIS ДЛЯ ТЕРАПИИ ОТРАВЛЕНИЙ ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИМИ ТОКСИНАМИ

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к получению рекомбинантной бутирилхолинэстеразы человека (БуХЭ). Предложена рекомбинантная плазмидная ДНК pPicZαA/BChE-14, обеспечивающая продукцию модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14 и состоящая из нуклеотидной последовательности с SEQ ID NO.:1. Изобретение может быть использовано в медицине в терапии отравлений фосфорорганическими токсинами, для терапии отравлений наркотическими веществами типа кокаин, для терапии последствий анестезии у людей с дефицитом эндогенной БуХЭ. 3 ил., 4 пр.

Формула изобретения RU 2 711 939 C2

Рекомбинантная плазмидная ДНК pPicZαA/BChE-14, обеспечивающая продукцию модифицированной бутирилхолинэстеразы человека rhBChE-14 и состоящая из нуклеотидной последовательности с SEQ ID NO.:1.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2020 года RU2711939C2

TEREKHOV S
S
ET AL
Expression of DNA-Encoded Antidote to Organophosphorus Toxins in the Methylotrophic Yeast Pichia Pastoris // Applied Biochemistry and Microbiology, 2016, Vol
Устройство для устранения мешающего действия зажигательной электрической системы двигателей внутреннего сгорания на радиоприем 1922
  • Кулебакин В.С.
SU52A1
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Деревянное стыковое скрепление 1920
  • Лазарев Н.Н.
SU162A1
ИЛЮШИН Д
Г
И ДР
Рекомбинантная бутирилхолинэстераза человека как биологический антидот нового поколения: разработка эукариотической системы

RU 2 711 939 C2

Авторы

Бобик Татьяна Владимировна

Габибов Александр Габибович

Мокрушина Юлиана Анатольевна

Смирнов Иван Витальевич

Терехов Станислав Сергеевич

Даты

2020-01-23Публикация

2016-12-29Подача