Способ диагностики отравлений тяжелыми металлами Советский патент 1980 года по МПК A61B10/00 

(54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОТРАВЛЕНИЙ ТЯЖЕЛЫМИ МЕТАЛЛАМИ

1

Изобретение относится к медицине, а именно к способам диагностики от-. равлений организма.

Известны в медицинской практике способы диагностики отравлений тяжелыми металлами, например таллием, свинцом и др. путем определения в крови концентрации гемоглобина, количестЬа эритроцитов, ретикулоцитов, базофильно-пунктированных эритроцитов , а в моче - концентрации порфири.ноБ и д -аминолевулиновой кислоты.

Известен способ диагностики отравлений тяжелыми металлами путем определения нуклеиновых кислот в эритроцитах. Сущность этого способа заключается в том, что 0,1-0,2 мл охлажден ной крови переносят в центрифужные . пробирки .с охлажденным цитратом натрия, перемешивают и центрифугируют 6 мин при 15000 об/мин. Эритроциты два раза промывают цитратом натрия и добавляют к ним 30-кратное количество диэтилового эфира. После перемешивания и сливания эфира к остатку добавляют смесь диэтилового эфира, этанола и ацетона в соотношении 30:1:1, которую после перемешивания удаляют струёй воздуха от водоструйного насоса. Из обработанной органическими растворителями пробы экстрагируют нуклеотиды обработкой 5%-ным раствором трихлоруксуснбй кислоты. Экстракт отделяют центрифугированием, трижды промывают охлажденным до 9С эфиром и наносят на стартовые полоски бумаги до 0,1 мл.

После высушивания полосок бумаги с нанесенными на них пробами провот

Ш дят электрофорез в условиях охлаждения при напряжении 850-950 В, при силе тока 2,5 А, падении потенциала. 30 В/см и рН 3,9 в течение 2 ч. Элюирование осуществляют 0,5 мл 0,1 н.

15 раствора соляной кислоты. Cпekтpoфoтoметрируют ПРИ 260 нм .

Однако, используя известные способы диагностики отравлений тяжелыми металлами, нельзя установить ран20ние или начальные признаки интоксикации. При помощи известных способов диагностики устанавливают наличие

интоксикации, когда в системе крови развились значительные нарушения, вы25ражающиеся в раздражении.эритроидного ростка красного костного мозга. В периферической крови появляемся большое количество регенеративных ;клетокретикулоцитов, обнаруживаются дегенеративные формы эритроцитов - базофильнопунктированные эритроциты. Наруается синтез гема, о чем свидетельствует повышение концентрации А -аминолевулиновой кислоты и появление перфорИнов в моче.

Целью изобретения является обеспечение ранней диагностики отравлений тяжелыми металлами..

Поставленная цель достигается тем, что определяют дёзоксирибонуклеиновую кислоту и при содержании ее 20,689,7 нг в млн. эритроцитов ставят . диагноз отравления.

Способ осуществляется следующим образом.

При определении ранних признаков интоксикации из последуемой крови путем ее очистки и центрифугирования удаляют ядросодержаадиё, клетки и плазму, а из оставшейся эритроцитарной массы вьщеляют деэоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и по ее количеству су- дят об отравлений тяжелыми металлами, так как в эритроцитах крови здоровых людей дезоксирибонуклеиновая кислота отсутствует. Данная кислота .появляется в эритроцитах при необходимости синтеза каких-либо веществ, способных повысить споротивляемость организма токсическому действию металлов. Так, при содержании дезоксирибонуклеиновой кислоты 20,6-89,7 нг в Млн. эритроцитов ставят диагноз отравления.

Пример. Для определения ранних признаков отравления тяжелыми металлами из эритроцитов крови исследуемого лица выделяют дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) методом двухволновой спектрофотометрии. Процесс количественного определения дезоксирибонуклеиновой кислоты(ДНК) в эритроцитах состоит из трех основных этапов.

Определяют в эритроцитарной массе суммарное количество нуклеиновых кислот (Снк), т.е. концентрацию ДНК + РНК..

Определяют в эритроцитарной массе концентрацию рибонуклеиновой кислоты (Срн) .

. По разности концентрации между суммой нуклеиновых.кислот (Снк) и концентрацией рибонуклеиновой кислоты (РНК) (Снк- Срнк Сднк), судят о концентрации дезоксирибонуклеиновой кислоты (Сднк ) в эритроцитах.

Кровь из вены берут-в охлажденные полиэтиленовые пробирки, содержащие 3,8%-ный раствор цитрата натрия. Центрифугируют при 1500 об/мин, плазму, лейкоциты и тромбоциты удаляют и еще раз промывают 3,8%-ным раствором цитрата натрия.

Затем количество отмытых эритроцйтов подсчитывают в мелажерах в миллионах на один микрометр. После чего 0,09-6,11 мл эритроцитарной массы наносят на два диска фильтроваль. 745506

ной бумаги и фиксируют в 10-15 мл смеси.0,2 Н. раствора .хлорной кислоты с 0,05 М хлористого магния ,в течение 10-15 мин при 4-5°С. Смесь сливают и процесс повторяют. После этого к обеим пробам приливают ацетон в количестве 10-15 мл, нагревают до кипения, ацетон сливают и процесс повторяют еще раз. После того, как слили ацетон, к эритроцитам добавляют 10-15 мл смеси этилового спиртами диэтиловогоэфира

взятыхв соотношении 3:1, нагревают до кипения, смесь сливают. Процесс повторяют.

К каждому диску фильтровальной бумаги, содержащему пробы эритроцитарной массы добавляют по 4 мл 0,3 н. раствора едкого калия и проводят гидролиз 50-70 ;мин при; 36737С.

Далее, к одному из дисков приливают 2 мл 0,5 М раствора хлорной кислоты, гидролизуют 18-22 мин на кипящей водяной бане и выделяют таким образам суг арное количество обеих нуклеиновых кИслот (CHK)I т.е. рибонуклеиновую (Срнк) и дезоксирибонуклеиновую (Сднк) кислоты, гидролизат охлаждают и фильтруют.

На спектрофотометре замеряют оптическую плотность полученного фильтрат а в кювете 1 см при дтще волны

270 нм и 290 нм. Проводят расчет .концентрации нуклеиновых кислот (Сцк)

+ Сцьк.г по известной форт.е. С

РНК муле

С„,..ИГ/,

МЛН.

Затем ко второму диску фильтровальной бумаги добавляют 2 мл смеси

1,2 н. раствора хлорной кислоты с 0,05 М хлористого магния и через 20-30 мин фильтруют,. вьщеляя таким об- разом только pибoнyклeинoвs o кислоту (СРНК ) .

На спектрофотометре замеряют оптическую плотность фильтрата в кювете 1 см при длине.волны 270 нм и 290 нм и проводят расчет концентрации рибонуклеиновой кислоты (Срн«)

по формуле

3264 у;л Е

270-290

F/МЛН

аНГ,

П

- СРНК - нг/мли, где - концентрация обеих нуклеиновых кислот; Срнц - концентрация рибонуклеино-.

войкислоты;

. концентрация дезоксирибонуклеиновой кислотыf п количество, эритроцитов; Е - разница оптической плотности при длине волны 270 нм и 290 нм. Так,исследуя кровь человека, имеющего контакт с таллием,, выявля ют, что количество эритроцитов 5, 6 млн. Контроль. Ег70 Of 32 им. Егоо « 0,295 нм дЕ 0,32 нм,- 0,295 нм 0,025 нм Е„о О37 нмЕгдо 0,265 нм дЕ 0,37 нм - 0,265 нм О,,105 нм Е 0,105 нм - 0,025 нм 0,08 нм Снк 32б4-р,08/56, « 46,.6 нг/млн , G9нк-CнкгCp : 4 5,6 нг/млн.т -14,5 нг/млн 32,,1 мг/млн Следовательно, из эритроцитов крови человека вьвделяют 31,2. нг/млн эритроцитов ,дезоксирибонуклеиновой кислоты, что говорит о начале талли вой интоксикации и требует принятия соответствующих мер .по профилактике для предупреждения нарастания инток сикации . Таким образом, способ диагностики отравлений тяжельми металлами путем определения нуклеиновых кислот в эритроцитах,позволяет выявить ранние признаки интоксикации металла при помощи определения количественного содержания металлами, а также определения количественного.содержания дезоксирибонуклеиновой кислоты в эритроцитах. Формула изобретения Способ диагностики отравлений тяжелыми металлами, путем определения нуклеиновЕлх кислот в эритроцитах,- отличающийся тем, что, с целью ранней диагностики, определяют дезоксири,бонуклеиновую кислоту и при содержании ее 20,6-89,7 нг в млн. эритроцитов ставят диагноз отравления.. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Авторское свидетельство СССР 316991, кл. G 01 N 33/16, 1974.