АНТИТЕЛА ПРОТИВ 5Т4 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК C07K16/28 C07K19/00 A61K39/395 A61P35/00 C12N15/13 

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно предварительной заявке на патент США №60/891,248, поданной 23 февраля 2007 и предварительной заявке на патент США №60/781,346, поданной 10 марта 2006, каждая из которых полностью включена в данное описание посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится главным образом к антителам против 5Т4 и конъюгатам антител с лекарственным препаратом (т.е. иммуноконъюгатам) для диагностики и/или лечения новообразований и злокачественных опухолей. Настоящее изобретение также относится к изолированными нуклеиновым кислотам, кодирующим вариабельную область антитела и полипептидам указанной области для приготовления антител против 5Т4 и конъюгатов антител с лекарственным препаратом.

ПРЕДПОСЫЛКИ К СОЗДАНИЮ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Доступность высокоаффинных моноклональных антител сделала возможным развитие направленной иммунотерапии. В соответствии с этим подходом терапевтическое средство соединяют с антителом, характеризующимся специфичностью связывания с определенной совокупностью клеток-мишеней. Терапевтические средства, которые конъюгируют с моноклональными антителами, включают цитотоксины, биологические модуляторы, ферменты (например, рибонуклеазы), вызывающие апоптоз белки и пептиды, и радиоизотопы. Конъюгаты антитела с цитотксином обычно называют иммуноцитоксинами. Антитела, связанные с низкомолекулярными лекарственными средствами, как например метотрексатом, обычно называются конъюгатами химиоантител с лекарственным средством. Конъюгаты, представленные как иммуномодуляторы, содержат модификаторы биологического ответа, такие как лимфокины (гуморальные межклеточные пептиды), факторы роста и комплемент-активирующий фактор яда змей (cobra venom factor, CVF). Антитела, меченные радиоактивными изотопами, включают радиоактивные изотопы, которые могут применяться как для целей радиотерапии, так и в качестве контраста.

Доставка лекарственного средства в опухолевые клетки с помощью антител увеличивает эффективность лекарственного средства посредством снижения его проникновения в здоровые ткани. См., например: Reffet al. (2002) Cancer Control 9:152-66; Sievers (2000) Cancer Chemother. Pharmacol. 46 Suppl:S18-22; Goldenberg (2001) Cut. Rev. Oncol. Hematol. 39:195-201. MY-LOTARG® (гемтузумаб озогамицин) является коммерчески доступным средством таргетной иммунотерапии, которое действует согласно вышеописанному принципу и которое допущено к применению при лечении острой миелоидной лейкемии у пожилых пациентов. См. Sievers et al. (1999) Blood 93:3678-84. В этом случае, таргетная молекула представляет собой моноклональное антитело против CD33, которое связано с калихеамицином.

Тем не менее, применение таргетной иммунотерапии на человеке было ограничено, частично вследствие побочного действия, связанного с моноклональными антителами, полученными от других животных. Ранние клинические попытки использования антител, полученных от грызунов, выявили ответную выработку организмом человека антител к антителам, полученным от мышей (МАМА) и антителам, полученным от крыс (HARA), что служило причиной быстрого клиренса антител. Впоследствии разработали менее иммуногенные антитела, которые включают гибридные антитела, гуманизированные антитела, PRIMATIZED® антитела и человеческие антитела, полученные посредством применения трансгенных библиотек мышей или бактериофагов. Смотри: Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-5; Queen et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-33; Newman et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:1455-60; Green et al. (1994) Nat. Genet. 7:13-21; Marks et al. (1991) J. Mol. Biol. 222:581-97. Исключение НАМА ответа допускает применения для достижения терапевтического эффекта высоких и повторных доз.

Отобранные антитела для направленного действия лекарственного средства включают антитела, которые распознают карциноэмбриональные антигены, то есть антигены, которые присутствуют в эмбриональных клетках и опухолевых клетках, и которые почти отсутствуют в нормальных клетках взрослых людей. См., например, Magdelenat (1992) J. Immunol. Methods 150:133-43. Карциноэмбриональный антиген 5Е4 является высоко гликозилированным трансмембранным гликопротеином с молекулярным весом 72 kDa, который включает 42 kDa негликолизированное ядро. (Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57:239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45:179-84; международная заявка WO89/07947; Патент США №5,869,053). 5Т4 содержит внеклеточный домен, который характеризуется двумя богатыми лейцином повторами (LRRs) и промежуточной гидрофильной областью, которая является доступным сайтом для таргетной терапии (Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9319-24).

Человеческий 5Т4 экспрессируется в многочисленных типах рака, включающих карциномы мочевого пузыря, молочной железы, шейки матки, эндометрия, легкого, пищевода, яичника, поджелудочной железы, желудка, яичек, и в основном отсутствует в нормальных тканях, за исключением синцитиотрофобластов в плаценте (см., например: Southall et al. (1990) Br. J. Cancer 61:89-95 (иммуногистологическое распределение 5Т4 антигена в нормальных и злокачественных тканях); Mieke et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:1923-1930 (низкая межклеточная адгезия молекулы 1 и высокая экспрессия 5Т4 в опухолевых клетках коррелирует с свободной от болезни выживаемостью больных раком кишечника); Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69: 899-902 (прогностическая значимость экспрессии 5Т4 карциноэмбрионального антигена в раке кишечника; Starzynska et al. (1992) Br. J. Cancer 66:867-869 (экспрессия антигена 5Т4 при раке кишечника и раке желудка); Jones et al. (1990) Br. J. Cancer 61:96-100 (экспрессия антигена 5Т4 при раке шейки матки); Connor и Stern (199) Int. J. Cancer 46:1029-1034 (утрата МНС (главный комплекс гистосовместимости, ГКГС) экспрессии класса-I при раке шейки матки), Ali et al. (2001) Oral Oncology 37:57-64 (модель экспрессии карциноэмбрионального антигена 5Т4 в нормальной, дисплазированной и злокачественно поврежденной слизистой оболочке рта); WO 89/07947; Патент США №5,869,053). Например, ткани, которые описаны как не имеющие экспрессии 5Т4, включают печень, кожу, селезенку, тимус, центральную нервную систему (ЦНС), надпочечники и яичники. Ткани, которые описаны как имеющие очаговую или низкую экспрессию 5Т4, включают: печень, кожу, селезенку, лимфатические узлы, миндалины, простату и семенные пузырьки. Слабая и умеренная экспрессия 5Т4 была описана для почки, легкого, поджелудочной железы, глотки и желудочно-кишечного тракта. Синцитиотрофобласт является единственной тканью, о которой сообщали, что она имеет высокую экспрессию 5Т4; 5Т4 также отсутствует в нормальной сыворотке крови или сыворотке крови беременных женщин (т.е. уровни менее 10 нг/мл). Сверхэкспрессия 5Т4 в опухолевых тканях была поставлена в зависимость с развитием заболевания и в качестве способа, пригодного для выявления пациентов с краткосрочными прогнозами была предложена оценка экспрессии 5Т4. (Mulder et al. (1997) Clin. Cancer Res. 3:1923-30, Naganuma et al. (2002) Anticancer Res. 22:1033-1038, Starzynska et al. (1994) Br. J. Cancer 69:899-902, Starzynska et al. (1998) Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 10:479-484, Wrigley et al. (1995) Int. J. Gynecol. Cancer 5:269-274).

Описано несколько антител против 5Т4, включая mAb5T4, которое также называют антителом Н8, которое различает конформационный эпитоп антигена 5Т4 (Shaw et al. (2002) Biochem. J. 363:137-45, WO 98/55607), моноклональное антитело крысы (Woods et al. (2002) Biochem. J. 366:353-65) и моноклональное антитело мыши, именуемое 5Т4 (Патент США №5,869,053). Также описаны антитела против 5Т4, имеющие одну цепь, а также гибридные белки, которые включают последовательности антител против 5Т4, сшитых с терапевтической молекулой. Например, последовательности антител к 5Т4, сшитые с константным доменом IgG1 человека или внеклеточным доменом В7.1 мыши, вызывают цитолиз 5Т4-экспрессирующих линий опухолевых клеток. (Myers et al. (2002) Cancer Gene Ther. 9:884-896, Shaw et al (2000) Biochim. Biophys. Acta. 1524:238-246; Заявка на патент США №2003/0018004). Аналогично, антитело против 5Т4 с одной цепью, сшитое с суперантигеном может стимулировать Т клеточно-зависимый цитолиз в клетках легочной карциномы in vitro. (Forsberg et al. (2001) Br. J. Cancer 85: 129-136). Первая фаза клинических испытаний применения PNU-214936, Fab фрагмента моно-клонального антитела 5Т4, сшитого с мутированным суперантигеном (антигеном с резко повышенной иммуногенностью) стафилококкового энтеротоксина A (SEA), выявили ограниченную токсичность и определенный противоопухолевый ответ (Cheng et al. (2004) J. Clin. Oncol. 22(4) 602-9). Рекомбинантные 5Т4 вакцины также предложены как вариант терапии при лечении рака (Mulryan et al. (2002) Mol. Cancer Ther. 1: 1129-37; патенты США№2,370,571 и 2,378,704; ЕР 1,160,323 и 1,152,060).

Задачей настоящего изобретения является создание новых антител против 5Т4, конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством, способы получения предложенных антител и конъюгатов антител с лекарственным средством и способы их применения в диагностике и терапии.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предлагает новые антитела против 5Т4, конъюгаты на их основе и способы применения вышеупомянутых объектов. Также предлагаются изолированные полипептиды против 5Т4 и кодирующие их изолированные последовательности нуклеиновых кислот.

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые специфично связывают антиген 5Т4 человека, причем антитело (а) содержит антигенсвязывающий домен антител А1, А2, A3 мыши; (б) конкурирует за связывание 5Т4 с антителами А1, А2, A3 мыши; (в) связывает эпитоп 5Т4, с которым связываются антитела А1, А2, A3 мыши; или (г) содержит в себе 5Т4-связывающий фрагмент антител (а)-(в). Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут быть гибридными, гуманизированными, одноцепочечными, Fab фрагментом, F(ab)2 фрагментом, Fv фрагментом, четырехмерными, четырехвалентными, полиспецифическими, домен-специфичными, однодоменным антителом, рекомбинантным белком или моноклональными телами мыши. Например, гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область с высокомолекулярной цепью и по меньшей мере одну вариабельную область с низкомолекулярной цепью, в которых гуманизированное антитело или фрагмент антитела: (а) содержит антигенсвязывающий домен мышиных антител А1, А2, A3; (б) конкурирует за связывание 5Т4 с мышиными антителами А1, А2, A3; (в) связывает эпитоп 5Т4, который связывают антитела А1, А2, A3; или (г) 5Т4-связывающий фрагмент антител (а)-(в).

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению имеют сродство связывания антигена 5Т4 человека по меньшей мере от порядка 1×10^-7 Моль до порядка 1×10^-12 Моль. Заявленные антитела против 5Т4 и их конъюгаты могут также проявлять специфичное сродство в отношении 5Т4-экспрессирующих клеток in vivo.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат вариабельную область тяжелой цепи, включающую (а) последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (в) последовательность остатков аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% идентична остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (д) последовательность остатков аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (ж) последовательность аминокислотных любой из последовательностей SEQ ID №:49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81, или 82; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:51; (и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №:54; (к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:77; (л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 79% идентична последовательности SEQ ID №:78; (м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID №:81; или (н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №:82.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат вариабельную область легкой цепи, содержащую (а) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (в) последовательность остатков аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (д) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:12; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12; (ж) последовательность аминокислот любой из последовательностей SEQ ID №:58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83, или 84; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 83% идентична последовательности SEQ ID №:60; (и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности SEQ ID №:70; (к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID №:76; (л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID №:76; (м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 88% идентична последовательности SEQ ID №:79; (н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 84% идентична последовательности SEQ ID №:80; (о) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID №:83; или (п) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №:84.

Например, антитело против 5Т4 может включать (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из остатков 19-135 последовательности SEQ ID №:6; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 23-130 последовательности SEQ ID №:8; или (в) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 20-141 последовательности SEQ ID №:10; и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, полученную из групп 21-127 последовательности SEQ ID №:12.

Гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут содержать константные области, происходящие из константных областей человека, такие как например, константная область легкой цепи антитела человека, полученная из константной области легкой цепи каппа человека и константная область тяжелой цепи антитела человека, полученная из константной области тяжелой цепи IgG1 или IgG4 человека.

Типичные представители антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые содержат (а) каркасные области, включающие остатки каркасной области антител человека; и (б) один или более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи с последовательностью SEQ ID №:4, 8, или 12; или один или более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи с последовательностью SEQ ID №:2, 6, или 10. Например, остатки каркасной области антител человека могут включать (а) каркасную область легкой цепи антитела человека из клона DPK24 подгруппы IV зародышевой линии, клона зародышевой линии подгруппы VHIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21) или подгруппы VHI (DPK9, DPK1, O2, DPK7); (б) каркасную область тяжелой цепи антитела человека, выбранную из группы, состоящей из DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b и VI-3 (VH1-03), DP-15 и V1-8 (VH1-08), DP-14 и V1-18 (VH1-18), DP-5 и V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 и YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 и DA-8 (VH1-f); (в) консенсусную последовательность каркасных областей тяжелой цепи (б); или (г) каркасную область, которая по меньшей мере на 63% идентична каркасной области (а)-(в).

Типичные представители гуманизированных антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут также включать два и более гипервариабельных участка с последовательностью: SEQ ID №:2, 4, 6, 8, 10, или 12, как например, два или три гипервариабельных участка вариабельной области легкой цепи, которые имеют последовательность: SEQ ID №:4, 8 или 12; или два или три гипервариабельных участка вариабельной области тяжелой цепи, которые имеют последовательность: SEQ ID №:2, 4 или 10; или один и более гипервариабельный участок вариабельной области легкой цепи, который имеет последовательность: SEQ ID №:4, 8 или 12 и один и более гипервариабельный участок вариабельной области тяжелой цепи, который имеет последовательность: SEQ ID №:2, 6 или 12

Типичные представители гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 включают антитела, которые содержа последовательность вариабельной области тяжелой цепи, включающую (а) последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (в) последовательность остатков аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% идентична остаткам аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (д) последовательность остатков аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична остаткам аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (ж) последовательность остатков аминокислот 1-119 последовательности SEQ ID №:49; (з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична остаткам аминокислот 1-119 последовательности SEQ ID №:49; или последовательность аминокислот гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи, изображенную на Рисунках 9А-9С.

Дополнительные гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую нуклеиновой кислотой, которая содержит: (а) последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1; (б) последовательность нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №: 5; (в) последовательность нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №: 9; (г) последовательность нуклеотидов 1-358 последовательности SEQ ID №: 48; (д) нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельные области гуманизированных антител А1, А2 или A3, изображенные на Фигуре 9А-9С; (е) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидной последовательности любой из последовательностей (а) - (д); или (ж) нуклеиновую кислоту, которая специфически гибридизируется с комплементом любой из (а) - (д) при строгих условиях гибридизации.

Типичные гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 включают антитела, содержащие последовательность вариабельной области легкой цепи, которпая содержит: (а) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4; (б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4; (в) последовательность остатков аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №: 8; (г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №: 8; (д) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 12; (е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 12; или (ж) последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи гуманизированных антител А1, А2 и A3, изображенные на Рисунках 9А-9С.

Также предложены конъюгаты антител с лекарственным средством для лекарственных форм, включающие (а) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 или фрагмент антитела согласно настоящему изобретению; и (б) лекарственное средство, которое прямо или косвенно связано с указанным антителом. Типичные лекарственные средства включают терапевтические агенты, такие как цитотоксины, радиоизотопы, иммуномодуляторы, антиангиогенные средства, антипрофилеративные средства, проапоптические средства, химиотерапевтические средства и нуклеиновые кислоты, применяемые в терапевтических средствах. Цитотоксином, например, может быть антибиотик, ингибитор полимеризации тубилина, алкилирующий агент, ингибитор синтеза белка, ингибитор протеин киназы, ингибитор фосфатазы, ингибитор топоизомеризы или фермент. Цитотоксины-антибиотики, такие как калихеамицин, N-ацетил-γ-калихеамицин или его производные, такие как N-ацетил-γ-калихеамицин диметилгидразид, особенно эффективны в противораковой терапии.

Предложенные конъюгаты антитела против 5Т4 с лекарственным средством могут включать линкер для связывания антитела с лекарственным средством. Типичные линкеры включают 4-(4'ацетилфенокси)масляную кислоту (AcBut), 3-ацетилфенилфенилуксусную кислоту (АсРас) и 4-меркапто-4-метилвалериановую кислоту (Amide). Конъюгаты антитела с лекарственным средством также включают полиэтитенгликоль и другие вещества, применяемые для увеличения включения лекарственного вещества.

Для доставки лекарственного средства в 5Т4-экспрессирующие клетки настоящее изобретение предлагает способы, согласно которым клетки приводят в контакт с конъюгатом антитела с лекарственным средством, включающим (i) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 и (ii) лекарственное средство, которое прямо или косвенно связано с гуманизированным антителом против 5Т4. В соответствии с предложенными способами лекарственное средство интернализируется в клетку-мишень. В данной заявке также предлагаются способы терапии, которые включают введение субъекту, имеющему 5Т4-положительную форму рака, терапевтически эффективного количества конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством, включающего (i) гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4 или фрагмент антитела и (ii) терапевтическое средство, которое прямо или косвенно связано с гуманизированным антителом против 5Т4 или фрагментом антитела. С целью усиления эффективности терапия против 5Т4 согласно настоящему изобретению может быть совмещена с любыми другими известными терапевтическими способами. Второй терапевтический агент можно применять в сочетании с конъюгатом антитела против 5Т4 с лекарственным средством параллельно или последовательно в любом порядке.

Также предложены изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированные вариабельные области антител против 5Т4, которые можно применять для производства предложенных гуманизированных антител против 5Т4. Типичные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированную вариабельную область тяжелой цепи антитела против 5Т4 включают: (а) последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1; (б) последовательность нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5; (в) последовательность нуклеотидов 58-423 SEQ ID №:9; (г) последовательность, кодирующую одну из последовательностей SEQ ID №:48, 50, 53, или 55; (д) последовательность нуклеотидов, которая на 89% идентична последовательности SEQ ID №:50, если охват запроса 100%; (е) последовательность нуклеотидов, которая на 82% идентична последовательности SEQ ID №:53, если охват запроса 100%; или (ж) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последовательностей из (а) - (г) при строгих условиях гибридизации. Типичные нуклеиновые кислоты, кодирующие гуманизированную вариабельную область легкой цепи антитела против 5Т4 включают (а) последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:3; (б) последовательность нуклеотидов 67-390 последовательности SEQ ID №:7; (в) нуклеотидную последовательность нуклеотидов 61-381. последовательности с идентификационным номером SEQ ID №:11; (г) последовательность кодирующую гуманизированные вариабельные области легкой цепи антител А1, А2, или A3 любой из последовательностей SEQ ID №:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, или 75; (д) последовательность нуклеотидов, которая на 84% идентична последовательности SEQ ID №:59, если охват запроса 100%; (е) последовательность нуклеотидов, которая на 86% идентична последовательности SEQ ID №:69, если охват запроса 100%; (ж) последовательность нуклеотидов, которая на 85% идентична последовательности SEQ ID №:75, если охват запроса 100%; или (з) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последоваетльностей (а) - (г) при строгих условиях гибридизации.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАЦИЙ

На Фиг.1А-1С изображены последовательности нуклеотидов и аминокислот вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи мышиных антител А1, А2, и A3 против 5Т4. Последовательности аминокислот снабжены комментариями для распознавания дополнительных гипервариабельных участков (CDR) путем подчеркивания и главная последовательность - путем двойного подчеркивания.

На Фиг.2 изображен вестерн-блот, приготовленный с использованием СТ26/5Т4 клеточных лизатов и протестироованный с указанными антителами.

На Фиг.3А-3В приведены линейные графики, на которых показана зависимость кривой отклика и кинетики связывания для двух независимых препаратов Н8 и А1 антител.

На Фиг.4А-4С приведены линейные графики, которые показывают модуляцию активности Н8, А1, А2, и A3 антител клетками MDAMB435/5T4. Уровни антитела на поверхности клетки уменьшаются со временем (Фигуры 4А, 4С (закрашенные точки)), в то время как уровень антитела в надосадочной жидкости остается постоянным (Фигуры 4В, 4С (незаполненные точки). MCF означает клеточную флюоресценцию; supt, - супернатант (надосадочная жидкость).

На Фиг.5 приведено схематическое изображение конструкта человеческого эктодомена 5Т4 Fc, конструкта эктодомена 5Т4 Fc мыши и конструкта гибридных человек/мышь эктодоменов. Эти структуры применили для картирования антигенных детерминант как это описано в Примере 4.

На Фиг.6А-6В приведены графические результаты конкурирующего связывания Н8 и каждого из обозначенных антител с 5Т4 эктодоменом Fc связанного белка человека. HuH8, гуманизированное Н8 антитело; ChiA1, гибридное А1 антитело; ChiA1+C67F, гибридное А1 антитело, несущее мутацию C67F; ChiA2, гибридное А2 антитело; muA2, А2 антитело мыши; ChiA3, гибридное A3 антитело; ChiA3+C91Y, гибридное A3 антитело, несущее мутацию C91Y, muA3, A3 антитело мыши; No Ab - отсутствие антитела (контроль).

Фиг.7 представляет собой линейную диаграмму, на которой показано связывание эпитопов 5Т4 человека с Н8, А1, А2 и A3. Приведенные остатки представляют собой остатки антигена 5Т4, описанные Майерой и сотр. Myers et al. (1994) J. Biol. Chem. 269(12):9319-9324, которые также имеются в наличии в Банке генов GenBank Accession № Z29083 (последовательность с индентификационным номером SEQ ID №:87). LRR, дупликация, насыщенная лейцином.

На Фиг.8 приведены результаты сферических анализов, проведенных согласно описанию в примере 6. Конъюгаты антител против 5Т4 с калихеамицином, полученные при использовании антител А1 и A3, значительно подавляют рост 5Т4 экспрессирующих клеток (MDAMB435/5T4) по сравнению с контрольными клетками (MDAMB435/neo). CMA-676, конъюгат антитела против CD33 с калихеамицино; huH8-AcBut-CalichDMH, гуманизированное Н8 антитело, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut); CalichDMH, неконъюгированный калихеамицин; А1-AcBut-CalichDMH, антитело А1, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut); А3-AcBut-CalichDMH, антитело A3, конъюгированное к калихеамицину с помощью 4-(4'-ацетилфенокси)-масляной кислоты (AcBut).

На Фиг.9А-9Н показаны нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 (huA1 VH) версии 1 (последовательность с идентификационным номером SEQ ID №:48-49); аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 V-версии 1.2 и 2.0, аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела А1 (huA1 VL) версии 1.0, 2.0 и 3.0; аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела А2 (huA2 VH) версии 1.0 и 2.0; аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела А2 (huA2 VL) версии 1.0 и 2.0; аминокислотные последовательности вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела A3 (huA3 VH) версии 1.0 и 2.0; и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела A3 (huA32 VL) версии 1.0 и 2.0. CDR (гипервариабельные участки) подчеркнуты.

На Фиг.10А-10В показаны типичные каркасные последовательности Вариабельной области тяжелой цепи, которые можно применять для получения гуманизированных антител против 5Т4. На Рисунке 10А показано правильное относительное расположение последовательностей Вариабельной области тяжелой цепи человека подгруппы 1 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 14-24) и консенсусные каркасные последовательности, выведенные здесь из (последовательностей с идентификационными номерами SEQ ID №: 25-27). На Рисунке 10 В показаны последовательности генов зародышевой линии человека подгрупп VH 7 и VH 3 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 88-93).

На Фиг.11 приведено правильное относительное расположение последовательностей вариабельной области легкой цепи чловека подгруппы VкIII (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 29-34). Обведенные в рамку последовательности - CDR (гипервариабельные участки).

На Фиг.12 приведено правильное относительное расположение последовательностей вариабельной области легкой цепи человека подгруппы VкI (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №:35-44). Обведенные в рамку последовательности - CDR (гипервариабельные участки).

На Фиг.13 приведены дополнительные последовательности зародышевой линии подгрупп Vk 1 и Vk IV, которые имеют каркасные участки, которые можно использовать для получения гуманизированных имунноглобулинов против 5Т4 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 94-99).

На Фиг.14 показаны аминокислотные последовательности типичных С-сегментов человека, которые могут применяться для приготовления гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 (последовательности с идентификационными номерами SEQ ID №: 45-47).

На Фиг.15 показаны аминокислотные последовательности полного 5Т4 антигена яванского макака (cynomolgus monkey - Масаса fascicularis) и неполного антигена 5Т4 чернохвостой мартышки. Подчеркнутые последовательности, главные последовательности. Для каждой последовательности 5Т4 эктодомен содержит аминокислоты 30-356.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

I. Антитела против 5Т4

В настоящем изобретении предложены новые антитела мыши, которые связывают человеческий 5Т4 антиген и которые пригодны для создания таргетной иммунотерапии. Человеческий антиген представляет собой 72 kDa негликолизированный фосфопротеин, обнаруженный на поверхности клеток тробопласта и ряде типов раковых клеток. См. See Hole et al. (1988) Br. J. Cancer 57:239-46, Hole et al. (1990) Int. J. Cancer 45: 179-184; PCT Международное издание № WO 89/07947; Патент США №5,869,053.

Мышиные антитела согласно настоящему изобретению обозначены А1, А2 и A3 и приготовлены как описано в Примере 1. Также предложены антитела против 5Т4, произведенные от А1, А2 и A3, которые специфически связываются с человеческим 5Т4 антигеном. Например, антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие антиген связывающие остатки из А1, А2 и A3 антител; антитела, которые конкурируют за связывание 5Т4 антигена с А1, А2 и A3 антителами; и антитела, которые связываются с вышеупомянутым 5Т4 эпитопом как А1, А2 и A3 антитела.

В частности, предложенные А1, А2 и A3 антитела каждое содержит антигенсвязывающий сайт, который различает специфичный эпитоп человеческого 5Т4 антигена. Каждое из этих антител также связывается с эпитопом, отлично от эпитопа, связанного Н8, и каждое А1, А2 и A3 не конкурирует с Н8 антителом за связывание с человеческим 5Т4. См. Примеры 4-5 и фиг.6-7. Таким образом, в настоящем изобретении предлагаются антитела, которые специфически связываются с остатками 30-168 человеческого 5Т4 (например, A3), антитела, которые специфически связываются с остатками 224-276 человеческого 5Т4 (например, А1), и антитела, которые специфически связываются с остатками 224-355 человеческого 5Т4 (например, А2). Также предложены человеческие 5Т4 антигены, включающие эпитопы, с которыми связываются антитела А1, А2 и A3. Например, в изобретении предлагаются фрагменты антигена против 5Т4, включающие остатки 30-163, 224-276 и 224-355 нативного или полномерного 5Т4 антигена.

Специфическое связывание предложенных антител против 5Т4 относится к предпочтительному связыванию антитела с 5Т4 антигеном человека в гетерогенном образце, который содержит различные антигены со сложной структурой. Обычно, специфическое связывание имеет место, если сродство связывания составляет по меньшей мере примерно 10^-7 М и более, так например, по меньшей мере, примерно 10^-8 М и более, включая по меньшей мере примерно 10^-9 М и более, по меньшей мере, примерно 10^-11 М и более или, по меньшей мере примерно 10^-12 М и более. Например, специфическое связывание антитела согласно настоящему изобретению с 5Т4 антигеном человека включает связывание в диапазоне от по меньшей мере примерно 10^-7 М до примерно 1×10^-12 М, также как в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-12 М, или в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-11 М, или в пределах от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-10 М, или в пределах от примерно 1×10^-9 М до примерно 1×10^-10 М. Специфическое связывание также относится к селективному таргетированию антитела против 5Т4 на 5Т4-экспрессирующие клетки после введения антитела субъекту.

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут иметь тетрамерную структуру (например, аналогичную встречающимся в природе антителам), или они могут включать любую другую структуру, имеющую хотя бы одну вариабельную область иммуноглобулина легкой цепи или хотя бы один V-региона иммуноглобулина тяжелой цепи, или 5Т4 связывающие фрагменты последних (например, фрагменты Fab, модифицированного Fab, F(ab')₂ или Fv). Также включены однодоменные антитела, в которых один или более гипервариабельных участка (CDR), но менее, чем все шесть гипервариабельных участка (CDR), составляют область связывания антигена. Предлагаются также гибридные антитела, гуманизированные антитела, супергуманизированные антитела, диатела, антитела с одной цепью, тетра-валентные антитела, и/или мультиспецифичные антитела (например, двуспецифичные антитела). Эти дескрипторы антител не являются взаимоисключающими.

Природные антитела представляют собой тетрамерные (H₂L₂) гликопротеины около 150,000 дальтонов, составленные из двух одинаковых легких (L) цепей и двух одинаковых тяжелых (Н) цепей. Две тяжелые цепи связаны друг с другом посредством дисульфидных связей, и каждая тяжелая цепь связана легкой цепи дисульфидной связью. Каждая из легких и тяжелых цепей дополнительно определена N-концевой вариабельной областью и С-сегментом. Вариабельные области включают последовательности, которые в значительной степени отличаются среди антител и определяют по существу сродство к связыванию и специфичность отдельного антитела к отдельному антигену. Вариабельные области легкой и тяжелой цепей выстраиваются с образованием антигенсвязывающего домена.

Гибридные антитела содержат последовательности, по меньшей мере, двух видов. В качестве одного из примеров, для включения вариабельных областей, которые содержат сайты связывания антигена, можно использовать технологию рекомбинантного клонирования из нечеловеческого антитела (т.е. антитело, приготовленное из нечеловеческих особей, иммунизированных антигеном) и C-сегментов, выведенных из иммуноглобулина человека.

Гибридные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, содержащие Вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи антител А1, А2 и A3; т.е. (а) вариабельную область тяжелой цепи, которая имеет последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2 и вариабельную область легкой цепи, имеющую последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, соответствующую остаткам аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №:6 и аминокислотную последовательность легкой цепи, соответствующую остаткам аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №:8; и (в) аминокислотную последовательность тяжелой цепи, соответствующую остаткам аминокислот 20-141 последовательности SEQ ID №:10 и аминокислотную последовательность легкой цепи, соответствующую остаткам аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №:12. Типичные гуманизированные антитела против 5Т4 могут включать вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую аминокислотам 1-119 последовательности SEQ ID №:49; или одну из гуманизированных вариабельных областей тяжелой цепи, изображенных на фиг.9А-9С, и гуманизированную вариабельную область легкой цепи, также изображенную на фиг.9А-9С. Приготовление типичных гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению описано в Примере 7.

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут также содержать вариабельную область тяжелой и/или легкой цепи, включающую аминокислотную последовательность, которая производна или по существу аналогична вариабельным областям антител А1, А2 или A3, или по существу аналогична вариабельным областям гуманизированных антител А1, А2 или A3. По отношению к по существу идентичным вариабельным областям тяжелой и легкой цепей, по существу идентичные последовательности по меньшей мере на 90% идентичны последовательностям вариабельных областей любой из последовательностей SEQ ID №:1-12 или вариабельным областям гуманизированных антител А1, А2 или A3, отображенным на фиг.9А-9С, например, по меньшей мере, на 92% идентичные, или по меньшей мере на 93% идентичные, или, по меньшей мере, на 94% идентичные, или, по меньшей мере, на 95% идентичные, или, по меньшей мере, на 96% идентичные, или, по меньшей мере, на 97% идентичные, или, по меньшей мере, на 98% идентичные, или, по меньшей мере, на 99% идентичные.

Типичные гибридные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению, т.е. антитела, которые специфически связывают 5Т4 антиген, также включают такие антитела, которые содержат (а) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, соответствующую остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2; остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6; остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10; или любой вариабельной области тяжелой цепи гуманизированных антител А1, А2 или A3, отображенной на фиг.9А-9С; (б) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 85% идентична остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (в) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 86% идентична остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая, по меньшей мере, на 91% идентична остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (д) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична остаткам 1-119 последовательности SEQ ID №:49; или (е) аминокислотную последовательность вариабельной области тяжелой цепи, являющуюся производной любой вариабельной области гуманизированных А1, А2 или A3, отображенной на фиг.9А-9С.

Вариабельная область тяжелой цепи гибридного или гуманизированного антитела против 5Т4, которое специфически связывается с 5Т4 антигеном, может кодировать (а) нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1, нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5, нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №:9, нуклеотидов 1-358 последовательности SEQ ID №:48, или нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельный области тяжелой цепи гуманизированных антител А1, А2 или A3, отображенные на фиг.9А-9С; (б) нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, на 90% идентична нуклеиновой кислоте, содержащей последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1, нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5, нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №:9. Например, вариабельную область тяжелой цепи гибридного антитела против 5Т4 может кодировать нуклеиновая кислота, которая, по меньшей мере, на 98% идентична нуклеотидам 58-414 последовательности SEQ ID №:1, нуклеиновая кислота, содержащая нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична нуклеотидам 55-405 последовательности SEQ ID №:5, или нуклеиновая кислота, которая по меньшей мере на 89% идентична нуклеотидам 1-358 последовательности SEQ ID №:48. Вариабельную область тяжелой цепи гибридного антитела против 5Т4 также может кодировать нуклеиновая кислота, которая специфично гибридизуется с комплементом нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №:1, нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5, нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №:9, или нуклеотидов 1-358 последовательности SEQ ID №:48, при строгих условиях гибридизации, например, при условиях окончательной отмывки 0.1Х SSC (0.1 кратный натрий хлорид/натрий цитрат буфер) при 65°C.

Типичные гибридные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению дополнительно включают такие антитела, которые содержат (а) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, соответствующую остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8; остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12; или остаткам вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела А1, А2 или A3, приведенной на фиг.9А-9С; или (б) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 90% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12. Например, аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи может включать (а) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (б) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (в) аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12; (г) или аминокислотную последовательность вариабельной области легкой цепи, являющуюся производно любой вариабельной области гуманизированных антител А1, А2 или A3, приведенных на фиг.9А-9С.

Вариабельную область легкой цепи гибридного антитела против 5Т4, которое специфически связывается с 5Т4 антигеном, может кодировать (а) нуклеиновая кислота, содержащая последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:3, нуклеотидов 67-390 последовательности SEQ ID №:7, нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:11, или нуклеотидов, кодирующих любую вариабельную область легкой цепи гуманизированных антител А1, А2 или A3, отображенных на фиг.9А-9С; или (б) нуклеиновая кислота, содержащей нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:3, нуклеотидам 87-390 последовательности SEQ ID №:7, или нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:11. Например, вариабельную область легкой цепи гибридного антитела против 5Т4 может кодировать нуклеиновая кислота, содержащая (а) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 97% идентична нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:3; (б) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 98% идентична нуклеотидам 67-390 последовательности SEQ ID №:7; или (в) последовательность нуклеотидов, которая по меньшей мере на 99% идентична нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:11. Вариабельную область легкой цепи гибридного антитела против 5Т4, которое специфически связывается с 5Т4 антигеном, может также кодировать нуклеиновая кислота, которая специфически гибридизуется с комплементом нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:3, нуклеотидов 67-390 последовательности SEQ ID №:7, или нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:11, при строгих условиях гибридизации, например, при условиях окончательной отмывки 0.1Х SSC (0.1 кратный натрий хлорид/натрий цитрат буфер) при 65°C.

Гуманизированные антитела представляют собой разновидность гибридных антител, в которых остатки вариабельной области, ответственные за связывание антигена (т.е. остатки гипервариабельного участка, укороченного гипервариабельного участка, или любые другие остатки, которые принимают участие в связывании антигена) происходят от отличных от человека животных, в то время как прочие остатки вариабельной области (т.е. остатки каркасных участков) и константные области происходят, по меньшей мере, частично, из последовательностей антител человека. Некоторое число остатков каркасной области и остатки константной области гуманизированного антитела могут происходить от отличных от человека животных. Вариабельные области гуманизированного антитела также описаны как Гуманизированные (те. гуманизированные вариабельные области легкой или тяжелой цепи) Отличные от человека животные представляют собой обычно виды, применяемые для иммунизации антигеномтакие как, например, мышь, крыса, кролик, нечеловекообразная обезьяна, или другие отличные от человека млекопитающие. Гуманизированные антитела обычно менее иммуногены, чем традиционные гибридные антитела и проявляют повышенную стабильность при применении у человека. См. Benincosa et al. (2000) J. Pharmacol. Exp. Ther. 292:810-6; Kalofnos et al. (1994) Eur. J. Cancer 30A: 1842-50; Subramanian et al. (1998) Pediatr. Infect. Dis. J. 17:110-5.

Гипервариабельные участки (CDR) представляют собой остатки вариабельной области антитела, которые участвуют в связывании антигена. На практике используют несколько систем нумерации для отождествления гипервариабельных участков. Определение Кабата (Kabat) основывается на вариабельности последовательности, определение Хотии (Chothia) основано на положении сегментов с замкнутой конструкцией. Определение AbM служит компромиссом между подходами Кабата и Хотии. В соответствии с алгоритмом Кабата, Хотии или AbM гипервариабельные участки (CDR) Вариабельной области легкой цепи ограничены остатками в положениях 24 и и 34 (CDR1-L), 50 и 56 (CDR2-L), и 89 и 97 (CDR3-L). Согласно определению Кабата, гипервариабельные участки (CDRs) вариабельной области тяжелой цепи ограничены остатками в положениях 31 и 35 В(CDR1-H), 50 и 65 (CDR2-H), и 95 и 102 (CDR3-H) (нумерация согласно Кабату). Согласно определению Хотии гипервариабельные участки (CDRs) вариабельной области тяжелой цепи ограничены остатками в положениях 26 и 32 (CDR1-H), 52 и 56 (CDR2-H), и 95 и 102 (CDR3-H) (нумерация согласно Хотии). Согласно определению AbM гипервариабельные участки (CDRs) вариабельной области тяжелой цепи ограничены остатками в положениях 26 и 35 В (CDR1-H), 50 и 58 (CDR2-H), 95 и 102 (CDR3-H) (нумерация согласно Кабату). См. Martin et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9268-9272; Martin et al. (1991) Methods Enzymol 203:121-153; Pedersen et al. (1992) Immu№methods 1:126; и Rees et al. (1996) In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, pp.,141-172.

Определяющие специфичность сегменты (SDR) представляют собой остатки внутри гипервариабельных участков, которые непосредственно взаимодействуют с антигеном. Определяющие специфичность сегменты соответствуют гипервариабельным остаткам. См. Padlan et al. (1995) FASEB J 9:133-139.

Каркасные участки представляют собой остатки вариабельных областей антитела иные, чем гипервариабельные или CDR остатки. Каркасные остатки могут быть получены из природных антител человека, таких как области каркаса антител человека, которые в значительной степени подобны каркасным участкам антител А1, А2 или A3. Также можно применять искусственные каркасные последовательности, представляющие консенсусную часть оригинальных последовательностей. При выборе каркасного участка для гуманизации, последовательности, которые в большей степени представлены в человеческом организме могут быть предпочтительными относительно менее представленных последовательностей. С целью восстановления остатков аминокислот последовательности мыши, которые, как полагают, вовлечены во взаимодействия антигена и/или остатков, участвующих в структурной интеграции сайта связывания антигена, или для повышения экспрессии антитела можно использовать дополнительные мутации в акцепторных последовательностях каркасных областей антител человека. При изучении гуманизированных последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей для идентификации и устранения сайтов пост-трансляционной модификации белков, вводимых при гуманизации, возможно применение прогнозирования структуры пептидов.

Гуманизированные антитела можно получить, применяя любой из многочисленных способов, которые включают венирование, прививание гипервариабельных сегментов, прививание укороченных гипервариабельных сегментов, прививание специфических определяющих сегментов, и генетическую сборку (сборку Франкенштейна), как это описано ниже. Гуманизированные антитела также включают сверхгуманизированные антитела, в которых было введено одно или более изменение в гипервариабельный сегмент. Например, остатки аминокислот последовательности человека можно заместить на остатки, происходящие от других животных в гипервариабельных сегментах. Для получения антитела против 5Т4 с любой требуемой последовательностью, эти общие подходы могут быть объединены со стандартными технологиями мутагенеза и синтеза.

Венирование основано на принципе уменьшения потенциально иммуногенных аминокислотных последовательностей в антителах грызунов или других животных посредством замены последовательностей доступной для растворителя внешней стороны молекулы антитела аминокислотными последовательностями человека. Таким образом, венированные антитела оказываются менее чужеродными для клеток человека, чем немодифицированное нечеловеческое антитело. См. Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98. Антитело, которое происходит не от человека, венируют посредством выявления выступающих остатков внешней части каркасных областей в таком антителе, которые отличаются от аналогичных остатков, располагающихся в тех же местах в каркасных областях антитела человека, и заменой выявленных остатков аминокислотами, которые типично занимают те же самые позиции в антителах человека.

Прививание гипервариабельных сегментов осуществляют посредством замены одного или более гипервариабельных сегментов антитела-акцептора (например, антитела человека или любого антитела, содержащего заданные каркасные остатки) гипервариабельными сегментами антитела-донора (например, антитела, происходящего от другого животного). Антитела-акцепторы могут быть отобраны, основываясь на сходстве остатков каркаса между возможным антителом-акцептором и антителом-донором. Например, согласно способу генетической сборки (способу Франкенштейна) каркасные участки антител человека определяют, как имеющие значительную гомологичность последовательности с каждым каркасным участком соответствующих антител другого животного, и гипервариабельные сегменты антитела, не происходящего от человека прививают на совокупность различных каркасных участков антител человека. Родственный способ, который также пригоден для приготовления антител согласно настоящему изобретению, предложен в заявке на патент США №2003/0040606.

Прививание укороченных гипервариабельных сегментов представляет собой сходный подход. Укороченные гипервариабельные участки содержат определяющие специфичность остатки и соседние аминокислоты, включая остатки и аминокислоты в положениях 27d-34, 50-55 и 89-96 легкой цепи, и в положениях 31-35b, 50-58, и 95-101 тяжелой цепи (условные обозначения номеров согласно Kabat et al. (1987)). См. Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133-9. Прививание определяющих специфичность сегментов основано на понимании того, что специфичность связывания и сродство паратопа определяются наиболее высоко вариабельными остатками в пределах каждого из гипервариабельных сегментов. Исследование трехмерных структур комплекса антитело/антиген, в сочетании с анализом имеющейся информации по аминокислотным последовательностям, можно применить для моделирования изменчивости последовательности, основанной на структурной неоднородности остатков аминокислот, которые имеют место в каждом положении в пределах гипервариабельного сегмента. Определяющие специфичность сегменты идентифицируют как минимально иммуногенные полипептидные последовательности, состоящие из остатков области контакта. См. Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133-139.

Обычно человеческие акцепторные каркасные области антител человека выбирают на основании того, что они в значительной степени сходны с каркасными областями донорных антител, или из тех участков, которые наиболее сходны с консенсусной последовательностью для подсемейства вариабельных областей. В целях достижения наивысшей эффективности связывания антитела, функциональных возможностей, использования кодонов, уровней экспрессии и т.д. вслед за прививанием можно провести дополнительные изменения, которые включают введение не происходящих от человека остатков в области каркаса. См., например: РСТ международное издание № WO91/09967.

Для прививания гипервариабельных сегментов в каркасные участки вариабельной области тяжелой цепи, пригодные каркасные последовательности можно получить из a DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b и VI-3 (VH1-03), DP-15 и V1-8 (VH1-08), DP-14 и V1-18 (VH1-18), DP-5 и V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 и YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 и DA-8 (VH1-f). Типичные вариабельные области тяжелой цепи, содержащие аминокислоты участков каркаса, которые подходят для гуманизации соответствуют последовательностям SEQ ID №:13-24 и 88-93. Типичные участки каркаса, которые представляют консенсусные каркасные остатки VH1 соответствуют последовательностям SEQ ID №:25-27. См. также: фиг.10А-10В.

Для прививания гипервариабельных сегментов в каркасные участки вариабельной области легкой цепи, пригодные каркасные последовательности можно получить из DPK24 подгруппы IV клона клеток зародышевой линии, подгруппы VkIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), или подгруппы VkI клона клеток зародышевой линии (DPK9, DPK1, O2, DPK7). Типичные вариабельные области легкой цепи, содержащие каркасные остатки, подходящие для гуманизации соответствуют последовательностям SEQ ID №:28-34, 35-44 и 94-99. См. фиг.11-14.

Типичные гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают антитела, которые имеют один или более гипервариабельный сегмент не происходящего от человека антитела против 5Т4, отобранный из гипервариабельных участков вариабельной области тяжелой цепи любой из последовательностей с SEQ ID №:2, 6, или 10, или вариабельной области легкой цепи любой из последовательностей SEQ ID №:4, 8, или 12. Например, гуманизированные антитела против 5Т4 могут включать два или более гипервариабельных сегментов, отобранных из гипервариабельных участков вариабельной области тяжелой цепи любой из последовательностей SEQ ID №:2, 6, или 10, или вариабельной области легкой цепи любой из последовательностей SEQ ID №:4, 8, или 12. Гуманизированные антитела против 5Т4 также могут содержать тяжелую цепь, содержащую вариабельную область, которая имеет 2 или 3 гипервариабельных участка любой из последовательностей SEQ ID №:2, 6, или 10, и легкую цепь, включающую вариабельную область, которая имеет 2 или 3 гипервариабельных участка любой из последовательностей SEQ ID №:4, 8, или 12.

Гуманизированные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению можно конструировать так, что в них вариабельная область первой цепи (т.е. вариабельная область легкой цепи или вариабельная область тяжелой цепи) гуманизирована, а вариабельная область второй цепи негуманизирована (т.е. вариабельная область антитела, получена в отличных от человека видах). Эти антитела представляют собой тип гуманизированного антитела, которое называют полугуманизированным антителом. Не происходящие от человека антитела против 5Т4, которые можно применять для получения полугуманизированных антител включают антитела А1, А2 и A3, описанные в данном документе, так же как антитело Н8, которое описано в РСТ международном издании № WO 98/55607 и в Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436, или моноклональное антитело крысы, описанные в Woods et al. (2002) Biochem. J. 366:353-65. Например, полугуманизированное антитело против 5Т4 может содержать вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую аминокислотам 1-119 последовательности SEQ ID №:49 или аминокислотам гуманизированной вариабельной области тяжелой цепи антител А1, А2 или A3, изображенной на фиг.9А-9С, вариабельной области легкой цепи любой из последовательностей SEQ ID №:4, 8, или 12.

Константные области гибридных и гуманизированных антител против 5Т4 можно получать из константных областей любого из of IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, любых их изотипов (например, IgG1, IgG2, IgG3, или IgG4 изотипы IgG), a также мутированных версий этих иммуноглобулинов. Выбор изотипа человека или модификации отдельных аминокислот в этом изотипе может приводить к увеличению или устранению активации иммунологических защитных механизмов и изменять биораспределение антитела. См. Reff et al. (2002) Cancer Control 9:152-66. Типичные константные области, пригодные для приготовления гибридных и гуманизированных антител согласно настоящему изобретению соответствуют последовательностям SEQ ID №s:45-47. Также возможно использование окнстантных областей легкой цепи лямбда антител человека, включая варианты и мутированные версии. При клонировании последовательностей, кодирующих константные области иммуноглобулина, допустимо удаление последовательностей интронов.

Гибридные и гуманизированные антитела против 5Т4 можно конструировать, используя стандартные технологии, известные в области техники, к которой относится данное изобретение. Например, вариабельные области можно получить посредством гибридизации перекрывающихся олигонуклеотидов, кодирующих вариабельные области и лигирования их в вектор экспрессии, содержащий константную область антитела человека См., например: Harlow & Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York и Патенты США №№4,196,265; 4,946,778; 5,091,513; 5,132,405; 5,260,203; 5,677,427; 5,892,019; 5,985,279; 6,054,561. Тетравалентные антитела (H₄L₄), содержащие два интактных тетрамерных антитела, включающих гомодимеры и гетеродимеры, можно приготовить, например, согласно описанному в Международной заявке РСТ № WO 02/096948. Димеры антител также можно приготовить с помощью введения остатка (остатков) цистеина в константную область антитела, что способствует образованию дисульфидной связи между цепями, посредством гетеробифункциональных кросс-линкеров (Wolff et al. (1993) Cancer Res. 53:2560-5), или посредством рекомбинаного получения для включения двойной константной области (Stevenson et al. (1989) Anticancer Drug Des. 3:219-30). Антиген-связывающие фрагменты антител согласно настоящему изобретению можно приготовить, например, посредством экспрессии усеченных последовательностей, кодирующих антитела, или при помощи пост-трансляционного расщепления полноразмерных антител.

Варианты антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению, т.е. антитела А1, А2 и A3, так же как гибридные и гуманизированные модификации на их основе, легко можно приготовить так, чтобы они содержали ряд изменений, замен, инсерций и делеций. Например, последовательности антитела можно оптимизировать для использования кодона в конкретном типе клеток, применяемых для экспрессии антитела. Для того чтобы увеличить период полужизни антитела в сыворотке крови, может быть, если еще не присутствует, введена антигенная детерминанта (эпитоп) связывания с salvage-рецептором в тяжеле. цепь антитела. См. Патент США №5,739,277. Дополнительные модификации для повышения стабильности антитела включают модификацию IgG4 для замены серина 241 остатком пролина. См. Angal et al. (1993) Mol. Immunol. 30:105-108. Другие полезные изменения включают замены, которые требуются для оптимизации эффективности конъюгации антитела с лекарственным средством. Например, антитело может быть модифицировано по карбоксильному концу, чтобы включить аминокислоты для присоединения лекарственного средства, например, можно добавить один или более остатков цистеина. Константные области можно модифицировать для введения сайтов связывания с углеводами или другими группами.

Варианты антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут быть получены применением стандартных рекомбинантных технологий, включая целенаправленный мутагенез или рекомбинационное клонирование. Способами компоновки генов и конверсии генов у трансгенных отличных от человека животных (Публикация патента США №2003/0017534) можно приготовить обширный спектр антител против 5Т4, которые затем испытывают способами функционального анализа на проявление соответствующих активностей. В частных вариантах реализации настоящего изобретения варианты антител против 5Т4 получают, применяя протоколы созревания афинности для мутирования гипервариабельных сегментов (Yang et al. (1995) J. Mol. Biol. 254:392-403), перетасовки цепей (Marks et al. (1992) Biotechnology (NY) 10:779-783), использования мутаторных штаммов of E.coli (Low et al. (1996) J. Mol. Biol. 260:359-368), перетасовки ДНК (Patten et al. (1997) Curr. Opin. Biotechnol. 8:724-733), фагового дисплея (Thompson et al. (1996) J. Mol. Biol. 256:77-88), и эволюционирующей ПЦР ("sexual PCR" Crameri et al. (1998) Nature 391:288-291). Для иммунотерапевтического применения соответствующие функциональные способы анализа включают специфичное связывание с антигеном 5Т4 человека, интернализацию антитела, и нацеленность на локализацию (локализации) новообразования при назначении животному с новообразованием, как описано в этом документе ниже.

В настоящем изобретении далее предлагаются клетки и клеточные линии, экспрессирующие антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению. Типичные клетки-хозяева включают клетки млекопитающих и человека, такие как СНО клетки, HEK-293 клетки, HeLa клетки, CV-1 клетки, и COS клетки. Способы для формирования устойчивой линии клеток, следующей за трансформацией гетерологической структуры в клетку-хозяина известны в данной области техники. Типичные клетки-хозяева немлекопитающих включают клетки насекомых (Potter et al. (1993) Int. Rev. Immunol. 10(2-3):103-112). Антитела могут также быть получены у трансгенных животных (Houdebine (2002) Curr. Opin. Biotechnol. 13(6):625-629) и в трансгенных растениях (Schillberg et al. (2003) Cell Mol. Life Sci. 60(3):433-45).

II. Полипептиды антител против 5Т4 и кодирующие их нуклеиновые кислоты

Настоящее изобретение также обеспечивает изолированные нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител против 5Т4 и выделенные полипептиды, кодируемые предложенными нуклеиновыми кислотами. Нуклеиновые кислоты и полипептиды согласно настоящему изобретению включают нуклеотидные и аминокислотные последовательности вариабельных областей антител А1, А2 и A3 и модификации на их основе. Изолированные нуклеиновые кислоты и полипептиды могут быть использованы для получения гибридных и гуманизированных антител против 5Т4.

II.A Нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела против 5Т4.

Нуклеиновые кислоты представляют собой дезоксирибонуклеотиды или рибонуклеотиды и их полимеры в одноцепочечной, двуцепочечной или триплексной формах. Если не указано конкретно, нуклеиновые кислоты могут содержать известные аналоги природных нуклеотидов, которые имеют сходные свойства по отношению к соответствующей природной нуклеиновой кислоте. Нуклеиновые кислоты включают гены, комплементарные ДНК, информационные РНК и комплементарные РНК (кДНК, mPHK и кРНК). Нуклеиновые кислоты можно синтезировать, или получить из любого биологического источника, включающего любой организм. Типичные способы клонирования нуклеиновых кислот, которые кодируют антитела против 5Т4, описаны в Примерах 1 и 7.

Типичные нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению содержат любую нуклеотидную последовательность, выбранную из SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11 и 48. В частности, нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи антител А1, А2 и A3, содержат нуклеотиды 58-41 последовательности SEQ ID №:1, нуклеотиды 55-405 последовательности SEQ ID №:5, и нуклеотиды 58-423 последовательности SEQ ID №:9, соответственно, которые кодируют вариабельные области тяжелой цепи, которые имеют аминокислотные последовательности, соответствующие остаткам аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №:2, остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6 и остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10, соответственно. Нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного антитела А1, содержит нуклеотиды 1-358 последовательности SEQ ID №:48. Нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области легких цепей гуманизированных антител А1, А2 и A3, содержат нуклеотиды 61-381 последовательности SEQ ID №:3, нуклеотиды 67-390 последовательности SEQ ID №:7 и нуклеотиды 61-381 последовательности SEQ ID №:11, соответственно; кодирующие вариабельные области тяжелой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, соответствующие остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4, остатки 23-130 последовательности SEQ ID №:8 и остатки 21-127 последовательности SEQ ID №:12, соответственно. Дополнительные нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению содержат нуклеотиды, кодирующие вариабельные области гуманизированных антител А1, А2 и A3 приведены на фиг.9А-9С.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут также включать нуклеотидные последовательности, которые в значительной степени идентичны любой одной из последовательностей SEQ ID №з:1, 3, 5, 7, 9, 11, и 48, включая нуклеотидные последовательности, которые по меньшей мере на 90% идентичны последовательностям, кодирующим вариабельные области с любой из последовательностей SEQ ID №з:1, 3, 5, 7, 9 и 11, такие как по меньшей мере приблизительно на 91% идентичные или такие как по меньшей мере на 92% идентичные, такие как по меньшей мере на 93% идентичные, или по меньшей мере на 94% идентичные, или по меньшей мере, на 95% идентичные, или, по меньшей мере, на 96% идентичные, или по меньшей мере на 97% идентичные, или по меньшей мере на 98% идентичные, или по меньшей мере на 99% идентичные. Например, нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут содержать (а) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID №:1, кодирующей вариабельную область; (б) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 97% идентична последовательности SEQ ID №:3, кодирующей вариабельную область; (в) нуклеотидную последовательность, которая по меньшей мере на 98% идентична последовательности SEQ ID №:5, кодирующей вариабельную область; (г) нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, на 98% идентична последовательности SEQ ID №:7, кодирующей вариабельную область; (д) нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, на 99% идентична последовательности SEQ ID №:11, кодирующей вариабельную область; или (е) нуклеотидную последовательность, которая, по меньшей мере, на 89% идентична последовательности SEQ ID №:48, кодирующей вариабельную область. Последовательности сравнивают на максимальное соответствие с помощью алгоритма сравнения последовательностей, с применением полноразмерной последовательности, кодирующей вариабельную область, которая имеет любую из последовательностей нуклеотидов SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, и 48 или последовательности нуклеотидов, кодирующей вариабельные области гуманизированных антител А1, А2 и A3, которая имеет последовательность нуклеотидов, приведенную на Фиг.9А-9Н в качестве последовательности сравнения, как описано ниже, или посредством визуального контроля. См. также Пример 1 и Таблицу 1, и пример 7 и Таблицу 11.

Идентичные в значительной степени последовательности могут быть полиморфными последовательностями, т.е. альтернативными последовательностями или аллелями в популяции. Разница между аллелями может составлять только одну пару оснований. Существенно идентичные последовательности могут также включать последовательности, подвергнутые мутагенезу, которые включают последовательности, содержащие молчащие мутации (мутации в неструктурном гене). Мутация может включать изменение одного и более остатков, делецию одного и более остатков, или инсерцию одного и более добавочных остатков.

Идентичные в значительной степени нуклеиновые кислоты, которые дополнительно определяют как нуклеиновые кислоты, которые специфично гибридизуются или гибридизуются по существу на полную длину с любой из последовательностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, или 48; на полную длину последовательности, кодирующей вариабельную область, которая имеет любую из последовательностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, или 48, или с нуклеотидной последовательностью, кодирующей последовательность вариабельной области гуманизированных антител А1, А2 и A3, которая имеет последовательность, приведенную на Фиг.9А-9Н, при строгих условиях гибридизации. В контексте гибридизации нуклеиновых кислот, две последовательности сравниваемых нуклеиновых кислот могут быть обозначены как зонд и мишень. Зондом является эталонная молекула нуклеиновой кислоты, а мишень представляет собой тестируемую молекулу нуклеиновой кислоты, которую часто обнаруживают внутри гетерогенной популяции молекул нуклеиновой кислоты. Последовательность-мишень аналогична тестируемой последовательности.

Пригодные для исследований гибридизации образцы комплементарны или соответствуют последовательность длиной по меньшей мере примерно от 14 до 40 нуклеотидов молекулы нуклеиновой кислоты согласно настоящему изобретению. Предпочтительно зонды содержат от 14 до 20 нуклеотидов, или если желательно длиннее, как например, 30, 40, 50, 60, 100, 200, 300, или 500 нуклеотидов, или вплоть до полной длины любой из последовательностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, или 48; полной длины последовательности, кодирующей вариабельную область, которая имеет любую из последовательностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, или 48; или нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности вариабельных областей гуманизированных антител А1, А2 и A3, приведенные на фиг.9А-9С. Такие фрагменты можно легко приготовить, например, химическим синтезом фрагмента, посредством технологии амплификации нуклеиновых кислот, или посредством введения отобранных последовательностей в рекомбинантные вектора для получения рекомбинантов.

Специфичная гибридизация обозначает связывание, образование дуплекса или гибридизацию молекулы только с определенной нуклеотидной последовательностью при строгих условиях, если эта последовательность присутствует в сложной смеси нуклеиновых кислот (например, совокупной клеточной ДНК и РНК). При специфичной гибридизации могут присутствовать ошибочные спаривания между последовательностями зонда и мишени в зависимости от строгости условий гибридизации.

Строгие условия гибридизации и строгие условия отмывки при гибридизации в контексте экспериментальных исследований гибридизации нуклеиновых кислот таких, как например, саузерн-блот анализ (для ДНК) и норзен-блот анализ (для РНК), зависят как от последовательности, так и от окружения. Более длинные последовательности гибридизируются при более высоких температурах. Подробное руководство по гибридизации нуклеиновых кислот приведено в Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, part I chapter 2, Elsevier, New York, New York. Обычно, очень строгие условия гибридизации и отмывки выбирают такими, чтобы температура были на ниже на 5°C, чем температура точки плавления (T_m) отдельной последовательности при заданных ионной силе и рН. Обычно, при строгих условиях зонд будет специфично гибридизироваться только со своей подпоследовательностью-мишенью, но не с другими последовательностями.

T_m представляет собой температуру (при заданных ионной силе и рН) при которой 50% последовательностей-мишеней гибридизуется с точно соответствующим зондом. Очень строгие условия выбирают так, чтобы они соответствовали T_m для конкретного зонда. Примером строгих условий гибридизации для саузерн-блот или норзен-блот анализов комплементарных нуклеиновых кислот, имеющих более 100 комплементарных остатков, служит гибридизация в течение ночи в 50% формамиде с 1 мг гепарина при 42°C. 15 мин в 0.1Х SSC (0.1 кратный натрий хлорид/натрий цитрат буфер) при 65°C являются примером очень строгих условий промывки. 15 мин в 0.2Х SSC буфере при 65°C являются примером очень строгих условий отмывки. См. Sambrook et al., eds (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York для описания SSC буфера. Часто отмывка в очень строгих условиях предшествует отмывке в менее строгих условиях для устранения фонового сигнала зонда. 15 мин в 1Х SSC при 45°C являются примером условий отмывки средней строгости для дуплекса из более 100 нуклеотидов. 15 мин в от 4Х до 6Х SSC при 40°C являются примером условий отмывки пониженной строгости для дуплекса из более 100 нуклеотидов. Для коротких зондов (например, 10-50 нуклеотидов) строгие условия типично включают концентрации соли менее, чем 1М иона Na⁺, типично около 0.01М концентрации иона Na⁺ (или других солей) при рН 7 0-8.3, и температуру около 30°C. Строгие условия также могут быть достигнуты добавлением дестабилизирующих регентов, таких как формамид. В общем, двукратное и более отличие отношения сигнал/шум, по сравнению со случайным зондом при конкретных анализах гибридизации, указывает на наличие специфичной гибридизации.

Ниже приведены примеры условий гибридизации и отмывки, которые можно применять для отождествления последовательностей, которые в значительной степени идентичны эталонным нуклеотидным последовательностям согласно настоящему изобретению: нуклеотидная последовательность-зонд предпочтительно гибридизуется с целевой нуклеотидной последовательностью в 7% додецилсульфате натрия (SDS), 0.5M NaPO₄, 1 мМ ЭДТА при 50°C с последующей промывкой 2Х SSC, 0.1% SDS при 50°C; предпочтительнее, гибридизация зонда и мишени в 7% додецилсульфонате натрия (SDS), 0.5M NaPO₄, 1 мМ ЭДТА при 50°C с последующей промывкой 1Х SSC, 0.1% SDS при 50°C; предпочтительнее, гибридизация зонда и мишени в 7% додецилсульфонате натрия (SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM ЭДТА при 50°C с последующей промывкой 0.5Х SSC, 0.1% SDS при 50°C предпочтительнее, гибридизация зонда и мишени в 7% додецилсульфонате натрия (SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM ЭДТА при 50°C с последующей отмывкой 0.1Х SSC, 0.1% SDS при 50°C; предпочтительнее, гибридизация зонда и мишени в 7% додецилсульфонате натрия (SDS), 0.5M NaPO₄, 1mM ЭДТА при 50° с последующей отмывкой 0.1Х SSC, 0.1% SDS при 65°C.

Следующим показателем того, что две последовательности нуклеиновых кислот в значительной степени идентичны, является то, что белки, которые кодируют указанные нуклеиновые кислоты в значительной степени идентичны, имеют общую трехмерную структуру, или биологические функциональные эквиваленты. Определение этих терминов приводится ниже. Молекулы нуклеиновых кислот, которые не гибридизируются друг с другом при строгих условиях являются, тем не менее, идентичными в существенной степени, если соответствующие им белки в значительной степени идентичны Это может иметь место, например, если две последовательности нуклеотидов содержат консервативно замещенные варианты, как это допускается генетическим кодом.

Консервативно замещенные варианты представляют собой последовательности нуклеиновых кислот, которые имеют замещения вырожденными кодонами, при которых в третьем положении одного и более выбранных (или всех) кодонов присутствуют остатки смешанного основания и/или остатками дезоксиинозина (дезоксирибоксина). См. See Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; and Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению также включают нуклеиновые кислоты, комплементарные любой из последовательностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, или нуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности вариабельных областей гуманизированных антител А1, А2 и A3, изображенные на фиг.9А-9С; или частичные или удлиненные варианты последоваетлньностей SEQ ID №:1, 3, 5, 7, 9, 11, 48, или нуклеотидных последовательностей, кодирующих последовательности вариабельных областей гуманизированных антител А1, А2 и A3, изображенных на фиг.9А-9С и последовательностей им комплементарных. Комплементарные последовательности представляют собой две нуклеотидные последовательности, которые содержат антипараллельные нуклеотидные последовательности, способные спариваться друг с другом посредством образования водородных связей между парами оснований. При использовании в данной заявке термин «комплементарные последовательности» означает нуклеотидные последовательности, которые в значительной степени комплементарны, что можно оценить посредством способов сравнения одинаковых нуклеотидов, описанных ниже, или такие последовательности определены, как способные к гибридизации с рассматриваемым сегментом нуклеиновой кислоты при относительно строгих условиях гибридизации как, например условия, описанные ниже. Антисмысловой олигонуклеотид является частным примером комплементарного сегмента нуклеиновой кислоты.

Частичная последовательность представляет собой последовательность нуклеиновых кислот, которая содержит часть последовательности нуклеиновой кислоты большей длины Типичная частичная последовательность представляет собой зонд, описанный в данном документе выше или праймер. В данном документе термин праймер относится к непрерывной последовательности, содержащей 8 и более дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, предпочтительно 10-20 нуклеотидов, и более предпочтительно 20-30 нуклеотидов выбранной молекулы нуклеиновой кислоты. Праймеры согласно настоящему изобретению охватывают олигонуклеотиды достаточной длины и соответствующие последовательности такие, чтобы обеспечивать инициацию полимеризации на молекуле нуклеиновой кислоты настоящего согласно настоящему изобретению.

Удлиненная последовательность содержит дополнительные нуклеотиды (или другие аналогичные молекулы) встроенные в нуклеиновую кислоту. Например, полимераза (например, ДНК полимераза) может добавлять последовательности по 3'-концу молекулы нуклеиновой кислоты. Кроме того, нуклеотидные последовательности могут быть объединены с другими последовательностями ДНК, такими как промоторы, промоторные области, энхансеры, сигналы полиаденилирования, интронные последовательности, дополнительные сайты ферментов рестрикции, множественного сайты клонирования, и другие кодирующие сегменты. Таким образом, изобретение также предлагает вектора, которые содержат нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению, включая вектора для рекомбинантной экспрессии, в которых нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению функциональным образом связана с функционирующим промотором. Будучи функциональным образом связанным с нуклеиновой кислотой, промотор находится в функциональном сочетании с нуклеиновой кислотой таким образом, что транскрипция нуклеиновой кислоты контролируется и регулируется промоторной областью. Термин «вектора» относится к нуклеиновым кислотам способным к репликации в клетке-хозяине, таким как плазмиды, космиды и вирусные векторы.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению могут быть клонированными, синтезированными, измененными, подвергнутыми мутагенезу или комбинацией таких нуклеиновых кислот. Стандартные технологии рекомбинантная ДНК и молекулярного клонирования, используемые для выделения нуклеиновых кислот, известны в отрасли техники, к которой относится настоящее изобретение. Сайт-специфичный мутагенез, приводящий к созданию изменений пар оснований, делециям и небольшим инсерциям также известны в данной области техники. См. например: Sambrook et al. (eds.) (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Silhavy et al. (1984) Experiments with Gene Fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; Glover & Hames (1995) DNA Cloning: A Practical Approach. 2nd ed. IRL Press at Oxford University Press, Oxford/New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed. Wiley, New York.

II.В. Полипептиды антител против 5Т4

Настоящее изобретении также предлагает изолированные полипептиды антител против 5Т4. Термины «полипептид» и «белок» относятся к соединению, состоящему из одиночной цепи аминокислот, связанных пептидными связями. Примеры полипептидов вариабельной области тяжелой цепи представляют собой остатки 20-138 последовательности SEQ ID №:2, остатки 19-135 последовательности SEQ ID №:6, остатки 20-141 последовательности SEQ ID №:10, и остатки 1-119 последовательности с SEQ ID №:49. Типичные представители полипептидов вариабельной области легкой цепи представляют собой остатки 21-127 последовательности SEQ ID №:4, остатки 23-130 последовательности SEQ ID №:8, и остатки 21-127 последовательности SEQ ID №:12. Дополнительные полипептиды согласно настоящему изобретению содержат аминокислоты гуманизизированных вариабельных областей антител А1, А2 и A3, изображенные на фиг.9А-9С.

Дополнительные полипептиды согласно настоящему изобретению включают полипептиды вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи, которые в значительной степени аналогичны предложенным полипептидам антител против 5Т4, такие, как по меньшей мере приблизительно на 90% идентичные вариабельной области, которая имеет последовательность, выбранную из SEQ ID Nos:2, 4, 6, 8, 10, 12, и 49, например, по меньшей мере приблизительно на 91% идентичны, по меньшей мере на 92% идентичны, по меньшей мере на 93% идентичны, по меньшей мере на 94% идентичны, по меньшей мере на 95% идентичны, по меньшей мере на 96% идентичны, по меньшей мере на 97% идентичны, по меньшей мере на 98% идентичны, или, по меньшей мере на 99% идентичны. Последовательности сравнивают на максимальное соответствие посредством алгоритма сравнения последовательностей, применяя любую полноразмерную последовательность, выбранную из SEQ ID №:2, 4, 6, 8, 10, 12, 49, или из последовательностей вариабельных областей гуманизированных антител А1, А2 или A3, изображенных на фиг.9А-9С в качестве последовательности запроса, или последовательности вариабельной области указанных антител, или посредством зрительного контроля. Изобретение далее охватывает полипептиды, кодируемые любой из предложенных в этом документе нуклеиновых кислот.

Например, репрезентативные полипептиды согласно настоящему изобретению включают: (а) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2; (б) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% аналогична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; (в) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% аналогична остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6; (г) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% аналогична остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8; (д) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% аналогична остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10; (е) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% аналогична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12; и (ж) полипептиды, имеющие последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% аналогична остаткам 1-119 последовательности SEQ ID №:49. См. Пример 1 и Таблицу 2, и Пример 7 и Таблицу 11.

Полипептиды согласно настоящему изобретению могут содержать природные аминокислоты, синтетические аминокислоты, генетически кодируемые аминокислоты, негенетически кодируемые аминокислоты, и их комбинации. Полипептиды могут включать аминокислот как в L-форме, так и в D-форме.

Типичные негенетически кодируемые аминокислоты включают, но не ограничиваются, 2-аминоадипиновую кислоту, 3-аминоадипиновую кислоту, (3-аминопропионовую кислоту; 2-аминомасляную кислоту; 4-аминомасляную кислоту (пиперидиновую кислоту); 6-аминокапроновую кислоту, 2-аминогептановую кислоту; 2-аминоизомасляную кислоту; 3-аминоизомасляную кислоту; 2-аминопимелиновую кислоту; 2,4-диаминомасляную кислоту; десмозин; 2,2'-диаминопимелиновую кислоту; 2,3-диаминопропионовую кислоту; N-этилглицин; N-этиласпарагин; гидроксилизин; аллогидроксилизин; 3-гидроксипролин; 4-гидроксипролин; изодесмозин; аллоизолейцин; N-метилгицин (саркозин); N-метилизолейцин; N-метилвалин; норвалин; норлейцин; и орнитин.

Типичные производные аминокислот включают, например, такие молекулы, в которых три аминогруппы были модифицированы с образованием гидрохлоридов амина, p-толуолсульфонатных групп, карбобензокси групп, t-бутилкарбоксильных групп, хлорацетильных групп или формильных групп. Свободные карбоксильные группы могут быть модифицированы с образованием солей, метиловых или этиловых сложных эфиров или других видов сложных эфиров или гидразидов. Свободные гидроксильные группы могут быть модифицированы с образованием O-ацил или O-алкил производных. Азот имидазола в гистидине может быть модифицирован с образованием N-бензилгистидина.

В настоящем изобретении также предложены фрагменты полипептидов антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению, например, фрагменты, составляющие связывающий сайт 5Т4 антигена. Также предусматриваются полипептидные последовательности, которые длиннее, чем раскрытые последовательности. Например, одна и более аминокислоты могут быть добавлены по N-концу или С-концу полипептида антитела. Такие дополнительные аминокислоты можно применять в ряде приложений, включающих, но не ограниченных, целями очистки. Способы получения удлиненных белков известны в области техники, к которой относится данное изобретение.

Полипептиды антител против 5Т4 согласно настоящему изобретению включают полипептиды, содержащие аминокислоты, которые являются консервативно замещенными вариантами любой из последовательностей SEQ ID №:2, 4, 6, 8, 10, 12, или 49. Термин «консервативно замещенный вариант» относится к полипептидам, в которой один или более остатков аминокислот был консервативно замещен функционально аналогичным остатком.

Примеры консервативных заместителей включают замещение одного из неполярных (гидрофобных) остатков, как например изолейцин, валин, лейцин или метионин другим; замещение одного полярного (гидрофильного) заместителя другим, как например, аргинина - лизином, глютамина - аспарагином, глицина - серином; замещение одного основного заместителя такого, как например, лизин, аргинин или гистидин другим; или замещение одного кислотного остатка, как например, аспарагиновой кислоты или глютаминовой кислоты другой кислотой.

Изолированные полипептиды согласно настоящему изобретению могут быть очищены и охарактеризованы посредством ряда стандартных способов, известных квалифицированному специалисту. См., например: Schroder & Lubke (1965) The Peptides. Academic Press, New York; Bodanszky (1993) Principles of Peptide Synthesis. 2nd rev. ed. Springer-Verlag, Berlin/ New York; Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed. Wiley, New York.

II.C. Сличение нуклеотидных аминокислотных последовательностей

Термины «идентичный» и «процент идентичности» в контексте двух и более нуклеотидных или белковых последовательностей, относятся к двум или более последовательностям или частичным последовательностям, которые одинаковы или имеют определенный процент остатков аминокислот или нуклеотидов, которые одинаковы при сравнении и наложении с максимальным соответствием, как например, измеряется согласно одному из алгоритмов сравнения последовательностей, описанных в данной заявке или визуально.

Термин «идентичный в значительной степени» по отношению к нуклеотидной или протеиновой последовательности означает, что конкретная последовательность отличается от природной последовательности одной или более делецией, заменой, добавлением, причем совокупный эффект которых не влияет на биологическую функцию полипептида антитела против 5Т4 или соответствующей нуклеиновой кислоты.

При сравнении двух и более последовательностей обычно одна последовательность служит эталонной последовательностью, с которой сравнивают одну или более анализируемых последовательностей. При использовании алгоритма сравнивания последовательностей, в компьютерную программу вводят анализируемую и эталонную последовательности, при необходимости обозначают координаты частичной последовательности и выбирают параметры программы для алгоритма сравнения последовательностей. Алгоритм сравнения последовательностей затем рассчитывает процент идентичности последовательности, базирующийся на выбранных параметрах программы, для обозначенной анализируемой последовательности (последовательностей) относительно эталонной последовательности.

Оптимальное выравнивание последовательностей для сравнения может быть проведено, например, посредством алгоритма локальной гомологии по Смиту и Ватерману Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math 2:482-489, алгоритма выравнивании гомологии Нидермана и Вюнша Needleman & Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443-453, способом разыскания подобия Пирсона и Липмана Pearson & Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-2448, посредством компьютерной реализации этих алгоритмов (GAP, BESTFIT, FASTA, и TFASTA в пакете генетических программ Висконсина Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin), или визуально. См. Ausubel (ed.) (1995) Short Protocols in Molecular Biology. 3rd ed. Wiley, New York.

Предпочтительным алгоритмом для определения процента идентичности последовательностей служит алгоритм BLAST, описанный в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410. Программы для проведения BLAST анализов имеется в открытом доступе через Национальный центр биотехнологической информации (адрес веб-сайта www.ncbi.nlm.nih.gov/).

Параметры алгоритма BLAST определяют чувствительности и скорость выравнивания. При сравнении двух нуклеотидных последовательностей применяемые по умолчанию параметры BLAST устанавливаются W=11 (длина слова) and E=10 (математическое ожидание) и включают также фильтр низкой сложности для маскирования остатков в исследуемой последовательности, которые имеют низкую композиционную сложность. При сравнении двух аминокислотных последовательностей применяемые по умолчанию параметры BLAST устанавливаются W=3 (длина слова) и Е=10 (математическое ожидание), применяют BLOSUM62 матрицу количественной оценки, цену внесения разрыва (дар)=11 и увеличение разрыва=1, и используют фильтр низкой сложности для маскирования остатков в исследуемой последовательности, которые имеют низкую композиционную сложность. См. Пример 1.

III. Конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством

Настоящее изобретение далее предлагает конъюгаты антител с лекарственным средством, содержащие антитело против 5Т4 согласно настоящему изобретению. Также предлагаются способы приготовления конъюгатов антитела с лекарственным средством, согласно которым лекарственное средство прямо или косвенно связанно с антителом. Конъюгаты антитела с лекарственным средством имеют общую формулу 5T4Ab(-X-W)_m.

В которой:

5T4Ab представляет собой фрагмент антитела против 5Т4, как описано в настоящей заявке;

Х представляет собой линкер, который включает продукт любой реакционоспособной группы, которая может реагировать с антителом против 5Т4 или фрагментом указанного антитела.

W представляет собой лекарственное средство;

m представляет собой среднюю загрузку для очищенного продукта конъюгации (например, такое, что лекарственное средство содержит около 3-10% конъюгата по весу);

(-X-W)_m - представляет собой производное соединение лекарственного средства.

Предлагаются также способы приготовления конъюгатов антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению. В качестве одного из примеров, конъюгат антитела с лекарственным средством формулы 5T4Ab(-X-W)_m может быть приготовлен посредством: (а) добавления производного лекарственного средства к антителу против 5Т4, при этом соотношение количеств лекарственного средства и антител против 5Т4 составляет 3-10 вес.%; (б) термостатирования производного лекарственного средства и антитела против 5Т4 в ненуклеофильном, белок-совместимом, буферном растворе, имеющем значение рН в пределах 7-9 для получения конъюгата антитела с лекарственным средством, дополнительно при этом раствор содержит (i) подходящей органический сорастворитель, и (ii) и одну и более добавок, содержащих по меньшей мере одну желчную кислоту или соль этой кислоты, при этом выдерживание в термостате проводят при значениях температуры от 30°C до 35°C в течение промежутка времени от 15 минут до 24 часов; и (в) хроматографической обработки полученного на стадии (б) конъюгата с целью отделения конъюгатов антител с лекарственным средством от неконъюгированного антитела против 5Т4, производного лекарственного средства и агрегированных конъюгатов при загрузке в пределах 3-10 вес.% лекарственного средства и низкоконъюгированной фракции.

III.A. Лекарственные средства

Лекарственное средство представляет собой любое соединение, которое имеет биологическую активность или обнаруживаемую активность, например, терапевтические средства, обнаруживаемые метки, связывающие агенты и т.д., и пролекарства, которые метаболизируются в активный агент in vivo. Лекарственным средством может быть также производное лекарства, в котором в лекарственное средство введены функциональные заместители для осуществления конъюгации с антителом согласно настоящему изобретению. Как правило, такие типы конъюгатов именуются иммуноконъюгатами.

Терапевтические агенты представляют собой композиции, которые можно использовать в случае возникновения необходимости для лечения или профилактики состояний субъекта. Применяемые в изобретении терапевтические агенты включают противораковые агенты, те. вещества, проявляющие противораковую активность в 5Т4-экспрессирующих клетках, таких, как раковые клетки сквамозной/аденоматозной легочной карциномы (немелкоклеточной легочной карциномы), инвазивной карциномы груди, колоректальной карциномы, рака желудка, сквамозной карциномы шейки матки, инвазивной карциномы эндометрия, инвазивного рака поджелудочной железы, рака яичника, сквамозного рака мочевого пузыря, и хориокарциномы.

Типичные терапевтические средства включают цитотоксины, радиоизотопы, химиотерапевтические средства, иммуномодулирующие средства, противососудистые препараты, противопрофилеративные средства, проапоптические средства, и цитостатические и цитолитические ферменты (например, рибонуклеазы). Лекарственное средство может также включать лечебную нуклеиновую кислоту, такую как ген, кодирующий иммуномодуляторное средство, противососудистое средство, противопрофилеративное средство, или проапоптическое средство. Эти описания лекарственных средств не являются взаимоисключающими, и, таким образом, терапевтическое средство может быть описано посредством одного и более вышеупомянутых определений. Например, выбранные радиоизотопы являются также цитотоксинами. Терапевтические средства можно применять в виде фармацевтически приемлемых солей, кислот или производных любого из вышеупомянутого. Как правило, конъюгаты, имеющие в качестве лекарственного средства радиоизотопы, называют радиоиммуноконъюгаты, и конъюгаты, включающие в качестве лекарственного средства химиотерапевтический агент, именуются химиоиммуноконъюгатами.

Примеры пригодных лекарственных средств для использования в составе иммуноконъюгатов включают таксаны, мейтансины, СС-1065 и диокармицины, калихеамицины и другие эенедины, и ауристатины. Другие примеры включают антифолаты, алкалоиды барвинка (Vinca L), и антрациклины. Растительные оксины, другие биологически активные белки, ферменты (т.е. ADEPT), радиоизотопы, фотосенсибилизаторы (т.е. для фотодинамической терапии) также можно использовать в иммуноконъюгатах. Дополнительно, конъюгаты можно получить, используя вторичные носители в качестве цититоксичного агента, такие как, например, липосомы или полимеры.

Термин цитотксин обычно относится к агенту, который ингибирует или предотвращает функцию клеток и/или приводит к разрушению клеток. Типичные цитотоксины включают антибиотики, ингибиторы полимеризации тубилина, алкилирующие агенты, которые связываются с ДНК и разрушают ее, и агенты, которые нарушают синтез белка или функцию необходимых белков клетки, таких как протеинкиназ, фосфатаз, топоизомераз, ферментов и циклинов. Типичные цитотоксины включают, но не ограничиваются ими, доксорубицин, даунорубицин, идарубицин, акларубицин, зорубицин, митоксантрон, эпирубицин, карубицин, ногаламицин, меногарил, питарубицин, валрубицин, цитарабин, гемцитабин, трифлуридин, анцитабин, эноцитабин, азацитабин, доксифлуридин, пентостатин, броксуридин, кепецитабин, кладрибин, децитабин, флоксуридин, флударабин, гоугеротин, пиромицин, тегафур, тиазофурин, адриамицин, цисплатин, карбоплатин, циклофосфамид, дакарбазин, винбластин, винкристин, митоксантрон, блеомицин, мехлоретамин, преднизон, прокарбазин, метотрексат, фторурацилы, этопозид, таксол, аналоги таксола, такие платины, как цис-платин и карбо-платин, митомицин, тиотепа, таксаны, винкрристин, даунорубицин, эпирубицин, актиномицин, аутрамицин, азасерины, блеомицины, тамоксифен, идарубицины, доластатины/ауристатины, гемиастерлины, эсперамицины и майтансиноиды.

В частных вариантах реализации настоящего изобретения цитотоксин представляет собой антибиотик, такой как калихеамицин, называемый также комплекс LL-E33288, например, гамма-калихеамицин (γ₁) или N-ацетил гамма-калихеамицин. См. Патент США №4,970,198. Дополнительные примеры калихеамицинов, пригодных для приготовления конъюгатов антител с лекарственным средством согласно настоящему изобретению предложены в Патентах США №№4,671,958; 5,053,394; 5,037,651; 5,079,233; и 5,108,912, которые полностью включены в данное описание посредством ссылки. Эти соединения содержат метилтрисульфид, который можно прореагировать с соответствующими тиолами с образованием дисульфидов, одновременно вводя такую функциональную группу, как. например, гидразид или другую функциональную группу, которая применяется для конъюгирования калихеамицина с антителом против 5Т4. Также можно применять дисульфидные аналоги калихеамицина, например, аналоги, приведенные в Патентах США №№5,606,040 и 5,770,710, которые объединены в данном документе во всей своей целостности.

Для приложения в радиотерапии антитело против 5Т4 согласно настоящему изобретению может содержать радиоизотопы с высокой активностью. Изотоп может быть связан с антителом напрямую, например, через остаток цистеина, присутствующий в антителе, или в качестве промежуточного звена в связывании антитела и радиоизотопа можно использовать хелатор. Радиоизотопы, пригодные для радиотерапии включают, но не ограничиваются, α-излучатели, β-излучатели и оже-электроны. Для применения в диагностике пригодные радиоизотопы включают излучатели позитронов и γ-излучатели. Антитело против 5Т4 согласно настоящему изобретению дополнительно может быть йодировано, например, по тирозиновому остатку антитела в целях улучшения обнаружения или для терапевтического эффекта антитела.

Типичные радиоизотопы, которые могут быть конъюгированы с антителом против 5Т4, включают ¹⁸фтор, ⁶⁴медь, ⁶⁵медь, ⁶⁷галлий, ⁶⁸галлий, ⁷⁷бром, ^80mбром, ⁹⁵рутений, ⁹⁷рутений, ¹⁰³рутений, ¹⁰⁵рутений, ^99mтехнеций, ¹⁰⁷ртуть, ²⁰³ртуть, ¹²³ртуть, ¹²⁴ртуть, ¹²⁵ртуть, ¹²⁶ртуть, ¹³¹ртуть, ¹³³ртуть, ¹¹¹индий, ¹¹³индий, ^99mрений, ¹⁰⁵рений, ¹⁰¹рений, ¹⁸⁶рений, ¹⁸⁸рений, ^121mтеллур, ⁹⁹technetium, ^122mтеллур, ^125mтеллур, ¹⁶⁵тулий, ¹⁶⁷тулий, ¹⁶⁸тулий, ⁹⁰иттрий, и их нитридные и оксидные производные. Другие пригодные радиоизотопы включают альфа излучатели, такие как ²¹³висмут, ²¹³свинец, и ²²⁵актиний.

Конъюгаты антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению могут включать иммуномодуляторы, т.е. агенты, которые вызывают иммунный ответ, включающий гуморальные иммунные ответы (например, продуцирование антигенспецифичных антител) и клеточно-опосредованные иммунные ответы (например, пролиферацию лимфоцитов). Типичные иммуномодуляторные агенты включают цитокины, ксантины, интерлейкины, интерфероны, и факторы роста (например, TNF, CSF, GM-CSF and G-CSF), и гормоны, такие как эстрогены (диэтилстилбестрол, эстрадиол), андрогены (тестестерон, HALOTESTIN® (флуоксиместерон)), прогестины (MEGACE® (мегестерол ацетат), PROVERA® (медроксипрогестерон ацетат)), и кортикостероиды (преднизон, дексаметазон, гидрокортизон).

Иммуномодулирующие агенты, применяемые в настоящем изобретении, также включают антигормоны, которые блокируют действие гормонов на опухоли, и иммуносупрессивные агенты, которые обеспечивают образование цитокина, понижают экспрессию аутоантигена, или маскируют гистосовместимые антигены. Типичные антигормоны включают антиэстрогены, включающие, например, тамоксифен, ралоксифен, ингибирующие ароматазу 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапстон, и торемифен; и антиандрогены, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролин, и госерелин; и антогормоны коры надпочечников. Типичные иммуносупрессоры включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины, азатиопурин, циклофосфамид, бромкриптин, даназол, дапзон, глутаровый альдегид, антиидиопатические антитела для гистосовместимых антигенов и гистосовместимых фрагментов, циклоспорин А, такие стероиды как глюкокортикостероиды, цитокин или антагонисты цитокиновых рецепторов (например, антитела против интерферона, антитела против IL10, антитела против TNF α, антитела против IL2), стептокиназу, TGFβ, рапамицин, рецептор Т-клетки, фрагменты рецептора Т-клетки и антитела рецептора Т-клетки.

Дополнительные лекарственные средства, применяемые в изобретении, включают антиангиогенные агенты, которые ингибируют образование кровеносных сосудов, например, ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы СОХ-2, ингибиторы VEGF, ингибиторы bFGF, ингибиторы стероидсульфатазы (например, 2-метоксиэстрадиол биссульфамат (2-MeOE2bisMATE)), интерлеукин-24, тромбоспондин, металлоспондиновые белки, интерферона I класса, интерлеукин 12, протамин, ангиостатин, ламинин, эндостатин, и фрагменты пролактина.

Анти-профилеративные средства и проапоптотические средства включают активаторы PPAR-гамма (например, циклопентеноновые простогландины (cyPGs)), ретиноиды, тритерпиноиды (например, циклоартан, лупан, урзан, олеанан, фриделан, даммаран, кукурбитацин, и лимоноидные тритерпеноиды), ингибиторы рецепторов фактора роста эпидермиса (например, HER4), рампамицин, CALCITRIOL® (1,25-дигидроксихолекальциферол (витамин D)), ингибиторы ароматазы (FEMARA® (летрозон)), ингибиторы теломеразы, хелатные комплексы железа (например, теосемикарбазон 3-аминопиридин-2-карбоксальдегида (Триапин)), апоптин (вирусный белок 3 - VP3 вируса куриной анемии), ингибиторы Bcl-2 и Bcl-X(L), TNF-альфу, FAS лиганд, TNF-зависимый индуцирующий апоптосис лиганд (TRAIL/Apo2L), активаторы TNF-альфа/FAS лиганд/TNF-зависимого индуцирующего апоптосис лиганда (TRAIL/Apo2L) передачи сигналов, и ингибиторы PI3K-Akt сигнального пути выживания (например, UCN-01 и гелданамицин).

Типичные химиотерапевтические агенты включают такие алкилирующие агенты, как тиотепа и циклофосфамид; алкил сульфонаты, например, бисульфан, импросульфан и пипосульфан; азитидины, например, бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, включающие алтретамин, триаэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтилентиофосфорамид и тритиоломеламин; азотистые иприты, например, хлорамбуцил, хлорнафазин, хлорфосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехиоретамин, мехиоретамин оксиды гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофостарнид, урацил горчичное масло; нитрозомочевины, например, кармустин, хлорозотоксин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, например, аклациномузины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомуцины, микофеноловая кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберсидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, например, метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, например деноптерин, метотрексат, птероптерин, тримексат; аналоги пурина, например, флударабин, 6-меркаптопурин, триампирин, тиогуанидин; аналоги пиримидина, например, анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидеоксиуридин, доксиуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-EU; андрогены, например, калустерон, дромостанолон пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; противоадренальные средства, например, аргиноглутетимидин, митотан, трилостан, пополнители фолиевой кислоты, например, фролиновая кислота,; ацеглатон; гликозид альдофосфарнида; арнинолевулиновая кислота; амсакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демеколцин, диазиквуон; элфорнитин; эллиптинум ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксмочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофилловая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквион; 2,2',2”-трихлортриэтиламин; туретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; галатозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например, паклитаксел (TAXOL®, Бристол-Майер Скуибб Онколоджи из Принстона, Нью-Джерси) и доксетаксел (TAXOTERE®, Рон-Пуленк Рорер из Энтони, Франция); хиорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; аналоги платина, например, цисплатин и карбоплатин; винбластин; платин; этопозид (VP-16); ифосфамид; митоцин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аиноптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноловая кислота; эсперамицины; и капецитабин.

Дополнительные терапевтические средства, которые могут быть конъюгированы с антителами против 5Т4 и которые можно применять в соответствии с терапевтическими способами согласно настоящему изобретению, включают фотосенсибилизирующие агенты (Заявка на патент США №2002/0197262 и Патент США №5,952,329) для фотодинамической терапии; магнитные частицы для термотерапии (Заявка на патент США №2003/0032995); связывающие агенты, например, белки, лиганды, лиганды клеточной адгезии и т.д., и пролекарства, такие как фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, β-лактамсоедржащие пролекарства, содержащие замещенный феноксиацетамид пролекарства или содержащие замещенный фенилацетамид пролекарства, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут быть превращены в более активное лекарственное средство, свободное от цитотоксичности

Для способов диагностики с применением антител против 5Т4, лекарственное средство может содержать определяемую метку, применяемую для определения наличия 5Т4-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo. Радиоизотопы, которые обнаруживаемы in vivo, например, такие метки, которые могут быть обнаружены применением сцинтиграфии, ядерно-магнитной томографии, или ультразвука, можно применять клиническо-диагностических приложениях. Пригодные сцинтиграфические метки включают излучатели позитрона и γ-излучатели. Типичные контрастные вещества для получения изображения посредством ядерно-магнитного резонанса представляют собой парамагнитные или суперпарамагнитные ионы (например, железо, медь, марганец, хром, эрбий, европий, диспрозий, гольмий и гадолиний), частицы оксида железа, и водорастворимые контрастные агенты. Для детектирования ультразвуком в поры неорганических частиц могут быть внедрены газы или жидкости, которые затем высвобождаются в виде микропузырьковых контрастных агентов. Для обнаружения in vitro пригодные определяемые метки включают флуорофоры, детектируемые эпитопы или связывающие агенты и радиоактивные метки.

III.В. Молекулы линкеры.

Лекарственное средство конъюгируют с гибридными или гуманизированными антителами против 5Т4 согласно настоящему изобретению или непосредственно или опосредованно через молекулу линкера. Молекула линкера может быть устойчивой или способной к гидролизу, посредством чего она высвобождается после входа в клетку. Основные механизмы, посредством которых лекарственное средство отщепляют от антитела, включают гидролиз при кислых значениях рН липосом (гидразоны, ацетали, и цис-аконитат подобные амиды), расщепление пептидов липосомальными ферментами (катепсины и другие липосомальные ферменты), и восстановление дисульфидов. Как результат перечисленных различных механизмов расщепления, механизмы связывания лекарственного средства с антителом также широко варьируют и можно применять любой подходящий линкер. Предпочтительно, чтобы способ конъюгации приводил к образцу с минимальной фракцией с низкой степенью конъюгации (фракция неконъюгированного в основном антитела), т.е. менее 10%.

Один пример пригодной методики конъюгации основан на конъюгации гидразидов и других нуклеофилов с альдегидами, генерированными посредством окисления углеводов, которые естественно встречаются в антителах. Гидразон-содержащие конъюгаты могут быть получены с помощью введения карбонильных групп, это обеспечивает желаемые свойства в освобождении лекарственного вещества. Конъюгаты также можно получить с линкером, который имеет дисульфидную группу на одном конце молекулы, алкильную цепь в центре, и производное гидразина на другом конце молекулы. Антрациклины представляют собой один из примеров цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы и антителами по этой технологии.

Линкеры, содержащие функциональные группы, отличные от гидразонов, проявляют способность к расщеплению в кислой среде лизосом. Например, конъюгаты можно получить из тиол-реактивных линкеров, которые содержат группу, отличную от гидразона, которая способна к расщеплению внутри клетки, например эфиры, амиды и кетали/ацетали. Камптотецин является одним из цитотоксичных агентов, который может быть конъюгирован с помощью этих линкеров. Также можно применять кетали, полученные из 5-7-членных циклических кетонов, в которых один из атомов кислорода соединен с цитотоксическим агентом и другой с линкером для присоединения антитела. Антрациклины являются также примером пригодного цитотоксина для использования с этими линкерами.

Цис-аконитаты, которые содержат остаток карбоновой кислоты по соседству с амидной группой, представляют собой другой пример класса рН чувствительных линкеров. Карбоновая кислота ускоряет гидролиз амида в кислой среде лизосом. Линкеры, которые осуществляют ускорение скорости гидролиза сходным образом с помощью структур некоторых других типов, также можно использовать. Майтанзиноиды являются примером цитотоксина, который можно конъюгировать с линкерами, присоединенными по С-9.

Другой возможный способ высвобождения для конъюгатов лекарственного средства представляет собой ферментный гидролиз пептидов ферментами липосом. В качестве примера, пептид присоединяют через амидную связь к пара-аминобензиловому спирту и затем между бензиловым спиртом и цитотксичным агентом создают карбаматную или карбонатную связь Расщепление пептидов вызывает распад, или саморазложение аминобензильного карбамата или карбоната. Иллюстрирующие эту стратегию цитоксические агенты включают антрациклины, таксаны, митомицин С и ауристатины. В одном из примеров взамен карбамата при рарушении линкера также может выделяться фенол. В другом варианте для инициирования распада пара-меркаптобензил карбамата или карбоната используется восстановление дисульфида.

Многие из цитотоксичных агентов, конъюгированных с антителами, имеют малую, если вообще имеют, растворимость в воде, и это может ограничивать загрузку лекарственного средства на конъюгат вследствие агрегации конъюгата. Один из подходов для избегания этой трудности заключается во введении в линкер повышающих растворимость групп. Можно применять конъюгаты с линкером, содержащим PEG (полиэтиленгликоль), и можно использовать дипептид, включающий PEG (полиэтиленгликоль), дикислоту тиол-кислоту, или малеинимид-кислоту, соединенные с антителом, спейсерную область дипептида, и амидную связь с амином в антрациклиновых или дуокармициновых аналогах. Другим примером является конъюгат, приготовленный с PEG-содержащим линкером, который связан посредством дисульфидной связи с цитотоксичным агентом и связан посредством амидной связи с антителом. Подходы, которые включают PEG группы, могут быть полезными для преодоления агрегации и ограничений, связанных с загруженностью лекарственным средством.

Типичные линкеры, которые предпочтительны для приготовления конъюгатов антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению, включают линкеры с формулой:

(СО-Alk¹-Sp¹-Ar-Sp²-Alk²-C(Z¹)=Q-Sp)

в которой,

Alk¹ и Alk² независимо представляют собой связь или разветвленную, или неразветвленную (C₁-C₁₀) цепь олефина;

Sp¹ представляет собой связь, -S-, -О-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(СН₂СН₂)₂N-, или -X-Ar'-Y-(CH₂)_n-Z в которой X, Y, и Z независимо представляют собой связь, -NR'-, -S-, или -О-, с ограничением, что если n=0, тогда хотя бы один Y и Z должны быть связью и Ar' является 1,2-, 1,3-, или 1,4-фениленом, который может быть замещен одной, двумя или тремя группами (C₁-C₅) алкил, (C₁-C₄) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкил, галогеном, нитро-группой, -COOR', -CONHR', -(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONHR', с ограничением, что если Alk¹ является связью, то Sp¹ представляет собой связь;

n - целое число от 0 до 5;

R' представляет собой разветвленную или неразветвленную (C₁-C₅) цепь, возможно замещенную одной или двумя группами -ОН, (C₁-C₄) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галогеном, нитро-группой, (C₁-C₃) диалкиламино, или (C₁-C₃) триалкиламмонием -А^-, в котором А^- представляет собой фармацевтически допустимый анион, соль присоединения;

Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, или 1,4-фенилен, который в качестве заместителей может иметь одну, две или три группы (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галоген, нитрогруппу, -COOR', -CONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONHR', в которых n и R' являются такими, как это определено выше или 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, или 2,7-нафталиден или

,

причем каждый нафталиден или фенотиазин может иметь один, два, три или четыре заместителя, выбранных из: (C₁-C₆) алкила, (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галоген, нитро-группу, -COOR', -CONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', или -S(CH₂)_nCONHR', в которых n и R' являются такими, как это определено выше, при условии, что если Ar является фенотиазином, Sp¹ является связью, соединенной только с азотом;

Sp² представляет собой связь, -S-, или -О-, при условии, что если Alk² является связью, то Sp² представляет собой связь;

Z¹ представляет собой Н, (C₁-C₅) алкил, фенил, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами (C₁-C₅) алкил (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галогеном, нитро-группой, -COOR', -ONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONH R', в которых n и R' являются такими, как это определено выше;

Sp представляет собой прямую или разветвленную цепь дизамещенного или тризамещенного (C₁-C₁₈) радикала, или дизамещенного или тризамещенного арильного или гетероарильногго радикала, или дизамещенного или тризамещенного (C₃-C₁₈) циклоалкил или гетероциклоалкил радикала, или дизамещенного или тризамещенного (C₂-C₁₈) ненасыщенного алкилрадикала, в который гетероарил предпочтительно является фурилом, тиенилом, N-метилпирролилом, пиридинилом, N-метилимидазолилом, оксазолилом, пиримидинилом, хинолилом, изохинолилом, N-метилкарбазоилом, аминокумаринилом, или феназинилом и в которых Sp является тривалентным радикалом, Sp может быть дополнительно замещен низшими (C₁-C₅) диалкиламино, низшими (C₁-C₅) алкокси, гидрокси, или низшими (C₁-C₅) алкилтио группами; и

Q представляет собой =NHNCO-, =NHNCS-, =NHNCONH-, =NHNCSNH-, или =NHO-.

Предпочтительно, Alk¹ представляет собой разветвленную или неразветвленную (C₁-C₁₀) цепь олефина; Sp' является связью, -S-, -О-, -CONH-, -NHCO-, или -NR', в которых R' являются такими, как это определено выше, с ограничением, что если Alk¹ является связью, то Sp¹ является связью;

Аг представляет собой 1,2-, 1,3-, или 1,4-фенилен, который может иметь заместителями одну, две или три группы (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галоген, нитрогруппу, -COOR', -CONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONHR', в которых n и R' являются такими, как это определено выше или Ar представляет собой 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6-, или 2,7-нафталиден, каждый из которых может иметь в качестве заместителей одну, две, три или четыре группы (C₁-C₆) алкил, (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галоген, нитрогруппу, -COOR', CONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONHR'.

Z¹ представляет собой (C₁-C₅) алкил или фенил, возможно замещенный одной, двумя или тремя группами (C₁-C₅) алкил (C₁-C₅) алкокси, (C₁-C₄) тиоалкокси, галогеном, нитро-группой, -COOR', -ONHR', -O(CH₂)_nCOOR', -S(CH₂)_nCOOR', -O(CH₂)_nCONHR', или -S(CH₂)_nCONH R'; Alk² и Sp² вместе представляют собой связь; и Sp и Q являются такими, как было определено выше.

Патент США №5,773,001, полностью включенный в описание данной заявки, раскрывает линкеры, которые могут применять с нуклеофильными лекарственными средствами, в частности гидразиды и родственные нуклеофилы, приготовленные из калихеамицинов. Эти линкеры особенно полезны в тех случаях, в которых лучшая активность получают, если образованная между лекарственным средством и линкером химическая связь может подвергаться гидролизу. Эти линкеры содержат две функциональные группы, включающие (1) группу для взаимодействия с антителом (например, карбоновую кислоту), и (2) карбонильную группу (например, альдегид или кетон) для осуществления реакции с лекарственным средством. Карбонильная группа может реагировать с гидразидной группой лекарственного средства с образованием гидразоновой связи. Эта связь способна к гидролизу, что позволяет терапевтическому агенту высвобождаться из конъюгата после связывания с клетками-мишенями.

В качестве одного из примеров, антитело против 5Т4 может быть конъюгировано с цитотоксичным лекарственным средством посредством: (1) добавления производного цитотоксичного лекарственного средства к антителу против 5Т4, при этом цитотоксичное лекарственное средство берут в соотношении 4.5-11 вес.% к белковому носителю; (2) термостатирования производного цитотоксичного лекарственного средства и антитела против 5Т4 в ненуклеофильном, совместимом с белком, в забуференном растворе, имеющем рН в пределах от 7 до 9, приводящего к образованию мономерного конъюгата антитела с лекарственным средством, при этом раствор дополнительно содержит (а) подходящий органический сорастворитель, и (б) добавку, содержащую, по меньшей мере, одну C₆-C₁₈ карбоновую кислоту или ее соль, при этом, указанное термостатирование проводят при темепературе от 30°C до 35°C в течение промежутка времени, который выбирают в диапазоне от 15 мин до 24 часов; и (3) хроматографического разделения конъюгата, полученного на стадии (2), с целью отделения мономерных конъюгатов с загруженностью цитотоксичным лекарственным средством в пределах от 3 вес.% до 10 вес.% и низкоконъюгированной фракции ниже 10% от неконъюгированногот антитела, производного цитотоксичного лекарственного средства, и агрегированных конъюгатов.

Хроматографическое разделение на стадии (3) может включать такие процессы, как эксклюзионную хроматографию, ультрафильтрацию/диафильтрацию, жидкостную хроматографию высокого давления (HPLC), быструю жидкостную хроматография белков (FPLC), хроматографию на Sephacryl S-200. Хроматографическое разделение также может сопровождаться гидрофобной хроматографией с использованием фенил Sepharose 6 Fast Flow среды для хроматографиии, бутил Sepharose 6 Fast Flow хроматографической среды, октил Sepharose 6 Fast Flow среды для хроматографиии, Toyopearl Ether-650M среды для хроматографиии, Macro-Prep метил среды для гидрофобной хроматографии или Macro-Prep t-бутил среды для гидрофобной хроматографии.

Типичные способы приготовления конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством включают способы, описанные для приготовления CMC-554 согласно находящейся в процессе одновременного рассмотрения Заявке на патент США №2004-082764А1 и Заявке на патент США №10/699,874, которая полностью включена в данное описание. Конъюгирование можно проводить при использовании следующих условий: 10 мг/мл антитела, 8.5 вес.% производного калихеамицина, 37.5 мМ раствора деканоата натрия, 9 об.% этанола, 50 мМ HEPES (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфоновой кислоты)), рН 8.5, 32°C, 1 час. Гидрофобную хроматографию можно проводить при применении смолы FF бутил сефарозы, буфера для загрузки с 0.65М фосфата калия, буфера для промывки с 0.49М фосфата калия и буфера для элюирования с 4 мМ калий фосфата. Буферный обмен может сопровождаться эксклюзионной хроматографией (SEC), ультрафильтрацией/диафильтрацией, или прочими пригодными средствами. Рецептура конъюгата антитела с лекарственным средством может быть составлена в 1.5% Декстране-40, 0.9% сахарозы, 0.01% TWEEN®-80, 20 мМ Tris/50 мМ NaCl (Tris - гидроксиметиламинометан, далее употребляется сокращение Tris, рН 8.0). Также возможно применение раствора с альтернативной формулой, содержащего 5% сахарозы, 0.01% TWEEN®-80, 20 мМ Tris/50 мМ NaCl, рН 8.0. Циклы лиофилизации применяют на основании разработанной рецептуры. Концентрация рецептуры может быть 0.5 мг конъюгата/мл. Каждая ампула содержит 1 мг конъюгата, т.е. 2 мл заполнения. При необходимости можно приготовить другие объемы наполнения, например, заполнение на 5 мл.

Другие типичные способы включают способы, описанные для CMD-193, которые также описаны в Заявке на патент США №20060002942. Конъюгирование можно проводить при использовании следующих условий: 10 мг/мл антитело, 7вес.% производного калихеамицина, 10 мМ раствора деоксихолата, 50 мМ HEPES (N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(4-бутансульфоновой кислоты)), 9 об.% этанола, рН 8.2, 32°C, 1 час. Реакционная смесь может быть разбавлена в 10 раз 0.65М раствором фосфатата калия с рН 8.56, и гидрофобную хроматографию можно проводить с использованием бутил сефароза FF смолы, 0.60М калий фосфатного буфера для загрузки и для промывки и 20 мМ Tris/50 мМ NaCl буфера для элюирования. Буферный обмен может сопровождаться ультрафильтрацией/диафильтрацией с мембраной из искусственной целлюлозы. Конъюгат можно подвергнуть диафильтрации против 20 mM Tris/10 мМ NaCl рН 8.0 (10 диаобъемов). Рецептура конъюгата антитела с лекарственным средством может быть составлена в 5% растворе сахарозы, 0.01% TWEEN®-80, 20 мМ Tris/50 мМ NaCl, рН 8.0. Концентрация массы конъюгата после составления смеси может быть 1 мг/мл, и заполнение ампулы может быть 5 мг/ампула, т.е. заполнение на 5 мл, или при необходимости можно приготовить другие объемы заполнения.

В отдельном варианте настоящего изобретения применяемый линкер представляет собой 4-(4-ацетилфенокси) масляную кислоту (AcBut). Конъюгаты антитела с лекарственным средством приготовляют взаимодействием β-калихеамицина, γ-калихеамицина или N-ацетил γ-калихеамицина или производных на их основе, с гидразидом 3-меркапто-3-метил масляной кислоты, AcBut линкером, и противо-5Т4 антителом согласно настоящему изобретению. См., например, Патент США №5,773,001. Этот линкер приводит к получению конъюгатов, которые в значительной степени устойчивы в системе кровообращения, выделяя ожидаемые 2% NAc-гамма DMH в день, и которые легко высвобождают NAc-гамма DMH в кислотных лизосомах. В другом варианте реализации настоящего изобретения конъюгаты антитела с лекарственным средством готовят, применяя в качестве молекул линкера 3-ацетилфенилуксусную кислоту (АсРас) или 4-меркапто-4-метилвалериановую кислоту (Amide).

Типичные линкеры, пригодные для конъюгирования радиоизотопов, включают диэтилентриамин пентаацетата (DTPA)-изотиоцианат, сукцинимидил 6-гидразино никотината гидрохлорид (SHNH), и оксим гексаметилпропиленамина (НМРАО) (Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28:741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35:1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15:267-270); Патент США №.6,024,938). В качестве альтернативы, можно получить производное нацеливающей молекулы так, чтобы радиоизотоп можно было присоединять к ней напрямую (Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38:294-300). В данной области техники также известны способы введения иода, типичные способики можно найти в литературе, например, в Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 and in Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9.

Для дополнительного увеличения числа молекул лекарственного средства, приходящихся на конъюгат антитела с лекарственным средством, лекарственное средство можно конъюгировать с полиэтиленгликолем (PEG), включая линейные или разветвленные полимеры и мономеры полиэтиленгликоля. Мономер полиэтиленгликоля имеет формулу -(CH₂CH₂O)-. Лекарственные средства и/или белки можно связать с полиэтиленгликолем напрямую или косвенно, т.е. посредством приемлемых пространственных группировок, например, Сахаров. Композиция PEG/антитело/лекарственное средство может также включать дополнительные липофильные и/или гидрофильные компоненты с целью содействия стабильности лекарственного средства и доставки к сайту мишени in vivo. Типичные методики для приготовления PEG-содержащих композиций можно найти, наряду с другими источниками, в Патентах США №№6,461,603; 6,309,633; и 5,648,095.

Например, с целью увеличения количества калихеамицина в конъюгатах антитела с калихеамицином, антитело конъюгируют перед конъюгацией с калихеамицином с PEG, например, с помощью PEG-SPA, PEG-SBA, или PEG-бисмалеинимида. Конъюгаты антитела с лекарственным средством, приготовленные с помощью PEG, могут показывать пониженное сродство к связыванию с антигеном-мишенью, но остаются все еще эффективными, вследствие увеличения загрузки лекарственным средством. Такие добавки, как деоксихолат и деканоат можно применять для получения конъюгатов антитело/калихеамицин с низкими уровнями неконъюгированного антитела и низкими уровнями агрегации.

Гидрофобная природа многих лекарственных средств, включая калихеамицины, может приводить к агрегации конъюгатов антитела с лекарственным средством. Для получения мономерных конъюгатов антитела с лекарственным средством с более высокими показателями доставки лекарственного средства, выхода и уменьшения агрегации, реакцию конъюгации можно проводить в ненуклеофильных, белок-совместимых, забуференных растворах, содержащих (i) в качестве сорастворителя пропиленгликоль и (ii) добавку, содержащую хотя бы одну C₆-C₁₈ карбоновую кислоту. Пригодные кислоты включают кислоты от C₇ до C₁₂, например, октановую, или каприловую кислоту или их соли. Возможно применение других, отличных от этиленгликоля, белок совместимых органических сорастворителей, например, этиленгликоля, этанола, ДМФА, ДМСО и т.д. Некоторые или все органические сорастворители применяют с целью внесения лекарственного средства и смесь для конъюгации. Пригодные буферные растворы для приготовления конъюгатов антитела с лекарственным средством, использующие сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (OSu) или другие сравнительно активированные сложные эфиры, включают солевой фосфатный буфер (PBS) и N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновую кислоту (HEPES буфер). Используемые в реакциях конъюгации буферные растворы не должны содержать в значительной мере свободных аминов и нуклеофилов. В другом варианте исполнения, реакцию конъюгирования можно проводить в ненуклеофильном, белкосовместимом, забуференном растворе, который содержит трет-бутанол без дополнительных добавок. См., например: Патенты США №№5,712,374 и 5,714,586. Дополнительные методики конъюгирования и в отношении содержащих калихеамицин конъюгатов приведены в Патентах США №№5,739,116 и 5,877,296.

Оптимальные условия для образования мономерных конъюгатов можно определить опытным путем, варьируя параметры проведения реакции, например температуру, рН, введение производного калихеамицина, концентрацию добавки. Типичные количества пропиленгликоля находятся в пределах от 10% до 60%, например, от 10% до 40%, или порядка 30% от общего объема раствора. Типичные количества добавок, содержащих хотя бы одну C₆-C₁₈ карбоновую кислоту, находятся в пределах от 20 мМ до 100 мМ, например, от 40 мМ до 90 мМ, или приблизительно от 60 мМ до 90 мМ. Концентрацию C₆-C₁₈ карбоновой кислоты можно увеличить до 150-300 мМ и снизить количество сорастворителя до от 1% до 10%. В типичных вариантах реализации настоящего изобретения карбоновая кислота представляет собой каприловую (октановую) кислоту, каприновую (декановую) кислоту, или их соответствующие соли. Например, можно использовать 200 мМ раствор каприловой кислоты с 5% пропиленгликоля или этанола. Реакцию конъюгирования можно проводить при слабо повышенной температуре (30-35°C) и рН (8.2-8.7). Концентрация антитела может быть в интервале от 1 до 15 мг/мл, и концентрация производного калихеамицина, например сложного эфира N-ацетил гамма-калихеамицина DMH AcBut OSu может быть в интервале от 4.5% до 11% от веса антитела. Приемлемые условия для конъюгации для других лекарственных средств могут быть определены квалифицированными специалистами в данной области техники без больших дополнительных исследований.

III.C. Очистка конъюгатов антитела с лекарственным средством

После проведения процесса конъюгирования мономерные конъюгаты можно отделить от непрореагировавших реагентов и/или агрегированных форм конъюгатов традиционными способами, например, эксклюзионной хроматографией, гидрофобной хроматографией, ионообменной хроматографией, или хроматофокусированием. Очищенные конъюгаты мономерны и обычно содержат от 3 вес.% до 10 вес.% лекарственного средства. Конъюгаты антитела с лекарственным средством также можно очистить посредством гидрофобной хроматографии, которая дает некоторые преимущества относительно эксклюзионной хроматографии, которые включают (1) возможность эффективного уменьшения содержания низконъюгированной фракции, а также агрегированной; (2) возможность использования больших объемов реакционной массы; и (3) минимальное разбавление продукта. Среда для гидрофобной хроматографии с большой емкостью, пригодная для использования в крупномасштабном производстве включает среду для хроматографиии фенил Sepharose 6 Fast Flow, среду для хроматографиии бутил Sepharose 4 Fast Flow, среду для хроматографиии октил Sepharose 4 Fast Flow, среду для хроматографиии Toyopearl Ether-650M, среду для гидрофобной хроматографии Macro-Prep метил или среду для гидрофобной хроматографии Macro-Prep t-бутил. Уьтрафильтрацию/диафильтрацию можно также применять для буферного обмена.

В типичном процессе очистки выполняют множественные операции, включающие стадию удаления клеток в центрифуге, стадию захвата аффиности Белка А, за которой следуют одна или две ортогональные хроматографические стадии очистки, стадию вирусной фильтрации, и стадию фильтрации тангенциального потока для концентрирования и формулирования. Процесс очистки предпочтительно приводит к продукту с менее чем 5% агрегирования, менее чем 20 частей на миллион Белка А, менее чем 50 частей на миллион белков клетки-хозяина, и общим извлечением более чем 50%.

Типичный препарат антитела против 5Т4 с калихеамицином содержит преимущественно (около 95%) конъюгированного антитела, содержащего 5-7 моль калихеамицина на моль антитела. Конъюгат воспроизводимо получали в лабораторном масштабе (10-200 мг). Загруженность лекарственным средством, которая выражается в виде µг калихеамицина на мг моноклонального антитела, определяют отнесением концентрации калихеамицина (µг/мл) к концентрации антитела (мг/мл). Эти значения определяют посредством измерения УФ поглощения раствора конъюгата при 280 нм и 310 нм. Важно отметить, что это значение представляет собой среднюю нагруженность и что фактическая нагруженность представляет собой квази-распределение Гаусса, центрированное на среднем значении нагрузки, т.е. некоторое количество антитела нагружено в большей степени чем среднее значение нагрузки и некоторое количество антитела нагружено в меньшей степени чем среднее значение нагрузки Неконъюгированное антитело (низкоконъюгированная фракция), которое могут быть определено посредством аналитической гидрофобной жидкостной хроматографии высокого разрешения, представляет собой популяцию антитела, которое в малой степени конъюгировано или неконъюгировано с калихеамицином. Это значение есть мера распределения калихеамицина на антителе и в целом не оказывает влияния на дозу калихеамицина. Не-конъюгированный калихеамицин, количество которого можно определить посредством иммуноферментного твердофазого анализа, определяется как количество калихеамицина, который не конъюгирован с антителом и выражается в процентах калихеамицина. Количественное определение нагрузки лекарственным средством не позволяет различить между неконъюгированным и конъюгированным калихеамицином. При количественном определении нагрузки лекарственным средством количество неконъюгированного калихеамицина не определимо или ничтожно, вследствие этого, эти анализы эффективно показывают количество конъюгированного калихеамицина.

Для определения высвобождения и стабильности гуманизированных конъюгатов против 5Т4 с калихеамицином можно применять аналитические способы. Конъюгаты можно оценить на идентичность, действенность (общий белок и общая загрузка калихеамицином), чистоту (неконъюгированный калихеамицин, низкоконъюгированный антитело, содержание агрегатов и SDS-PAGE Reduced (анализ с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата в восстановительных условиях), и иммуноаффинность (иммуноферментный твердофазный анализ связывания с антителом). Можно применять дополнительные, известные специалисту в данной области техники, аналитические исследования. При использовании этих способов можно поддерживать межгрупповую соответствие между производимыми партиями для коммерческих целей.

III.D, Фармакокинетика конъюгатов антитела с лекарственным средством

Фармакокинетику 5Т4-специфичных иммуноконъюгатов можно определит и сравнить с фармакокинетикой неконъюгированного калихеамицина у различных животных. Например, это можно сделать, после однократного внутривенного введения лекарственного препарата самкам безтимусных мышей, самцам крыс Спег-Давлея (Sprague-Dawley) и самкам яванского макака (cynomolgus monkey). Фармакокинетика антитела против 5Т4 в целом характеризуется низким клиренсом, низким объемом распределения, и долгим наблюдаемым периодом полураспада у различных видов. Полагают, что концентрации в сыворотке крови неконъюгированных производных калихеамицина ниже предела количественного обнаружения. Ожидается, что профиль токсичности для этих конъюгатов при изучении уровней токсичности однократной дозы аналогичен уровням токсичности, полученным для других конъюгатов антитело/калихеамицин, взятых в сравнимых дозах.

IV. Функциональные анализы получения характеристик антител против 5Т4 и конъюгатов антитела с лекарственным средством

В изобретении далее предлагаются способы анализа для характеристики активностей антитела против 5Т4 in vitro и in vivo, включающие связывающую активность 5Т4, проникновение в клетки интернализацию с последующим связыванием с 5Т4 антигеном, присутствующем на поверхности клеток, и специфичности к 5Т4-экспрессирующим клеткам субъекта. Будучи конъюгированными с цитотоксином, антитела согласно настоящему изобретению могут проявлять противораковую активность, включающую ингибирование роста 5Т4-экспрессирующих раковых клеток и/или гибель 5Т4-экспрессирующих клеток. Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению могут проявлять одну и более вышеизложенных активностей.

Технические средства для определения связывания антител против 5Т4 с 5Т4 антигеном известны в данной области техники, например, BIACORE® измерения приведенные в Примере 2. Дополнительные типичные технические приемы включают центрифугирование, аффинную хроматографию и другие способы иммунохимии. См., например, Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassav, Elsevier, Amsterdam/New York. Измерения связывания с антигеном могут быть выполнены посредством использования изолированного 5Т4 антигена или 5Т4 экспрессирующих клеток. См. Пример 2.

Специфичность связывания антител против 5Т4 можно дополнительно охарактеризовать посредством определения связывающего эпитопа, т.е. идентификации остатков, включающих несмежные остатки, которые участвуют в связывании с антигеном, и/или определение остатков, которые оказывают влияние на связывание с антигеном. См. Примеры 4-5.

Интернализацию антител против 5Т4 и конъюгатов антитела с лекарственным средством 5Т4-экспрессирующими клетками можно количественно определить посредством определения количества антител или конъюгатов, связывающихся с поверхностью 5Т4-экпрессирующих клеток в течение времени. Типичные методики для определения величины локализации антител и конъюгатов антитела с лекарственным средством на мембране приведены в Примере 3.

Функциональные способы анализа также включают способы определения противораковой активности конъюгатов антител с лекарственными средствами, например, способности к уничтожения имеющихся раковых клеток, или замедлению или препятствованию росту раковых клеток. Виды рака, подвергаемые таргетной (нацеленной) терапии конъюгатами антител с лекарственным средством согласно настоящему изобретению, включают как первичные, так и метастазированные опухоли и карциномы любой ткани субъекта, включая карциномы и злокачественные заболевания органов кроветворения, например, лейкемии и лимфосаркомы.

Антитела против 5Т4, которые обладают противоростовой активностью, могут элиминировать 5Т4-экспрессирующие клетки или препятствовать или снижать пролиферацию 5Т4-экспрессирующих клеток. Типичные способы для быстрого in vitro определения ингибирования роста клеток описаны в Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98.

Антитела против 5Т4 также могут проявлять способность к стимулированию гибели клетки, например, запрограммированной гибели клетки, характеризуемой деградацией ядерной ДНК, дегенерацией ядер или их конденсацией, потерей целостности мембраны, и фагоцитозом Типичные биологические опыты для оценки клеточной активности описаны в Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885.

Например, для определения цитотоксичности конъюгатов антител с лекарственным средством in vitro клетки MDAMB435/5T4 (клетки рака молочной железы человека, сверхэкспрессирующие человеческий 5Т4 антиген) и MDAMB435/neo клетки (контрольные клетки) культивируют в присутствии конъюгатов антител с лекарственным средством или свободного калихеамицина, практически, как описано в Boghaert et al. (2004), Clin. Cancer Res., 10:4538-4549. Цитотоксичность каждого агента приводят в ED50 (нг/мл), что представляет собой количество калихеамицина, взятого в виде конъюгата или в виде свободного лекарственного средства, которое вызывает 50% подавление культуры клеток по сравнению с необработанным контрольным образцом. Количество клеток в культуре определяют посредством витального окрашивания, проводимого после обработки лекарственным средством. См. также Пример 6.

Цитотоксичность конъюгатов антител с калихеамицином также можно оценивать посредством применения MDAMB435/5T4 и MDAMB435/neo клеток, культивированных способом, который пригоден для образования сфероидов. Клетки культивируют в присутствии конъюгатов антител с калихеамицином или свободного калихеамицина, и вслед за экспозицией лекарственного средства определяют размеры каждого сфероида. Эффективность каждого агента в подавлении сфероидного роста приводят как ED50 (нг/мл), т.е. количества калихеамицина, взятого в виде конъюгата или в виде свободного лекарственного средства, которое вызывает 50% подавление роста сфероидов по сравнению с необработанным контрольным образцом. См. Пример 6.

Для оценки цитотоксичности конъюгатов антител против 5Т4 с калихеамицином in vivo готовят опухоли у "голых" мышей (бестимусная мышь с мутацией nude) посредством подкожного введения клеток MDAMB435/5T4 (сверхэкспрессирующие человеческий антиген 5Т4 клетки рака молочной железы человека), NCI-H157 (клетки немелкоклеточного рака легкого человека), РС14РЕ6 клеток (клетка немелкоклеточного рака легкого человека), или N87 (клетки рака желудка человека). Конъюгаты антител с калихеамицином и контрольные соединения водят имеющим опухолевые клетки мышам, например, внутрибрюшинным введением через 4-х дневной интервал общим количеством в 3 дозы, например, на 1, 5 и 9 сутки. Измеряемые терапевтические отклики включают ингибирование роста клеток опухоли.

Для дальнейшей оценки нацеливающей возможности конъюгатов антител против 5Т4 с калихеамицином можно применить ортоопическую модель для немелкоклеточного и мелкоклеточного рака, по существу как описано Onn et al. (2003) Clin. Cancer Res. 9(15):5532-5539. В кратком изложении, клетки аденокарциномы легкого человека (РС14РЕ6) вводят в хвостовые сосуды «голых» мышей, которые затем мигрируют с образованием опухолей в легком. Опухоли могут возникнуть в виде твердых узелков в паренхиме легкого и вызвать геморрагические плевральные выпоты, содержащие взвешенные опухолевые клетки. Контрольные соединения и конъюгаты антител с калихеамицином вводят мышам, имеющим опухоли, например, внутрибрюшинно, начиная с 6 дня после инъекции опухолевых клеток общим числом 3 дозы, вводимых с 4-х дневным промежутком, например, на 6, 10 и 14 сутки. Измеряемые терапевтические отклики включают уменьшенные плевральные выпоты и повышенную выживаемость.

V. Применение антител против 5Т4 и конъюгатов антитела с лекарственным средством

Антитела против 5Т4 и конъюгаты антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению можно применять как in vitro так и in vivo в приложениях, относящихся к 5Т4-экспрессирующим клеткам Виды раков, экспрессирующих 5Т4, включают сквамозную/аденоматозную легочную карциному (немелкоклеточную легочную карциному), инвазивный рак груди, колоректальную карциному, рак желудка, сквамозный рак шейки матки, инвазивную аденокарциному эндометрия, инвазивный рак поджелудочной железы, рак яичника, сквамозный рак мочевого пузыря и хориокарциному. 5Т4 обнаружен в высоких уровнях при карциномах бронхов, груди, толстой кишки, прямой кишки, желудка, шейки матки, эндометрия, поджелудочной железы, яичника, хориума и семенных пузырьков.

V.A. Приложения in vitro

В настоящем изобретении предложены технологии, in vitro применения антитела против 5Т4. Например, предлагаемые антитела можно применять или самостоятельно или в сочетании с цитотоксическими средствами или другими лекарственными средствами для специфичного связывания 5Т4-позитивных раковых клеток для выделения подобных клеток из совокупности клеток Также предложены способы индукции апоптоза и/или ингибирования пролиферации клеток через контактирование 5Т4-экспресирующих клеток с конъюгатами антитела с лекарственным средством, содержащих антитело против 5Т4, конъюгированное с цитотоксином. Типичные способы in vitro приведены в этом документе выше под заглавием «Функциональные анализы для получения характеристик антител против 5Т4 и конъюгатов антител с лекарственным средством».

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению также можно применять для определения 5Т4-позитивных клеток in vitro, которое основано на их способности специфически связывать 5Т4 антиген. Способ для определения 5Т4-экспрессирующих клеток может включать: (а) приготовление биологического образца, содержащего клетки; (б) приведения в контакт антитела против 5Т4 с биологическим образцом in vitro; и (в) определение связывания антитела против 5Т4. Для облегчения обнаружения антитело может быть конъюгировано с меткой.

V.B. Обнаружение и диагностика In Vivo

Антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению можно использовать в способах обнаружения in vivo, например, для диагностики, для обеспечения интраоперационной поддержки, или для определения доз. После введения меченного антитела против 5Т4 субъекту, через промежуток времени, достаточный для связывания, можно наблюдать биораспределение связанных антителом 5Т4-экспрессирующих клеток. Предложенные диагностические способы можно применять в сочетании со способами лечения. Дополнительно, антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению можно применять с двойными целями: диагностики и терапии.

Типичные неинвазивные способы обнаружения включают сцинтиграфию (например, SPECT (компьютерная томография эмиссии одиночного протона), PET (позитронная эмиссионная томография), гамма-камера томографию, и прямолинейное сканирование), магнитно-резонансную томографию (например, традиционную магнитно-резонансную томографию, томографию с переносом намагниченности, спектроскопию протонного магнитного резонанса, диффузионно-взвешенную томографию и функциональную магнитно-резонансную хроматографию, и ультразвуковое исследование.

V.C. Терапевтическое применение

Далее в настоящем изобретении предлагаются способы и композиции, пригодные для индукции цитолиза 5Т4-экспрессирующих раковых клеток у субъекта. Конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению пригодны для подавления роста раковых клеток и клеток, не связанных с новообразованиями пролиферативных нарушений, например, гиперплазии, метаплазии или, в частности, дисплазии (обзор по таким аномальным состояниям роста См. DeVita, Jr. et a. (2001), Cancer: Principles and Practice, 6^th edition, Lippincott Williams & Wilkins.

Виды рака, чувствительные к таргетной терапии конъюгатами антител с лекарственным средством, включают 5Т4-экспрессирующие первичные и метастазированные опухоли груди, толстой кишки, прямой кишки, легкого, ротовой части глотки (мезофаринкс), подглоточника (гипофаринкс), пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, желчного пузыря, желчных протоков, тонкой кишки, мочевых путей, включая почку, мочевого пузыря, уретры, женских половых путей, шейки матки, яичников, мужских половых путей, простаты, семенных пузырьков, яичек, эндокриновых желез, щитовидной железы, надпочечника, гипофиза, кожи, кости, мягких тканей, мозга, кровеносных сосудов, нервов, глаз, оболочек мозга. Другие релевантные виды рака представляют собой 5Т4-экспрессирующие лейкемии и лимфомы (например, лимфома Ходжикина (Hodgkin) и отличная от лимфомы Ходжикина лимфома), включающие вялотекущую, агрессивную, низкозлокачественную, злокачественную промежуточной степени, высокозлокачественную лейкемию или лимфому.

В частности, известно, что 5Т4 экспрессируется клетками сквамозной/аденоматозной легочной карциномы (немелкоклеточный рак легкого), инвазивным раком груди, колоректальной карциномой, раком желудка, сквамозной карциномы шейки матки, инвазивной аденокарциномы эндометрия, инвазивной карциномы поджелудочной железы, рака яичника, сквамозной карциномы мочевого пузыря, и хориокарциномы. 5Т4 обнаруживается в высоких количествах при раке бронхов, груди, толстой кишки, прямой кишки, желудка, шейки матки, эндометрия, поджелудочной железы, яичника, хориума и семенных пузырьков. Распределение на поверхности клетки антигена 5Т4 может быть гомогенным или гетерогенным. При колоректальной карциноме, раке желудка, и раке яичника экспрессия 5Т4 находится в прямой зависимости с развитием заболевания. При раке груди наблюдается повышенная интенсивность 5Т4 прокрашивания на метастатических узелках, несмотря на это, экспрессия 5Т4 не находится в зависимости со стадией заболевания. Карциномы также могут экспрессировать углеводный антиген Льюиса Y, включая карциномы груди, толстой кишки, желудка, пищевода, поджелудочной железы, легкого, мочевого пузыря и почки, и гастральные и незидобластомные нейроэндокринные опухоли. См. Патент США №6,310,185.

Таким образом, пациентов, подлежащих лечению конъюгатами антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению, можно определять, основываясь на экспрессии биомаркера, включающего, но не ограниченного повышенной экспрессией 5Т4 антигена, что приводит к отбору группы пациентов на основании увеличенной экспрессии мишени, а не на основании локализации или гистологии опухоли. Экспрессию мишени можно измерять как функцию числа окрашенных клеток в сочетании с интенсивностью окрашивания клеток. Например, классифифкация по высокой экспрессии 5Т4 включает тех пациентов, которые имеют более 30% (т.е. 40%, 50% или 60%) клеток, определяемых как позитивные к иммуногистохимическому прокрашиванию на 5Т4 со значением 3+ (по шкале от 1 до 4), в то время, как умеренная экспрессия 5Т4 может включать тех пациентов, которые имеют окрашивание более 20% клеток со значением от 1+ до 2+.

Для отбора пациентов также допустимо применять отличные от экспрессии 5Т4 антигена биомаркеры, включающие определение параметров опухоли на основе, например, множественной лекарственной устойчивости. Около 50% раковых заболеваний у человека или целиком устойчивы к химиотерапии или чувствительны только кратковременно, после чего на них более не действуют обычно используемые противораковые препараты. Это явление называют MDR (множественная лекарственная устойчивость) и его исходно наблюдают у некоторых типов опухолей, хотя другие опухоли приобретают множественную лекарственную устойчивость после применения химиотерапевтического лечения. P-глюкопротеин, насос для откачки лекарственного средства, опосредует большинство видов множественной лекарственной устойчивостей, связанных с цитотоксическими химиотерапиями. С целью установления соответствия конкретного (конкретных) механизма (механизмов) множественной лекарственной устойчивости для конкретных типов опухолей можно проводить фенотипический и функциональный анализ механизмов множественной лекарственной устойчивости, существующей в образцах опухолей больных раком пациентов.

Термины «рост/развитие рака» или «патологическая пролиферация» относятся к любому из значений показателей, которые предполагают изменение в клетках в сторону более развитой формы рака или стадии заболевания. Ингибирование роста раковых клеток или клеток, не относящегося к новообразованиям пролиферативного нарушения, можно исследовать известными в данной области техники способами, например, задержка роста опухоли или ингибирование метастазов. Другие показатели для измерения подавления роста раковых клеток включают: уменьшение выживаемости раковых клеток, уменьшение размера опухоли или морфологии (например, определенных посредством компьютерной томографии, сонографии или других способов томографии), разрушение сосудистой сети опухоли, улучшение показателей в тесте отложенной гиперчувствительности кожи, увеличение активности цитолитических Т-лимфоцитов и уменьшение уровней опухоль-специфичных антигенов.

Не ограничиваясь любым отдельным способом лечения, как антиген-направляемая таргетная терапия, так и пассивная таргетная терапия конъюгатами антител против 5Т4 с лекарственным средством могут вносить вклад в противоопухолевую эффективность. Антиген-направленная таргетная терапия относится к предпочтительному перемещению и/или накоплению пептида или пептидного аналога в тканях-мишенях (т.е. тканях, содержащих 5Т4-экспрессирующие клетки и предполагаемый сайт для накопления конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством) по сравнению с контрольной тканью (т.е. тканью, которую полагают по существу не содержащей 5Т4-экспрессирующие клетки и не имеющей связывания и/или накопления применяемого конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством). Предпочтительная локализация конъюгата антитела с лекарственным средством в общем случае такова, что количество указанного конъюгата антитела с лекарственным средством в ткани-мишени в 2 раза выше, чем количество конъюгата антитела с лекарственном средством в контрольной ткани, например, в 5 и более раз выше, или в 10 и более раз выше.

Пассивная таргетная терапия обычно относится к связыванию антител или конъюгатов антитела с лекарственным средством в локализации опухоли, происходящему за счет местных изменений сосудистой сети. Например, конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством могут покидать сосудистую сеть в месте опухоли, которая фенестрирована вследствие увеличенного образования VEGF, связываться с 5Т4-экспрессирующими клетками и запускать механизм интернализации конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством. Низкое венозное и лимфатическое дренирование опухоли также приводит к секвестрированию несвязанных конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством. Антитела, конъюгированные с лекарственными средствами посредством неустойчивых к кислотам линкеров, могут высвобождать лекарственное средство при своей диффузии в клетки опухоли. Противоопухолевый эффект пассивной таргетной терапии непостоянен или не столь значителен, чем эффект, вызываемый антиген-направленной таргетной терапией, но тем не менее может вносить свой вклад в общую эффективность лечения.

V.D. Рецептуры

Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению легко приготовить и ввести в состав рецептур для надежного и эффективного клинического применения. Пригодные рецептуры для назначения субъекту включают водные и неводные стерильные растворы для инъекции, которые могут содержать анти-оксиданты, буферы, бактериостаты, противобактериальные и противогрибковые средства (например, парабены, хлорбутиловый спирт, фенол, аскорбиновую кислоту, и тимеросал), растворенные вещества, приводящие к изотоничности рецептуры по отношению к жидкостям тела реципиента (например, сахара, соли и многоатомные спирты), суспендирующие агенты и загустители. Пригодные растворители включают воду, этанол, многоатомные спирты (например, глицерин, пропиленгликоль, и жидкий полиэтиленгликоль) и их смеси. Препараты могут быть представлены в виде упаковок, содержащих лекарственное средство в дозах для однократного приема или нескольких приемов, например, запаянных ампул и флаконов, и могут храниться в замороженном или высушенном замораживанием (лиофилизированном) состоянии, которое требует только добавления стерильного жидкого носителя непосредственно перед применением пациентом или для последующей радиоизотопного мечения изотопом, который соответствует планируемому применению. Антитела против 5Т4 и конъюгаты антитела с лекарственным средством согласно настоящему изобретению предпочтительно готовят в виде эффективных доз, описанных ниже.

В качестве одного из примеров, типичная рецептура антитела против 5Т4 или конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством включает состав на несколько приемов лекарственного средства, который содержит 40 мг/мл антитела или конъюгата антитела с лекарственным средством, 25 мМ ацетата, 150 мМ трегалозы, 0.9% бензилового спирта, 0.02% полисорбата 20 при рН 5.0, и который имеет минимальный срок хранения 2 года при 2-8°C. В качестве другого примера, рецептура антитела против 5Т4 или конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством может состоять из 10 мг/мл антитела или конъюгата антитело с лекарственным средством в 9 0 мг/мл хлориде натрия, 7.35 мг/мл натрия цитрата дигидрата, 0.7 мг/мл полисорбата 80 и стерильной воды, рН 6.5. Типичные рецептуры конъюгата антитела против 5Т4 с калихеамицином для применения на экспериментальных мышиных моделях содержат 2 или 4 микрограмма калихеамицина (См. Примеры 3, 4 и 7), которые допустимо соответственно увеличить для применения на людях.

Стабильная лиофилизированная рецептура антитела против 5Т4 или конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством может быть приготовлена путем (а) растворения конъюгата антитела с лекарственным средством до конечной концентрации от 0.5 до 2 мг/мл в растворе, содержащем криопротектор в концентрации 1,5%-5% по весу, полимерный наполнитель в концентрации 0.5%-1.5% по весу, электролиты с концентрацией 0.01 М до 0.1 М, облегчающий растворимость агент в концентрации от 0.005% до 0.05% по весу, буферный агент в концентрации 5-50 мМ, таким образом, чтобы значение рН конечного раствора было 7.8-8.2, и воды; (б) перемещения полученного выше раствора во флаконы при температуре от +5°C до +10°C; (в) замораживания раствора при температуре холодильника от -35°C до -50°C; (г) первоначального замораживания-высушивания замороженного раствора при первоначальном давлении сушки от 20 до 80 микрон при температуре полки от -10°C до -40°C в течение от 24 до 78 часов; и (е) вторичного высушивания продукта стадии (г) при давлении сушки от 20 до 80 микронов при температуре полки от +10°C до +35°C в течение от 15 до 30 часов.

Типичные криопротекторы, пригодные для применения при лиофилизации, включают альдитиол, маннитол, сорбитол, инозитол, полиэтиленгликоль, альдоновую кислоту, мочевую кислоту, альдаровую кислоту, альдозы, кетозы, аминосахара, альдитолы, инозитолы, глицериновые альдегиды, арабинозу, ликсозу, пентозу, рибозу, ксилозу, галактозу, глюкозу, гексозу, идозу, маннозу, талозу, гептозу, глюкозу, фруктозу, глуконовую кислоту, сорбитол, лактозу, маннитол, метил α-глюкопиранозу, мальтозу, изо-аскорбиновую кислоту, аскорбиновую кислоту, лактон, сорбозу, глукаровую кислоту, эритрозу, треозу, арабинозу, аллозу, альтрорзу, гулозу, идозу, талозу, эритрулозу, рибозу, ксилулозу, псикозу, тагатозу, глюконуровую кислоту, глуконовую кислоту, глукаровую кислоту, галактуроновую кислоту, маннуроновую кислоту, глукозамин, галактозамин, сукрозу, трехалозу, нейрамовую кислоту, полимеры арабинозы, полимеры фруктозы, фуканы, галактаны, галактураны, глюканы, маннаны, ксиланы, леваны, фукоиданы, каррагенин, галактакаролозу, пектины, пектиновые кислоты, амилозу, пуллулан, гликоген, амилопектин, целлюлозу, декстран, пустулан, хитин, арагозу, кератин, хондроитин, дерматан, гуалуроновую кислоту, альгиновую кислоту, ксантановую смолу, крахмал, сахарозу, глюкозу, лактозу, трегалозу, этиленгликоль, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, глицерин и пентаэритритол.

Например, сахарозу можно применять в качестве криопротектора в концентрациях 1,5% по весу, полимерный наполнитель Декстран 40 или гидроксиэтилированный крахмал 40 можно использовать в концентрации 0,9% по весу, причем электролит, который используют в растворе для лиофилизации представляет собой хлорид натрия, который присутствует в концентрациях 0.05 М, и буферный агент - трометамин можно применять в концентрации 0.02 М. Способствующий растворению агент (например, такое поверхностно активное вещество, как Полисорбат 80) также можно использовать во время процесса лиофилизации. Обычно указанный способствующий растворению агент представляет собой поверхностно активное вещество. Типичные стадии приготовления лиофилизированной рецептуры включают замораживание флаконов при температуре -45°C; замороженный раствор подвергают начальной стадии сушки на холоде при первичном давлении сушки 60 микрон и при температуре полки -30°C в течение 60 часов; затем подвергают высушенный на холоде продукт вторичной стадии сушки при давлении сушки 60 микрон при температуре +25°C в течение 24 часов.

Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител с лекарственным средством готовят в фармацевтически приемлемом носителе, например, используя медленно метаболизирующиеся макромолекулы, такие как белки, полипептиды, липосомы, полисахариды, полимерные молочные кислоты, полимерные аминокислоты, кополимеры аминокислот и инактивированные вирусные частицы. Также можно применять фармацевтически приемлемые соли, например, соли минеральных кислот, такие как гидрохлориды, гидробромиды, карбонаты, фосфаты и сульфаты, или соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, малонаты и бензоаты. Рецептуры могут дополнительно содержать такие жидкости, как воду, солевые растворы, глицерин и этиловый спирт, и/или в такой композиции могут присутствовать вспомогательные вещества, такие как смачивающие или эмульгирующие агенты или стабилизирующие рН буферные вещества. Эти носители позволяют готовить композиции в виде таблеток, пилюль, драже, капсул, жидкостей, гелей, сиропов, суспензий и взвесей для орального приема.

V.E. Дозы и введение

Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению можно принимать парентерально, например, интраваскулярно. подкожно, внутрибрюшинно или внутримускульно. Для доставки композиций в пульмональные пути, композиции можно вводить в виде аэрозоля или крупных брызг, т.е. трансназально. Введение интратекально, интрамедуллярно или интравентикулярно можно применять при лечении раков ЦНС или ЦНС-связанных раков. Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством также можно назначать трансдермально, транскожно, локально, энтерально, интравагинально, сублингвально или ректально. Внутривенное введение возможно регулярно использовать в клинике. Способ введения выбирают на основании таких соображений, как условия и место лечения, типа рецептуры антител и терапевтической эффективности композиции.

Настоящее изобретение предусматривает, что субъекту вводят эффективное количество антитела против 5Т4 и конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством, т.е. количество антитела против 5Т4 и конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством достаточно для индукции желаемого биологического ответа. Например, при введении раковому больному, эффективное количество включает в себя количество, достаточное для достижения противораковой активности, включая цитолиз раковых клеток, подавление пролиферации раковых клеток, апоптоз раковых клеток, снижение количества антигенов раковой клетки, замедление роста опухоли, и/или ингибирование метастазирования. Сокращение размера опухоли вполне приемлемо в качестве клинического признака, заменяющего собой эффективность. Другой вполне приемлемый показатель эффективности представляет собой увеличение свободной выживаемости. Конъюгаты антитела против 5Т4 с калихеамицином в целом демонстрируют, по меньшей мере, 25% повышение ключевых параметров эффективности, например повышение средней выживаемости, увеличение времени развития опухоли и общей степени ответной реакции.

В общем случае, эффективная доза находится в пределах от 0.01 мг/м² до 50 мг/м², например, от 0.1 мг/м² до 20 мг/м², или до 15 мг/м², каждую дозу рассчитывают на основании количества антитела против 5Т4. Эффективную дозу конъюгата антител против 5Т4 с лекарственным средством также можно рассчитать, основываясь на количестве конъюгированного лекарственного средства. Например, типичные дозы конъюгата антитела против 5Т4 с калихеамицином для введения в экспериментальной модели мыши включают от 2 до 4 микрограмм калихеамицина, и их можно соответственного увеличить для применения на людях. Например, конъюгаты антитела против 5Т4 с калихеамицином согласно настоящему изобретению можно вводить пациентам раз в 3 недели до 6 циклов. Для меченных радиоактивными изотопами антител против 5Т4 эффективная доза обычно находится в пределах от 1 мКи до 300 мКи, как правило, от 5 мКи до 100 мКи, в зависимости от радиоизотопа и связывающей активности антитела.

Для обнаружения 5Т4-положительных клеток при применении раскрытых антител против 5Т4, детектируемое количество композиции согласно настоящему изобретению вводят субъекту, т.е. доза антитела против 5Т4, достаточна, чтобы присутствие антитела можно было определить in vitro или in vivo. Для сцинтиграфии, использующей радиоизотопы, типичные дозы радиоизотопа могут включать активности от 10 µКи до 50 мКи, или от 100 µКи до 25 мКи, или от 500 µКи до 20 мКи, или от 1 µКи до 10 мКи, или 10 мКи.

Фактические уровни дозы активных ингредиентов в композиции согласно настоящему изобретению можно варьировать так, чтобы ввести то количество композиции, которое эффективно для достижения желаемого диагностического или терапевтического ответа. Режимы приема также можно варьировать. Допустимо применять одиночные или многократные инъекции. Выбранные уровень дозирования и режим будут зависеть от ряда факторов, включая активность и стабильность (т.е. период полураспада) терапевтической композиции, рецептуру, путь введения, сочетание с другими лекарственными средствами и назначениями, заболевания или нарушения которое требуется обнаружить и/или лечить, и физического состояния и предшествующей истории болезни подвергаемого лечению субъекта.

Для антител против 5Т4 или конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению терапевтически эффективная доза может быть установлена предварительно либо при исследовании на культуре клеток, либо на животных моделях, например, грызунах, кроликах, свиньях, и/или приматах. Животную модель также можно использовать для определения приемлемых уровней концентрации и способов введения. Такая информация далее может быть использована для определения действенных доз и путей введения у людей. Обычно вводят минимальную дозу, и увеличивают дозу при отсутствии ограничивающей дозу цитотоксичности. Определение и коррекция эффективного количества или дозы, как и оценка, где и как сделать подобные корректировки, известны обычным специалистам в области медицины.

Для комбинированной терапии антитела против 5Т4, конъюгаты антител против-5Т4 с лекарственным средством и/или дополнительные терапевтические или диагностические агенты вводят в течение некоторого промежутка времени, подходящего для проведения назначенной терапии или диагностики. Так, отдельные агенты можно вводить практически одновременно (т.е. в виде единой рецептуры или в пределах минут или часов) или последовательно в любом порядке. Например, лечение отдельными агентами можно проводить предела 1 года друг от друга, например, в пределах 10, 8, 6, 4, или 2 месяца или в пределах 4, 3, 2 или 1 недели (недель), или в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 день (дней).

Для дополнительного руководства относительно составления рецептур, доз, режимов введения и измеряемых терапевтических откликов - см. Berkow et al. (2000) The Merck Manual of Medical Information, Merck & Co, Inc., Whitehouse Station, New Jersey; Ebadi (1998) CRC Desk Reference of Clinical Pharmacology, CRC Press, Boca Raton, Florida; Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania; Katzung (2001) Basic & Clinical Pharmacology, Lange Medical Books / McGraw-Hill Medical Pub. Div., New York; Hardman et al. (2001) Goodman & Gilman's the Pharmacological Basis of Therapeutics, The McGraw-Hill Companies, Columbus, Ohio; Speight & Holford (1997) Avery's Drug Treatment: A Guide to the Properties, Choices, Therapeutic Use and Economic Value of Drugs in Disease Management, Lippincott, Williams, & Wilkins, Philadelphia, Pennsylvania.

V.F. Комбинированная терапия

Предложенные антитела против 5Т4 согласно настоящему изобретению и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством можно применять в качестве первичного лечения, или для лечения состояний, которые невосприимчивы к традиционным способам лечения. Дополнительно, антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством можно применять в сочетании с другими видами терапии (например, хирургическим иссечением, радиотерапией, дополнительными противораковыми агентами и т.д.), тем самым вызывая дополнительное или усиленное терапевтическое действие и/или уменьшая гепатотоксичность некоторых противораковых средств. Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению можно вводить совместно или приготовить совместно в смеси с дополнительными агентами, или формулировать для последовательного введения с дополнительными агентами в любом порядке.

Типичные агенты, пригодные комбинированной терапии включают любые из лекарственных средств, приведенных в данном документе выше в качестве пригодных для приготовления конъюгатов антител против 5Т4 с лекарственным средством. Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством согласно настоящему изобретению можно также использовать в сочетании с другими терапевтическими антителами и конъюгатами антител с лекарственным средством, включая антитела против 5Т4, отличные от раскрытых в данной заявке антител против 5Т4, а также антитела и конъюгаты направляемые другим антигеном. Типичные антитела, которые можно применять отдельно или в виде конъюгата антител а с лекарственным средством, включают антитела против CD19, антитела против CD20 (например, RITUXAN®, ZEVALIN®, BEXXAR®), антитела против CD22. антитела против CD33 (например, MYLOTARG®), конъюгаты антитело против CD33 с лекарственным средством, антитела против антигена Льюис Y (например, Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), антитела против HER-2 (например, HERCEPTIN® (трастузумаб), MDX-210, OMNITARG® (пертузумаб, rhuMAb 2C4)), антитела против CD52 (например, САМРАТН®), антитела против EGFR (например, ERBITUX® (цетуксимаб), ABX-EGF (панитумумаб)), антитела против VEGF (например, AVASTIN® (бевацизумат)), антитела против комплекса ДНК/гистон (например, ch-TNT-1/b), антитела против СЕА (например, CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, антитела против CD47 (например, 6Н9), антитела против VEGFR2 (рецептор, содержащий домен встраивания киназы KDR) (например, 1МС-1С11), антитела против Ер-САМ (например, ING-1), антитела против FAP (например, сибротузумаб), антитела против DR4 (например, TRAIL-R), антитела против рецептора прогестерона (например, 2С5), антитела против СА19.9 (например, GIVAREX®) и антифибриновые антитела (например, МН-1).

Конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством можно также вводить как часть схемы лечения совместно с сочетанием одного иили более цитотоксического агента. Пригодные цитотоксические препараты для этих целей включают СНОРР (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон и прокарбазин); CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин и преднизон); СОР (циклофосфамид, винкристин и преднизон); САР-ВОР (циклофосфамид, доксорубицин, прокарбазин, блеомицин, винкристин и преднизон); m-BACOD (метотрексат, блеомицин, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и леуковорин); ProMACE-МОРР (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, леуковорин, мехлоэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин); РгоМАСЕ-CytaBOM (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, леуковорин, цитарабин, блеомицин и винкристин); МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и леуковорин); МОРР (мехлоэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин); ABVD (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин); МОРР (мехлоэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин) чердующийся с ABV (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин); МОРР (мехлоэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин) чередующийся с ABVD (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин); ChlVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин, преднизон); IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат, этопозид); MIME (метил-гаг, ифосфамид, метотрексат, этопозид); DHAP (дексаметазон, высокие дозы цитарибина и цисплатина); ESHAP (этопозид, метилпредизолон, высокие дозы цитарабина, и цисплатин); СЕРР(В) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин), CAMP (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон); и CVP-1 (циклофосфамид, винкристин и преднизон); DHAP (цисплатин, высокие дозыв цитарабина и дексаметазон); CAP (циклофосфамид, доксорубицин, цисплатин); PV (цисплатин, винбластин или виндезин); СЕ (карбоплатин, этопозид); ЕР (этопозид, цисплатин); MVP (митомицин, винбластин или виндезин, цисплатин); PFL (цисплатин, 5-фторурацил, леуковорин); IM (ифосфамид, митомицин); IE (ифосфамид, этопозид); IP (ифосфамид, цисплатин), MIP (митомицин, ифосфамид, цисплатин); ICE (ифосфамид, карбоплатин, этопозод); PIE (цисплатин, ифосфамид, этопозид); Виорельбин и цисплатин; Карбоплатин и паклитахель; CAV (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин); САЕ (циклофосфамид, доксорубицин, этопозид); CAVE (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, этопозид); ЕР (этопозид; цисплатин); и CMCcV (циклофосфамид, метотрексат, ломустин, винкристин).

Антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с калихеамицином можно применять в сочетании с системными противораковыми лекарственными препаратами, например эпитилонезом (BMS-247550, Еро-906), переформулирования таксанов (Абраксан, Ксиотакс), ингибиторы микротубилина (MST-997, TTI-237), или с таргетированными цитотксинами, например, CMD-193 и SGN-15. Дополнительные пригодные противораковые агенты включают TAXOTERE®, TARCEVA®, GEMZAR® (гемцитабин), 5-FU, AVASTIN®, ERBITUX®, TROVAX®, анатумомаб мафенатокс, летразол, доцетаксель, и антрациклины.

В способах комбинированной терапии антитела против 5Т4 и конъюгаты антител против 5Т4 с лекарственным средством и/или один или более дополнительных терапевтических или диагностических агентов вводят в течение некоторого промежутка времени, пригодного для проведения назначенной терапии или диагностики. Таким образом, индивидуальные агенты можно вводить практически одновременно (т.е. в виде единой рецептуры или в пределах минут или часов) или последовательно в любом порядке. Например, лечение индивидуальными агентами можно проводить в пределах 1 года по отношению друг к другу, например, в пределах 10, 8, 6, 4, или 2 месяцев или в пределах 4, 3, 2 или 1 недели (недель), или в пределах 5, 4, 3, 2 или 1 день (дней). Введение антитела против 5Т4 или конъюгата антитела против 5Т4 с калихеамицином в сочетании со вторым терапевтическим агентом предпочтительно вызывает больший эффект, чем введение любого из них по отдельности.

ПРИМЕРЫ

Для иллюстрации способов согласно настоящему изобретению были включены нижеследующие примеры. Некоторые аспекты приведенных примеров описываются в показателях технических приемов и технологий, которые, как установлено или предполагается авторами данной работы, хорошо работают при реализации настоящего изобретения. Эти примеры иллюстрируют стандартные лабораторные способы работы авторов. Принимая во внимание настоящее описание и общий уровень специальных знаний, специалисты в данной области техники должны понимать, что следующие примеры представляют собой только образцы, и что можно осуществить многочисленные изменения, модификации и вариации без выхода за рамки настоящего изобретения.

ПРИМЕР 1

Мышиные антитела против 5Т4

Антитела против 5Т4 получали в мышах с применением антигена 5Т4 человека и стандартных способов иммунизации. Линии клеток гибридомы, производящие антитела А1, А2 и A3, были получены гибридизацией индивидуальных В клеток и клетками миеломы.

Вариабельные области тяжелой и легкой цепей антител А1, А2 и A3 против 5Т4 клонировали посредством SMART® системы синтеза кДНК (Клонтех Лабраториз Инк. Маутейн Вью, Калифорния, Clontech Laboratories Inc. of Mountain View, California) с последующей амплификацией ПЦР. кДНК синтезировали из 1 микрограмма тотальной РНК, выделенной из клеток гибридом А1, А2 или A3, посредством олиго(dT) и SMART® IIA олиго (Клонтех Лабораториз Инк.) с обратной транскриптазой POWERSCRIPT™ (Клонтех Лабораториз Инк.). кДНК затем амплифицировали с помощью ПЦР, используя праймер, который гибридизуется с олиго последовательностью SMART® IIA и праймер, специфичный для константной области антител мыши (легкой цепи Каппа мыши, IgG2a мыши для тяжелей цепи А1, IgG2b мыши для тяжелой цепи А2, и IgG1 мыши для тяжелой цепи A3) с полимеразой VENT® (Нью Ингланд Биолабз Инк. Ипсуич, Массачусетс New England Biolabs Inc. of Ipswich, Massachusetts). ПЦР продукты вариабельных областей тяжелой и легкой цепей субклонировали в вектор экспрессии pED6и определяли последовательность нуклеиновой кислоты. Этот способ преимуществен тем, что не требуются никакие предварительные знания последовательности ДНК. Кроме того, при использовании вырожденных ПЦР праймеров не изменяется результирующая последовательность ДНК.

Нуклеотидные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител А1, А2 и A3 соответствуют нуклеотидам 58-414 последовательности SEQ ID №:1, нуклеотидам 55-405 последовательности SEQ ID №:5, и нуклеотидам 58-423 последовательности SEQ ID №:9, соответственно. Аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи антител А1, А2, и A3 соответствуют остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №:2, остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №:6, и остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №:10, соответственно. Нуклеотидные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител А1, А2, and A3 соответствуют нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:3, нуклеотидам 67-390 последовательности SEQ ID №:7, и нуклеотидам 61-381 последовательности SEQ ID №:11, соответственно. Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи антител А1, А2 и A3 соответствуют остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:4; остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №:8 и остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №:12, соответственно. См. также фиг.1А-1С.

Для того чтобы оценить новизну последовательностей вариабельных областей антител А1, А2 и A3 против 5Т4, проводили BLASTp поиск (для запрашиваемых белковых последовательностей) с принятыми по умолчанию параметрами Ожидание = 10, Длина слова = 3, фильтр низкой сложности и матрица BLOSUM62, внесение разрыва (gap existence) E=11, и расширение разрыва (дар extension) W=1. Поиски BLASTn (для запрашиваемых нуклеотидных последовательностей) проводили с принятыми по умолчанию параметрами Ожидание = 10, Длина слова = 11 и фильтр низкой сложности Результаты поиска BLAST представлены в виде списка последовательностей, относящихся к запрашиваемой последовательности упорядоченных по порядку значения E, которое является показателем статистической значимости совпадений, обнаруженных в базе данных. Последовательности, которые наиболее близко родственны последовательностям вариабельной области, использовавшимся для анализов BLAST приведены в Таблице 1 (BLASTn) и Таблице 2 (BLASTp).

Таблица 1 BLASTn анализы Запрашиваемая последовательность Тождественность (%), наиболее близкой последовательности Описание наиболее близкой последовательности A1 VH (SEQ ID №:1) 97% gi|31322165|gb|AY169686.1| клон Mus musculus VGBC1.13 предшественник вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, ген, неполное cds A1 VL (SEQ ID №3) 96% gi|804922|dbj|D50385.1|MUSIKCVRJ mPHK Mus musculus для вариабельной области каппа цепи иммуноглобулина, неполная последовательность, клеточная линия:K3F10 A2 VH (SEQ ID №:5) 97% gi|11612012|gb|AF303853.1|AF303853 клон Mus musculus J558 22 mPHK вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина, неполное cds A2 VL (SEQ ID №:7) 97% gi|1556423|emb|X79906.1|MMMABMST2 Mus musculus mPHK легкой цепи монклонального антитела MST2 A3 VH (SEQ ID №:9) 99% gi|3420272|gb|AF064445.1|AF064445 Mus musculus вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина (Vh10.2) гена, Vh10.2a аллель, неполное cds A3 VL (SEQ ID №:11) 98% gi|2906107|gb|AF045512.1]AF045512 Mus musculus 9E10 вариабельная область легкой цепи каппа моноклонального антитела, (IgK) mRNA, неполное cds

Таблица 2 BLASTp анализы Запрашиваемая последовательность Тождественность (%) наиболее близкой последовательности Описание наиболее близкой последовательности A1 VH (SEQ ID №:2) 84% gi|15865327|emb|CAC82228.1| тяжелая цепь иммуноглобулина [Mus musculus] A1 VL (SEQ ID №:4) 93% gi|644862|gb|AAA62143.1| вариабельная область каппа цепи иммуноглобулина против альфа 4 интегрина A2 VH (SEQ ID №:6) 85% gi|15149453|gb|AAK85298.1| одноцепное антитело HFN7.1 [синтетическая конструкция] A2 VL (SEQ ID №:8) 95% gi|297678|emb|CAA80086.1| вариабельная область иммуноглобулина [Mus musculus domesticus] A3 VH (SEQ ID №:10) 90% gi|2906050|gb|AAC04511.1| тяжелая цепь моноклонального антитела против поли(dC) [Mus musculus] A3 VL (SEQ ID №:12) 97% gi|2906108|gb|AAC04540.1| легкая цепь каппа моноклонального антитела [Mus musculus]

ПРИМЕР 2

Специфичность связывания и сродство мышиных антител против 5Т4

Для проведения оценки связывающей специфичности и сродства антител А1, А2 и A3 проводили анализ BIACORE®, используя антиген 5Т4 человека иммобилизованный на СМ5 чипе. Технология BIACORE® использует изменения в показателе преломления на поверхности слоя при связывании антитела с антигеном 5Т4иммобилизованном в слое. Связывание определяют посредством поверхностного плазменного резонанса луча лазера, отражающегося от поверхности. Исследование кинетики сигнала по скорости заполнения и скорости ухода (on- and off-rates) позволяет провести различие между неспецифичным и специфичным взаимодействиями. Н8 антитело против 5Т4 применяли в качестве стандарта. Н8 представляет собой образуемые гибридомой моноклональные мышиные IgG1 антитела, описанные в РСТ международное издание № WO 98/55607 и в Forsberg et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(19):124430-12436.

Таблица 3 Результаты анализа BIACORE® Антитело KD (M) KA (1/М) kd (1/s) ka (1/Ms) Н8 4.1×10^-10 2.5×10⁹ 5.1×10^-5 1.3×10⁵ А1 6.4×10^-10 1.6×10⁹ 1.3×10^-4 2.0×10⁵ А2 1.5×10-8 6.5×10⁷ 8.7×10^-4 5.6×10⁴ A3 2.2×10^-9 4.6×10⁸ 5.2×10^-5 2.4×10⁴

Полученные BIACORE® данные показывают, что антитела Н8 и А1 имеют более высокое сродство к 5Т4 по сравнению с антителами А2 и A3. А2 является антителом со сравнительно небольшим сродством. Несвойственный цистеин присутствует в положении 67 вариабельной области тяжелой цепи А1 и в остатке 91 вариабельной области тяжелой цепи А1. Замена этих остатков фенилаланином (А1) или тирозином (A3) не влияет на свойства связывания антитела или уровни экспрессии.

Сродство связывания антител Н8, А1, А2 и A3 также оценивали посредством вестерн-блоттинга с использованием клеточных лизатов СТ26/5Т4, что показало сильное связывание с Н8, А1 и A3. См. Фиг.2.

Способность антител Н8, А1, А2 и A3 связывать клетки, экспрессирующие антиген5Т4, оценивали посредством флуоресцентно активированной сортировки клеток (FACS) клеток РС14РЕ6. Антитела показали специфическое связывание с 5Т4-экспрессирующими клетками РС14РЕ6, однако, уровень связывания А2 был значительно ниже, чем уровень, наблюдавшийся для Н8, А1 и A3. См. Таблицу 4.

Таблица 4 Результаты FACS анализа Антитело Среднее значение клеточной флуоресценции Контроль (вторичный Ab) 4 Контроль (мышиный IgG) 4 Н8 24 А1 18 А2 7 A3 27

Для оценки возможной изменчивости при получении антител провели исследование двух независимо приготовленных партий А1 и Н8. При проведении сравнения антител из разных партий свойства связывания и кинетики каждого антитела существенно не отличались. См. фиг.3А-3B.

ПРИМЕР 3

Интернализация мышиных антител против 5Т4 5Т4-экспрессирующими клетками

Для оценки интернализации антител при связывании с 5Т4 антигеном, количество Н8 и А1 антител, найденных на поверхности клетки по сравнению с надосадочной жидкостью, измеряли как функцию от времени. Неэнзиматически диссоциированные MDAMB435/5T4 клетки (клетки рака груди человека) подвергали воздействию антител против 5Т4 в течение 1 часа при 4°С. Клетки промывали и термостатировали в среде при 37°С от 4 часов до 24 часов. Определяли количество связанного с клеточными мембранами антитела по отношению к несвязанному антителу (т.е. наличию в надосадочной жидкости) способом FACS. Исчезновение 5Т4 антител с поверхности MDAMB435/5T4 клеток показывает модуляцию комплекса 5Т4-антиген/антитело на поверхности клетки, что возможно означает интернализацию и/или диссоциацию. См. Фиг.4А-4С.

ПРИМЕР 4

Картирование эпитопов с помощью химерных белков 5Т4

Для идентифицирования эпитопов, к которыми связывается каждое из антител А1, А2, A3 и Н8, проводили ELISA (иммуноферментный твердофазный анализ), используя (1) конструкты эктодомен 5Т4 - Fc с удаленными или мутированными последовательностями, и (2) химерные конструкты 5Т4 кратковременно экспрессируемые в COS-1 клетках. Эктодомен содержит амино-концевой сегмент, два богатых лейцином повтора, и переходный гидрофильный сегмент. Химерные белки, содержащие эктодомен 5Т4 и константные области Fc из IgG1 человека, готовили, применяя 5Т4 мыши (аминокислоты 1-136), 5Т4 крысы (аминокислоты 1-361), 5Т4 яванского макака (cynomolgus monkey) (аминокислоты 1-355), 5Т4 шимпанзе (аминокислоты 1-355), и 5Т4 чернохвостой мартышки (аминокислоты 1-355). Гибридные конструкты 5Т4 изображены на Фиг.5. Результаты связывания суммированы в Таблице 5, результаты показывают специфичное связывание, частичное связывание или отсутствие связывания каждого из антител Н8, А1, А2 и A3. Гуманизированное антитело Н8 и химерные антитела А1, А2 и A3 показали связывающие свойства сходные с Н8, А1, А2 и A3 мыши соответственно.

Основываясь на этих результатах, установили, что гуманизированные антитело Н8 связывается 5Т4 человека между остатками 173 и 252. Гуманизированное Н8 связывается с 5Т4 в присутствие или в отсутствие N-связанного гликозилирования по остатку 344, что подтверждает, что связывание гуманизированного Н8 с 5Т4 человека не является мембрано проксимальным. Антитело А1 имеет первую область контакта с 5Т4 человека между остатками 173 и 252 и второй контакт с 5Т4 человека между остатками 282 и 361. Антитело А2 связывает 5Т4 человека между остатками 282 и 361. Антитело A3 связывает первый богатый лейцином повтор человеческого 5Т4 между остатками 83 и 163. Эпитопы, которые связывает каждое антитело, изображены на фиг.7.

Таблица 5 Результаты картирования эпитопов при использовании рекомбинантных белков эктодомена 5Т4 с Fc и химер 5Т4 человека/мыши конструкт 5Т4 антигена Антитело Н8 А1 А2 A3 эктодомен 5Т4 человека/Fc + + + + эктодомен 5Т4 мыши/Fc - - - - эктодомен 5Т4 крысы/Fc - +/- - - эктодомен 5Т4 яванского макака/Fc - + + + эктодомен 5Т4 шимпанзе \Fc + + + + эктодомен 5Т4 чернохвостой мартышки/Fc +/- + + - человек/мышь 83-163 + + + - человек/мышь 173-361 - - - + человек/мышь 173-258 - +/- + +

человек/мышь 282-361 (с или без N-связи в положении 344) + +/- - + (+) связывание; (-) отсутствие связывания; (+/-) частичное связывание

На основании различного связывания, наблюдаемого для эктодоменов 5Т4 человека и яванского макака, провели направленный мутагенез для выявления остатков, которые участвуют в связывании антителоа. Связывание гуманизированного антитела Н8 определяли с каждым из мутированных эктодоменов 5Т4, приведенных в Таблице 6 ниже, т.е. эктодоменами 5Т4 человека, которые включают остатки от яванского макака в отмеченном положении. Эти результаты показывают, что остатки 213 и 214 человеческого антигена 5Т4 являются обязательными для связи эпитопа гуманизированным антителом Н8.

Таблица 6 Результаты картирования эпитопа при использовании гибридного белка эктодомен 5Т4 человека/Fc направленным мутагенезом мутация связывание гуманизированным Н8 E189K + V200K + L204V + R213H +/- R213H and R214L - (+) связывание; (-) отсутствие связывания; (+/-) частичное связывание

В дополнение к прямому определению связывания проводили измерение конкурентного связывания при помощи биотинилированного гуманизированного антитела Н8 и каждого из антител А1, А2 и A3. Ингибирование связывания с человеческим 5Т4 не наблюдали, что подтверждало, что каждое из антител А1, А2 и A3 связывается с эпитопом 5Т4, который отличен от эпитопа, связанного антителом Н8.

ПРИМЕР 6

Картирование эпитопа при помощи BIACORE®

Также было выполнено картирование эпитопа антител Н8, А1, А2 и A3 при помощи BIACORE® при использовании чипа СМ5 со связанным антигеном 5Т4 человека. Чип насыщали антителами Н8, А1, А2 и A3, и измеряли первый отклик. Затем чип насытили вторым антителом из числа антител Н8, А1, А2 и A3, и измеряли второй отклик. Для многократных экспериментов чип регенерировали диссоциацией связанных антител в 10 мМ глицине, рН 1.5, с последующей промывкой буферным раствором. Результаты суммированы в Таблице 7 ниже. Приведенные проценты представляют собой единицы отклика, измеренного при связывании второго антитела непосредственно с СМ5 чипом, отнесенные единицам отклика, измеренного при связывании второго антитела с СМ5 чипом, насыщенным первым антителом. Эти результаты показывают, что каждое из антител Н8, А1, А2 и A3 связывает отличный эпитоп 5Т4 человека.

Эпитопы, связанные с антителами Н8 и A3, стерически близки друг к другу таким образом, что скорость ассоциации с антигеном уменьшается, если связывание Н8 определяют в присутствии A3 и наоборот. Сходные результаты получили при использовании гибридных и гуманизированных антител Н8, А1, А2 и A3, которые были приготовлены как описано в Примере 7 ниже в этом документе. См. Таблицу 8.

Таблица 7 Результаты анализа конкурентного связывания при использовании BIACORE® - процентный отклик второго антитела вслед за насыщением первым антителом Второе антитело Первое антитело Н8 А1 А2 A3 Н8 -------- 114% 102% 85% А1 109% -------- 109% 98% А2 99% 98% -------- 94% A3 73% 104% 106% --------

Таблица 8 Результаты анализа конкурентного связывания при использовании BIACORE® - процентное содержание второго антитела вслед за насыщением первым антителом второе антитело / первые антитело связывание время после введения второго антитела (секунды) 19 37.5 75 150 300 600 гуманизированное Н8 / химерное A3 44.9% 57.0% 69.1% 79.4% 86.6% 91.3% химерное A3 / гуманизированное Н8 46.2% 51.2% 58.4% 67.5% 76.2% 83.6% химерное А2 / химерное А1 102.9% 93.5% 90.1% 89 0% 88 9% 89 1% химерное А1 / химерное А2 92.5% 90.6% 91.4% 92.7% 93.9% 95 5% химерное A3 / 82.1% 82.0% 84.5% 87.8% 90 8% 92.8%

химерное А1             химерное А1 / химерное A3 98.8% 96.5% 97.0% 98.0% 98.8% 99.6% химерное A3 / химерное А2 92.2% 88.6% 89.5% 91.5% 93.4% 94.6% химерное А2 / химерное A3 89.2% 88.4% 89.8% 91.5% 92.9% 94.3% гуманизированное Н8 / химерное А1 93.2% 92.7% 94.2% 95.9% 96.9% 97.3% химерное А1 / гуманизированное Н8 92.7% 92.4% 93.8% 95.8% 97.3% 98.7% гуманизированное Н8 / химерное А2 93.8% 94.0% 96.0% 98.1% 99.8% 101.3% химерное А2 / гуманизированное Н8 86.9% 84.7% 86.9% 90.5% 93.7% 96.7%

Объединенные результаты изучения картирования эпитопа, полученные при использовании гибридных конструктов (см. Пример 4) и BIACORE® представлены в Фиг.7.

ПРИМЕР 6

Эффективность конъюгатов антител против 5Т4 с калихеамицином

Для определения количества выживающих клеток после применения разных лекарств использовали окрашивание витальным красителем (MTS). MTS (нерадиоактивный набор для определения пролиферации клеток) приобрели у Promega (Мэдисон, Висконсин) и использовали в соответствии с техническим описанием производителя. Для каждой клеточной линии строили калибровочную кривую (число клеток в зависимости от оптической плотности через 2 час) для определения подходящей начальной плотности посева. Затем клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью от 750 до 5000 клеток на лунку. Немедленно после засевания клетки обрабатывались разными концентрациями (0, 0.01, 0.05, 0.1, 1, 10, 100 и 500 нг калихеамицин эквивалентами/мл) калихеамицина, СМА-676 и конъюгатами калихеамицина с антителами против 5Т4. Вслед за определением числа клеток, выживших после 96 часов экспозиции лекарственного средства на основании параметров логистической регрессии, полученной из кривых доза-ответ, вычисляли ED₅₀. ED₅₀ определяли как концентрацию лекарственного средства (CalichDMH), которая вызывала 50% уменьшение числа клеток после 96 часов воздействия лекарственного средства. Эквивалент калихеамицина (cal. eq - кал. экв.) представляет собой концентрацию калихеамицина, заданную или в виде чистого соединения, или в виде конъюгата. В зависимости от количества калихеамицина, связывающегося с антителом (нагрузка антитела лекарственным средством), различные эквиваленты калихеамицина могут означать различные концентрации белка.

Результаты MTS анализа приведены в Таблице 9. Конъюгаты антител с калихеамицином приготовленные, с применением антител А1 и A3 против 5Т4, существенным образом понижали жизнеспособность клеток MDAMB435/5T4. Значения селективности рассчитывали путем сравнения специфичной активности конъюгатов с неспецифичной активностью. То есть кратность CalichDMH для 5Т4 экспрессирующих клеток относили к кратностям значений CalichDMH для неэкспрессирующих клеток. Если используют неспецифичное антитело, например, hp67.6 (СМА-676), кратности значений CalichDMH приблизительно одинаковые, что означает, что селективность равна 1.

Таблица 9 Результаты MTS анализов Обработка Клеточная линия MDAMB435/neo ED50 (нг/мл) MDAMB435/5T4 ED50 (нг/мл) CalichDMH 3.3-5.0 5.0-8.0 huHS-ActBut-CalichDMH 0.4-0.8 0.08-0.1 СМА-676 34-60 50-100 A1-ActBut-CalichDMH 22-34 0.4-0.6 A2-ActBut-CalichDMH 60 40 А3-ActBut-CalichDMH 20-20 0.3-20   обработка Клеточная линия MDAMB435/neo кратность CalichDMH MDAMB435/5T4 кратность CalichDMH CalichDMH 1.0-1.0 1.0-1.0 huH8-ActBut-CalichDMH 4.0-12.5 50-100 СМА-676 0.08-0.1 008-0.1 AI-ActBut-CalichDMH 0.14-0.15 13-13 A2-ActBut-CalichDMH 0.06 0.13 А3-ActBut-CalichDMH 0.17-0.25 04-17

Селективность: H8=8; hP67.6=1; A1=93; A3=1.6

CalichDMH, неконъюгированный калихеамицин

huHS-AcBut-CalichDMH, гуманизированное Н8 антитело конъюгированное с калихеамицином посредством 4-(4'-ацетилфенокси)масляной кислоты (AcBut)

СМА-676, конъюгат антитела против CD33 с калихеамицином

A1-AcBut-CalichDMH, A1 антитело, конъюгированное с калихеамицином посредством 4-(4'-ацетилфенокси)масляной кислоты (AcBut)

A2-AcBut-CalichDMH, A2 антитело, конъюгированное с калихеамицином посредством 4-(4'-ацетилфенокси)масляной кислоты (AcBut)

А3-AcBut-CalichDMH, A3 антитело, конъюгированное с калихеамицином посредством 4-(4'-ацетилфенокси)масляной кислоты (AcBut)

Цитотоксичность конъюгатов антител против 5Т4 с калихеамицином также измеряли, используя трехмерную сфероидную культуру клеток, которая более близко апроксимирует клеточное окружение in vivo. Сфероиды были приготовлены по существу согласно способу Yuhas et al. (1977) Cancer Res. 37:3639-3643. В кратком изложении, 10⁵ клеток в 5 мл культурной среды высеивали на 60 мм полистироловые чашки для клеточной культуры, которые предварительно покрывали 5 мл 0.65% агаром. для клеточных тканей в культуральной среде (Сигма Сент-Лоис, Миссури). Чашки термостатировали на 5-6 дней при 37°C и при содержании CO₂ в воздухе 5%. Отбирали сфероиды с диаметром 0.2 мм и помещали в 24-луночный планшет. Каждая лунка содержала 0.5 мл агара подложки, 1 сфероид, и 1 мл верхнего слоя культуры. Сфероиды затем подвергали воздействию различных концентраций (0, 0.091, 0.365, 1.46, 5.86, 23.44, 93.75 и 375 нг калихеамицин экв/мл) калихеамицина, СМА-676 и конъюгатов антитела против 5Т4 с калихеамицином, приготовленных с применением антител A1 и A3 против 5Т4 и AcBut линкера. Оба конъюгата антител против 5Т4 с калихеамицином существенно подавляли рост MDAMB435/5T4 клеток. См. фиг.8.

ПРИМЕР 7

Получение и исследование связывающих свойств гибридных и гуманизированных антител против 5Т4

Гибридные антитела Н8, А1, А2 и A3 получали с применением последовательностей вариабельных областей легкой и тяжелой цепей Н8 мыши и константных областей тяжелой цепи IgG4 человека и константных областей легкой цепи каппа человека. Присутствующий в положении 67 вариабельной области тяжелой цепи антитела А1 цистеин, необязательно заменяли на фенилаланин, а цистеин, присутствующий в положении 91 вариабельной области тяжелой цепи A3, произвольно заменяли на тирозин. Эти варианты соответствуют последовательности SEQ ID №:2 (А1 VH) и последовательности SEQ ID №:10 (A3 VH). Наличие или отсутствие интронных последовательностей и замещение цистеиновых остатков не оказывало влияния на экспрессию антитела. Для клонирования последовательностей, кодирующих константные области IgG, интронные последовательности удаляли.

Гуманизированные антитела Н8 готовили, как описано в Заявке РСТ № WO 2006/031653. Гуманизированные антитела А1 готовили посредством перенесения гипервариабельных участков как это описано ниже в настоящем документе. Гипервариабельные участки мышиных антител А1, А2 и A3 идентифицировали, используя AbM определение, которое основано на вариабельности последовательности, а также на локализации сегментов замкнутой структуры. Вообще, человеческие акцепторные каркасы отбирали на том основании, чтобы они являлись в существенной степени сходными с каркасными областями мышиных антител, или были наиболее сходными с консенсусной последовательностью подсемейства вариабельной области. Также принимали во внимание частоту встречаемости каркасных локусов у человека, с условием, что более широко представленные последовательности были в целом были предпочтительнее, чем менее распространенные последовательности. Для восстановления мышиных остатков, которые, как полагают, вовлечены во взаимодействие антигена и/или остатков, вовлеченных в структурную целостность антиген-связывающего сайта, вводили дополнительные мутации акцепторных последовательностей каркасных областей антител человека. Аминокислотные последовательности также можно оптимизировать с учетом предпочтения кодонов в СНО клетках и для удаления сайтов рестриктаз. Для анализа гуманизированных последовательностей вариабельных областей тяжелых и легких цепей с целью идентификации и избегания сайтов посттрансляционных модификаций белка, вводимых при гуманизации, можно применить программу предсказания структуры белка.

Вариабельные области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 (А1 VH версии 1.0) конструировали таким образом, чтобы включить гипервариабельные участки антитела А1 мыши, которые прививали в каркасную область DP-21 человека (VH7 подгруппа, код доступа №.САА43346, номер последовательности SEQ ID №:88), которая содержит мутацию в каркасе (S82A) и одну обратную мутацию (E46K). Варианты готовили путем удаления обратной мутации (A1VH версий 1.1 и 1.2). Вторую вариабельную область тяжелой цепи гуманизированного А1 готовили прививанием гипервариабельных участков А1 в каркасную область DP-54 зародышевой линии человека (А1 VH версии 2.0). Для получения А1 VH версии 2.1 провели шесть (6) обратных мутаций. Как описано ниже, обе вариабельные области тяжелой цепи А1 сохраняли 5Т4 связывающие свойства. Каркасные области DP-21 и DP-54 показали 63% идентичность аминокислотной последовательности по их длине, это показывает, что можно сделать множественные замены аминокислот с сохранением при этом связывающей специфичности антитела, включающей способность связывания с определенным эпитопом. Сходность вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного А1 показана в Таблице 10. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи гуманизированного А1, соответствуют последовательностям SEQ ID №:48, 50, 53 и 55. Типичные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированных антител соответствуют последовательностям SEQ ID №:49, 51, 52, 54 и 56. См. также Фиг.9А-9В.

Гуманизированные вариабельные области легкой цепи конструировали таким образом, чтобы они включали гипервариабельные участки мышиных А1, привитые на каркасные области DPK24 (VKIV подгруппа), DPK9 (VKI подгруппа) и DPK23 (VKIII подгруппа) зародышевой линии человека. После внедрения S67Y обратной мутации в каркасные участки вариабельной области легкой цепи гуманизированного А, антитела, приготовленные с такими каркасными, областями показали связывание с 5Т4. См. ниже, включая Таблицу 13. Каркасные области DPK24 показывают 74% и 73% идентичность аминокислотной последовательности с DPK9 и DPK23 соответственно. Каркасная область DPK9 показывает 74% идентичность аминокислотной последовательности с DPK23. Сходность вариабельных областей легкой цепи гуманизированных А1 показана в Таблице 10. Многочисленные варианты гуманизированных каркасных участков вариабельных областей легкой цепи показывают, что можно делать множественные замены аминокислот с сохранением при этом связывающей специфичности антитела, включающей способность связываться с определенным эпитопом. Типичные нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные области легкой цепи гуманизированного антитела А1 соответствуют последовательностям SEQ ID №:57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, и 75. Типичные аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи гуманизированного А1 соответствуют SEQ ID: №58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 и 76. См. также Фиг.9C-9F.

Таблица 10 Связанность гуманизированных А1 антител Первая вариабельная область / Вторая вариабельная область Процент идентичности HuA1 VL v1.1 (SEQ ID №.60)/ HuA1 VL v2.4 белок (SEQ ID №:70) 86% HuA1 VL v1.1 (SEQ ID №:60) / HuA1 VL v3.1 белок (SEQ ID №:75) 86% HuA1 VL v2.4 белок (SEQ ID №:70) / HuA1 VL v3.1 белок (SEQ ID №:75) 85% HuA1 VH v1.1 белок (SEQ ID №:52) / HuA1 VH v2.0 белок (SEQ ID №:54) 78%

Гуманизированные А2 и A3 антитела конструировали, с применением сходной стратегии. Типичные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела А2 и вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела А2 соответствуют последовательностям SEQ ID №№77-78 и SEQ ID №№79-80, соответственно. См. также фиг.9G. Типичные аминокислотные последовательности вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированного антитела и вариабельных областей легкой цепи гуманизированного антитела A3 соответствуют SEQ ID №81-82 и SEQ ID №83-84, соответственно. См. также Фиг.9Н.

Для оценки новизны вариабельных областей тяжелой и легкой цепей гуманизированных антител А1, А2 и A3, выполняли BLASTn и BLASTp анализы, как описано в Примере 1. Результаты представлены в Таблице 11.

Таблица 11 BLASTn и BLASTp анализы Запрашиваемая последователь
ность Идентичность (%) наиболее близкой последовательности Описание наиболее близкой последовательности Гуманизирован
ное А1. VL
вариант 1.1 ДНК (SEQ ID №:59) 83%* ОПРЕДЕЛЕНИЕ частичная mPHK вариабельной области каппа цепи иммуноглобулина Homo sapiens (IGKV2 ген). КОД АМ040532 Гуманизирован
ное А1. VL
вариант 1.1 белка (SEQ ID №:60) 82% ОПРЕДЕЛЕНИЕ сегмент В17 предшественника каппа цепи V-IV Ig. КОД Р06314 Гуманизирован
ное А1. VL
вариант 24 ДНК 85%* ОПРЕДЕЛЕНИЕ клон SC4064 mPHK вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина Homo sapiens

(SEQ ID №69)   против вируса бешенства, полные cds. КОД AY942044 Гуманизирован
ное A1. VL
вариант 24 белка
(SEQ ID №:70) 92% ОПРЕДЕЛЕНИЕ вариабельная область каппа цепи гуманизированного иммуноглобулина против интегрина альфа 4 КОД ААА62146 Гуманизирован
ное A1. VL
вариант 3.1 ДНК
(SEQ ID №:75) 84%* ОПРЕДЕЛЕНИЕ клон 136е06 (IGL@) mPHK вариабельной области легкой цепи иммуноглобулина Homo sapiens против токсина столбняка, частичные cds. КОД AY867377 Гуманизирован
ное A1. VL
вариант 3.1 белка
(SEQ ID №:76) 84% ОПРЕДЕЛЕНИЕ scFv антитело против Burkholderia mallei [синтетический конструкт]. КОД АВ197018 Гуманизирован
ное A1. VH
вариант 1.1 ДНК
(SEQ ID №:50) 88%* ОПРЕДЕЛЕНИЕ ID CLL097 mPHK вариабельной области тяжелой цепи IgA Homo sapiens, частиные cds. КОД AF021940 Гуманизирован
ное A1. VH
вариант белка 1.1
(SEQ ID №:51) 90% ОПРЕДЕЛЕНИЕ вариабельная область тяжелой цепи IgA [Homo sapiens] КОД ААС09074 Гуманизирован
ное A1. VH
вариант 20 ДНК
(SEQ ID №:53) 81%* ОПРЕДЕЛЕНИЕ клон 23u-45 mPHK вариабельной области тяжелой цепи иммуноглобулина Homo sapiens (IGH), частичные cds. КОД AF062241 Гуманизирован
ное A1. VH
вариант 2.0 77% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Цепь D, Инсайты в Erbb передачи сигнала из структуры

белка
(SEQ ID №:54)   Erbb2-Pertuzumab комплекса КОД 1S78_D Гуманизирован
ное А2 VL
вариант 1.0 белка
(SEQ ID №:79) 87% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Цепь А, Кристаллическая структура Fab-области человеческого моноклонального Igm агглютинина холода. КОД 1QLR_A Гуманизирован
ное А2. VL
вариант 2.0 белка
(SEQ ID №:80) 83% ОПРЕДЕЛЕНИЕ легкая цепь каппа 1 иммуноглобулина [Homo sapiens] КОД AAD29608 Гуманизирован
ное А2. VH
вариант белка 1.0
(SEQ ID №:77) 88% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Chain A, Кристаллическая структура гуманизированного антитела Fv 528. КОД 1WT5_A Гуманизирован
ное А2. VH
вариант белка 2.0
(SEQ ID №:78) 78% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Цепь D, Инсайты в Erbb передачи сигнала из структуры Erbb2-Pertuzumab комплекса. КОД 1S78_D Гуманизирован
ное A3. VL
вариант 1.0 белка
(SEQ ID №:83) 85% ОПРЕДЕЛЕНИЕ VLJ сегмент легкой цепи каппа иммуноглобулина [Homo sapiens]. КОД ВАС01708 Гуманизирован
ное A3. VL
вариант белка 2.0
(SEQ ID №:84) 90% ОПРЕДЕЛЕНИЕ HerMel [синтетический конструкт]. КОД CAL47329 Гуманизирован
ное A3 VH
вариант белка 1.0
(SEQ ID №:81) 79% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Igh-1a белка [Mus musculus]. КОД ААН80671

Гуманизирован
ное A3. VH
вариант белка 2.0
(SEQ ID №:82) 77% ОПРЕДЕЛЕНИЕ Igh-1a белка [Mus musculus]. КОД AAH80671 * Если покрытие запроса = 100%

На фиг.10А-10В приведены дополнительные последовательности вариабельной области тяжелой цепи, которые можно использовать в качестве каркасов для приготовления гуманизированных антител А1, А2 и A3 против 5Т4. На фиг.11-13 показаны дополнительные последовательности вариабельной области легкой цепи, которые можно использовать в качестве каркаса для получения гуманизированных антител А1, А2 и A3 против 5Т4. На фиг.14 показаны типичные коснтантные области, которые можно использовать для получения гибридных и гуманизированных антител А1, А2 и A3 против 5Т4.

Для оценки связывающей способности и сродства гибридных и гуманизированных антител Н8, А1, А2 и A3, проводили BIACORE® анализ с использованием антигена 5Т4, иммобилизованного на СМ5 чипе. См. Пример 2. Полученные результаты для гибридных антител А1, А2 и A3 приведены в Таблице 12 ниже.

Таблица 12 Данные BIACORE® анализа Антитело KD (M) KA (1/М) kd (1/c) ka (1/Mc) Гуманизированное Н8 1.5×10^-10 6.5×10⁹ 4.0×10^-5 26×10⁵ Химерное А1 4.4×10^-10 2.3×10⁹ 6.7×10^-5 1.5×10⁵ Химерное А2 1.8×10^-9 5.7×10⁸ 2.5×10^-4 1.4×10⁵ Химерное A3 ~1.8×10^-10 ~5.4×10⁹ ~1.0×10^-5 ~5.4×10⁴ Химерное А1 + 3.8×10^-10 2.6×10⁹ 6.3×10^-5 1.7×10⁵

C67F         Химерное A3 + C91Y 5.9×10^-9 1.7×10⁹ 1.6×10^-5 2.7×10⁴

В общем случае, гибридизация/гуманизация увеличивает сродство антител Н8, А1, А2 и A3 к 5Т4 человека. Сравни с Таблицей 3. Увеличение связывающей активности по всей видимости главным образом происходит в результате более медленной диссоциации антитела от антигена по сравнению с более быстрой ассоциацией. Гибридные антитела А2 и A3 показали наиболее хорошие связывающие свойства после получения их химер.

Все вариабельные области тяжелой цепи гуманизированного антитела А1 сохраняют свойства связывания 5Т4. Кроме того, удаление обратной мутации К46 из вариабельных областей тяжелой цепи гуманизированных антител А1 не влияет на параметры их связывания с 5Т4. Гуманизированные вариабельные области легкой цепи гуманизированного А1 проявляют умеренные свойства связывания 5Т4. Гуманизированные вариабельные области легкой цепи антитела А1, полученные при использовании каркасных участков DPK9 и DPK23, связывают 5Т4 с большим сродством, чем вариабельные области легкой цепи гуманизированного А1, полученные при использовании каркаса DPK24. Для восстановления и/или оптимизации связывания 5Т4 вводили обратные мутации. Замещение остатка серина в положении 67 остатком тирозина, как видно в каркасной области А1 мыши, полностью восстанавливает свойства связывания с 5Т4. См. Таблицу 13.

Таблица 13 Ингибирование связывания биотинилированного гибридного антитела А1 с 5Т4 ELISA Версия А1 антитела IC₅₀ Химерное А1 16-20 нМ huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v1.1 >1 µM huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v1.1 28 нМ huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v2.0 >1 µM huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v2.4 16 нМ huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v3.0 >1 µM huA1 V_H v2.0+huA1 V_L v3.1 27 нМ huA1, гуманизированное А1 v, версия

ПРИМЕР 8

Кросс-реактивность антител против 5Т4

Для выявления межвидовой эффективности in vivo и токсикологического анализа определяли реакционную способность антител против 5Т4, предложенных в этом документе у различных видов животных. Для дальнейшей характеристики эпитопа, который связывает каждое антитело также применяли зависимость связывающей активности и родственность различных 5Т4 эктодоменов. Определение связывания проводили при использовании 5Т4 эктодоменов из различных видов, слитых с человеческим IgG1 Fc. Процент идентичности каждого эктодоменого участка с 5Т4 человека показан в Таблице 14.

Таблица 14 Родственность 5Т4 из различных видов Типы Процент идентичности с человеческим 5Т4 Аминокислоты эктодомена Человек 100 1-355 Мышь 84.0 1-361^a Крыса 83.1 1-361^а Шимпанзе (частичная последовательность - 396/420 аминокислот) ~99.5 1-355 Яванский макак 96.7 1-355 Чернохвостая мартышка (частичная последовательность - 367/420 аминокислот) ~94.6 1-355 Собака 87.9 1-355 Корова 86.9 1-355 ^a Содержит прямой повтор из 6 аминокислот в гидрофильном домене

Полные или частичные последовательности 5Т4 человека, мыши, крысы, собаки или коровы были ранее описаны, через коды доступа GenBank Z29083 (человек, SEQ ID №:87), AJ012160 (мышь), ВС087011 (крыса), ХМ539020 (собака) и ХМ593502 (корова). Виртуальную последовательность 5Т4 шимпанзе получили при помощи выравнивания mPHK и последовательностей генома. Нуклеиновые кислоты, кодирующие 5Т4 белки выделили из яванского макака и чернохвостой мартышки. Аминокислотные последовательности этих дополнительных 5Т4 антигенов приведены в фиг.15, а также описаны, как SEQ ID №:86 (яванский макак) и SEQ ID №:85 (чернохвостая мартышка).

Для оценки новизны последовательностей яванского макака и чернохвостой мартышки, проводили BLAST анализы согласно описанию в Примере 2. При использовании полных последовательностей чернохвостой мартышки в качестве запрашиваемой последовательности, наиболее близкая последовательность идентифицирована как 5Т4 человека (каталожный номер GenBank № NP_006661.1) с 94% идентичностью (302/320 аминокислоты). Последовательности также отличались по карбоксильным концам, причем аминокислоты 1-19 последовательности с идентификационным номером SEQ ID №:85 не выравнивались наиболее близкой последовательностью. При использовании полных последовательностей яванского макака в качестве запрашиваемой последовательности, ближайшая реально существующая последовательность идентифицирована как предшественник тробопластного гликопротеина также из яванского макака (каталожный номер GenBank ВАЕ00432.11) с 99% идентичностью (364/366 аминокислоты). Последовательности также отличались по карбоксильным концам, причем аминокислоты 1-25 последовательности с идентификационным номером SEQ ID №:86 не выравнивались с наиболее близкой последовательностью.

Для определения связывания антител против 5Т4 рекомбинантные белки 5Т4 эктодомен/Fc временно трансфектировали в COS-1 клетки, и проводили анализ способом ELISA. В качестве контрольных образцов использовали нерелевантные антитела IgG4 и IgG1 человека. Межвидовая реакционная способность антител против 5Т4 суммирована в Таблице 15.

Таблица 15 Межтиповая реакционная способность антител против 5Т4 (ED50 в нМ)   huH8 γ4 huH8 γ1 ChiA1 γ4 ChiA2 γ4 ChiA3 γ4 человек 0.19 0.20 0.28 0.21 0.20 шимпанзе 0.19 0.22 0.27 0.22 0.20 чернохвостая мартышка +/- +/- 0.24 0.22 - яванский макак - - 0.18 0.18 0.23 крыса - - +/- - - мышь - - - - - huH8 γ4, гуманизированное Н8 антитело, имеющее константные области IgG4 huH8 γ1, гуманизированное Н8 антитело, имеющее константные области IgG1 ChiA1 γ4, гибридное А1 антитело, имеющиее константные области IgG4 ChiA2 γ4, гибридное А2 антитело, имеющее константные области IgG4 ChiA3 γ4, гибридное A3 антитело, имеющее константные области IgG4 (+/-), частичное связывание (-), отсутствие связывания

Настоящее изобретение относится к области иммунологии. Предложены антитела против 5Т4, нуклеиновые кислоты, кодирующие вариабельные области таких антител, конъюгаты антител с лекарственным средством, способ доставки лекарственного средства посредством такого конъюгата, а также способ лечения субъекта, имеющего рак, характеризующийся экспрессией антигена 5Т4, путем введения конъюгата по изобретению. Настоящее изобретение может найти дальнейшее применение в терапии 5Т4-ассоциированных заболеваний. 8 н. и 34 з.п. ф-лы, 8 пр., 15 табл., 15 ил.

1. Изолированное антитело или фрагмент антитела, которое специфически связывает антиген 5Т4 человека, причем указанное антитело или указанный специфический фрагмент антитела содержит
(a) три гипервариабельных участка вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 2, и три гипервариабельных участка вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 4;
(b) три гипервариабельных участка вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 6, и три гипервариабельных участка вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 8; или
(c) три гипервариабельных участка вариабельной области тяжелой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 10, и три гипервариабельных участка вариабельной области легкой цепи, которая имеет последовательность SEQ ID №: 12.

2. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой химерное антитело, гуманизированное антитело, одноцепочечное антитело, Fab фрагмент, F(ab)₂ фрагмент, Fv фрагмент, тетрамерное антитело, четырехвалентное антитело, домен-специфичное антитело или рекомбинантный белок.

3. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой моноклональное антитело мыши.

4. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело имеет аффинность связывания с антигеном 5Т4 человека, составляющую по меньшей мере от примерно 1·10^-7 М до примерно 1·10^-12 М.

5. Антитело по п.1, отличающееся тем, что указанное антитело специфично направлено на 5Т4-экспрессирующие клетки in vivo.

6. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №: 2, остатков 19-135 последовательности SEQ ID №: 6 или остатков 20-141 последовательности SEQ ID №: 10.

7. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область легкой цепи указанного антитела содержит последовательность остатков 21-127 последовательности SEQ ID №: 4, остатков 23-130 последовательности SEQ ID №: 8 или остатков 21-127 последовательности SEQ ID №: 12.

8. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №: 2 и в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4.

9. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность остатков аминокислот, полученную из остатков 19-135 последовательности SEQ ID №: 6, и в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность остатков аминокислот, полученную из остатков 23-130 последовательности SEQ ID №: 8.

10. Антитело по п.1, отличающееся тем, что вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит последовательность остатков аминокислот, полученную из остатков 20-141 последовательности SEQ ID №: 10, и в котором вариабельная область легкой цепи содержит последовательность остатков аминокислот, полученную из остатков 21-127 последовательности SEQ ID №: 12.

11. Изолированное антитело по п.1, которое специфично связывается с эпитопом 5Т4 человека, содержащее остатки 173-252 и 276-355 последовательности SEQ ID №: 87.

12. Изолированное антитело по п.1, которое специфично связывается с эпитопом 5Т4 человека, который содержит аминокислоты 276-355 последовательности SEQ ID №: 87.

13. Изолированное антитело по п.1, которое специфично связывается с эпитопом 5Т4 человека, который содержит аминокислоты 83-163 последовательности SEQ ID №: 87.

14. Антитело по п.2, отличающееся тем, что указанное антитело представляет собой гибридное или гуманизированное антитело против 5Т4.

15. Антитело по п.14, отличающееся тем, что указанное антитело содержит константные области, полученные из константных областей антител человека.

16. Антитело по п.15, отличающееся тем, что константная область легкой цепи человека получена из константной области легкой цепи каппа человека.

17. Антитело или фрагмент антитела по п.15, отличающееся тем, что константная область тяжелой цепи человека получена из константной области тяжелой цепи IgGI, IgG2, IgG3, или IgG4 человека.

18. Антитело или фрагмент антитела по п.17, отличающееся тем, что константная область тяжелой цепи IgG4 человека содержит пролин в положении 241.

19. Антитело по п.14, отличающееся тем, что вариабельная область легкой цепи и/или вариабельная область тяжелой цепи указанного антитела содержит каркасную область, содержащую остатки каркасной области антитела человека.

20. Антитело по п.19, отличающееся тем, что остатки аминокислот человека представляют собой остатки аминокислот каркасных областей антител человека, выбранных из группы, состоящей из
(а) каркасной области тяжелой цепи антитела человека, выбранной из группы, включающей: DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8 (VH1-2), DP-25, VI-2b и VI-3 (VH1-03), DP-15 и V1-8 (VH1-08), DP-14 и V1-18 (VH1-18), DP-5 и V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 и YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 и DA-8 (VH1-f);
(б) каркасной области легкой цепи антитела человека клона зародышевой линии DPK24 подгруппы IV, подгруппы VkIII (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), или клона зародышевой линии подгруппы VkI (DPK9, DPK1, O2, DPK-7);
(в) консенсусной последовательности каркасной области тяжелой цепи по п. (а); и
(г) каркасной области, которая по меньшей мере на 63% идентична каркасной области по п. (а)-(с).

21. Антитело по п.14, отличающееся тем, что последовательность вариабельной области тяжелой цепи указанного антитела содержит
(а) последовательность остатков аминокислот 20-138 последовательности SEQ ID №: 2;
(б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична остаткам 20-138 последовательности SEQ ID №: 2;
(в) последовательность остатков аминокислот 19-135 последовательности SEQ ID №: 6;
(г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 86% идентична остаткам 19-135 последовательности SEQ ID №: 6;
(д) аминокислотную последовательность остатков 20-141 последовательности SEQ ID №: 10;
(е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична остаткам 20-141 последовательности SEQ ID №: 10;
(ж) последовательность остатков аминокислот, соответствующая любой из последовательностей SEQ ID №: 49, 51, 52, 54, 56, 77, 78, 81 или 82;
(з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №: 51;
(и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №: 54;
(к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 89% идентична последовательности SEQ ID №: 77;
(л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 79% идентична последовательности SEQ ID №: 78;
(м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID №: 81;
(н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 78% идентична последовательности SEQ ID №: 82,
причем указанные проценты идентичности достигают посредством одной или более консервативных замен аминокислот в указанных последовательностях.

22. Антитело по п.14, отличающееся тем, что последовательность вариабельной области легкой цепи указанного антитела содержит
(а) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 4;
(б) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 94% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №: 4;
(в) последовательность остатков аминокислот 23-130 последовательности SEQ ID №: 8;
(г) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 96% идентична остаткам 23-130 последовательности SEQ ID №: 8;
(д) последовательность остатков аминокислот 21-127 последовательности SEQ ID №: 12;
(е) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 98% идентична остаткам 21-127 последовательности SEQ ID №: 12;
(ж) последовательность остатков аминокислот любой из последовательностей SEQ ID №: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83 или 84;
(з) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 83% идентична последовательности SEQ ID №: 60;
(и) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 93% идентична последовательности SEQ ID №: 70;
(к) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 85% идентична последовательности SEQ ID №: 76;
(л) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 88% идентична последовательности SEQ ID №: 79;
(м) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 84% идентична последовательности SEQ ID №: 80;
(н) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID №: 83; или
(о) последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 91% идентична последовательности SEQ ID №: 84,
причем указанные проценты идентичности достигают посредством одной или более консервативных замен аминокислот в указанных последовательностях.

23. Антитело по п.14, которое является гибридным или гуманизированным и включает
(а) вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательности остатков аминокислот 21-127 SEQ ID №: 4 и любой из SEQ ID №: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74 или 76; и
(б) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательности остатков аминокислот 20-138 SEQ ID №: 2 и любой из SEQ ID №: 49, 51, 52, 54 или 56.

24. Антитело по п.14, которое является гибридным или гуманизированным и включает
(а) вариабельную область легкой цепи, которая содержит последовательность аминокислот SEQ ID №: 70; и
(б) вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит последовательность аминокислот SEQ ID №: 54.

25. Конъюгат антитела с лекарственным средством для доставки лекарственного средства в клетки, экспрессирующие 5Т4, включающий
(а) антитело согласно любому из пп.1-24; и
(б) лекарственное средство, которое напрямую или опосредованно связано с антителом.

26. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.25, отличающийся тем, что указанное лекарственное средство представляет собой терапевтический агент, выбранный из группы, состоящей из цитотоксина, радиоизотопа, иммуномодулирующего средства, противоангиогенного средства, противопрофилеративного средства, проапоптического средства, химиотерапевтического агента и терапевтической нуклеиновой кислоты.

27. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.26, отличающийся тем, что терапевтический агент представляет собой цитотоксин.

28. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.26, отличающийся тем, что цитотоксин представляет собой антибиотик, ингибитор полимеризации тубулина, алкилирующий агент, ингибитор синтеза белка, ингибитор протеин киназы, ингибитор фосфатазы, ингибитор топоизомеразы или фермент.

29. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.26, отличающийся тем, что цитотоксин представляет собой антибиотик.

30. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.29, отличающийся тем, что антибиотик представляет собой калихеамицин.

31. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.30, отличающийся тем, что калихеамицин представляет собой N-ацетильное производное или дисульфидный аналог калихеамицина.

32. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.31, отличающийся тем, что калихеамицин представляет собой N-ацетил-γ-калихеамицин.

33. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.26, отличающийся тем, что лекарственное средство связано с антителом через линкер.

34. Конъюгат антитела с лекарственным средством по п.33, отличающийся тем, что линкер выбирают из группы, включающей 4-(4'-ацетилфенокси)-масляную кислоту (AcBut), 3-ацетилфенилуксусную кислоту (АсРас), 4-меркапто-4-метил-валериановую кислоту (Amide) и их производные.

35. Способ доставки лекарственного средства в 5Т4-экспрессирующие клетки, включающий приведение клеток в контакт с конъюгатом антитела с лекарственным средством, содержащим (i) антитело против 5Т4 по п.1 формулы изобретения и (ii) лекарственное средство, которое связано с антителом против 5Т4 напрямую или опосредовано.

36. Способ по п.35, отличающийся тем, что лекарственное средство проникает в целевую клетку.

37. Способ лечения субъекта, имеющего 5Т4-положительный рак, который включает введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества конъюгата антитела против 5Т4 с лекарственным средством, при этом указанный конъюгат содержит (i) антитело против 5Т4 по любому из пп.1-24 формулы изобретения и (ii) терапевтическое средство, которое связано с антителом против 5Т4 напрямую или опосредовано.

38. Способ по п.37, отличающийся тем, что конъюгат антитела против 5Т4 с лекарственным средством представляет собой конъюгат антитела против 5Т4 с калихеамицином, при этом способ дополнительно включает введение второго терапевтического средства, причем конъюгат антитела против 5Т4 с калихеамицином и второе лекарственное средство вводят одновременно или последовательно в любом порядке.

39. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи антитела против 5Т4 или ее консервативно замещенный вариант, включающая
(а) последовательность нуклеотидов 58-414 последовательности SEQ ID №: 1;
(б) последовательность нуклеотидов 55-405 последовательности SEQ ID №:5;
(в) последовательность нуклеотидов 58-423 последовательности SEQ ID №:9;
(г) последовательность, кодирующую любую из последовательностей SEQ ID №: 48, 50, 53 или 55;
(д) последовательность нуклеотидов, которая кодирует вариабельную область тяжелой цепи, соответствующую любой из SEQ ID №: 49, 51, 54, 56, 77, 78, 81 и 82;
(е) последовательность, которая на 89% идентична последовательности SEQ ID №: 50, если покрытие запроса составляет 100%;
(ж) последовательность, которая на 82% идентична последовательности с идентификационным номером SEQ ID №; 53, если покрытие запроса составляет 100%; или
(з) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последовательностей (а)-(г) при строгих условиях гибридизации.

40. Изолированная нуклеиновая кислота, кодирующая вариабельную область легкой цепи антитела против 5Т4 или ее консервативно замещенный вариант, включающая
(а) последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №:3;
(б) последовательность нуклеотидов 67-390 последовательности SEQ ID №:7;
(в) последовательность нуклеотидов 61-381 последовательности SEQ ID №: 11;
(г) последовательность нуклеотидов, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, которая имеет любую последовательность из SEQ ID №: 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73 или 75;
(д) последовательность нуклеотидов, кодирующую вариабельную область легкой цепи гуманизированного антитела, которая имеет любую последовательность из SEQ ID №: 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 79, 80, 83 и 84;
(е) последовательность нуклеотидов, которая на 84% идентична последовательности SEQ ID №: 59, если покрытие запроса составляет 100%;
(ж) последовательность нуклеотидов, которая на 86% идентична последовательности SEQ ID №: 69, если покрытие запроса составляет 100%;
(з) последовательность нуклеотидов, которая на 85% идентична последовательности SEQ ID №: 75, если покрытие запроса составляет 100%; или
(и) нуклеиновую кислоту, которая специфично гибридизуется с комплементом любой из последовательностей (а)-(г) при строгих условиях гибридизации.

41. Применение антитела по п.1 для получения антитела с множественной специфичностью.

42. Применение антитела по п.1 для получения однодоменного антитела, которое специфично связывается с антигеном 5Т4 человека.