СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ДВУХВОЛНОВОГО ТЕЧЕНИЯ КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА Российский патент 2013 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, неврологии, инфекционным болезням, а именно к ранней диагностике двухволнового течения клещевого энцефалита (КЭ).

Широкое распространение КЭ, высокий уровень заболеваемости обусловливают высокую медико-социальную и экономическую значимость КЭ и делает необходимым дальнейший поиск новых ранних методов прогнозирования течения инфекции. При двухволновом течении КЭ первая волна проявляется общеинфекционным синдромом без неврологических симптомов, что является причиной недооценки тяжести состояния этих пациентов. Вторая волна протекает тяжело, начинается с фебрильной лихорадки и появления общемозговых, менингеальных и нередко очаговых симптомов. Практическим врачам трудно, а чаще невозможно определить, ограничится ли все одноволновым течением или возникнет вторая волна.

Актуальным является поиск прогностических маркеров, отражающих вероятность возникновения второй волны заболевания с целью раннего, адекватного лечения и облегчения тяжести течения КЭ.

Известен способ прогнозирования развития двухволнового течения КЭ [Субботин А.В., Чебаненко Н.В., Зинчук С.Ф. «Способ прогнозирования течения клещевого энцефалита» Патент РФ №2221247 от 2004 г.], основанный на оценке совокупности клинических (температура тела, частота дыхания, частота сердечных сокращений) и лабораторных данных, в том числе анализе крови: определение люциферазного индекса крови (ЛИ) в динамике на второй, шестой, десятый и четырнадцатый дни заболевания. Результаты уровня ЛИ сопоставляют с прогностической таблицей и делают прогноз возникновения двухволнового течения. Недостатки: способ трудоемок, длителен, требует исследований в динамике.

Техническим результатом изобретения является упрощение и ускорение способа раннего прогнозирования двухволнового течения КЭ при высокой специфичности и чувствительности.

Поставленная задача решается тем, что у больного в тромбоцитах крови определяют уровень серотонина в первые дни заболевания, и при величине тромбоцитарного серотонина (ТС) выше 200 нг/мл прогнозируют одноволновое течение заболевания, меньше 200 нг/мл - прогнозируют двухволновое течение.

Способ осуществляют следующим образом. У больного с КЭ в первые дни заболевания утром натощак забирают 5 мл крови из вены в пластиковую пробирку, содержащую цитрат. Далее для получения плазмы крови, обогащенной тромбоцитами (ПОТ), образцы центрифугируют в течение 10 минут при комнатной температуре при 200×g. Переносят надосадочную жидкость в другую пробирку и проводят подсчет тромбоцитов. Осадок тромбоцитов получают путем добавления 800 мкл физиологического раствора к 200 мкл ПОТ и центрифугирования (4500×g, 10 минут). Надосадочную жидкость удаляют. К осадку тромбоцитов добавляют 200 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешивают на вортексе. Полученную суспензию затем можно хранить замороженной при температуре минус 200°С в течение нескольких недель. Замороженный образец после размораживания центрифугируют при 10000×g в течение 2 минут при комнатной температуре. Для реакции ацилирования используют 25 мкл надосадочной жидкости. До проведения ИФА проводят количественное ацилирование серотонина.

Набор Serotonin ELISA Fast Track (LDN, Германия) основан на твердофазном конкурентном варианте иммуноферментного анализа. На поверхности лунок планшета (твердой фазе) иммобилизованы молекулы антигена. Молекулы ацилированного серотонина, содержащиеся в стандартах, контролях и исследуемых образцах, и молекулы, иммобилизованные на твердой фазе, конкурируют за ограниченное число центров связывания специфических антител. После того, как реакция связывания достигнет равновесия, несвязавшиеся с твердой фазой антигены и комплексы «антиген-антитело» удаляют промывкой. Антитела, связавшиеся с иммобилизованным на твердой фазе антигеном, выявляют с помощью конъюгата - антител к IgG кролика, меченных пероксидазой. В качестве субстрата используют тетраметилбензидин (ТМБ). Интенсивность цветовой реакции измеряют при длине волны 450 нм. Количество серотонина в исследуемых образцах рассчитывают по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям в стандартах. Содержание серотонина в тромбоцитах выражается отношением к 10⁹ тромбоцитов.

Для прогнозирования течения КЭ в тромбоцитах крови определяют уровень серотонина. Если величина серотонина более 200 нг/мл, то прогнозируют одноволновое течение заболевания. В случае если величина серотонина будет менее 200 нг/мл, прогнозируют двухволновое течение.

При помощи заявляемого способа повышается точность прогнозирования двухволнового течения КЭ.

Чувствительность метода - 81,3%, специфичность метода - 91%.

ПРИМЕРЫ КОНКРЕТНОГО ВЫПОЛНЕНИЯ

Пример №1. Б-я Я., 36 лет, служащая. Поступила на второй день болезни с жалобами на повышение температуры, сильную головную боль в лобно-височной области, боли при движении глазных яблок, слабость. Эпидемиологический анамнез - 7 дней назад была на сплаве на реке Вишера, где было присасывание клеща в правое бедро, клещ не исследован, сырое козье молоко не пила. От КЭ не вакцинирована, противоэнцефалитный иммуноглобулин не получала. Заболела остро, температура 38,0°С, слабость, озноб, головная боль, миалгии, боли в глазных яблоках. При объективном обследовании в стационаре: состояние средней тяжести, температура 37,5°С в течение 2 дней. Гиперемия лица, инъекция сосудов склер. В зеве разлитая легкая гиперемия. АД 120/70 мм рт.ст. Пульс - 86 в мин. Менингеальных, очаговых неврологических симптомов нет. В общем анализе крови: эр. - 4,1×10¹²/л, гемоглобин - 132 г/л, тромбоциты - 205×10⁹/л, лейкоциты - 3,7×10⁹/л, э - 1%, п - 6%, с - 43%, л - 41%, м - 9%, СОЭ - 17 мм/ч. Общий анализ мочи и биохимический анализ крови без отклонений от нормы. В ИФА в сыворотке крови обнаружены антитела класса IgM к вирусу КЭ, КП 3,4. ИФА на боррелиоз, анаплазмоз, эрлихиоз - антитела не выявлены. Тромбоцитарный серотонин методом ИФА - 231,87 нг/мл. Диагноз: Клещевой энцефалит, лихорадочная форма, средней степени тяжести, одноволновое течение.

Вывод. Определение уровня тромбоцитарного серотонина позволило с высокой вероятностью говорить о том, что течение КЭ у этой больной будет одноволновым.

Пример №2. Б-й В., 30 лет, служащий. Поступил на второй день болезни с жалобами на лихорадку, сильную головную боль в лобной и височной областях, боли в глазных яблоках, ломоту в теле, слабость. Эпидемиологический анамнез - 10 дней назад посещал лес, снял с себя 2 присосавшихся клещей, клещи не исследованы, сырое козье молоко не пил. От КЭ не вакцинирован, противоэнцефалитный иммуноглобулин не вводили, принимал с профилактической целью реаферон липинт и юнидокс. Заболел остро, температура 38,0°С, озноб, головная боль, боль в глазных яблоках, слабость, миалгии. При объективном обследовании в стационаре: состояние средней тяжести, температура до 38,0°С в течение 3 дней. Гиперемия лица, инъекция сосудов склер. В зеве разлитая легкая гиперемия. АД 140/90 мм рт.ст. Пульс - 80 ударов в мин. Менингеальных, очаговых неврологических симптомов нет. Лихорадка держалась 3 дня, затем 7 дней температура была нормальной, далее вновь подъем температуры до 39,0°С в течение 3 дней. Во время второй волны появились положительные менингеальные симптомы - ригидность затылочных мышц +1,0 см. В анализе крови - эр. - 4,8×1012/л, гемоглобин - 165 г/л, тромбоциты - 215×109/л, лейкоциты - 3,5×109/л, п - 5%, с - 56%, л - 33%, м - 6%, СОЭ - 6 мм/ч. Проведена люмбальная пункция, ликвор прозрачный, плеоцитоз 151 клетка лимфоцитарный, белок 790 мг/л, сахар - 3,2 ммоль/л. Общий анализ мочи и биохимический анализ крови без отклонений от нормы. В ИФА в сыворотке крови обнаружены антитела класса IgM к вирусу КЭ, КП 4,4. ИФА на боррелиоз, анаплазмоз, эрлихиоз - антитела не выявлены. Тромбоцитарный серотонин методом ИФА - 196,28 нг/мл. Диагноз: Клещевой энцефалит, менингеальная тяжелая форма, двухволновое течение.

Вывод. Определение уровня тромбоцитарного серотонина позволило уже в первые дни заболевания с высокой вероятностью говорить о том, что у данного пациента заболевание примет двухволновое течение.

Пример №3. Б-й М., 24 лет, пожарный. Поступил на 2 день болезни с жалобами на высокую температуру, головную боль, слабость, миалгии. Эпидемиологический анамнез - 2 недели назад было присасывание 3 клещей, клещи не исследованы, иммунопрофилактика не проведена, сырое козье молоко не пил. От КЭ не вакцинирован. Заболел остро, температура 37,6°С, озноб, головная боль, боли при глотании, миалгии, принимал жаропонижающие. При объективном обследовании в стационаре: состояние средней тяжести, температура 39,8°С. Гиперемия лица, шеи, инъекция сосудов склер. В зеве разлитая легкая гиперемия. АД 100/60 мм рт.ст. Пульс - 100 ударов в мин. Менингеальных симптомов нет. Температура держалась 3 дня. Затем через четыре дня вновь повышение температуры до 38,8°С в течение 2 дней. Менингеальные, очаговые симптомы отрицательные. В общем анализе крови эр. - 5,0×10¹²/л, гемоглобин - 152 г/л, тромбоциты - 220×10⁹/л, лейкоциты - 6,9×10⁹/л, п - 8%, с - 73%, л - 17%, м - 2%, СОЭ - 5 мм/ч. Общий анализ мочи и биохимический анализ крови без отклонений от нормы. В ИФА в сыворотке крови обнаружены антитела класса IgM к вирусу КЭ, КП 12,95. ИФА на боррелиоз, анаплазмоз, эрлихиоз - антитела не выявлены. Тромбоцитарный серотонин методом ИФА - 157,3 нг/мл. Диагноз: Клещевой энцефалит, лихорадочная форма, средней тяжести, двухволновое течение.

Вывод: Определение уровня тромбоцитарного серотонина позволило уже в первые дни заболевания с высокой вероятностью говорить о том, что у пациента заболевание примет двухволновое течение.

Таким образом, проведенные исследования позволили выявить критерий, на основании которого можно прогнозировать течение КЭ. Полученные знания позволят инфекционистам и неврологам уже в первые дни заболевания прогнозировать двухволновое течение инфекции, назначить адекватные режим и терапию, снизить количество осложнений.

Существенным преимуществом заявляемого способа является небольшое количество крови, необходимое для исследования, в сочетании с высокой чувствительностью и специфичностью. Кроме того, способ не травматичен и не имеет противопоказаний. Способ апробирован на клиническом материале и найдет применение в практике инфекционистов, неврологов.

Изобретение относится к медицине, а именно к ранней диагностике двухволнового течения клещевого энцефалита. Способ прогнозирования развития двухволнового течения клещевого энцефалита с помощью анализа крови, отличающийся тем, что в тромбоцитах крови больного определяют уровень серотонина, при его значении более 200 нг/мл прогнозируют одноволновое течение заболевания, менее 200 нг/мл - прогнозируют двухволновое течение. Вышеописанный способ упрощает и ускоряет раннее прогнозирование двухволнового течения клещевого энцефалита, а также является высоко специфичным и чувствительным. 3 пр.

Способ прогнозирования развития двухволнового течения клещевого энцефалита с помощью анализа крови, отличающийся тем, что в тромбоцитах крови больного определяют уровень серотонина, при его значении более 200 нг/мл прогнозируют одноволновое течение заболевания, менее 200 нг/мл - прогнозируют двухволновое течение.