КОНЪЮГАТЫ АНТИ-РТК7 АНТИТЕЛО-ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО Российский патент 2019 года по МПК C07K16/30 C07K16/40 A61K47/68 

РОДСТВЕННАЯ ЗАЯВКА

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США № 61/986,520, поданной 30 апреля 2014 года, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данная заявка подается в электронном виде через EFS-Web и включает в себя представленный в электронном виде перечень последовательностей в формате .txt. Файл .txt содержит перечень последовательностей под названием "PC072045_Sequence_Listing.txt", созданный 30 апреля 2014 года и имеющий размер 57,7 КВ. Перечень последовательностей, содержащийся в этом .txt файле, является частью описания изобретения и во всей его полноте включен в него посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к антителам к протеинтирозинкиназе 7 (РТК7) и конъюгатам антитело-лекарственное средство. Настоящее изобретение также относится к способам использования таких антител и конъюгатов антитело-лекарственное средство для лечения рака.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Протеинтирозинкиназа 7(РТК7), также известная как киназа карциномы ободочной кишки 4 (CCK4), является рецепторной тирозинкиназой, первоначально клонированной из нормальных меланоцитов человека и отдельно из ткани карциномы ободочной кишки. Высокие уровни PTK7 были идентифицированы в клетках ряда опухолей, включая рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак ободочной и прямой кишки, рак почки, рак легкого и меланому. Экспрессия PTK7 также наблюдается на клетках миелоидного лейкоза взрослых (AML) и острого лимфобластного лейкоза (ALL).

Лечение рака улучшилось за последнее десятилетие с применением хирургии, лучевой терапии и химиотерапии в качестве основных вариантов лечения. Такие виды лечения могут продлевать срок жизни и/или облегчать симптомы у многих пациентов, но многих пациентов не способны вылечить. Следовательно, остается большая потребность в дополнительных терапевтических вариантах для лечения рака.

С этой целью согласно настоящему изобретению предложены новые конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые направленно воздействуют на PTK7-позитивные виды рака. Раскрытые конъюгаты анти-РТК7 антитело-лекарственное средство могут оказывать клинически полезное цитотоксическое воздействие на PTK7-экспрессирующие опухолевые клетки, не оказывая нежелательных воздействий на клетки, не экспрессирующие PTK7.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство и их применение в обнаружении, профилактике и терапии PTK7-ассоциированных расстройств. Конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению имеет общую формулу: Ab-(L-D), где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7, или его PTK7-связывающий фрагмент; и L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство.

Ab раскрытого конъюгата антитело-лекарственное средство может представлять собой любое PTK7-связывающее антитело. В некоторых аспектах изобретения Ab представляет собой химерное, CDR-привитое, гуманизированное или рекомбинантное человеческое антитело или его PTK7-связывающий фрагмент. В некоторых аспектах изобретения Ab представляет собой интернализующееся антитело и/или нейтрализующее антитело.

Согласно настоящему изобретению также предложены конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство и их применение в обнаружении, профилактике и терапии PTK7-ассоциированных расстройств. Конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению имеет общую формулу: Ab-(L-D), где AB представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7, или его PTK7-связывающий фрагмент; и L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер, и D представляет собой ауристатин.

В конкретных аспектах изобретения Ab представляет собой антитело hu23, hu24 или hu58 или антитело, которое конкурирует за связывание с PTK7 человека с hu23, hu24 или hu58 и/или антителом, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело hu23, hu24 или hu58. Например, Ab может конкурировать за связывание с PTK7 человека с антителом, содержащим (а) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 15; (б) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 39; или (в) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 63, и/или связывать тот же эпитоп, что и указанное антитело.

Среди Ab, которые конкурируют за связывание с PTK7 человека с hu23 и/или связывают тот же эпитоп, что и hu23, репрезентативные Ab, полезные для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению, включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 3, 7 и 11. Дополнительные Ab включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 17, 19 и 21. Дополнительные Ab включают антитела, содержащие (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 3, 7 и 11; и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 17, 19 и 21.

В других конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению Ab содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 15, например вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 15.

Среди Ab, которые конкурируют за связывание с PTK7 человека с hu24 и/или связывают тот же эпитоп, что и hu24, репрезентативные Ab, полезные для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению, включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 27, 31 и 35. Дополнительные AB включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO SEQ ID NO: 41, 43 и 45. Дополнительные AB включают антитела, содержащие (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 27, 31 и 35; и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 41, 43 и 45.

В других конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению AB содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 39, например вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 39.

Среди Ab, которые конкурируют за связывание с PTK7 человека с hu58 и/или связывают тот же эпитоп, что и hu58, репрезентативные Ab, полезные для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 51, 55, и 59. Дополнительные Ab включают антитела, содержащие по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 65, 67 и 69.

Дополнительные Ab включают антитела, содержащие (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 51, 55 и 59; и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 65, 67 и 69.

В других конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению AB содержит вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 63, например вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 63.

В некоторых аспектах изобретения конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство содержат Ab, содержащее константную область тяжелой цепи IgG1, константную область легкой цепи каппа или константную область тяжелой цепи IgG1 и константную область легкой цепи каппа. Например, Ab, полезные для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению включают антитела, содержащие тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23, или тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23. Дополнительные примеры включают антитела, содержащие тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47, или тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47. Еще дополнительные примеры включают антитела, содержащие тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71, или тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71.

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению содержит антитело, имеющее вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, 25 или 49. В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению содержит антитело, имеющее вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 15, 39 или 63.

В конкретных аспектах изобретения Ab представляет собой антитело hu23, hu24 или hu58 или антитело, которое конкурирует за связывание с PTK7 человека с антителом hu23, hu24 или hu58 и/или антителом, которое связывается с тем же эпитопом, что и антитело hu23, hu24 или hu58. Например, Ab может конкурировать за связывание с PTK7 человека с антителом, содержащим (а) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO:13 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO:23; (б) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 25и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 39; или (в) вариабельную область тяжелой цепи SEQ ID NO: 49 и вариабельную область легкой цепи SEQ ID NO: 63, и/или связывать тот же эпитоп, что и указанное антитело.

В другом аспекте изобретения Ab представляет собой гуманизированное моноклональное антитело, такое как антитело hu23, hu24 или hu58.

Любой из конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, может быть получен с линкером, который является расщепляемым или нерасщепляемым. В одном аспекте расщепляемый линкер может представлять собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc). В другом аспекте расщепляемый линкер может представлять собой4-(4'-ацетилфенокси)бутановую кислоту (AcBut). В другом аспекте нерасщепляемый линкер может представлять собой малеимидокапроил (mс).

Любой из конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, может быть получен с лекарственным средством, которое представляет собой ауристатин. В одном аспекте ауристатин может представлять собой 0101 (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид). В другом аспекте ауристатин может представлять собой 8261 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид.

Любой из конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, может быть получен с лекарственным средством, которое представляет собой калихеамицин, включая N-ацетильные производные калихеамицина, такие как N-ацетил-γ-калихеамицин и диметилгидразид N-ацетил-γ-калихеамицина (СМ).

Любое из антител к PTK7, раскрытых в данном документе, может быть использовано в конъюгате антитело-лекарственное средство путем конъюгирования с группировкой линкер-лекарственное средство (L-D). В одном аспекте L-D может представлять собой vc0101 (N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[(21S,24S,25R)-24-[(2S)-бутан-2-ил]-25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-2-оксоэтил)-18,18,23-триметил-3,16,19,22-тетраоксо-21-(пропан-2-ил)-2,7,10,13,26-пентаокса-4,17,20,23-тетраазагептакоз-1-ил]фенил}-N~5~-карбамоил-L-орнитинамид). В другом аспекте L-D может представлять собой mc8261 (N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид). В еще одном аспекте L-D может представлять собой AcButCM (4-(4'-ацетилфенокси)бутановая кислота-диметилгидразидN-ацетил-γ-калихеамицина). Любой из конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, может иметь соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) от 1 до8.

В конкретном аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроил (mc), и где лекарственное средство представляет собой 8261.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроил (тс), и где лекарственное средство представляет собой 8261.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроил (mc), и где лекарственное средство представляет собой 8261.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой AcBut (4-(4'-ацетилфенокси)бутановая кислота), и где лекарственное средство представляет собой СМ (диметилгидразид N-ацетил-γ-калихеамицина).

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой AcBut (4-(4'-ацетилфенокси)бутановая кислота), и где лекарственное средство представляет собой СМ (диметилгидразид N-ацетил-γ-калихеамицина).

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой AcBut (4-(4'-ацетилфенокси)бутановая кислота), и где лекарственное средство представляет собой СМ (диметилгидразид N-ацетил-γ-калихеамицина).

Согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие совокупность конъюгатов антитело-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, и возможно фармацевтический носитель, где указанная композиция имеет среднее DAR в диапазоне от 1 до 8. В конфетном аспекте изобретения композиция может иметь среднее DAR в диапазоне от 3 до 5. В другом аспекте изобретения композиция может иметь среднее DAR в диапазоне от 3 до 4. В другом аспекте изобретения композиция может иметь среднее DAR примерно 4.

Согласно настоящему изобретению предложена также композиция, содержащая совокупность конъюгатов антитело-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, и возможно фармацевтический носитель, где указанная композиция имеет по меньшей мере 50% конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих DAR от 3 до 5. В другом аспекте изобретения композиция имеет по меньшей мере 60% конъюгатов антитело-лекарственное средство, имеющих DAR от 3 до 5.

Согласно настоящему изобретению предложен также конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство общей формулы: Ab-(L-D), где Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7, или его PTK7-связывающий фрагмент; и L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой vc, или mc, или AcBut, и D представляет собой лекарственное средство.

Согласно настоящему изобретению предложен также конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство общей формулы: Ab-(L-D), где AB представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7, или его PTK7-связывающий фрагмент; и L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер, и D представляет собой ауристатин (такой как 0101 или 8261) или СМ.

Согласно настоящему изобретению предложены также способы получения конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытого в данном документе. Например, способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство может включать в себя стадии (а) связывания линкера с лекарственным средством; (б) конъюгирования группировки линкер-лекарственное средство с антителом; и (в) очистки конъюгата антитело-лекарственное средство.

В других аспектах изобретение охватывает способы изготовления, способы получения, способы синтеза, способы конъюгирования и способы очистки конъюгатов антитело-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, и промежуточные соединения для получения, синтеза и конъюгирования конъюгатов антитело-лекарственное средство, раскрытых в данном документе.

Предложены также фармацевтические композиции, содержащие конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытый в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В других аспектах предложены способы лечения расстройства, ассоциированного с PTK7, путем введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытый в данном документе. Репрезентативные ассоциированные с PTK7 расстройства включают гиперпролиферативные расстройства, такие как неопластические расстройства, такие как опухоли (например, рак молочной железы, такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы; рак яичника; рак ободочной кишки и прямой кишки; рак пищевода; рак желудка; меланому; саркому; рак почки; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; рак печени, такой как печеночноклеточная карцинома (НСС); и рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и мелкоклеточный рак легкого (SCLC) и т.д.) и гематологические злокачественные заболевания (например, лейкоз, такой как миелоидный лейкоз взрослых (AML) или острый лимфобластный лейкоз (ALL) и т.д.). Предложено также применение раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство для изготовления лекарственного средства для лечения расстройства, ассоциированного с PTK7, у субъекта. Предложены также конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство для применения в лечении расстройства, ассоциированного с PTK7

В других аспектах настоящего изобретения предложены способы лечения расстройства, ассоциированного с PTK7, у субъекта путем введения терапевтически эффективного количества композиции, содержащей конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытый в данном документе, и химиотерапевтический агент.

В еще одном аспекте изобретение охватывает способы лечения расстройства, характеризующегося сверхэкспрессией PTK7, у пациента конъюгатом антитело-лекарственное средство, раскрытым в данном документе.

В других аспектах настоящего изобретения предложены способы лечения рака, характеризующегося сверхэкспрессией PTK7, у пациента конъюгатом антитело-лекарственное средство, раскрытым в данном документе.

В других аспектах настоящего изобретения предложен способ снижения опухоль-инициирующих клеток в популяции опухолевых клеток. Например, этот способ может включать приведение популяции опухолевых клеток, содержащей опухоль-инициирующие клетки и опухолевые клетки, иные, чем опухоль-инициирующие клетки, в контакт с конъюгатом антитело к PTK7-лекарственное средство, в результате чего частота опухоль-инициирующих клеток в популяции опухолевых клеток снижается. Стадия приведения в контакт может быть осуществлена in vitro или in vivo.

В еще одном аспекте изобретение охватывает диагностическое и терапевтическое применение соединений и композиций, раскрытых в данном документе.

В других аспектах изобретение охватывает продукты производства, т.е. наборы, содержащие конъюгат антитело-лекарственное средство, раскрытый в данном документе, контейнер и вкладыш в упаковку или этикетку с указанием лечения.

Эти и другие аспекты изобретения станут понятны при рассмотрении заявки в целом.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На ФИГ. 1 приведена аминокислотная последовательность репрезентативного полноразмерного белка PTK7 (SEQ ID NO. 73).

ФИГ. 2А-В показывают, что связывание hu24 коррелирует с клеточной экспрессией PTK7. (А) Иммуноблот цельноклеточного лизата с анти-РТК7 и анти-GAPDH антителами. Иммуноблот-сигнал ранее был проверен путем демонстрации потери сигнала при ингибировании экспрессии гена PTK7 малой интерферирующей РНК (миРНК). (В) Средние значения интенсивности флуоресценции из анализа методом проточной цитометрии с анти-РТК7 антителом (hu24) на тех же линиях раковых клеток, что и в иммуноблоте. Пунктирная линия изображает сигнал, когда первичным антителом было антитело-отрицательный контроль, а не hu24.

ФИГ. 3 показывает экспрессию PTK7 на образцах ткани из семи PDX (ксенотрансплантат, имеющий происхождение из ткани пациента)-моделей по результатам иммуногистохимии. Окрашивание показывает PTK7. Репрезентативные микроснимки представлены для каждой модели. Масштабная полоска 100 мкМ.

ФИГ. 4А-С представляют собой графики, показывающие экспрессию мРНК PTK7 в первичных опухолях. Показаны: (А) раковые опухоли молочной железы; (В) раковые опухоли NSCLC; и (С) раковая опухоль яичника.

ФИГ. 5 представляет собой график, показывающий корреляцию между более высокой экспрессией мРНК PTK7 и худшими общими показателями жизнеспособности у пациентов с NSCLC.

ФИГ. 6 представляет собой график, показывающий уровни белка PTK7 в сыворотке здоровых людей и раковых пациентов, имеющих 8 разных типов опухолей. Горизонтальные линии показывают среднее значение для каждой группы.

На ФИГ. 7 представлен анализ методом хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC) hu24-vc0101.

ФИГ. 8 представляет собой график, показывающий эффективность анти-PTK7-vc0101 ADC в PDX-модели трижды негативного рака молочной железы (TNBC) Breast-13(BR13).

ФИГ. 9 представляет собой таблицу данных, показывающую эффективность hu24-vc0101 и анти-РТК7-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR13.

ФИГ. 10 представляет собой график данных из ФИГ. 9, показывающий эффективность hu24-vc0101 и анти-РТК7-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR13.

ФИГ. 11 представляет собой график, показывающий эффективность анти-PTK7-vc0101 ADC в PDX-модели TNBC Breast-22 (BR22).

ФИГ. 12 представляет собой таблицу данных, показывающую эффективность hu23-vc0101 и анти-РТК7-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR22.

ФИГ. 13 представляет собой график данных из ФИГ. 12, показывающий эффективность hu23-vc0101 и анти-РТК7-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR22.

ФИГ. 14 представляет собой график, показывающий эффективность анти-PTK7-vc0101 ADC в PDX-модели TNBC Breast-31 (BR31).

ФИГ. 15 представляет собой график, показывающий эффективность hu24-vc0101 ADC в PDX-модели TNBC Breast-64 (BR64).

ФИГ. 16 представляет собой график, показывающий эффективность hu24-vc0101 ADC в PDX-модели TNBC BR5.

ФИГ. 17 представляет собой график, показывающий эффективность hu24-vc0101 ADC в PDX-модели PR+ TNBC BR36.

ФИГ. 18А-В представляют собой графики, показывающие эффективность hu24-vc0101 и hu23-AcButCM в двух разных PDX моделях SCLC: (A) PDX модель Н1048 и (В) PDX модель SCLC 95.

ФИГ. 19А-В представляют собой графики, показывающие эффективность hu24-AcButCM в двух разных PDX моделях SCLC: (A) PDX модель SCLC 117 и (В) PDX модель SCLC 102.

ФИГ. 20 представляет собой график, показывающий эффективность hu24-vc0101 ADC в PDX-модели немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) Lung-135 (LU135).

ФИГ. 21 представляет собой график, показывающий эффективность hu24-vc0101 ADC в PDX-модели немелкоклеточного рака легкого (NSCLC) Lung-176(LU176).

На ФИГ. 22 представлены микроснимки структуры микротрубочек после обработки 4 мкг/мл hu24-vc0101 ADC, 4 мкг/мл неконъюгированного hu24 mAb, 4 мкг/мл ADC-отрицательного контроля или 0,1 нМ свободного ауристатина 0101. Клетки Н661 обрабатывали в течение 48 часов и затем окрашивали с использованием антитела к тубулину и DAPI (4' ,6-диамино-2-фенилиндол) для визуализации ДНК.

ФИГ. 23 показывает воздействие hu24-vc0101 ADC на эндотелиальные клетки in vitro.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты антитело-лекарственное средство, которые связываются с PTK7, способы получения конъюгатов с использованием антител к PTK7, линкеров и лекарственных средств. Конъюгаты антитело-лекарственное средство по изобретению полезны для получения и изготовления композиций, таких как лекарственные средства, которые могут быть использованы в диагностике, профилактике и/или лечении гиперпролиферативных расстройств, характеризующихся экспрессией PTK7. В некоторых аспектах изобретения раскрытые конъюгаты антитело-лекарственное средство могут снижать частоту опухоль-инициирующих клеток (TIC), которые охватывают как клетки, постоянно поддерживающие опухоль (ТРС), так и высокопролиферативные клетки-предшественники опухоли (TProg).

I. Физиология PTK7

Протеинтирозинкиназа (РТК7), также известная как киназа 4 карциномы ободочной кишки (CCK4), представляет собой рецепторную тирозинкиназу, первоначально клонированную из нормальных меланоцитов человека (Lee et al., Oncogene 8(12):3403-3410, 1993) и отдельно из ткани карциномы ободочной кишки (Mossie et al., Oncogene 11(10):2179-2184, 1995). Ген PTK7 локализован в 6р21.1 - pI 2.2. Пять сплайс-изоформ PTK7 человека были клонированы из тестикулярной кДНК (Jung, et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002). Относительная распространенность изоформ относительно друг друга различается между линиями семенников и гепатомы или карциномы ободочной кишки, но функциональная значимость этих изоформ, если имеется, неизвестна. Биоинформационные анализы дают основание считать, что мышь может экспрессировать растворимую изоформу PTK7 из альтернативно сплайсированных мРНК (Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006).

Полноразмерный белок PTK7 представляет собой трансмембранный белок типа I с внеклеточным доменом (ECD) из 674 аминокислот, за которым следуют короткий ТМ спиральный участок и цитоплазматический домен из 345 аминокислот. Репрезентативная полноразмерная аминокислотная последовательность PTK7 показана на ФИГ. 1 (SEQ ID NO. 73). Аминокислотные последовательности репрезентативных изоформ PTK7 имеются в GenBank под номерами доступа: ЕАХ04154.1 (изоформа а), ЕАХ04155.1 (изоформа b), ЕАХ04156.1 (изоформа с), ЕАХ04157.1 (изоформа d), ЕАХ04158.1 (изоформа е), ЕАХ04159.1 (изоформа f) и ЕАХ04160.1 (изоформа g). Все изоформы кодируют один и тот же внутриклеточный домен. Полная последовательность нуклеиновых кислот репрезентативной изоформы PTK7 человека (т.е. вариант транскрипта PTK7-1) имеет номер доступа в Genbank NM_002821.

Зрелый полноразмерный ECD PTK7 содержит семь иммуноглобулиноподобных доменов, а различные сплайс-варианты кодируют изоформы PTK7, которые различаются по структуре их ECD. Все изоформы содержат цитоплазматический домен с существенной гомологией с доменом, найденном в общем классе тирозинкиназ. Однако PTK7 не обладает детектируемой тирозинкиназной активностью и, как таковой, принадлежит подсемейству псевдокиназ, в которых несколько аминокислотных замен в различных консервативных киназных субдоменах приводят к нарушению связывания ATP (Boudeau, et al., Trends Cell Biol. 16, 2006). Конкретно, ключевые остатки в субдоменах I и VII изменены в PTK7 таким образом, что прямые взаимодействия с неспособными к переносу фосфатами АТР, а также хелатирование Мg²⁺ кофактора, связывающего эти фосфаты, могут быть нарушены.

Вывод о биологической важности функции PTK7 может быть сделан исходя из присутствия консервативных ортологов у видов от гидры через дрозофилу до цыпленка и человека, у каждого из которых по результатам анализа последовательностей прогнозируется отсутствие киназной активности. Основываясь на высокой консервативности специфического мотива ТМ домена, ассоциированного с предрасположенностью к спираль-спиральной ассоциации, было выдвинуто предположение, что ТМ домен может опосредовать димеризацию PTK7. Не ожидается, что сам псевдокиназный домен PTK7 прямо передает сигнал, но он может взаимодействовать как каркасная структура для других молекул в сигнальном пути или может рекрутировать другую(ие) тирозинкиназу(ы). Было показано, что PTK7 может функционировать в клеточной адгезии, миграции клеток, клеточной полярности, пролиферации, перегруппировке актинового цитоскелета и апоптозе для регуляции эмбриогенеза, организации эпителиальной ткани, закрытии нервной трубки, формировании нервного гребня и ориентации аксонов (Peradziryi, Н. et al. Arch Biochem Biophys. 524, 2012).

Известно, что нормальные ткани и клетки, экспрессирующие PTK7, включают ткани и клетки легкого, щитовидной железы, яичника, CD4+ недавние тимусные мигрирующие Т-клетки и нормальные предшественники миелоида и CD34 + CD38 - клетки костного мозга. Что касается раковых тканей, экспрессия PTK7 была также обнаружена в клетках карциномы ободочной кишки, образцах миелоидного лейкоза взрослых (AML), CD34-пре-TALL клетках и в карциноме желудка. PTK7 может быть утеряна при некоторых видах рака молочной железы, содержащих делеции хромосомы 6р21, хотя экспрессия является вариабельной в линиях клеток рака молочной железы. PTK7 также экспрессируется в аденокарциноме легкого. Точное картирование амплификаций 6pI 2-р21 области в остеосаркомах показало, что увеличение числа копий гена необязательно приводит к сверхэкспрессии PTK7, как это было определено методом qRT-PCR (количественная ПЦР в режиме реального времени).

Лиганд или лиганды к PTK7 неизвестны, хотя PTK7 связана с различными биологическими сигнальными путями и процессами развития. Например, PTK7 действует в качестве ко-рецептора как в неканонических (также известных как Wnt/передача сигналов планарной клеточной полярности), так и канонических путей передачи сигналов Wnt. В неканоническом Wnt пути PTK7 активирует последующую передачу сигналов посредством прямого взаимодействия с RACK1 (рецептор активированной киназы С) и рекрутинга DSH (белок Dishevelled) в локализованный на мембране рецепторный комплекс. PTK7 оказывает ингибирующее воздействие на канонический путь передачи сигнала Wnt через конкуренцию за связывание рецептора Frizzled на поверхности мембраны. Экспрессия гена PTK7 регулируется Cdx, тогда как стабильность белка регулируется распадом мембрано-ассоциированной протеазы. PTK7 предназначена для протеолитического расщепления и шеддинга внеклеточного домена металлопротеиназами ММР14 и Adam17, приводя к усилению клеточной пролиферации, миграции и облегчению инвазии раковыми клетками (Peradziryi, et al. Arch Biochem Biophys. 524, 2012). Растворимую PTK7 (sPTK7) используют, чтобы показать роль PTK7 в VEGF-индуцированном ангиогенезе, а также в образовании трубочек in vitro, миграции и инвазии эндотелиальных клеток человека.

В раковых тканях, помимо ее потенциальной возможности модулировать Wnt пути, PTK, оказывается, передает сигналы про-пролиферации и анти-апоптические сигналы в линии карциномы ободочной кишки НСТ116, фенотипы которой могут быть реверсированы РНКи-опосредованным нокаутом PTK7 (Meng, et al., 2010, PLoS One 5(11):e14018). PTK7 анти-апоптические сигналы передавали устойчивость к антрациклин-опосредованному уничтожению клеток в бластах миелоидного лейкоза взрослых (AML), которая могла быть реверсирована с использованием растворимого PTK7-Fc белка (Prebet, et al., 2010, Blood 116(13):2315-23). Сверхэкспрессия PTK7 специфическими раковыми клетками была использована в стратегии направленной доставки даунорубицина в T-ALL клетки в культуре с использованием аптамеров, которые связывают PTK7 и впоследствии интернализируются.

II. Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство

Согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты антитело-лекарственное средство формулы Ab-(L-D), где (а) AB представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7, и (б) L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство. Предложены также способы получения и изготовления таких конъюгатов антитело-лекарственное средство и использования их в клинических применениях. "Конъюгат антитело-лекарственное средство", или "ADC", относится к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, включая производные антител, которые связываются с PTK7 и конъюгированы с лекарственным средством, таким как цитотоксический, цитостатический и/или терапевтический агент, как дополнительно описано ниже. Например, цитотоксический агент может быть связан или конъюгирован с анти-РТК7 антителом, как описано в данном документе, для направленной доставки цитотоксического агента в опухоли (например, PTK7-экспрессирующие опухоли).

Использованный в данном документе термин "РТК7" охватывает варианты, изоформы, гомологи, ортологи и паралоги. PTK7 также известна в данной области как киназа карциномы ободочной кишки 4 (CCK4 или CCK-4). Для целей настоящей заявки будет понятно, что термины "РТК7" и "CCK4" используются взаимозаменяемо и охватывают сплайс-варианты, изоформы, ортологи видов и гомологи PTK7 человека или CCK4 человека. Должно быть также понятно, что эти термины могут также относиться к любому производному или фрагменту нативной или вариантной формы PTK7 или CCK4, содержащей эпитоп, с которым антитело к PTK7 может специфически связываться.

В некоторых аспектах изобретения антитела и конъюгаты антитело-лекарственное средство перекрестно взаимодействуют с PTK7 из видов, иных, чем человек, например PTK7 мыши, крысы или примата, а также с разными формами PTK7 (например, гликозилированной PTK7). В других аспектах антитела и конъюгаты антитело-лекарственное средство могут быть полностью специфическими в отношении PTK7 человека и могут не проявлять виды или другие типы перекрестной реакционной способности. Использованный в данном документе термин "РТК7" относится к природной PTK7 человека, если контекстуально не диктуется иное. Следовательно, "антитело к PTK7" или "анти-РТК7 антитело" или другое подобное выражение означает любое антитело (как оно определено в данном описании), которое ассоциируется, связывается или взаимодействует с PTK7 человека или ее фрагментом или производным. Кроме того, "конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство" или " конъюгат анти-PTK7 антитело-лекарственное средство" означает любой конъюгат антитело-лекарственное средство, или ADC (как он определен в данном описании), который ассоциируется, связывается или взаимодействует с PTK7 человека или ее фрагментом или производным.

"Линкер (L)" означает прямую или опосредованную связь антитела с лекарственным средством. Присоединение линкера к антителу может быть осуществлено различными способами, такими как через поверхностные лизины, посредством восстановительного сочетания с окисленными углеводами, через цистеиновые остатки, высвобождаемые в результате восстановления межцепочечных дисульфидных связей, реакционноспособные цистеиновые остатки, сконструированные на специфических сайтах, и через являющийся донором ацила глутамин-содержащий маркер или эндогенный глутамин, сделанный реакционноспособным посредством полипептидного конструирования в присутствии трансглутаминазы и амина. Различные системы связи ADC известны в данной области, в том числе гидразоновые, дисульфидные и пептидные связи.

"Лекарственное средство (D)" представляет собой любое вещество, имеющее биологическую и детектируемую активность, например терапевтические агенты, детектируемые метки, связывающие агенты и т.д., и пролекарства, которые метаболизируются в активный агент in vivo. Термины "лекарственное средство", "полезная нагрузка" и "соединение" используются взаимозаменяемо.

"L-D" представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, образованную из лекарственного средства (D), связанного с линкером (L).

Дополнительные научные и технические термины, использованные в связи с настоящим изобретением, если не указано иное, имеют значения, которые обычно понятны специалистам в данной области. Кроме того, если контекст не требует иного, термины в единственном числе охватывают формы множественного числа, а термины во множественном числе охватывают формы единственного числа. Как правило, номенклатура, использованная в связи с клеточной и тканевой культурой, молекулярной биологией, иммунологией, микробиологией, генетикой и химией белков и нуклеиновых кислот и гибридизацией и их методами, описанными в данном документе, общеизвестны и обычно используются в данной области.

В конкретном аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 15; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 39; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 63; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

В другом аспекте изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) содержит (а) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, Ab, содержащее тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71; и (б) группировку линкер-лекарственное средство, L-D, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство, где линкер представляет собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), и где лекарственное средство представляет собой 0101.

DAR (соотношение лекарственного средства к антителу) или лекарственная нагрузка, означающее(ая) количество конъюгированных молекул лекарственного средства на антитело, может составлять от 1 до8. Композиции, партии и/или препараты совокупности конъюгатов антитело-лекарственное средство могут быть охарактеризованы средним DAR. DAR и среднее DAR могут быть определены различными стандартными методами, такими как УФ-спектроскопия, масс-спектроскопия, ELISA анализ, радиометрические методы, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), электрофорез и HPLC (высокоэффективная жидкостная хроматография).

В конкретных аспектах изобретения очищенные анти-РТК7 ADC могут не иметь присутствующих неконъюгированных антител (свободных антител). В других аспектах изобретения очищенные анти-РТК7 ADC могут представлять собой мономерные ADC, а агрегаты и димеры отсутствуют. В других аспектах изобретения очищенные анти-РТК7 ADC могут не иметь присутствующего свободного лекарственного средства. В дополнительных аспектах изобретения очищенные анти-РТК7 ADC могут представлять собой мономерные ADC и не иметь присутствующего свободного лекарственного средства.

IIA. PTK7 Антитела

Для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению антитело или его антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой любое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) специфически связывается с PTK7. Антитела по настоящему изобретению дополнительно раскрыты и охарактеризованы в международной публикации РСТ WO 2012/112943, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки. Более конкретно, последовательности антител к PTK7, раскрытые в данном документе, в том числе полные тяжелые и легкие цепи, их вариабельные области и их CDR, включены в данный документ посредством ссылки. Для использования в получении конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть выделены, очищены или дериватизированы.

"Антитело", или "Ab", представляет собой молекулу иммуноглобулина, способную распознавать и связываться с конкретной мишенью или конкретным антигеном, таким как углевод, полинуклеотид, липид, полипептид и т.д., через по меньшей мере один сайт распознавания антигена, локализованный в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. В данном документе термин "антитело" может охватывать любой тип антител, включая, без ограничения, моноклональные антитела, поликлональные антитела, "антигенсвязывающие фрагменты" (или участки), такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, Fc и т.д. интактных антител, которые сохраняют способность специфически связываться с данным антигеном (например, PTK7), изолированную область, определяющую комплементарность (CDR), биспецифические антитела, антитела-гетероконъюгаты, их мутанты, слитые белки, имеющие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, доменное антитело), одноцепочечные (ScFv) и однодоменные антитела (например, акульи и верблюжьи антитела), макситела, минитела, интратела, диатела, триатела, тетратела, v-NAR и bis-scFv (смотри, например, Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9):1126-1136), гуманизированные антитела, химерные антитела и любую другую модифицированную конфигурацию молекулы иммуноглобулина, которая содержит сайт распознавания антигена требуемой специфичности, включая варианты гликозилирования антител, варианты аминокислотных последовательностей антител и ковалентно модифицированные антитела. Антитела могут быть мышиными, крысиными, человеческими или любого другого происхождения (включая химерные или гуманизированные антитела). В некоторых аспектах изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в раскрытых конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство является химерным, гуманизированным или рекомбинантным человеческим антителом или его PTK7-связывающиим фрагментом.

Антитело, конъюгат антитело-лекарственное средство или полипептид, которое(ый) "специфически связывается" или "преимущественно связывается" (эти термины используются в данном документе взаимозаменяемо) с мишенью или антигеном (например, белком PTK7), являются терминами, понятными в данной области, и методы определения такого специфического или преимущественного связывания также общеизвестны в данной области. Молекула проявляет "специфическое связывание" или "преимущественное связывание", если она взаимодействует или ассоциируется чаще, быстрее, с большей продолжительностью и/или с большей аффинностью с конфетной клеткой или конкретным веществом, чем с альтернативными клетками или веществами. Антитело "специфически связывается" или "преимущественно связывается" с мишенью или антигеном, если оно связывается с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими веществами. Например, антитело, которое специфически или преимущественно связывается с эпитопом PTK7, представляет собой антитело, которое связывает этот эпитоп с большей аффинностью, авидностью, легче и/или с большей продолжительностью, чем оно связывается с другими эпитопами PTK7 или эпитопами не PTK7.

Термин "аффинность связывания" или "К_D" в данном описании относится к константе равновесной диссоциации взаимодействия конкретный антиген-антитело. K_D представляет собой отношение скорости диссоциации, также называемой "константой диссоциации" или "K_d", к скорости ассоциации, или "константе ассоциации", или "К_а". Таким образом, К_D равно K_d/K_a и выражается в виде молярной концентрации (М). Отсюда следует, что чем меньше K_D, тем сильнее аффинность связывания. Следовательно, K_D 1 мкМ означает слабую аффинность связывания по сравнению с K_D 1 нМ. Значения К_D для антител могут быть определены методами, общепризнанными в данной области. Одним методом определения К_D антитела является поверхностный плазмонный резонанс, обычно с использованием биосенсорной системы, такой как система BIACORE^®.

Специфическое связывание раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство относится к преимущественному связыванию конъюгата антитело-лекарственное средство с антигеном PTK7 человека в гетерогенном образце, имеющем множество разных антигенов. Обычно специфическое связывание происходит, если аффинность связывания конъюгата антитело-лекарственное средство или его антительной части (Ab) составляет по меньшей мере примерно 10^-7 М или выше, например по меньшей мере примерно 10^-8 М или выше, включая по меньшей мере примерно 10^-9 М или выше, по меньшей мере примерно 10^-10 М или выше, по меньшей мере примерно 10^-11 М или выше или по меньшей мере примерно 10^-12 М или выше. Например, специфическое связывание конъюгата антитело-лекарственное средство или его антительной части (Ab) по изобретению с антигеном PTK7 человека включает связывание в диапазоне по меньшей мере от примерно 1×10^-7 М до примерно 1×10^-12 М, например в диапазоне от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-12 М, или в диапазоне от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-11 М, или в диапазоне от примерно 1×10^-8 М до примерно 1×10^-10 М, или в диапазоне от примерно 1×10^-9 М до примерно 1×10^-10 М. Специфическое связывание также относится к селективному направленному воздействию конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство или его антительной части (Ab) на PTK7-экспрессирующие клетки после введения антитела субъекту.

Понятно также, что антитело (или группировка, или эпитоп), которое специфически или преимущественно связывается с первой мишенью, может или не может специфически или преимущественно связываться со второй мишенью. Как таковое, "специфическое связывание" или "преимущественное связывание" необязательно требует (хотя оно может включать) эксклюзивного связывания. Как правило, но необязательно, упоминание связывания означает преимущественное связывание.

В данном документе термин "эпитоп" охватывает любую белковую детерминанту, способную специфически связываться с иммуноглобулином или Т-клеточным рецептором или иным образом взаимодействовать с молекулой. Эпитопные детерминанты обычно состоят из химически активных поверхностных группировок молекул, таких как аминокислоты или боковые цепи углеводов или Сахаров, и, как правило, имеют конкретные характеристики трехмерных структур, а также конкретные характеристики заряда. Эпитоп может быть "линейным" или "конформационным". В линейном эпитопе все точки взаимодействия между белком и взаимодействующей молекулой (такой как антитело) располагаются линейно вдоль первичной аминокислотной последовательности белка. В конформационном эпитопе точки взаимодействия включают аминокислотные остатки на белке, которые отделены друг от друга. Как только желаемый эпитоп на антигене определен, становится возможным образование антител к этому эпитопу, например с использованием методов, описанных в настоящем изобретении. Альтернативно, в процессе выявления, создания и определения характеристик антител может быть изучена информация о желаемых эпитопах. Исходя из этой информации, затем антитела могут быть подвергнуты конкурентному скринингу в отношении связывания с этим же эпитопом. Подход для достижения этого заключается в проведении исследований перекрестной конкуренции с целью обнаружения антител, которые конкурентно связываются друг с другом, т.е. антитела конкурируют за связывание с антигеном. Имеющий высокую пропускную способность способ "сортировки" антител, основанный на их перекрестном конкурировании, описан в публикации международной заявки РСТ № WO 03/48731. Использованный в данном описании термин "сортировка" относится к способу группирования антител на основе их характеристик связывания с антигеном и конкурировании друг с другом.

В данном документе "выделенное антитело" относится к антителу, которое по существу не содержит других антител, имеющих другие антигенные специфичности (например, выделенное антитело, которое специфически связывает PTK7, по существу не содержит антител, которые специфически связывают антигены, иные, чем PTK7). Более того, выделенное антитело может по существу не содержать другого клеточного вещества и/или других химических веществ. Выделенное антитело, которое специфически связывает PTK7, однако, может обладать перекрестной реакционной способностью с другими антигенами, такими как молекулы PTK7 из других видов (т.е. ортолог), или с более чем одной изоформой PTK7.

В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело, которое конкурирует за связывание с PTK7 человека с антителом, имеющим (а) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 15; или (б) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 39; или (в) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, определенную как SEQ ID NO: 63, или его антигенсвязывающим фрагментом и/или связывает тот же эпитоп, что и указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент.

Термин "конкурирует", используемый в данном документе применительно к антителу, означает, что первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом по существу аналогично связыванию второго антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, так что результат связывания первого антитела с его узнаваемым эпитопом детектируемо снижается в присутствии второго антитела по сравнению со связыванием первого антитела в отсутствие второго антитела. Альтернативно, если связывание второго антитела с его эпитопом также детектируемо снижается в присутствии первого антитела, то такое снижение может иметь место, но не обязательно. То есть, первое антитело может ингибировать связывание второго антитела с его эпитопом без ингибирования вторым антителом связывания первого антитела с его соответствующим эпитопом. Однако если каждое антитело детектируемо ингибирует связывание другого антитела с его узнаваемым эпитопом или лигандом в одинаковой, большей или меньшей степени, то считается, что антитела "перекрестно конкурируют" друг с другом за связывание с их соответствующими эпитопами. И конкурирование, и перекрестное конкурирование охвачены настоящим изобретением. Независимо от механизма, по которому такое конкурирование или перекрестное конкурирование происходит (например, стерическая затрудненность, конформационное изменение или связывание с общим эпитопом или его участком), специалисту должно быть понятно, исходя из сведений, представленных в данном документе, что такое конкурирование и/или перекрестное конкурирование антител охвачены и могут быть полезными для способов, раскрытых в данном документе.

Нативные или природные антитела и нативные иммуноглобулины обычно представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины примерно 150000 Дальтон, состоящие из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (Н) цепей. Каждая легкая цепь связана с тяжелой цепью одной ковалентной дисульфидной связью, а число дисульфидных связей варьирует между тяжелыми цепями разных изотипов иммуноглобулина. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет равномерно расположенные в пространстве межцепочечные дисульфидные мостики. Каждая тяжелая цепь имеет на одном конце вариабельный домен (VH), за которым следуют несколько константных доменов. Каждая легкая цепь имеет вариабельный домен на одном конце (VL) и константный домен на его другом конце; константный домен легкой цепи выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи, и вариабельный домен легкой цепи выровнен с вариабельным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные аминокислотные остатки образуют сопряжение между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепи. Термин "вариабельный" относится тому, что некоторые участки вариабельных доменов сильно различаются по последовательностям антител.

Антитела и вышеуказанные домены антител могут быть описаны как "полипептиды", "олигопептиды", "пептиды" и "белки", т.е. цепи аминокислот любой длины, предпочтительно относительно короткие (например, 10-100 аминокислот). Цепь может быть линейной или разветвленной, она может содержать модифицированные аминокислоты и/или может быть прерванной неаминокислотами. Понятно также, что полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или в виде ассоциированных цепей. Аминокислоты могут быть обозначены в данном описании либо их общепринятыми трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными IUPAC-IUB Biochemical. Термины "полипептиды", "олигопептиды", "пептиды" и "белки" также охватывают аминокислотную цепь, которая модифицирована естественным образом или в результате вмешательства, например в результате образования дисульфидных связей, гликозилирования, липидирования, ацетилирования, фосфорилирования или любой другой обработки или модификации, такой как конъюгирование с вводящим метку компонентом. Данное определение также охватывает, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области. Аминокислотные модификации могут быть выполнены любым способом, известным в данной области, и многие такие способы специалист хорошо знает и использует в обычной практике. Например, но без ограничения, замены, делеции и вставки аминокислот могут быть осуществлены с использованием любых общеизвестных способов на основе ПЦР. Замены аминокислот могут быть осуществлены посредством сайт-направленного мутагенеза (смотри, например, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res. 10:6487-6500; и Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488).

"Константная область" антитела относится к константной области легкой цепи антитела или константной области тяжелой цепи антитела, либо по отдельности, либо в комбинации. Константные области химерных и гуманизированных антител к PTK7 могут иметь происхождение из константных областей любого одного из IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, любых их изотипов (например, изотипов IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 IgG), а также их подклассов и мутантных вариантов. В зависимости от аминокислотной последовательности константной области их тяжелых цепей иммуноглобулины могут принадлежать разным классам. Существует пять основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них дополнительно могут быть подразделены на подклассы (изотипы), например IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. Константные области тяжелых цепей, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов называются альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации иммуноглобулинов разных классов общеизвестны.

Константные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как связывание Fc-рецептора (FcR), участие антитела в антитело-зависимой клеточной токсичности, опсонизация, инициирование комплемент-зависимой цитотоксичности и дегрануляция тучных клеток. Как известно в данной области, термин "Fc-область" используется для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина. "Fc-область" может представлять собой Fc-область нативной последовательности или Fc-область варианта. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьировать, Fc-участок тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как участок от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Рго230, до его карбоксильного конца. Нумерация остатков в Fc-области соответствует нумерации указателя ЕС (Указатель Европейской системы нумерации), как в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc-область иммуноглобулина, как правило, имеет две константные области, СН2 и СН3.

Используемые в данной области термины "Fc-рецептор" и "FcR" описывают рецептор, который связывается с Fc-областью антитела. Предпочтительным FcR является FcR нативной последовательности человека. Более того, предпочтительным FcR является FcR, который связывает антитело IgG (гамма рецептор) и включает в себя рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, в том числе аллельные варианты и альтернативно сплайсированные формы этих рецепторов. Рецепторы FcyRII включают FcyRIIA ("активирующий рецептор") и FcyRIIB ("ингибирующий рецептор"), которые имеют сходные аминокислотные последовательности, которые отличаются в основном их цитоплазматическими доменами. FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; и de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" также охватывает неонатальный рецептор, FcRn, который ответственен за перенос материнских IgG в утробный плод (Guyer et al., J. Immunol., 117:587-593 (1976); и Kim et al., European J. Immunol., 24:2429-2434 (1994)).

Ранее сообщалось, что некоторые остатки, предположительно присутствующие на поверхности СН2 или СН3 домена тяжелой цепи антител, или на константном домене легкой цепи, или иным образом доступны, подходят для замены природной аминокислоты дикого типа, например, цистеином, и поэтому полезны для конструирования сайта, способного к конъюгированию с различными агентами.

Под "сконструированным Fc-полипептидом", "сконструированной Fc-областью" и "сконструированным Fc" в качестве терминов, взаимозаменяемым образом используемых в данном документе, подразумеваются Fc-полипептид или его участок, содержащий по меньшей мере одну мутацию, например замену аминокислоты, вводящую сайт для конъюгирования. Мутация вводит цистеин вместо остатка природной аминокислоты, и в этом положении мутация создает реакционноспособный сайт (например, реакционноспособную сульфгидрильную группу) для конъюгирования группировки с Fc.

Термины "являющийся донором ацила глутамин-содержащий маркер" или "глутаминовый маркер", используемые в данном документе, относятся к полипептиду или белку, содержащему один или более остатков Gin, который действует в качестве акцептора амина в присутствии трансглутаминазы.

"Вариабельная область" антитела относится к вариабельная области легкой цепи антитела или вариабельной области тяжелой цепи антитела, либо отдельно, либо в комбинации. Как известно в данной области, вариабельные области тяжелой и легкой цепи, каждая, состоят из четырех каркасных областей (FR), соединенных тремя областями, определяющими комплементарность (CDR), также известными как гипервариабельные области. CDR в каждой цепи удерживаются вместе в тесной близости FR-областями и вместе с CDR из другой цепи способствуют образованию антигенсвязывающего сайта антитела. Существует по меньшей мере два метода определения CDR: (1) подход, основанный на межвидовой вариабельности последовательности (т.е. согласно Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); и (2) подход, основанный на кристаллографических исследованиях комплексов антиген-антитело (Al-Lazikani et al., J. Molec. Biol. 273:927-948 (1997)). В данном документе CDR может относиться к CDR, определенным любым подходом или комбинацией обоих подходов.

CDR вариабельного домена представляют собой аминокислотные остатки в пределах вариабельной области, которые идентифицируют в соответствии с определениями Kabat, Chothia, кумулятивно и Kabat, и Chothia, VBASE2, АbМ, контактными и/или конформационными определениями или любым методом определения CDR, общеизвестным в данной области. CDR антитела могут быть идентифицированы как гипервариабельные области согласно первоначальному определению Kabat et al. (смотри, например, Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.). Положения CDR могут быть идентифицированы также как структуры структурной петли, первоначально описанные Chothia и другими (смотри, например, Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989)). Положения CDR могут быть также выявлены в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри, например, Retter et al., 2005, Nucleinic acids Res. 33(Database lssue): D671-D674).

Другие подходы для идентификации CDR включают "определение AbM", которое является компромиссом между Kabat и Chothia и осуществляется с использованием пакета программ для моделирования антител Oxford Molecular s АbМ (теперь ACCELRYS^®), или "контактное определение" CDR на основе наблюдаемых контактов антигенов, изложенное в MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996). В другом подходе, упомянутом в данном описании как "конформационное определение" CDR, положения CDR могут быть идентифицированы как остатки, которые вносят энтальпийный вклад в связывание с антигеном (смотри, например, Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008). Еще другие определения границ CDR могут не строго следовать одному из вышеуказанных подходов, но все же будут частично перекрываться с по меньшей мере частью CDR Kabat, хотя они могут быть укороченными или удлиненными в свете прогнозирования или экспериментальных данных, что конкретные остатки, или группы остатков, или даже целые CDR по существу не оказывают сильного воздействия на связывание с антигеном. В данном документе CDR может относиться к CDR, определенным с помощью любого подхода, известного в данной области, включая комбинации подходов. В используемых в данном документе методах могут быть использованы CDR, определенные согласно любому из этих подходов. Для конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, описанных в данном документе, CDR могут быть определены в соответствии с любым из определений Kabat, Chothia, расширенным, VBASE2, АbМ, контактным и/или конформационным.

В других аспектах изобретения антитело к PTK7 или его антигенсвязывающий фрагмент содержит одну или более CDR антитела (например, один, два, три, четыре, пять или все шесть CDR).

Для настоящего изобретения CDR антител hu23, hu24 и hu58, приведенные в Таблице 1 ниже (SEQ ID NO: 1-72), были определены с использованием Kabat и Chothia. CDR, представленные на ФИГ. 6 международной публикации РСТ № WO 2012/112943, которая включена в данное описание посредством ссылки, были определены в результате анализа базы данных VBASE2. Соответственно, антитела, имеющие CDR, определенные с помощью любой такой номенклатуры, в прямой форме входят в объем настоящего изобретения. Более широко, термин "аминокислотный остаток CDR вариабельной области" включает аминокислоты в CDR, которые идентифицированы с использованием любой последовательности или структуры на основе метода, изложенного выше.

В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) CDR антитела hu23. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи имеет три CDR, определенные как SEQ ID NO: 3, 7 и 11. В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи имеет три CDR, определенные как SEQ ID NO: 17, 19 и 21. Конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может также содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 3, 7 и 11; и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 17,19 и 21.

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) одну или более CDR hu23, определенных согласно Chothia или выявленных в результате анализа базы данных VBASE2. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR hu23, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1) или три CDR hu23, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943). В качестве еще одного примера, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR hu23, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1) или три CDR hu23, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943). В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR hu23, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1); и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR hu23, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1). В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR hu23, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943); и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR hu23, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943).

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) CDR антитела hu24. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 27, 31 и 35. В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельная область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 41, 43 и 45. Конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может также содержать (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 27, 31 и 35; и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ IDNO: 41, 43 и 45.

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) одну или более CDR hu24, определенных согласно Chothia или выявленных в результате анализа базы данных VBASE2. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR hu24, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1) или три CDR hu24, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943). В качестве еще одного примера, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR hu24, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1) или три CDR hu24, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943). В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR hu24, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1); и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR hu24, определенные согласно Chothia (смотри Таблицу 1). В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR hu24, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943); и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR hu24, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2 (смотри международную публикацию РСТ № WO 2012/112943).

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) CDR антитела hu58. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 51, 55 и 59. В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельная область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR, определенные как SEQ ID NO: 65, 67 и 69. Конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может также содержать (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 51, 55 и 59; и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR, определенные как SEQ ID NO: 65, 67 и 69.

В других аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) одну или более CDR hu58, определенных согласно Chothia или выявленных в результате анализа базы данных VBASE2. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область тяжелой цепи содержит три CDR hu58, определенные согласно Chothia, или три CDR hu58, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2. В качестве еще одного примера, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи, где по меньшей мере одна вариабельная область легкой цепи содержит три CDR hu58, определенные согласно Chothia, или три CDR hu58, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2. В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую три CDR hu58, определенные согласно Chothia; и (б) вариабельную область легкой цепи, имеющую три CDR hu58, определенные согласно Chothia. В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) (а) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую три CDR hu58, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2; и (б) вариабельную область легкой цепи, содержащую три CDR hu24, выявленные в результате анализа базы данных VBASE2.

В некоторых аспектах изобретения антитела, используемые для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению, будут представлять собой моноклональное антитела. Термин "моноклональное антитело" или "mAb" относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. популяции, содержащей индивидуальные антитела, которые являются идентичными, за исключением возможных природных мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах. Моноклональное антитела являются высокоспецифическими, будучи направленными против единственного антигеннного сайта. Кроме того, в отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают в себя разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственной детерминанты на антигене. Определение "моноклональное" указывает на характер антитела как полученного из по существу гомогенной популяции антител, и не должно толковаться как требующее получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, предназначенные для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены гибридомным методом, впервые описанным в Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975), или могут быть получены методами рекомбинантных ДНК, такими как методы, описанные в патенте США № 4816567. Моноклональные антитела могут быть также выделены из фаговых библиотек, созданных с использованием методов, описанных, например, в McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990).

В некоторых аспектах изобретения антитела, используемые для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство по изобретению, будут моновалентными, т.е. имеющими один антигенсвязывающий сайт на молекулу (например, IgG или Fab). В некоторых случаях моновалентное антитело может иметь более одного антигенсвязывающих сайтов, но связывающих сайтов из разных антигенов. В некоторых аспектах изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент конъюгата антитело-лекарственное средство по изобретению может содержать "бивалентное антитело", т.е. антитело, имеющее два антигенсвязывающих сайта на молекулу (например, IgG). В некоторых случаях эти два связывающих сайта имеют одинаковую антигенную специфичность. Альтернативно, бивалентные антитела могут быть биспецифическими. "Биспецифическое", "двуспецифическое" или "бифункциональное" антитело является гибридным антителом, имеющим два разных антигенсвязывающих сайта. Эти два антигенсвязывающих сайта биспецифического антитела связываются с двумя разными эпитопами, которые могут находиться на одном и том же или на разных белках-мишенях.

Термин "химерное антитело" относится к антителам, в которых часть или все последовательности вариабельных областей имеют происхождение из одного вида, а последовательности константных областей имеют происхождение из другого вида, например к антителу, в котором последовательности вариабельных областей имеют происхождение из мышиного антитела, а последовательности константных областей имеют происхождение из человеческого антитела.

В данном документе "гуманизированное" или "CDR-привитое" антитело относится к формам антител, не являющихся человеческими (например, мышиных), которые представляют собой химерные иммуноглобулины, иммуноглобулиновые цепи или их фрагменты (такие как Fv, Fab, Fab', F(ab')₂ или другие антигенсвязывающие субпоследовательности антител), которые содержат минимальную последовательность, имеющую происхождение из иммуноглобулина, не являющегося человеческим. Предпочтительно, гуманизированные антитела представляют собой человеческие иммуноглобулины (антитело-реципиент), в которых остатки из одной или более определяющих комплементарность областей (CDR) реципиента заменены остатками из одной или более CDR вида, не являющегося человеком (антитело-донор), такого как мышь, крыса или кролик, имеющими желаемую специфичность, аффинность и активность.

В некоторых случаях остатки Fv каркасной области (FR) иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками не человека. Кроме того, гуманизированное антитело может содержать остатки, которые не встречаются ни в антителе-реципиенте, ни в импортированных последовательностях CDR или каркасной области, но включены для дополнительного улучшения и оптимизации свойств антитела. Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все CDR области соответствуют CDR областям иммуноглобулина, не являющегося человеческим, и все или по существу все FR-области являются FR-областями консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело также оптимально будет содержать по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина или домена (Fc), обычно участок иммуноглобулина человека. В некоторых аспектах изобретения антитела имеют Fc-области, модифицированные так, как описано в международной публикации РСТ № WO 99/58572. Другие формы гуманизированных антител имеют одну или более CDR (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR Н1, CDR Н2 или CDR Н3), которые могут быть изменены относительно первичного антитела, и которые также упоминаются как одна или более CDR, "имеющих происхождение из" одной или более CDR из первичного антитела.

Гуманизирование может быть осуществлено по существу методом Winter с соавторами (Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988)) путем замены CDR или последовательностей CDR грызуна или мутантного грызуна соответствующими последовательностями человеческого антитела (смотри также патенты США №№ 5225539, 5585089, 5693761, 5693762, 5859205, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки). В некоторых случаях остатки в пределах каркасных областей одной или более вариабельных областей иммуноглобулина человека заменены соответствующими остатками, не являющимися человеческими (смотри, например, патенты США №№ 5585089, 5693761, 5693762 и 6180370). Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которые не обнаруживаются в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации создают для дополнительного улучшения характеристик антитела (например, для получения желаемой аффинности). Как правило, гуманизированное антитело будет содержать по существу все из по меньшей мере одного и обычно двух вариабельных доменов, в которых все или по существу все гипервариабельные области соответствуют гипервариабельным областям иммуноглобулина, не являющегося иммуноглобулином человека, и все или по существу все каркасные области являются каркасными областями последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело возможно также будет содержать по меньшей мере участок константной области иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Дополнительные подробности смотри в Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988) и Presta Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992), которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. Соответственно, такие "гуманизированные" антитела могут включать антитела, в которых по существу менее чем интактный человеческий вариабельный домен заменен соответствующей последовательностью из вида, не являющегося человеком. На практике гуманизированные антитела обычно представляют собой человеческие антитела, в которых некоторые остатки CDR и возможно некоторые остатки каркасной области заменены остатками из аналогичных сайтов в антителах грызунов (смотри, например, патенты США №№ 5225539, 5585089, 5693761, 5693762, 5859205; смотри также патент США № 6180370 и публикацию международной заявки РСТ № WO 01/27160, где описаны гуманизированные антитела и методы получения гуманизированных антител, имеющих улучшенную аффинность к предопределенному антигену).

"Рекомбинантное человеческое антитело" или "полностью человеческое антитело" относится к тем антителам, которые имеют аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотной последовательности антитела, вырабатываемого человеком, и/или которые были получены с использованием методов получения антител человека, известных специалистам в данной области или раскрытых в данном описании. Это определение человеческого антитела охватывает антитела, имеющие по меньшей мере один полипептид человеческой тяжелой цепи или по меньшей мере один полипептид человеческой легкой цепи. Одним таким примером является антитело, имеющее полипептиды мышиной легкой цепи и человеческой тяжелой цепи. Человеческие антитела могут быть получены с использованием различных методов, известных в данной области. Например, человеческое антитело выбирают из фаговой библиотеки, если эта фаговая библиотека экспрессирует антитела человека (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227(2):381-388 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222(3):581-597 (1991)). Человеческие антитела могут быть получены путем иммунизации животных, которым трансгенно были введены локусы иммуноглобулина человека вместо эндогенных локусов, например мышей, у которых эндогенные гены иммуноглобулина были частично или полностью инактивированы. Этот подход описан в патентах США №№ 5545807, 5545806, 5569825, 5625126, 5633425 и 5661016. Альтернативно, человеческое антитело может быть получено путем иммортализации В-лимфоцитов человека, которые вырабатывают антитело, направленное против антигена-мишени (такие В-лимфоциты могут быть выделены из индивидуума или в результате клонирования кДНК из одной клетки, или могли быть иммунизированы in vitro) (смотри, например, Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therpy, Alan R. Liss, p. 77, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991); и патент США № 5750373).

Антитела по изобретению могут быть получены с использованием методов, общеизвестных в данной области, например рекомбинантных технологий, технологий фагового дисплея, синтетических технологий или комбинаций таких технологий или других технологий, известных в данной области (смотри, например, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) и Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)). Дополнительное руководство можно найти в Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); и Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Репрезентативные способы также описаны в Примере 1, приведенном ниже.

В общем, для продуцирования гибридомной линии клеток путь и схема иммунизации животного-хозяина, как правило, соответствуют установленным и стандартными методам стимуляции и продуцирования антител. Предполагается, что любой субъект-млекопитающее, включая людей, или клетки, продуцирующие антитела, могут служить в качестве основы для продуцирования гибридомных линий клеток млекопитающих, включая человека. Обычно животному-хозяину инокулируют интраперитонеально, внутримышечно, перорально, подкожно, интраплантарно и/или интрадермально некоторое количество иммуногена, в том числе как описано в данном документе.

Гибридомы могут быть получены из лимфоцитов и иммортализованных клеток миеломы с использованием общего соматического метода гибридизации клеток, описанного в Kohler, В. and Milstein, С, Nature 256:495-497, 1975, или модифицированного согласно Buck, D.W., et al., In vitro, 18:377-381, 1982. Доступные линии клеток миеломы, включая, без ограничения, Х63-Ag8.653 и линии из Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, могут быть использованы в гибридизации. Как правило, этот метод включает в себя слияние клеток миеломы и лимфоидных клеток с использованием вещества, способствующего слиянию клеток, такого как полиэтиленгликоль, или с помощью электрических средств, общеизвестных специалистам в данной области. После слияния клетки отделяют от среды для слияния и выращивают в селективной ростовой среде, такой как среда гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT), для исключения негибридизованных родительских клеток. Любая среда, описанная в данном документе, дополненная сывороткой или без сыворотки, может быть использована для культивирования гибридом, которые секретируют моноклональные антитела. В качестве еще одной альтернативы методу слияния клеток, В-клетки, иммортализованные вирусом Эпштейна-Барра (EBV), могут быть использованы для продуцирования моноклональных антител к PTK7 по изобретению. Гибридомы увеличивают в количестве и субклонируют, если желательно, и супернатанты анализируют на анти-иммуногенную активность по стандартным методикам иммуноанализа (например, радиоиммуноанализа, иммуноферментного анализа или флуоресцентного иммуноанализа). Гибридомы, которые могут быть использованы в качестве источника антител, охватывают все производные, клетки-потомки родительских гибридом, которые продуцируют моноклональные антитела, специфичные к PTK7, или их участок.

Гибридомы, которые продуцируют такие антитела, могут быть выращены in vitro или in vivo с использованием известных методик. Моноклональные антитела могут быть выделены из культуральной среды или жидкостей организма по стандартным методикам очистки иммуноглобулина, таким как осаждение сульфатом аммония, гель-электрофорез, диализ, хроматография и ультрафильтрация, при желании. Нежелательная активность, если она есть, может быть удалена, например, путем пропускания препарата над адсорбентами, изготовленными из иммуногена, присоединенного к твердой фазе, и элюирования или высвобождения желаемых антител с иммуногена. Иммунизация животного-хозяина PTK7 человека или фрагментом, содержащим аминокислотную последовательность-мишень, конъюгированную с белком, который является иммуногенным у вида, который подвергают иммунизации, например гемоцианином лимфы улитки, сывороточным альбумином, бычьим тироглобулином или соевым ингибитором трипсина с использованием бифункционального или дериватизирующего агента, например сложного эфира малеимидобензоил-сульфосукцинимида (конъюгирование через цистеиновые остатки), N-гидроксисукцинимида (через лизиновые остатки), глутаральдегида, янтарного ангидрида, SOCl₂ или R¹N=C=NR, где R и R¹ представляют собой разные алкильные группы, обеспечивает выработку популяции антител (например, моноклональных антител).

При желании, интересующее антитело к PTK7 (моноклональное или поликлональное) может быть секвенировано, и полинуклеотидная последовательность затем может быть клонирована в вектор для экспрессии или размножения. Последовательность, кодирующая интересующее антитело, может быть сохранена в векторе в клетке-хозяине, и клетка-хозяин затем может быть размножена и заморожена для использования в будущем. Продуцирование рекомбинантных моноклональных антител в клеточной культуре может быть проведено посредством клонирования генов антител из В-клеток способами, известными в данной области (смотри, например, Tiller et al., J. Immunol. Methods 329:112-124 (2008); патент США № 7314622).

"Клетка-хозяин" включает индивидуальную клетку или клеточную культуру, которая может быть или была реципиентом для вектора(ов) для введения полинуклеотидных вставок. Клетки-хозяева включают потомство единственной клетки-хозяина, и это потомство необязательно может быть полностью идентичным (по морфологии или по геномному ДНК комплементу) первоначальной родительской клетке из-за естественной, случайной или спланированной мутации. Клетка-хозяин включает клетки, трансфицированные in vivo полинуклеотидом(ами) по данному изобретению.

Термин "вектор" означает конструкцию, которая способна доставлять и, предпочтительно, экспрессировать один или более ген(ов) или одну или более последовательность(ей), представляющих интерес, в клетке-хозяине. Примеры векторов включают, без ограничения, вирусные векторы, векторы экспрессии депротеинизированной ДНК или РНК, плазмидные, космидные или фаговые векторы, векторы экспрессии ДНК или РНК, ассоциированные с катионными конденсирующими агентами, векторы экспрессии ДНК или РНК, инкапсулированные в липосомах, и некоторые эукариотические клетки, такие как клетки-продуценты.

Термин "последовательность, управляющая экспрессией" означает последовательность нуклеиновой кислоты, которая направляет транскрипцию нуклеиновой кислоты. Последовательность, управляющая экспрессией, может представлять собой промотор, такой как конститутивный или индуцибельный промотор, или энхансер. Последовательность, управляющая экспрессией, функционально связана с последовательностью нуклеиновой кислоты, подлежащей транскрипции.

Альтернативно, полинуклеотидная последовательность может быть использована для генетической манипуляции с целью "гуманизации" антитела или для улучшения аффинности или других характеристик антитела. Например, константная область может быть сконструирована таким образом, чтобы она как можно больше напоминала константные области человека во избежание иммунного ответа при использовании антитела в клинических испытаниях и лечении людей. Может быть желательным генетически воздействовать на последовательность антитела для достижения большей аффинности к PTK7 и большей эффективности в ингибировании PTK7.

Существуют четыре общие стадии, которые могут быть использованы для гуманизации моноклонального антитела: (1) определение нуклеотидной и спрогнозированной аминокислотной последовательности вариабельных доменов легкой и тяжелой цепей исходного антитела; (2) конструирование гуманизированного антитела, т.е. решение, какую каркасную область антитела использовать в процессе гуманизирования; (3) фактические методологии/технологии гуманизирования; и (4) трансфекция и экспрессия гуманизированного антитела (смотри, например, патенты США №№ 4816567, 5807715, 5866692, 6331415, 5530101, 5693761, 5693762, 5585089 и 6180370).

Гуманизированные антитела могут быть получены с использованием одного из множества различных методов, включая "виниринг" (veneering), прививку областей, определяющих комплементарность (CDR), прививку укороченных CDR, прививку областей, определяющих специфичность (SDR), и сборку Франкенштена, как описано ниже. Гуманизированные антитела также включают супергуманизированные антитела, в которых одна или более замен были сделаны в CDR. Например, в CDR остатки, не являющиеся человеческими, могут быть заменены человеческими остатками. Эти общие подходы могут быть объединены со стандартными методами мутагенеза и синтеза для получения анти-РТК7 антитела с желаемой последовательностью.

Виниринг основан на концепции уменьшения потенциально иммуногенных аминокислотных последовательностей в антителе грызуна или в другом антителе, не являющемся человеческим, посредством замены доступной для растворителя внешней поверхности антитела человеческими аминокислотными последовательностями. За счет этого винированные антитела оказываются менее инородными для клеток человека, чем немодифицированное не являющееся человеческим антитело (смотри Padlan (1991) Mol. Immunol. 28:489-98). Антитело, не являющееся человеческим, винируют путем идентификации экспонированных внешних остатков каркасной области в не являющимся человеческим антителе, которые отличаются от остатков в тех же положениях в каркасных областях человеческого антитела, и замены идентифицированных остатков аминокислотами, которые обычно занимают те же положения в человеческих антителах.

Прививку CDR осуществляют, заменяя одну или более CDR акцепторного антитела (например, человеческого антитела или другого антитела, имеющего желаемые остатки каркасной области) CDR антитела-донора (например, антитела, не являющегося человеческим). Антитела-акцепторы могут быть выбраны исходя из сходства остатков каркасной области потенциального антитела-акцептора и остатков каркасной области антитела-донора. Например, согласно подходу Франкенштейна человеческие каркасные области идентифицируют как имеющие существенную гомологию последовательности с каждой каркасной областью релевантного антитела, не являющегося человеческим, и CDR антитела, не являющегося человеческим, прививают на комплекс разных человеческих каркасных областей. Родственный метод, который также полезен для получения антител по изобретению, описан в патенте США № 7321026.

Прививка укороченных CDR является родственным подходом. Укороченные CDR содержат остатки, определяющие специфичность, и соседние аминокислоты, включая те, которые находятся в положениях 27d-34, 50-55 и 89-96 в легкой цепи и в положениях 31-35b, 50-58 и 95-101 в тяжелой цепи (система нумерации согласно Kabat et al. (1987) (смотри Padlan et al. (1995) FASEB J. 9: 133-9)). Прививка остатков, определяющих специфичность (SDR), базируется на концепции, что специфичность связывания и аффинность антигенсвязывающего активного центра антитела определяются самыми высоковариабельными остатками в каждой области, определяющей комплементарность (CDR). Анализ трехмерных структур комплексов антитело-антиген в сочетании с анализом доступных данных по аминокислотным последовательностям может быть использован для моделирования вариабельности последовательности на основе структурного несходства аминокислотных остатков, которые находятся в каждом положении в пределах CDR. SDR идентифицируют как минимально иммуногенные полипептидные последовательности, состоящие из контактных остатков (смотри Padlan et al. (1995) FASEB J. 9:133-139).

Как правило, человеческие акцепторные каркасные области выбирают, основываясь на том, что они по существу сходны с каркасными областями антител-доноров, или выбирают те, которые наиболее сходны с консенсусной последовательностью подсемейства вариабельных областей. После прививки могут быть произведены дополнительные изменения в донорной и/или акцепторной последовательностях для оптимизации связывания антител, функциональности, использования кодонов, уровней экспрессии и т.д., включая введение в каркасные области остатков, не являющихся человеческими (смотри, например, публикацию международной заявки РСТ № WO 91/09967).

Для прививки CDR на вариабельную каркасную область тяжелой цепи полезные каркасные последовательности могут быть получены из DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH3-30), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b и VI-3 (VH1-03), DP-15 и V1-8 (VH1-08), DP-14 и V1-18 (VH1-18), DP-5 и V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 и YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 и DA-8 (VH1-f). Для прививки CDR на вариабельную каркасную область легкой цепи полезные каркасные последовательности могут быть получены из DPK24 подгруппы IV клона клеток зародышевой линии, подгруппы Will (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21) или подгруппы VκI клона клеток зародышевой линии (DPK9, DPK1, 02, DPK7).

Антигенсвязывающие фрагменты или фрагменты антител могут быть получены посредством протеолитического или иного расщепления антител, рекомбинантными методами (т.е. отдельные или слитые полипептиды), как описано выше, или методами химического синтеза. Полипептиды антител, в частности короткие полипептиды размером вплоть до примерно 50 аминокислот, традиционно получают в результате химического синтеза. Методы химического синтеза известны в данной области и коммерчески доступны. Например, антитело или фрагмент антитела может быть получен(о) с помощью автоматического синтезатора полипептидов, использующего твердофазный метод (смотри также патенты США №№ 5807715, 4816567 и 6331415).

В других аспектах изобретения конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство включают антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи и/или легкой цепи hu23, hu24 или hu58, или вариабельную область, по существу сходную с вариабельной областью тяжелой цепи или легкой цепи hu23, hu24 или hu58.

Применительно к полипептидам термин "по существу идентичные" или "по существу сходные" означает, что две аминокислотные последовательности при оптимальном выравнивании, например с помощью программ GAP или BESTFIT с использованием штрафов за гэп по умолчанию, которые поставляются с программами, имеют по меньшей мере 70%-ную, 75%-ную или 80%-ную идентичность последовательностей, предпочтительно по меньшей мере 90%-ную или 95%-ную идентичность последовательностей и более предпочтительно по меньшей мере 97%-ную, 98%-ную или 99%-ную идентичность последовательностей. В некоторых по существу сходных аминокислотных последовательностях положения остатков, которые не являются идентичными, отличаются консервативными аминокислотными заменами.

По существу сходные полипептиды также включают варианты с консервативными заменами, в которых один или более остатков были консервативно заменены функционально сходным остатком. Примеры консервативных замен включают замену одного неполярного (гидрофобного) остатка, такого как изолейцин, валин, лейцин или метионин, на другой; замену одного полярного (гидрофильного) остатка на другой, например между аргинином и лизином, между глутамином и аспарагином, между глицином и серином; замену одного основного остатка, такого как лизин, аргинин или гистидин, на другой; или замену одного кислотного остатка, такого как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота, на другой.

Дополнительным свидетельством того, что два белка по существу идентичны, является то, что они имеют общую трехмерную структуру или являются биологически функциональными эквивалентами.

В некоторых аспектах изобретения конъюгат антитело-лекарственное средство, который связывается с PTK7, содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как любая из SEQ ID NO: 1, 25 или 49, и/или вариабельную область легкой цепи, определенную как любая из SEQ ID NO: 15, 39 или 63. Например, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 15; или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 1, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 15. В качестве еще одного примера, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 39; или антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 25, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 39. В качестве еще одного примера, конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может содержать антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 63; или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющее(ий) вариабельную область тяжелой цепи, определенную как SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 63.

Антитела могут быть также модифицированы, например в вариабельных доменах тяжелой и/или легкой цепях, например с целью изменения связывающего свойства антитела. Например, мутация может быть создана в одной или более CDR областях для увеличения или уменьшения Ко антитела к PTK7, для увеличения или уменьшения K_off или для изменения специфичности связывания антитела. Методы сайт-направленного мутагенеза общеизвестны в данной области (смотри, например, Sambrook et al. и Ausubel et al. выше).

Модификация или мутация могут быть также сделаны в каркасной области или константной области для увеличения периода полужизни антитела к PTK7 (смотри, например, публикацию международной заявки РСТ № WO 00/09560). Мутация в каркасной области или константной области может быть также создан с целью изменения иммуногенности антитела, получения сайта для ковалентного или нековалентного связывания с другой молекулой или изменения таких свойств, как фиксация комплемента, связывание FcR и антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность. Согласно изобретению одно антитело может иметь мутации в любой одной или более CDR, или в каркасных областях вариабельного домена, или в константной области.

В процессе, известном как "модифицирование на уровне генов зародышевой линии", некоторые аминокислоты в последовательностях VH и VL могут быть видоизменены такими образом, чтобы они соответствовали тем последовательностям, которые естественно находятся в последовательностях VH и VL зародышевой линии. В частности, аминокислотные последовательности каркасных областей в последовательностях VH и VL могут быть видоизменены таким образом, чтобы они соответствовали последовательностям зародышевой линии, для снижения риска иммуногенности при введении антитела. В данном документе термин "зародышевая линия" относится к нуклеотидным последовательностям и аминокислотным последовательностям генов или сегментов генов антител, переходящих от родителей к потомству через зародышевые клетки. Эта последовательность зародышевой линии отличается от нуклеотидных последовательностей, кодирующих антитела в зрелых В-клетках, которые были изменены в результате событий рекомбинации и гипермутации в ходе созревания В-клеток. Антитело, которое "использует" конкретную зародышевую линию, имеет нуклеотидную или аминокислотную последовательность, которая наиболее точно выравнивается с той нуклеотидной последовательностью или аминокислотной последовательностью зародышевой линии, которую оно определяет. Такие антитела часто подвергаются мутациям по сравнению с последовательностью зародышевой линии. Последовательности ДНК зародышевой линии для генов VH и VL человека известны в данной области (смотри, например, базу данных последовательностей зародышевой линии человека "Vbase"; смотри также Kabat, Е. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol. 227:776-798, 1992; и Cox et al., Eur. J. Immunol. 24:827-836, 1994).

Еще одним типом замен аминокислот, которые могут быть сделаны, является удаление потенциальных протеолитических сайтов в антителе. Такие сайты могут находиться в CDR или каркасной области вариабельного домена или в константной области антитела. Замена цистеиновых остатков и удаление протеолитических сайтов могут снижать риск гетерогенности в антительном продукте и таким образом увеличивать его гомогенность. Еще одним типом замен аминокислот является исключение пар аспарагин-глицин, которые образуют потенциальные сайты деамидирования, путем изменения одного или обоих остатков. В качестве другого примера, С-концевой лизин тяжелой цепи антитела к PTK7 по изобретению может быть отщеплен. В различных аспектах изобретения тяжелые и легкие цепи антител к PTK7 возможно могут содержать сигнальную последовательность.

Для экспрессии антител к PTK7 по настоящему изобретению фрагменты ДНК, кодирующие VH и VL области, сначала могут быть получены любым способом, описанным выше. Как известно в данной области, "полинуклеотид" "нуклеиновая кислота/нуклеотид" и "олигонуклеотид" используются взаимозаменяемым образом в данном описании и включают полимерные формы нуклеотидов любой длины, либо дезоксирибонуклеотиды, либо рибонуклеотиды, их аналоги или любой субстрат, который может быть встроен в цепь ДНК- или РНК-полимеразой. Полинуклеотиды могут иметь трехмерную структуру и могут выполнять любую функцию, известную или неизвестную. Не ограничивающими примерами полинуклеотидов являются: ген или фрагмент гена, экзоны, интроны, матричная РНК (мРНК), транспортная РНК, рибосомальная РНК, рибозимы, ДНК, кДНК, геномная ДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК любой последовательности, выделенная РНК любой последовательности, зонды на основе нуклеиновых кислот и праймеры.

Полинуклеотиды могут быть природными, синтетическими, рекомбинантными или любой их комбинацией. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Модификация нуклеотидной структуры, если она присутствует, может быть обеспечена до или после сборки цепи. Последовательность нуклеотидов может быть прервана ненуклеотидными компонентами. После полимеризации полинуклеотид может быть дополнительно модифицирован, например посредством конъюгирования с компонентом, вводящим метку. Другие типы модификаций включают, например, "кэпы", замену одного или более природных нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации, такие как, например, модификации незаряженными связями (например, метилфосфонатами, фосфотриэфирами, фосфоамидатами, карбаматами и т.д.) и заряженными связями (например, фосфоротиоатами, фосфородитиоатами и т.д.), модификации, включающие боковые группировки, такие как, например, белки (например, нуклеазы, токсины, антитела, сигнальные пептиды, поли-L-лизин и т.д.), модификации интеркаляторами (например, акридином, псораленом и т.д.), модификации, включающие хелатирующие агенты (например, металлы, радиоактивные металлы, бор, металлы-окислители и т.д.), модификации, включающие алкилирующие агенты, модификации модифицированными связями (например, альфа аномерными нуклеиновыми кислотами и т.д.), а также немодифицированные формы полинуклеотида(ов). Дополнительно, любая из гидроксильных групп, обычно присутствующих в сахарах, может быть заменена, например, фосфонатными группами, фосфатными группами, защищена стандартными защитными группами или активирована с получением дополнительных связей с дополнительными нуклеотидами, или может быть конъюгирована с твердыми подложками. 5'- и 3'-концевой ОН могут быть фосфорилированы или замещены аминами или органическими кэпирующими группировками из 1-20 атомов углерода. Другие гидроксилы могут быть также дериватизированы до стандартных защитных групп. Полинуклеотиды могут также содержать аналогичные формы рибозных или дезоксирибозных сахаров, которые, как правило, известны в данной области, включая, например, 2'-O- метил-, 2'-O-аллил, 2'-фтор- или 2'-азидо-рибозу, карбоциклические аналоги сахаров, альфа- или бета-аномерные сахара, эпимерные сахара, такие как арабиноза, ксилозы или ликсозы, пиранозные сахара, фуранозные сахара, седогептулозы, ациклические аналоги и лишенные азотистого основания нуклеозидные аналоги, такие как метилрибозид. Одна или более фосфодиэфирных связей могут быть заменены альтернативными связывающими группами. Эти альтернативные связывающие группы включают, без ограничения, формы, в которых фосфат заменен P(O)S ("тиоат"), P(S)S ("дитиоат"), (O)NR₂ ("амидат"), P(O)R, P(O)OR' , СО или СН₂ ("формацеталь"), где каждый R или R' независимо представляет собой Н или замещенный или незамещенный ал кил (1-20 С), возможно содержащий простую эфирную (-O-) связь, арил, алкенил, циклоалкил, циклоалкенил или аралкил. Не все связи в полинуклеотиде должны быть идентичными. Предыдущее описание применимо ко всем полинуклеотидам, упомянутым в данном документе, включая РНК и ДНК.

Репрезентативные ДНК, кодирующие вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи анти-РТК7 антитела, определены как SEQ ID NO: 2 (hu23 VH ДНК), SEQ ID NO: 16 (hu23 VL ДНК), SEQ ID NO: 26 (hu24 VH ДНК), SEQ ID NO: 40 (hu24 VL ДНК), SEQ ID NO: 50 (hu58 VH ДНК) и SEQ ID NO: 64 (hu58 VL ДНК). Репрезентативные ДНК, кодирующие тяжелые цепи и легкие цепи анти-РТК7 антитела, определены как SEQ ID NO: 14 (hu23 НС ДНК), SEQ ID NO: 24 (hu23 LC ДНК), SEQ ID NO: 38 (hu24 НС ДНК), SEQ ID NO: 48 (кодирующая hu24 LC ДНК), SEQ ID NO: 62 (hu58 НС ДНК) и SEQ ID NO: 72 (hu58 LC ДНК).

Различные модификации, например мутации, замены, делеции и/или присоединения также могут быть введены в последовательности ДНК hu23, hu24 и hu58 стандартными методами, известными специалистам в данной области. Например, мутагенез может быть проведен стандартными методами, такими как ПЦР-опосредованный мутагенез, при котором мутантные нуклеотиды встраивают в праймеры ПЦР таким образом, чтобы продукт ПЦР содержал желаемые мутации, или сайт-опосредованный мутагенез.

Соответственно, на основе описания настоящего изобретения специалист в данной области без труда распознает последовательности ДНК, по существу сходные с ДНК hu23, hu24 и hu58. Термин "по существу сходные" или "по существу сходные последовательности" при упоминании нуклеиновой кислоты или ее фрагмента означает, что при оптимальном выравнивании с соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) нуклеотидные последовательности идентичны по меньшей мере на примерно 85%, предпочтительно по меньшей мере на примерно 90% и более предпочтительно по меньшей мере на примерно на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидным основаниям при измерении с помощью любого общеизвестного алгоритма идентичности последовательностей, такого как FASTA, BLAST или Gap.

Термин "процент идентичности последовательностей" в контексте последовательностей нуклеиновых кислот означает остатки в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при выравнивании для максимального соответствия. Сравниваемая длина последовательностей при определении идентичности последовательностей может превышать участок из по меньшей мере примерно девяти нуклеотидов, обычно по меньшей мере примерно 18 нуклеотидов, еще чаще по меньшей мере примерно 24 нуклеотидов, типично по меньшей мере примерно 28 нуклеотидов, более типично по меньшей мере примерно 32 нуклеотида и предпочтительно по меньшей мере примерно 36, 48 или более нуклеотидов. Существует несколько разных алгоритмов, известных в данной области, которые могут быть использованы для измерения идентичности нуклеотидных последовательностей. Например, полинуклеотидные последовательности можно сравнивать с использованием FASTA, Gap или Bestfit, которые представляют собой программы в Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, который включает в себя, например, программы FASTA2 и FASTA3, обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательностей областей наилучшего перекрывания между запрашиваемой и искомой последовательностями (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276:71-84 (1998), которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки). Если конкретно не указано иное, используют параметры по умолчанию для конкретной программы или конкретного алгоритма. Например, процент идентичности последовательностей между последовательностями нуклеиновых кислот может быть определен с использованием FASTA с его параметрами по умолчанию (длина сегмента 6 и NOPAM фактор для матрицы замен) или с использованием Gap с его параметрами по умолчанию, предусмотренными в GCG Version 6.1, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.

Еще одним свидетельством по существу идентичности двух последовательностей нуклеиновых кислот является то, что белки, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами, по существу идентичны, имеют общую трехмерную структуру или являются биологически функциональными эквивалентами. Эти термины определены дополнительно ниже. Молекулы нуклеиновых кислот, которые не гибридизируются друг с другом в жестких условиях, все еще по существу идентичны, если соответствующие белки являются по существу идентичными. Это может иметь место, например, когда две нуклеотидные последовательности содержат консервативно замещенные варианты, которые допускаются генетическим кодом.

Консервативно замещенные варианты представляют собой последовательности нуклеиновой кислоты, имеющие замещения вырожденных кодонов, где третье положение одного или более выбранных (или всех) кодонов замещено остатками смешанного основания и/или дезоксиинозина (смотри Batzer et al. (1991) Nucleic acids Res. 19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem. 260:2605-2608; и Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98).

Например, один тип замещения, который может быть сделан, заключается в замене одного или более цистеинов в антителе, которые могут быть химически реакционноспособными, другим остатком, таким как, без ограничения, аланин или серин. Например, может иметь место замена неканонического цистеина. Замена может быть сделана в COR, или в каркасной области вариабельного домена, или в константной области антитела. В качестве еще одного примера, цистеин может быть каноническим.

Сразу после получения фрагментов ДНК, кодирующих сегменты VH и VL по настоящему изобретению, эти фрагменты ДНК могут быть дополнительно обработаны стандартными методами рекомбинантных ДНК, например для превращения генов вариабельной области в гены полноразмерной цепи антитела, гены Fab-фрагмента или в ген scFv. В этих обработках VL- или VH-кодирующий фрагмент ДНК функционально связан с другим фрагментом ДНК, кодирующим другой белок, такой как константная область антитела или гибкий линкер. Термин "функционально связан", использованный в данном контексте, означает, что два фрагмента ДНК соединены таким образом, что аминокислотные последовательности, кодируемые этими двумя фрагментами ДНК, остаются внутри рамки считывания.

Выделенная ДНК, кодирующая VH область, может быть превращена в ген полноразмерной тяжелой цепи посредством функционального связывания VH-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константные области тяжелой цепи (СН1, СН2 и СН3). Последовательности генов константной области тяжелой цепи человека известны в данной области (смотри, например, Kabat, Е. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены посредством стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но наиболее предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG2. Последовательность константной области IgG может представлять собой любой из различных аллелей или аллотипов, о которых известно, что они встречаются среди разных индивидуумов, таких как Gm(1), Gm(2), Gm(3) и Gm(17). Эти аллотипы представляют собой природные аминокислотные замены в константных областях IgG1. Для гена Fab-фрагмента тяжелой цепи VH-кодирующая ДНК может быть функционально связана с другой молекулой ДНК, кодирующей только константную область тяжелой цепи СН1. Константная область тяжелой цепи СН1 может иметь происхождение из любых генов тяжелой цепи.

Выделенная ДНК, кодирующая VL область, может быть превращена в ген полноразмерной легкой цепи (а также ген Fab легкой цепи) посредством функционального связывания VL-кодирующей ДНК с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи, CL. Последовательности генов константной области легкой цепи человека известны в данной области (смотри, например, Kabat, Е.A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242), и фрагменты ДНК, охватывающие эти области, могут быть получены посредством стандартной ПЦР-амплификации. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область каппа или лямбда. Константная область каппа может представлять собой любой из различных аллелей, о которых известно, что они встречаются у разных индивидуумов, таких как Inv(1), Inv(2) и Inv(3). Константная область лямбда может иметь происхождение из трех генов лямбда.

Для создания гена scFv VH- и VL-кодирующие фрагменты ДНК функционально связывают с другим фрагментом, кодирующим гибкий линкер, таким образом, чтобы последовательности VH и VL могли экспрессироваться в виде сопряженного одноцепочечного белка с VL и VH областями, соединенными гибким линкером (смотри, например, Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554). Одноцепочечное антитело может быть моновалентным, если использованы только единственные VH и VL, бивалентным, если использованы две VH и VL, или поливалентным, если использовано больше двух VH и VL. Могут быть созданы биспецифические или поливалентные антитела, которые связываются специфически с PTK7 и с другой молекулой.

В другом аспекте изобретения может быть получено слитое антитело или иммуноадгезин, которое(ый) содержит все антитело к PTK7 по изобретению, связанное с другим полипептидом, или участок указанного антитела. В другом аспекте только вариабельные домены антитела к PTK7 связаны с полипептидом. В другом аспекте VH домен антитела к PTK7 связан с первым полипептидом, a VL домен антитела к PTK7 связан со вторым полипептидом, который ассоциирован с первым полипептидом таким образом, что VH и VL домены могут взаимодействовать друг с другом с образованием сайта связывания антигена. В другом аспекте VH домен отделен от VL домена линкером таким образом, что VH и VL домены могут взаимодействовать друг с другом. Антитело VH-линкер-VL затем связывают с полипептидом, представляющим интерес. Кроме того, могут быть созданы слитые антитела, в которых два (или более) одноцепочечных антитела связаны друг с другом. Это полезно, если нужно создать двухвалентное или поливалентное антитело на одной полипептидной цепи, или если нужно создать биспецифическое антитело.

Другие модифицированные антитела могут быть получены с использованием молекул нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело к PTK7. Например, "каппа-тела" (III et al., Protein Eng. 10:949-57, 1997), "минитела" (Martin et al., EMBO J., 13:5303-9, 1994), "диатела" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993) или "янусины (Janusins)" (Traunecker et al., EMBO J. 10:3655-3659, 1991; и Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52, 1992) могут быть получены стандартными молекулярными биологическими методами на основе сведений, приведенных в описании изобретения.

Биспецифические антитела или антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены различными методами, включающими слияние гибридом или связывание Fab'-фрагментов (смотри, например, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321, 1990; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553, 1992). Кроме того, биспецифические антитела могут быть образованы в виде "диател" или "янусинов". В некоторых аспектах изобретения биспецифическое антитело связывается с двумя разными эпитопами PTK7. В других аспектах модифицированные антитела, описанные выше, получают с использованием одного или более вариабельных доменов или CDR областей из антител к PTK7, предложенных в данном документе.

Для использования в получении конъюгатов антитело-лекарственное средство антитела к PTK7, описанные в данном документе, могут быть по существу чистыми, т.е. имеющими чистоту по меньшей мере 50% (т.е. не содержащими примесей), более предпочтительно по меньшей мере 90%, более предпочтительно по меньшей мере 95%, еще более предпочтительно по меньшей мере 98% и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99%.

В Таблице 1 представлены аминокислотные (белковые) последовательности и ассоциированные последовательности нуклеиновых кислот (ДНК) гуманизированных анти-РТК7 антител по настоящему изобретению. CDR hu23 VH, hu23 VL, hu24 VH, hu24 VL, hu58 VH и hu58 VL, как определено согласно Kabat и Chothia, определены как отдельные последовательности.

II.В. Линкеры

Конъюгаты анти-PTK7 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут быть получены с использованием линкера для связывания или конъюгирования лекарственного средства с анти-РТК7 антителом. Линкер представляет собой бифункциональное соединение, которое может быть использовано для связывания лекарственного средства и антитела с образованием конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC). Такие конъюгаты полезны, например, в образовании иммуноконъюгатов, направленных против ассоциированных с опухолями антигенов. Такие конъюгаты обеспечивают избирательную доставку цитотоксических лекарственных средств в клетки опухоли. Подходящие линкеры включают, например, расщепляемые и нерасщепляемые линкеры. Расщепляемый линкер обычно чувствителен к расщеплению во внутриклеточных условиях. Основные механизмы, по которым конъюгированное лекарственное средство отщепляется от антитела, включают гидролиз лизосом (гидразонов, ацеталей и цис-аконитат-подобных амидов) при кислотном рН, расщепление пептидов лизосомальными ферментами (катепсинами и другими лизосомальными ферментами) и восстановление дисульфидов. В результате этих различных механизмов расщепления механизмы связывания лекарственного средства с антителом также широко варьируются, и любой подходящий линкер может быть использован.

Подходящие расщепляемые линкеры включают, например, пептидный линкер, расщепляемый внутриклеточной протеазой, такой как лизосомальная протеаза или эндосомальная протеаза. В аспектах изобретения линкер может представлять собой дипептидный линкер, такой как валин-цитруллин (val-cit), линкер фенилаланин-лизин (phe-lys) или линкер малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc). В другом аспекте линкер может представлять собой сульфосукцинимидил-4-[N-малеимидометил]циклогексан-1-карбоксилат (smcc). Конъюгирование с использованием сульфо-smcc происходит через малеимидную группу, которая взаимодействует с сульфгидрилами (тиолами, -SH), а его сульфо-NHS эфир способен взаимодействовать с первичными аминами (которые находятся в лизине и белке или N-конце пептида). Кроме того, линкер может представлять собой малеимидокапроил (mc).

Другие подходящие линкеры включают линкеры, гидролизуемые при конкретном рН или в конкретном диапазоне рН, например гидразоновый линкер. Дополнительные подходящие расщепляемые линкеры включают дисульфидные линкеры. Линкер может быть ковалентно связан с антителом в той степени, в которой антитело должно расщепляться внутриклеточно, чтобы лекарственное средство высвобождалось, например линкер mc и т.п.

В конкретных аспектах изобретения линкер конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может представлять собой малеимидокапроновый-валин-цитрулин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc), малеимидокапроил (mc) или AcBut.

Примером подходящей методики конъюгирования основывается на конъюгировании гидразидов и других нуклеофилов с альдегидами, образованными в результате окисления углеводов, которые естественно имеются на антителах. Гидразонсодержащие конъюгаты могут быть получены с введенными карбонильными группами, которые обеспечивают желаемые свойства высвобождения лекарственного средства. Конъюгаты могут быть получены также с использованием линкера, который имеет дисульфид на одном конце, алкильную цепь в середине и производное гидразина на другом конце. Антрациклины являются примером цитотоксинов, которые могут быть конъюгированы с антителами с использованием этой технологии.

Линкеры, содержащие функциональные группы, иные, чем гидразоны, могут расщепляться в кислотном окружении лизосом. Например, конъюгаты могут быть получены из тиол-реакционноспособных линкеров, которые содержат сайт, иной, чем гидразон, который расщепляется внутриклеточно, такой как сложные эфиры, амиды и ацетали/кетали. Камптотецин является цитотоксическим агентом, который может быть конъюгирован с использованием этих линкеров. Также могут быть использованы кетали, полученные из 5-7-членного кольцевого кетона, которые имеют один из атомов кислорода, присоединенный к цитотоксическому агенту, а другой к линкеру для присоединения антитела. Антрациклины также являются примером подходящего цитотоксина для использования с этими линкерами.

Еще одним примером класса рН-чувствительных линкеров являются цис-аконитаты, которые имеют карбоновую кислоту, сопредельную с амидной связью. Карбоновая кислота ускоряет гидролиз амида в кислотных лизосомах. Могут быть использованы также линкеры, которые осуществляют подобного типа ускорение гидролиза, с несколькими другими типами структур. Майтанзиноиды являются примером цитотоксина, который может быть конъюгирован с использованием линкеров, присоединяемых по С-9.

Другим потенциальным способом высвобождения для конъюгатов лекарственных средств является ферментативный гидролиз пептидов лизосомальными ферментами. В одном примере пептид присоединяют посредством амидной связи к лара-аминобензиловому спирту, а затем образуют карбамат или карбонат между бензиловым спиртом и цитотоксическим агентом. Расщепление пептида приводит к разрушению или самоуничтожению аминобензилкарбамата или карбоната. Цитотоксические агенты, примеры которых приводятся в связи с этой стратегией, включают антрациклины, таксаны, митомицин С и ауристатины. В одном примере фенол также может высвобождаться в результате разрушения линкера вместо карбамата. В другом варианте для инициирования разрушения пара-меркаптобензилкарбамата или карбоната используют восстановление дисульфида.

Многие из цитотоксических агентов, конъюгированных с антителами, имеют, если имеют, невысокую растворимость в воде, и это может ограничивать лекарственную нагрузку на конъюгат вследствие агрегации конъюгата. Один подход к преодолению этого заключается в присоединении солюбилизирующих групп к линкеру. Могут быть использованы конъюгаты, полученные с линкером, состоящим из PEG и дипептида, включая те, которые имеют PEG дикислоту, тиол-кислоту или малеимид-кислоту, присоединенную к антителу, дипептидный спейсер и амидную связь с амином антрациклина или аналога дуокармицина. Еще одним примером является конъюгат, полученный с PEG-содержащим линкером, дисульфид которого связан с цитотоксическим агентом, а амид связан с антителом. Подходы с введением PEG групп могут быть полезными в преодолении агрегации и ограничениях лекарственной нагрузки.

В патенте США № 5773001, который во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки, раскрыты линкеры, которые могут быть использованы с нуклеофильными лекарственными средствами, в частности гидразидами и родственными нуклеофилами, полученными из калихеамицинов. Эти линкеры особенно полезны в случаях, когда лучшая активность тогда достигается, когда связь, образованная между лекарственным средством и линкером является гидролизуемой. Эти линкеры содержат две функциональные группы: (1) группу для взаимодействия с антителом (например, карбоновокислотную) и (2) карбонильную группу (например, альдегидную или кетонную) для взаимодействия с лекарственным средством. Карбонильные группы могут взаимодействовать с гидразидной группой на лекарственном средстве с образованием гидразоновой связи. Эта связь расщепляется (гидролизуется), обеспечивая высвобождение терапевтического агента из конъюгата после связывания с клетками-мишенями. В конкретных аспектах изобретения линкер в конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению может представлять собой 4-(4-ацетилфенокси)-бутановую кислоту (AcBut). В других аспектах изобретения конъюгаты антитело-лекарственное средство могут быть получены с использованием (3-ацетилфенил)-уксусной кислоты (АсРАс) или 4-меркапто-4-метил-пентановой кислоты (амида) в качестве линкерной молекулы.

Сложные эфиры N-гидроксисукцинимида (OSu) или другие сравнимо активированные сложные эфиры могут быть использованы для образования активированной гидролизуемой группировки линкер-лекарственное средство. Примеры других подходящих активирующих сложных эфиров включают NHS (N-гидроксисукцинимид), сульфо-NHS (сульфонированный NHS), PFP (пентафторфенил), TFP (тетрафторфенил) и DNP (динитрофенил).

В некоторых аспектах изобретения конъюгаты антитело-лекарственное средство получают в результате взаимодействия калихеамицина или его производных, AcBut линкера и анти-РТК7 антитела по настоящему изобретению (смотри, например, патент США № 5773001). Линкер AcBut образует конъюгаты, которые по существу стабильны в системе кровообращения, высвобождая, по оценкам, 2% калихеамицина в сутки при анализе при 37°С в плазме крови человека in vitro. Конъюгаты высвобождают калихеамицин в кислотных лизосомах.

В некоторых аспектах изобретения группировка AcButCM может быть образована с использованием методов и способов, описанных в данной области, например в публикации международной заявки РСТ № WO 08/147765 и в патенте США № 8273862, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. В некоторых аспектах изобретения группировка AcButCM может быть образована с использованием усовершенствованного способа синтеза, описанного в предварительной заявке на патент США № 61/899,682, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.

Репрезентативные линкеры, полезные для конъюгирования радиоизотопов, включают диэтилентриаминпентаацетат (ОТРА)-изотиоцианат, гидрохлорид никотината сукцинимидил-6-гидразиния (SHNH) и гексаметилпропиленамина оксим (НМРАО) (Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31: 1501-1509; Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol. 28:741-744; Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med. 35:1054-63; Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-244; Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med. 15: 267-270; патент США № 6024938). Альтернативно, направленно воздействующая молекула может быть дериватизирована таким образом, чтобы радиоизотоп мог быть связан непосредственно с ней (Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med. 38: 294-300). Способы йодинирования также известны в данной области, и репрезентативные протоколы можно найти, например, в Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 и в Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med. 31:1501-9. II.C. Лекарственные средства

Лекарственные средства, полезные в получении раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, включают любое вещество, обладающее биологической или детектируемой активностью, например терапевтические агенты, детектируемые метки, связывающие агенты и т.д., и пролекарства, которые метаболизируются с образованием активного агента in vivo. Лекарственное средство может также представлять собой производное лекарственного средства, где лекарственное средство функционализировано, чтобы сделать возможным конъюгирование с антителом по изобретению. В соответствии с раскрытыми способами лекарственные средства используют для получения конъюгатов антитело-лекарственное средство формулы Ab-(L-D), где (а) Ab представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которое(ый) связывается с PTK7; и (б) L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер, и D представляет собой лекарственное средство. Соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) или лекарственная нагрузка означает количество молекул лекарственного средства (D), которые конъюгированы, на антитело. Конъюгаты антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению имеют DAR, который находится в диапазоне от 1 до 8. Таким образом, в аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать 1 молекулу лекарственного средства (DAR равно 1), или 2 молекулы лекарственного средства (DAR равно 2), или 3 молекулы лекарственного средства (DAR равно 3), или 4 молекулы лекарственного средства (DAR равно 4), или 5 молекул лекарственного средства (DAR равно 5), или 6 молекул лекарственного средства (DAR равно 6), или 7 молекул лекарственного средства (DAR равно 7), или 8 молекул лекарственного средства (DAR равно 8). DAR может быть определено различными стандартными методами, такими как УФ-спектроскопия, масс-спектроскопия, анализ ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ), радиометрические методы, хроматография гидрофобного взаимодействия (HIC), электрофорез и HPLC.

Композиции, партии и/или препараты конъюгата антитело-лекарственное средство (ADC) формулы Ab-(L-D) могут содержать совокупность антител, причем каждое антитело конъюгировано с конкретным количеством молекул лекарственного средства (DAR от 1 до 8). Композиции, партии и/или препараты имеют среднее DAR.

В конкретных аспектах изобретения композиция, партия и/или препарат конъюгатов антитело-лекарственное средство могут быть охарактеризованы средним DAR в диапазоне от примерно 1 до примерно 8, например средним DAR в диапазоне от примерно 2 до примерно 7, или средним DAR в диапазоне от примерно 3 до примерно 6, или средним DAR в диапазоне от примерно 4 до примерно 5, или средним DAR в диапазоне от примерно 5 до примерно 7, или средним DAR в диапазоне от примерно 6 до примерно 8. В некоторых аспектах композиции, партии и/или препараты конъюгата антитело-лекарственное средство могут иметь среднее DAR примерно 1, или среднее DAR примерно 2, или среднее DAR примерно 3, или среднее DAR примерно 4, или среднее DAR примерно 5, или среднее DAR примерно 6, или среднее DAR примерно 7, или среднее DAR примерно 8. В вышеуказанных диапазонах среднего DAR термин "примерно" означает +/-0,5%.

Более того, композиция, партия и/или препарат конъюгатов антитело-лекарственное средство могут быть охарактеризованы предпочтительным диапазоном среднего DAR, например средним DAR в диапазоне от примерно 3 до примерно 5, средним DAR в диапазоне от примерно 3 до примерно 4, или средним DAR в диапазоне от примерно 4 до примерно 5. Дополнительно композиция, партия и/или препарат конъюгатов антитело-лекарственное средство могут быть охарактеризованы предпочтительным диапазоном среднего DAR, например средним DAR в диапазоне от 3 до 5, средним DAR в диапазоне от 3 до 4, или средним DAR в диапазоне от 4 до 5.

Композиции, партии и/или препараты ADC формулы Ab-(L-D) могут быть охарактеризованы распределением DAR. Распределение DAR обеспечивает процент или долю различных видов ADC, например DAR 1-8, которые могут присутствовать в композиции, партии и/или препарате ADC. Распределение DAR композиции, партии и/или препарата ADC может быть определено методами, известными в данной области, такими как капиллярное изоэлектрическое фокусирование (cIEF).

В одном аспекте изобретения распределение DAR композиции, партии и/или препарата ADC формулы Ab-(L-D) может быть охарактеризовано как высокогетерогенная смесь ADC с широким распределением DAR, как правило содержащим широкий диапазон видов ADC с DAR 1-8.

В другом аспекте изобретения распределение DAR композиции, партии и/или препарата ADC может быть охарактеризовано как высокогомогенная смесь с узким распределением DAR, обычно содержащим узкий диапазон видов ADC, имеющих конкретное значение DAR, такое как DAR от 3 до 5.

Например, терапевтический агент представляет собой агент, который оказывает цитотоксическое, цитостатическое и/или иммуномодуляторное воздействие на раковые клетки или активированные иммунные клетки. Примеры терапевтических агентов включают цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, цитостатические агенты и иммуномодулирующие агенты. Химиотерапевтические агенты представляют собой химические соединения, полезные в лечении рака.

Терапевтические агенты представляют собой композиции, которые могут быть использованы для лечения или предупреждения расстройства у нуждающегося в этом субъекта. Терапевтические агенты, полезные в данном изобретении, включают противораковые агенты, т.е. агенты, обладающие противораковой активностью в PTK7-экспрессирующих клетках, таких как раковые клетки рака молочной железы, такого как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы; рак яичника; рак ободочной кишки и прямой кишки; лейкозы, такие как острый миелоидный лейкоз (AML) и острый лимфобластный лейкоз (ALL); рак пищевода; рак желудка; меланома; саркома; рак почки; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; рак печени, такой как печеночноклеточная карцинома (НСС); и рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и мелкоклеточный рак легкого (SCLC).

Репрезентативные терапевтические агенты включают цитотоксины, цитотоксические агенты и цитостатические агенты. Цитотоксическое воздействие относится к истощению, элиминации и/или уничтожению клетки-мишени (клеток-мишеней). Цитотоксический агент относится к агенту, который оказывает цитотоксическое и/или цитостатическое воздействие на клетку. Цитостатическое воздействие относится к ингибированию пролиферации клеток. Цитостатический агент относится к агенту, который оказывает цитостатическое воздействие на клетку, ингибируя рост и/или распространение конкретной подсовокупности клеток.

Дополнительные репрезентативные терапевтические агенты включают радиоизотопы, химиотерапевтические агенты, иммуномодулирующие агенты, антиангиогенные агенты, антипролиферативные агенты, проапоптические агенты и цитолитические ферменты (например, РНКазы). Агент может также включать терапевтическую нуклеиновую кислоту, такую как ген, кодирующий иммуномодулирующий агент, антиангиогенный агент, антипролиферативный агент или проапоптический агент. Эти определения лекарственных средств не являются взаимоисключающими, и поэтому терапевтический агент может быть описан с использованием одного или более вышеуказанных терминов. Например, выбранные радиоизотопы также являются цитотоксинами. Терапевтические агенты могут быть получены в форме фармацевтически приемлемых солей, кислот или производных любого из вышеуказанных агентов. Как правило, конъюгаты, имеющие радиоизотоп в качестве лекарственного средства, называются радиоиммуноконъюгатами, а имеющие химиотерапевтический агент в качестве лекарственного средства называются химиоиммуноконъюгатами.

Примеры цитотоксических агентов включают, но не ограничены ими, антрациклин, ауристатин, СС-1065, доластатин, дуокармицин, энедиин, гелданамицин, майтанзин, пуромицин, таксан, алкалоид барвинка, SN-38, тубулизин, гемиастерлин и их стереоизомеры, изостеры, аналоги или производные. Могут быть использованы химиотерапевтические агенты, растительные токсины, другие биологически активные белки, ферменты (т.е. ADEPT (терапия антиген-направляемым ферментом и пролекарством)), радиоизотопы, агенты фотосинтеза (т.е. для фотодинамической терапии). В одном воплощении цитотоксический агент не является рибосома-инактивирующим белком. В более конкретном воплощении цитотоксический агент не является сапорином.

Антрациклины имеют происхождение из бактерий Strepomyces, и их используют для лечения широкого спектра видов рака, таких как лейкозы, лимфомы, рак молочной железы, рак матки, рак яичника и рак легкого. Иллюстративные антрациклины включают, без ограничения, даунорубицин, доксорубицин (т.е адриамицин), эпирубицин, идарубицин, валрубицин и митоксантрон.

Доластатины и их пептидные аналоги и производные, ауристатины, являются высокоэффективными антимитотическими агентами, которые, как было показано, обладают противораковой и противогрибковой активностью (смотри, например, патент США № 5663149 и Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother. 42:2961-2965, (1998)). Иллюстративные доластатины и ауристатины включают, без ограничения, доластатин 10, ауристатин Е, ауристатин ЕВ (АЕВ), ауристатин EFP (AEFP), MMAD (монометил-ауристатин D или монометил-доластатин 10), MMAF (монометил-ауристатин F или N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-фенилаланин), ММАЕ (монометил-ауристатин Е или N-метилвалин-валин-долаизолейцин-долапроин-норэфедрин), 5-бензоилвалериановая кислота-АЕ эфир (AEVB).

В некоторых аспектах данного изобретения используют ауристатины, описанные в публикации международной заявки РСТ № WO 2013/072813, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки, и способы получения этих ауристатинов.

Например, ауристатин представляет собой 0101, (2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

В качестве еще одного примера ауристатин представляет собой 8261, (8261 2-метилаланил-N-[3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамид), имеющий следующую структуру:

Дуокармицин и СС-1065 являются ДНК алкилирующими агентами с цитотоксическим действием (смотри Boger and Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995). Иллюстративные доластатины и ауристатины включают, без ограничения, (+)-докармицин А и (+)-дуокармицин SA, и (+)-СС-1065.

Энедиины представляют собой класс противоопухолевых антибактериальных продуктов, характеризующихся наличием девяти- и десяти-членных колец или наличием циклической системы конъюгированных тройных-двойных-тройных связей. Иллюстративные энедиины включают, без ограничения, калихеамицин, эсперамицин и динемицин.

В некоторых аспектах изобретения цитотоксический агент представляет собой антибиотик, такой как калихеамицин, также называемый комплексом LL-Е33288, например β-калихеамицин, γ-калихеамицин или N-ацетил-γ-калихеамицин (гамма-калихеамицин (γ₁)). Примеры калихеамицинов, подходящих для использования в настоящем изобретении, раскрыты, например, в патентах США №№ 4671958, 4970198, 5053394, 5037651, 5079233 и 5108912, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. Эти соединения содержат метилтрисульфид, который может взаимодействовать с соответствующими тиолами с образованием дисульфидов, одновременно вводя функциональную группу, такую как гидразид, или другую функциональную группу, которая полезна для конъюгирования калихеамицина с анти-РТК7 антителом. Дисульфидные аналоги калихеамицина также могут быть использованы, например аналоги, описанные в патентах США №№ 5606040 и 5770710, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки. В некоторых аспектах изобретения дисульфидный аналог представляет собой N-ацетил-γ-калихеамицин-диметилгидразид (далее "СМ").

Гелданамицины являются бензохиноновыми ансамициновыми антибиотиками, которые связываются с Hsp90 (белок теплового шока 90) и используются в качестве противоопухолевых лекарственных средств. Иллюстративные гелданамицины включают, без ограничения, 17-AAG (17-N-аллиламино-17-деметоксигелданамицин) и 17-DMAG (17-

диметиламиноэтиламино-17-деметоксигелданамицин).

Майтанзины или их производные майтанзиноиды ингибируют клеточную пролиферацию посредством ингибирования образования микротрубочек во время митоза через ингибирование полимеризации тубулина (смотри Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975). Иллюстративные майтанзины и майтанзиноиды включают, без ограничения, мертанзин (DM1) и его производные, а также ансамитоцин.

Таксаны представляют собой дитерпены, которые действуют в качестве противотубулиновых агентов или митотических ингибиторов. Иллюстративные таксаны включают, без ограничения, паклитаксел (например, TAXOL^®) и доцетаксел (TAXOTERE^®).

Алкалоиды барвинка также являются противотубулиновыми агентами. Иллюстративные алкалоиды барвинка включают, без ограничения, винкристин, винбластин, виндезин и винорелбин.

В некоторых аспектах изобретения агент представляет собой иммуномодулирующий агент. Примеры иммуномодулирующего агента включают, без ограничения, ганцикловир, этанерцепт, такролимус, сиролимус, воклоспорин, циклоспорин, рапамицин, циклофосфамид, азатиоприн, микофенолгат мофетил, метотрексат, глюкокортикоид и его аналоги, цитокины, ксантины, факторы роста стволовых клеток, лимфотоксины, фактор некроза опухоли (TNF), гематопоэтические факторы, интерлейкины (например, интерлейкин-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18 и IL-21), колониестимулирующие факторы (например, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF)), интерфероны (например, интерфероны-α, -β и -γ), фактор роста стволовых клеток, обозначенный "S 1 фактор", эритропоэтин и тромбопоэтин или их комбинацию.

Иммуномодулирующие агенты, полезные в данном изобретении, также включают антигормональные агенты, которые блокируют действие гормонов на опухоли, и иммуносупрессивные агенты, которые подавляют продуцирование цитокинов, отрицательно регулируют самоантигенную экспрессию или маскируют МНС антигены. Репрезентативные антигормональные агенты включают анти-эстрогеновые агенты, в том числе, например, тамоксифен, ралоксифен, ароматаза-ингибирующие 4(5)-имидазолы, 4-гидрокситамоксифен, триоксифен, кеоксифен, LY 117018, онапстон и торемифен; и антиандрогенные агенты, такие как флутамид, нилутамид, бикалутамид, лейпролид и госерелин; и антиадренальные агенты. Репрезентативные иммуносупрессивные агенты включают 2-амино-6-арил-5-замещенные пиримидины, азатиоприн, циклофосфамид, бромокриптин, даназол, дапсон, грутаральдегид, антиидиотипические антитела к МНС антигенам и МНС фрагментам, циклоспорин А, стероиды, такие как глюкокортикостероиды, антагонисты цитокинов или цитокиновых рецепторов (например, анти-интерфероновые антитела, анти-IL10 антитела, анти-TNFα антитела, анти-IL2 антитела), стрептокиназу, TGFβ, рапамицин, Т-клеточный рецептор, фрагменты Т-клеточного рецептора и антитела к Т-клеточным рецепторам.

В некоторых аспектах изобретения лекарственное средство представляет собой терапевтический белок, включая, но без ограничения, токсин, гормон, фермент и фактор роста.

Примеры белка (или полипептида) токсина включают, без ограничения, дифтерийный токсин (например, цепь А дифтерийного токсина), экзотоксин и эндотоксин Pseudomonas, рицин (например, цепь А рицина), абрин (например, цепь А абрина), модекцин (например, цепь А модексина), альфа-сакрин, белки Aleurites fordii, белки диантина, рибонуклеазу (РНазу), ДНазу I, энтеротоксин-А Staphylococcal, противовирурный белок фитолакки, гелонин, токсин дифтерии, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин, трикотецены, пептиды-ингибиторы "цистинового узла" (ICK) (например, кератотоксины) и конотоксин (например, KIIIA или SmIIIa).

Примеры гормонов включают, без ограничения, эстрогены, андрогены, прогестины и кортикостероиды.

В некоторых аспектах изобретения цитотоксический агент может быть получен с использованием липосомы или биосовместимого полимера. Анти-РТК7 антитела, описанные в данном документе, могут быть конъюгированы с биосовместимым полимером для увеличения срока жизни и биологической активности в сыворотке и/или для продления сроков жизни in vivo. Примеры биосовместимых полимеров включают водорастворимый полимер, такой как полиэтиленгликоль (PEG) или его производные, и цвиттерион-содержащие биосовместимые полимеры (например, фосфорилхолин-содержащий полимер).

В некоторых аспектах изобретения лекарственное средство представляет собой олигонуклеотид, такой как антисмысловые олигонуклеотиды.

Дополнительные лекарственные средства, полезные в данном изобретении, включают антиангиогенные агенты, которые ингибируют образование кровеносных сосудов, например, ингибиторы фарнезилтрансферазы, ингибиторы СОХ-2, ингибиторы VEGF, ингибиторы bFGF, ингибиторы стероидной сульфатазы (например, 2-метоксиэстрадиола бис-сульфамат (2-MeOE2bisMATE)), интерлейкин-24, тромбоспондин, белки маталлоспондина, интерфероны класса I, интерлейкин 12, протамин, ангиостатин, ламинин, эндостатин и фрагменты пролактина.

Антипролиферативные агенты и про-апоптические агенты включают активаторы PPAR-гамма (например, циклопентеноновые простагландины (cyPGs)), ретиноиды, тритерпеноиды (например, циклоартат, лупан, урсан, олеанан, фриеделан, даммаран, кукурбитацин и лимоноидные тритерпеноиды), ингибиторы рецептора EGF (например, HER4), рампамицин, CALCITRIOL^® (1,25-дигидроксихолекальциферол (витамин D)), ингибиторы ароматазы (FEMARA^® (летрозон)), ингибиторы теломеразы, хелаторы железа (например, 3-аминопиридин-2-карбоксальдегида тиосемикарбазон (триапин)), апоптин (вирусный белок 3 - VP3 из вируса анемии циплят), ингибиторы BcI-2 и BcI-X(L), TNF-альфа, FAS лиганд, TNF-родственный апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL/Apo2L), активаторы передачи сигнала TNF-альфа/FAS лиганд/TNF-родственный апоптоз-индуцирующий лиганд (TRAIL/Apo2L) и ингибиторы передачи сигнала пути выживания PI3K-Akt (например, UCN-01 и гелданамицин).

Репрезентативные химиотерапевтические агенты включают алкилирующие агенты, такие как тиотепа и циклофосфамид; алкилсульфонаты, такие как бусульфан, импросульфан и пипосульфан; азиридины, такие как бензодопа, карбоквон, метуредопа и уредопа; этиленимины и метиламеламины, в том числе алтретамин, триэтиленмеламин, триэтиленфосфорамид, триэтиленотиофосфорамид и триметилоломеламин; азотистые аналоги иприта, такие как хлорамбуцил, хлорнафазин, холофосфамид, эстрамустин, ифосфамид, мехлорэтамин, мехлорэтамина оксида гидрохлорид, мелфалан, новембицин, фенестерин, преднимустин, трофосфамид, урацильный аналог иприта; нитрозомочевины, такие как кармустин, хлорозотоцин, фотемустин, ломустин, нимустин, ранимустин; антибиотики, такие как аклациномизины, актиномицин, аутрамицин, азасерин, блеомицины, кактиномицин, калихеамицин, карабицин, карминомицин, карзинофилин, хромомицины, дактиномицин, даунорубицин, деторубицин, 6-диазо-5-оксо-L-норлейцин, доксорубицин, эпирубицин, эзорубицин, идарубицин, марцелломицин, митомицины, микофенольная кислота, ногаламицин, оливомицины, пепломицин, потфиромицин, пуромицин, квеламицин, родорубицин, стрептонигрин, стрептозоцин, туберцидин, убенимекс, зиностатин, зорубицин; антиметаболиты, такие как метотрексат и 5-фторурацил (5-FU); аналоги фолиевой кислоты, такие как деноптерин, метотрексат, птероптерин, триметрексат; аналоги пурина, такие как флударабин, 6-меркаптопурин, тиамиприн, тиогуанин; аналоги пиримидина, такие как анцитабин, азацитидин, 6-азауридин, кармофур, цитарабин, дидезоксиуридин, доксифлуридин, эноцитабин, флоксуридин, 5-EU; андрогены, такие как калустерон, дромостанолона пропионат, эпитиостанол, мепитиостан, тестолактон; анти-адренельные агенты, такие как арниноглутетимид, митотан, трилостан; воспополнители фолиевой кислоты, такие как фролиновая кислота; ацеглатон; альдофосфамидный гликозид; аминолевулиновая кислота; амасакрин; бестрабуцил; бисантрен; эдатраксат; дефофамин; демекольцин; диазиквон; элфорнитин; эллиптиния ацетат; этоглуцид; нитрат галлия; гидроксимочевина; лентинан; лонидамин; митогуазон; митоксантрон; мопидамол; нитракрин; пентостатин; фенамет; пирарубицин; подофиллиновая кислота; 2-этилгидразид; прокарбазин; разоксан; сизофиран; спирогерманий; тенуазоновая кислота; триазиквон; 2,2',2'-трихлортриэтиламин; уретан; виндезин; дакарбазин; манномустин; митобронитол; митолактол; пипоброман; гацитозин; арабинозид (Ara-С); циклофосфамид; тиотепа; таксоиды, например паклитаксел (TAXOL^®, Bristol-Myers Squibb Oncology of Princeton, N.J.) и доксетаксел (TAXOTERE^®, Rhone-Poulenc Rorer of Antony, France); хлорамбуцил; гемцитабин; 6-тиогуанин; меркаптопурин; метотрексат; платиновые аналоги, такие как цисплатин и карбоплатин; винбластин; платина; этопозид (VP-16); ифосфамид; митомицин С; митоксантрон; винкристин; винорелбин; навелбин; новантрон; тенипозид; дауномицин; аминоптерин; кселода; ибандронат; СРТ-11; ингибитор топоизомеразы RFS 2000; дифторметилорнитин (DMFO); ретиноевая кислота; эсперамицины; и капецитабин.

Дополнительны терапевтические агенты, которые могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением, включают фотосенситизирующие агенты, такие как те, которые раскрыты в патентах США №№ 7498029 и 5952329, которые во всей их полноте включены в данное описание посредством ссылки, для фотодинамической терапии; магнитные частицы для термотерапии, такие как те, которые раскрыты в патенте США № 6997863, который во всей его полноте включен в данное описание посредством ссылки; связывающие агенты, такие как пептиды, лиганды, лиганды клеточной адгезии и т.д., и пролекарства, такие как фосфатсодержащие пролекарства, тиофосфатсодержащие пролекарства, сульфатсодержащие пролекарства, пептидсодержащие пролекарства, β-лактамсодержащие пролекарства, пролекарства, содержащие замещенный феноксиацетамид, или пролекарства, содержащие замещенный фенилацетамид, 5-фторцитозин и другие 5-фторуридиновые пролекарства, которые могут превращаться в более активное цитотоксическое свободное лекарственное средство.

Для диагностических способов с использованием анти-РТК7 антител лекарственное средство может содержать детектируемую метку, используемую для обнаружения присутствия PTK7-экспрессирующих клеток in vitro или in vivo. Радиоизотопы, которые детектируются in vivo, такие как метки, которые детектируются с использованием сцинтиграфии, магнитно-резонансной визуализации или ультразвука, могут быть использованы в клинических диагностических применениях. Полезные сцинтиграфические метки включают эмиттеры позитронов и у-эмиттеры. Репрезентативными контрастными агентами для магнитно-резонансной визуализации являются парамагнитные или суперпарамагнитные ионы (например, железа, меди, марганца, хрома, эрбия, европия, диспрозия, гольмия и гадолиния), частицы оксида железа и водорастворимые контрастные агенты. Для ультразвукового детектирования газы или жидкости могут улавливаться в пористые неорганические частицы, из которых они высвобождаются в виде микропузырьков контрастных агентов. Для детектирования in vitro полезные детектируемые метки включают фторофоры, детектируемые эпитопы или связывающие агенты и радиоактивные метки.

Таким образом, в некоторых аспектах изобретения лекарственное средство представляет собой визуализирующий агент (например, фторофор или метку, применяемую в PET (позитронно-эмиссионная томография), метку, применяемую в SPECT (однофотонная эмиссионная компьютерная томография), или метку, применяемую в MRI (магнитно-резонансная визуализация).

Термин "метка" в данном документе относится к детектируемому соединению или композиции, которое(ая) конъюгировано(а) непосредственно или опосредованно с антителом с образованием "меченого" антитела. Метка может быть детектируемой сама по себе (например, радиоизотопные метки или флуоресцентные метки) или, в случае ферментативной метки, может катализировать химическое изменение соединения или композиции субстрата, которое становится детектируемым. Радионуклиды, которые могут служить в качестве детектируемых меток, включают, например, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212 и Pd-109. Метка может быть также недетектируемым веществом, таким как токсин.

Примеры фторофоров включают, без ограничения, флуоресцеина изотиоцианат (FITC) (например, 5-FITC), флуоресцеина амидит (FAM) (например, 5-FAM), эозин, карбоксифлуоресцеин, эритрозин, Alexa Fluor^® (например, Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 или 750), карбокситетраметилродамин (TAMRA) (например, 5-TAMRA), тетраметилродамин (TMR) и сульфородамин (SR) (например, SR101).

Терапевтические или диагностические радиоизотопы или другие метки (например, метки, применяемые в PET или SPECT) могут быть введены в агент для конъюгирования с анти-РТК7 антителом, как описано в данном документе. Изотоп может быть напрямую связан с антителом, например по цистеиновому остатку, присутствующему в антителе, или может быть использован хелатообразующий агент для опосредования связывания антитела и радиоизотопа. Радиоизотопы, подходящие для радиотерапии, включают, но не ограничены ими, а-эмиттеры, В-эмиттеры и оже-электроны. Для диагностических применений полезные радиоизотопы включают эмиттеры позитронов и у-эмиттеры. Анти-РТК7 антитело по изобретению может быть также йодированным, например по тирозиновому остатку антитела, для облегчения детектирования или терапевтического эффекта антитела.

Примеры радиоизотопов или других меток включают, без ограничения, ³Н, ¹¹С, ¹³N, ¹⁴С, ¹⁵N, ¹⁵O, ³⁵S, ¹⁸F, ³²Р, ³³Р, ⁴⁷Sc, ⁵¹Cr, ⁵⁷Со, ⁵⁸Со, ⁵⁹Fe, ⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ga, ⁷⁵Se, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ⁸⁶Y, ⁸⁹Zr, ⁹⁰Y, ⁹⁴Tc, ⁹⁵Ru, ⁹⁷Ru, ⁹⁹Tc, ¹⁰³Ru, ¹⁰⁵Rh, ¹⁰⁵Ru, ¹⁰⁷Hg, ¹⁰⁹Pd, ¹¹¹Ag, ¹¹¹ln, ¹¹³ln, ¹²¹Te, ¹²²Te, ¹²³l, ¹²⁴l, ¹²⁵l, ¹²⁵Te, ¹²⁶l, ¹³¹l, ¹³¹ln, ¹³³l, ¹⁴²Pr, ¹⁴³Pr, ¹⁵³Pb, ¹⁵³Sm, ¹⁶¹Tb, ¹⁶⁵Tm, ¹⁶⁶Dy, ¹⁶⁶H, ¹⁶⁷Tm, ¹⁶⁸Tm, ¹⁶⁹Yb, ¹⁷⁷Lu, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁸⁹Re, ¹⁹⁷Pt, ¹⁹⁸Au, ¹⁹⁹Au, ²⁰¹TI, ²⁰³Hg, ²¹¹At, ²¹²Bi, ²¹²Pb, ²¹³Bi, ²²³Ra, ²²⁴Ac и ²²⁵Ac.

II.D. Способы получения конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство

Предложены также способы получения конъюгатов антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению. Например, способ получения конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство, который раскрыт в данном документе, может включать (а) связывание линкера с лекарственным средством; (б) конъюгирование группировки линкер-лекарственное средство с антителом; и (с) очистку конъюгата антитело-лекарственное средство. Репрезентативные способы синтеза vc0101 и mc8261 описаны в Примере 9, и репрезентативные способы конъюгирования анти-PTK7-VC0101, анти-РТК7-mc8621 ADC и анти-РТК7-AcButCM ADC описаны в Примере 10.

В одном аспекте конъюгат антитело-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) может быть получен (а) присоединением группировки линкер-лекарственное средство (например vc0101 или mc8261) к анти-РТК7 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где анти-РТК7 антитела могут быть частично восстановлены в растворе, содержащем 2-10-молярный избыток трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР), 100 мМ буферного раствора 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES), имеющего рН 6-9, и 1 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA), в течение периода времени в диапазоне от примерно 30 минут до 16 часов при температуре в диапазоне примерно 0-37°С. Группировка линкер-полезная нагрузка vc0101 или mc8261 затем может быть присоединена в молярном соотношении линкер-полезная нагрузка/антитело примерно 4-10 с использованием диметилацетамида (DMA) в течение инкубационного периода времени в диапазоне от примерно 30 минут до 16 часов при температуре в диапазоне примерно 0-37°С. После этого непрореагировавшие тиолы могут быть кэпированы N-этилмалеимидом, и непрореагировавшая группировка линкер-полезная нагрузка может быть погашена L-Cys.

В другом аспекте конъюгат антитело-лекарственное средство формулы Ab-(L-D) может быть получен путем (а) добавления группировки линкер-лекарственное средство (например, AcButCM) к анти-РТК7 антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, где концентрация антитела может находиться в диапазоне от 1 до 25 мг/мл, и группировка линкер-лекарственное средство присутствует в молярном соотношении от примерно 1-15 до 1 анти-РТК7 антитела; (б) инкубирования группировки линкер-лекарственное средство и анти-РТК7 антитела в ненуклеофильном, белок-совместимом буферном растворе, имеющем рН в диапазоне от примерно 7 до 9, с получением мономерного конъюгата антитело-лекарственное средство, где указанный раствор дополнительно содержит (1) подходящий органический сорастворитель и (2) добавку, имеющую по меньшей мере одну C₆-C₁₈ карбоновую кислоту или ее соль, и где инкубирование проводят при температуре в диапазоне от примерно 0°С до примерно 45°С в течение периода времени в диапазоне от примерно 1 минуты до примерно 24 часов; и (в) подвергания конъюгата, полученного на стадии (б), процессу хроматографического разделения для выделения конъюгатов антитело-лекарственное средство с DAR от 1 до 8; и обеспечивает фракцию с низким уровнем конъюгирования (LCF) ниже 10% из неконъюгированного анти-РТК7 антитела, группировки линкер-лекарственное средство и агрегированных конъюгатов.

Оптимальные реакционные условия для образования конъюгата могут быть эмпирически определены путем варьирования реакционных переменных, таких как температура, рН, ввод группировки линкер-полезная нагрузка и концентрация добавок. Условия, подходящие для конъюгирования других лекарственных средств, могут быть определены специалистами в данной области без излишнего экспериментирования.

В некоторых аспектах лекарственное средство может быть модифицировано введением группы, способной взаимодействовать с сайтом конъюгирования на антителе. Например, лекарственное средство может быть присоединено путем алкилирования (например, по эпсилон-аминогруппе лизинов или N-концу антител), восстановительного аминирования окисленного углевода, трансэтерификации между гидроксильными и карбоксильными группами, амидирования по аминогруппам или карбоксильным группам и конъюгирования с тиолами. В некоторых воплощениях количество конъюгированных молекул лекарственного средства (D) на молекулу антитела находится в диапазоне от 1 до 8, от 1 до 7, от 1 до 6, от 1 до 5, от 1 до 4, от 1 до 3 или от 1 до 2. В других воплощениях количество конъюгированных молекул лекарственного средства (D) на молекулу антитела равно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8. В некоторых воплощениях композиции, партии и/или препараты совокупности конъюгатов антитело-лекарственное средство могут быть охарактеризованы средним DAR. Среднее DAR варьирует в диапазоне от примерно 1 до примерно 8, от примерно 1 до примерно 7, от примерно 1 до примерно 6, от примерно 1 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 4, от примерно 1 до примерно 3, от примерно 1 до примерно 2. В некоторых воплощениях среднее DAR для композиции, партии и/или препарата совокупности конъюгатов антитело-лекарственное средство находится в диапазоне от примерно 2 до примерно 8, от примерно 2 до примерно 7, от примерно 2 до примерно 6, от примерно 2 до примерно 5, от примерно 2 до примерно 4, от примерно 2 до примерно 3 или от примерно 3 до примерно 5. В вышеуказанных диапазонах среднего DAR термин "примерно" означает +/- 0,5%. Примеры химических процессов и явлений, которые могут быть использованы для конъюгирования, смотри, например, в Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modificftions of Proteins).

Другие способы получения конъюгатов антитело-лекарственное средство описаны в различных публикациях. Например, химическая модификация может быть осуществлена в антителах либо через амины боковой цепи лизина, либо через сульфгидрильные группы цистеина, активированные посредством восстановления межцепочечных дисульфидных связей для того, чтобы происходила реакция конъюгирования (смотри, например, Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, 2005, и Gentle et al., Bioconjugate Chem. 15:658-663, 2004). Описаны также реакционноспособные цистеиновые остатки, сконструированные в специфических сайтах антител для конъюгирования специфичных лекарственных средств с определенной стехиометрией (смотри, например, Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008).

Кроме того, как описано в международной публикации WO 2013/093809, некоторые остатки, предположительно присутствующие на поверхности СН2 или СН3 домена тяжелой цепи антител или на константном домене легкой цепи, или ином доступном домене, являются подходящими для замены природной аминокислоты дикого типа, например, цистеином, и поэтому являются полезными для конструирования сайта, способного конъюгироваться с различными агентами.

В некоторых аспектах, сконструированный полипептид Fc по изобретению может быть использован для получения антитела к PTK7 или конъюгата антитело-лекарственное средство, так чтобы антитело или его фрагмент содержали сконструированную Fc-область, которая может быть использована для конъюгирования по сконструированному остатку (т.е. замененная аминокислота по сравнению с немодифицированным Fc дикого типа) широкого разнообразия агентов.

Антитела к PTK7 и конъюгаты антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут охватывать сконструированный полипептид Fc, где 1, 2 или более аминокислот, выбранных из положений: 347, 392, 398, 422 и 443 тяжелой цепи антитела (НС) родительского, нативного антитела или антитела дикого типа, заменены другой аминокислотой (включая природные и неприродные/синтетические аминокислоты), где система нумерации константной области является системой нумерации указателя ЕС согласно Kabat.

Следует отметить, что единственная замена в полипептиде Fc, например цистеинового остатка, обычно приводит к представлению двух соответствующих остатков в результирующем IgG антителе вследствие гомодимерной природы молекул IgG антитела. Таким образом, полученные в результате IgG антитела по изобретению могут представлять по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или более реакционноспособных групп в целях конъюгирования с лекарственным средством или соединением. В одном аспекте одна или более замен являются заменами цистеиновым остатком, и полученные в результате сконструированные антитела могут представлять по меньшей мере 1, 2, 3, 4 или более тиольных групп с целью конъюгирования с лекарственным средством или соединением.

В другом аспекте раскрытый сконструированный полипептид Fc может содержать одну или более замен, выбранных из положений 347, 392, 398, 422 и 443 тяжелой цепи (НС) антитела, где система нумерации константной области является системой нумерации указателя ЕС согласно Kabat, и где аминокислотная последовательность тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37 и SEQ ID NO: 61.

Антитела к PTK7 и конъюгаты антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут охватывать константную область легкой цепи (LC) сконструированного антитела или ее участок, где 1, 2 или 3 аминокислоты, выбранные из положений 111, 183 или 188 легкой цепи антитела, где система нумерации константной области легкой цепи является системой нумерации указателя ЕС согласно Kabat, родительского, нативного антитела или антитела дикого типа, заменены другой аминокислотой (включая природные и неприродные/синтетические аминокислоты).

В некоторых аспектах раскрытый сконструированный полипептид LC содержит одну или более замен из положений 111, 183 или 188 легкой цепи антитела, где аминокислотная последовательность легкой цепи выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 47 и SEQ ID NO: 71.

В других аспектах вследствие димерной природы многих антител (например, IgG содержат две легких цепи и две тяжелых цепи, причем каждая тяжелая цепь содержит полипептид Fc) антитело по изобретению может содержать по меньшей мере один сконструированный полипептид Fc и может дополнительно содержать по меньшей мере один сконструированный константный полипептид легкой цепи, тем самым обеспечивая наличие по меньшей мере двух сайт-специфических сайтов конъюгирования - один в полипептиде Fc, а другой в полипептиде LC.

В некоторых аспектах изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство содержит константную область тяжелой цепи IgG1, например тяжелую цепь hu23, определенную как SEQ ID NO: 13, тяжелую цепь hu24, определенную как SEQ ID NO: 37, или тяжелую цепь hu58, определенную как SEQ ID NO: 61. В других аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство содержит константную область легкой цепи каппа, например легкую цепь hu23, определенную как SEQ ID NO: 23, легкую цепь hu24, определенную как SEQ ID NO: 47, или легкую цепь hu58, определенную как SEQ ID NO: 71. В конкретных аспектах изобретения конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство может содержать константную область тяжелой цепи IgG1 и константную область легкой цепи каппа, например тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 13, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 23; или, в качестве еще одного примера, тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 47; или, в качестве еще одного примера, тяжелую цепь, определенную как SEQ ID NO: 61, и легкую цепь, определенную как SEQ ID NO: 71.

Кроме того, как описано в международной публикации WO 2012/059882, способы конъюгирования включают использование являющегося донором ацила глутамин-содержащего маркера или эндогенного глутамина, сделанного реакционноспособным (т.е. способным образовывать ковалентную связь в качестве донора ацила) в результате конструирования полипептида в присутствии трансглутаминазы и амина (например, цитотоксического агента, содержащего реакционноспособный амин или присоединенного к реакционноспособному амину).

В некоторых аспектах антитело к PTK7 или конъюгат антитело- лекарственное средство может содержать являющийся донором ацила глутамин-содержащий маркер, сконструированный на специфическом сайте антитела (например, на карбоксильном конце, амино-конце или на другом сайте) антитела к PTK7. В некоторых аспектах этот маркер содержит аминокислоту глутамин (Q) или аминокислотную последовательность GGLLQGG (SEQ ID NO: 74), LLQGA (SEQ ID NO:75), GGLLQGA (SEQ ID NO: 76), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81), LLQPGK (SEQ ID NO: 82), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁ представляет собой G или P, где Х₂ представляет собой A, G, Р или отсутствует, где Х₃ представляет собой A, G, K, Р или отсутствует, где Х₄ представляет собой G, К или отсутствует, и где Х₅ представляет собой K или отсутствует (SEQ ID NO: 86), или LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁, представляет собой любую природную аминокислоту, и где каждый из Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ представляет собой природную аминокислоту или отсутствует (SEQ ID NO: 87). В некоторых воплощениях антитело к PTK7 или конъюгат антитело-лекарственное средство может содержать аминокислотную замену аспарагина (N) на глутамин (Q) в положении 297 антитела к PTK7.

В другом аспекте антитело к PTK7 или конъюгат антитело-лекарственное средство может содержать являющийся донором ацила глутамин-содержащий маркер и аминокислотную модификацию в положении 222, 340 или 370 антитела (схема нумерации ЕС), где модификация представляет собой делецию, вставку, замену, мутацию аминокислот или их комбинацию. Соответственно, в некоторых аспектах антитело к PTK7 или конъюгат антитело-лекарственное средство может содержать являющийся донором ацила глутамин-содержащий маркер (например, Q, GGLLQGG (SEQ ID NO: 74), LLQGA (SEQ ID NO:75), GGLLQGA (SEQ ID NO:76), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81), LLQPGK (SEQ ID NO: 82), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁ представляет собой G или P, где X₂ представляет собой A, G, P или отсутствует, где X₃ представляет собой A, G, K, Р или отсутствует, где Х₄ представляет собой G, K или отсутствует, и где Х₅ представляет собой K или отсутствует (SEQ ID NO: 86), или LLQX₁X₂X₃X₄X₅, где X₁ представляет собой любую природную аминокислоту, и где Х₂, Х₃, Х₄ и Х₅ являются любыми природными аминокислотами или отсутствуют (SEQ ID NO: 87), конъюгированную по специфическому сайту (например, по карбоксильному концу тяжелой или легкой цепи или по другому сайту) антитела к PTK7, и аминокислотную модификацию в положении 222, 340 или 370 антитела (схема нумерации ЕС).

Для дополнительного увеличения количества молекул лекарственного средства на конъюгат антитело-лекарственное средство лекарственное средство может быть конъюгировано с полиэтиленгликолем (PEG), включая полиэтиленгликолевые полимеры и мономеры с прямой или разветвленной цепью. Мономер PEG имеет формулу: -(CH₂CH₂O)-. Лекарственные средства и/или пептидные аналоги могут быть связаны с PEG напрямую или опосредованно, т.е. через подходящие спейсерные группы, такие как сахара. Композиция PEG-антитело-лекарственное средство может также содержать дополнительные липофильные и/или гидрофильные группировки для способствования стабильности лекарственного средства и доставки в сайт-мишень in vivo. Репрезентативные способы получения PEG-содержащих композиций можно найти в патентах США №№ 6461603, 6309633 и 5648095 и в других источниках информации.

Например, для увеличения количества ауристатина или калихеамицина в конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, антитело может быть конъюгировано с PEG до конъюгирования с лекарственным средством, например с использованием PEG-SPA, PEG-SBA или PEG-бис-малеимид. Конъюгаты антитело-лекарственное средство, полученные с использованием PEG, могут показывать пониженную аффинность связывания с антигеном-мишенью, но все же являются эффективными за счет увеличения лекарственной нагрузки.

После конъюгирования конъюгаты могут быть выделены и очищены от неконъюгированных реагентов и/или агрегированных форм конъюгатов общепринятыми методами. Они могут включать такие методы, как эксклюзионная хроматография (SEC), ультрафильтрация/диафильтрация, ионообменная хроматография (IEC), хроматофокусирование (CF), HPLC, FPLC, или хроматография на Sephacryl S-200. Выделение может быть осуществлено также хроматографией гидрофобного взаимодействия (HIC). Подходящие среды для HIC включают хроматографическую среду Phenyl Sepharose 6 Fast Flow, хроматографическую среду Butyl Sepharose 4 Fast Flow, хроматографическую среду Octyl Sepharose 4 Fast Flow, хроматографическую среду Toyopearl Ether-650M, среду Macro-Prep methyl HIC или среду Macro-Prep t-Butyl HIC.

В некоторых аспектах изобретения выделение может быть осуществлено с использованием хроматографической среды Butyl Sepharose 4 Fast Flow. При использовании специально разработанного градиента удаляют компоненты с более высоким DAR, которые по-прежнему связаны с колонкой. В некоторых аспектах способ очистки может включать стадию центрифужного удаления клеток, возможно стадию захвата с аффинностью к белку А, затем одну или две стадии заключительной ортогональной хроматографической очистки, стадию фильтрации вирусов и стадию фильтрации в тангенциальном потоке для концентрирования и приготовления лекарственного средства.

III. Функциональные анализы для определения характеристик конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство

Настоящее изобретение также раскрывает анализы in vitro и in vivo для определения активности конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство, в том числе активности связывания с PTK7, клеточной интернализации после связывания с PTK7 антигеном, представленным на клеточной поверхности, и направленного воздействия на PTK7-экспрессирующие клетки у субъекта. В некоторых аспектах изобретения конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство характеризуются нейтрализующими или истощающими аспектами антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых аспектах изобретения конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство характеризуются неожиданной эффективностью конкретного лекарственного средства по сравнению с отсутствием эффективности альтернативного лекарственного средства. В некоторых аспектах изобретения конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство характеризуются как превосходящие терапевтический агент стандартного лечения, имеющий такой же принцип действия, как и данное лекарственное средство.

Методы детектирования связывания конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство с PTK7 антигеном или другим PTK7 антигеном известны в данной области, например анализы BIACORE^®. Дополнительные репрезентативные методы включают центрифугирование, аффинную хроматографию и другие иммунохимические методы (смотри, например, Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, N.J., United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme Immunoassay, Elsevier, Amsterdam/New York). Анализы связывания антигена могут быть осуществлены с использованием выделенного PTK7 антигена или PTK7-экспрессирующих клеток.

Специфичность связывания конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство может быть дополнительно охарактеризована определением связывающего эпитопа, т.е. идентификацией остатков, включая несопряженные остатки, которые участвуют в связывании антигена, и/или определением остатков, которые влияют на связывание антигена.

Интернализация конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство PTK7-экспрессирующими клетками может быть проанализирована путем определения количества антител или конъюгатов, связанных с поверхностью PTK7-экспрессирующих клеток, во времени (смотри, например, Пример 7). Выбранные PTK7 лиганды или их изоформы могут присутствовать в растворимой форме, и по меньшей мере какое-то количество PTK7 остается ассоциированным с клеточной поверхностью, тем самым обеспечивая интернализацию антител, раскрытых в данном документе. Соответственно, конъюгаты анти-РТК7 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут быть интернализированы клетками, которые экспрессируют PTK7. Например, конъюгат анти-РТК7 антитело-лекарственное средство, который связывается с PTK7 на поверхности опухоль-инициирующей клетки, может быть интернализирован опухоль-инициирующей клеткой. Количество интернализованных молекул ADC может быть достаточным или адекватным для уничтожения PTK7-экспрессирующей клетки, в частности PTK7-экспрессирующей опухолевой клетки. В зависимости от силы действия ADC в некоторых случаях обратный захват единственной молекулы ADC в клетку является достаточным для уничтожения клетки-мишени, с которой связывается ADC. Например, некоторые токсины обладают высокой эффективностью в уничтожении, исходя из условия, что интернализации одной молекулы токсина, конъюгированного с антителом, достаточно для уничтожения опухолевой клетки.

Интернализация антитела к PTK7 может быть оценена с использованием функционального анализа, при котором клетки инкубируют с антителом к PTK7 и Fab-фрагментом вторичного антитела, который конъюгирован с токсином сапорином. Затем измеряют жизнеспособность клеток любым подходящим методом, с клеточной цитотоксичностью, свидетельствующей об интернализации антитела (смотри Пример 7).

В некоторых аспектах изобретения антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в раскрытых конъюгатах антитело к PTK7-лекарственное средство является "антагонистом" в самом широком смысле, т.е. молекулой, которая частично или полностью блокирует, ингибирует или нейтрализует биологическую активность нативной мишени, раскрытой в данном документе, или ее транскрипцию или трансляцию. Термины "ингибировать" или "нейтрализовать", использованные в данном документе по отношению к биологической активности антитела по изобретению, означают способность антитела оказывать существенное антагонистическое действие, существенно препятствовать, предупреждать, замедлять, прерывать, исключать, останавливать, ослаблять или реверсировать, например, прогрессирование или тяжесть того, что ингибируют, включая, без ограничения, биологическую активность. Например, в некоторых аспектах изобретения конъюгат анти-РТК7 антитело-лекарственное средство способствует уничтожению клеток при интернализации конъюгата антитело-лекарственное средство. Например, нейтрализующее антитело или антагонист предпочтительно будет снижать функцию PTK7 по меньшей мере на примерно 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% или более.

В других аспектах изобретения конъюгаты анти-РТК7 антитело-лекарственное средство по настоящему изобретению могут представлять собой истощающие антитела. Термин "истощающее антитело" относится к антителу, которое связывается с или ассоциируется с PTK7 на или вблизи клеточной поверхности и индуцирует, промотирует или вызывает гибель или элиминацию клетки (например, за счет комплемент-зависимой цитотоксичности или антитело-зависимой клеточной цитотоксичности). Предпочтительно, истощающее антитело будет способно удалять, элиминировать или уничтожать по меньшей мере 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% или 99% сохраняющихся опухолевых клеток в определенной популяции клеток.

Функциональные анализы также включают методы оценки противораковой активности конъюгатов антитело-лекарственное средство, например способности разрушать существующие раковые клетки или задерживать или предотвращать рост раковых клеток. Виды рака, на которые направленно воздействуют конъюгаты антитело-лекарственное средство по изобретению, включают как первичные, так и метастазированные опухоли и карциномы любой ткани субъекта, включая карциномы и гематопоэтические злокачественные заболевания, такие как лейкозы и лимфомы.

Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, обладающие ингибирующей рост активностью, могут элиминировать PTK7-экспрессирующие клетки или предотвращать или снижать пролиферацию PTK7-экспрессирующих раковых клеток. Репрезентативные методы быстрой оценки in vitro ингибирования роста клеток описаны в Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98.

Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство могут также иметь способность индуцировать гибель клеток, например запрограммированную гибель клеток, характеризующуюся деградацией ядерной ДНК, ядерной дегенерацией и конденсацией, потерей целостности мембран и фагоцитозом. Репрезентативные анализы для оценки клеток описаны в in Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J. 17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem. 51:873-885.

Например, чтобы оценить цитотоксичность конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство in vitro, PTK7-экспрессирующие раковые клетки и контрольные клетки культивируют в присутствии конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство и отдельно со свободным лекарственным средством. Цитотоксичность каждого агента выражают в виде показателя ED50 (нг/мл), который представляет собой количество лекарственного средства, введенного в виде конъюгата или в виде свободного лекарственного средства, которое вызывает 50%-ное сокращение клеточной культуры относительно необработанного контроля. Количество клеток в культуре определяют с использованием витального красителя (MTS) после воздействия лекарственного средства (смотри Пример 12).

Чтобы оценить цитотоксичность конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство in vivo, у мышей NOD/SCID, "голых" (nu/nu) мышей или мышей другой линии с ослабленным иммунитетом создают опухоли подкожным инъецированием различных раковых клеток. Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство и контрольные соединения можно вводить имеющим опухоль мышам, например, интраперитонеальной инъекцией дважды в неделю в течение двух недель (q4dx4). Измеряемые терапевтические результаты включают ингибирование роста опухолевых клеток (смотри Пример 13).

Кроме того, согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, которые могут истощать, останавливать, нейтрализовать, элиминировать или ингибировать рост, размножение или выживание опухолевых клеток, включая опухоль-инициирующие клетки (TIC), и/или ассоциированную неоплазию через различные механизмы, включая агонистическое или антагонистическое воздействие на выбранные пути или элиминирование специфических клеток в зависимости, например, от анти-РТКТ антитела или дозирования и способа доставки.

В данном документе термин "опухоль-инициирующая клетка" ("tumor initiating cell") (TIC) охватывает как клетки, постоянно поддерживающие опухоль (tumor perpetuating cells) (ТРС; т.е. раковые стволовые клетки или CSC), так и высокопролиферативные клетки-предшественники опухоли (tumor progenitor cells) (TProg), которые вместе, как правило, включают уникальную субпопуляцию (т.е. 0,1-40%) объемной опухоли или массы. В целях раскрытия настоящего изобретения термины "клетки, постоянно поддерживающие опухоль" и "раковые стволовые клетки" эквивалентны и могут быть использованы взаимозаменяемо. Напротив, ТРС отличаются от TProg тем, что они могут полностью повторять строение опухолевых клеток, существующих в опухоли, и имеют неограниченные возможности самообновления, как это было продемонстрировано в результате серийной трансплантации (два или более пассажей через мышей) небольших количеств выделенных клеток. В данном документе термин "опухоль-инициирующая клетка" также относится к раковым стволовым клеткам различных гематологических злокачественностей, которые не характеризуются непосредственно опухолью per se.

Согласно настоящему изобретению предложены конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, которые направленно воздействуют на опухоль-инициирующие клетки (TIC), и в частности клетки, постоянно поддерживающие опухоль (ТРС), тем самым способствуя лечению, управлению течением или предупреждению неопластических расстройств и гиперпролиферативных расстройств. Более конкретно, конкретные субпопуляции опухолевых клеток экспрессируют PTK7 и по всей вероятности модифицируют локализованную координацию морфогенетической передачи сигналов, важную для самовозобновления раковых стволовых клеток и жизнеспособности клеток. Таким образом, конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство могут быть использованы снижения частоты TIC при введении субъекту. Снижение частоты опухоль-инициирующих клеток может происходить в результате а) элиминации, истощения, сенситизации, выключения (сайлесинга) или ингибирования опухоль-инициирующих клеток; б) контролирования роста, распространения или повторного появления опухоль-инициирующих клеток; в) прерывания инициации, размножения, поддержания или пролиферации опухоль-инициирующих клеток; или г) иного затруднения выживания, регенерации и/или метастазирования опухолегенных клеток. В некоторых аспектах изобретения снижение частоты опухоль-инициирующих клеток происходит в результате изменения одного или более физиологических путей. Изменение пути, в результате снижения или элиминации опухоль-инициирующих клеток, или модификации их потенциала (например, индуцированной дифференциации, разрушения ниши), или иного вмешательства в их способность оказывать воздействия на опухолевое окружение или другие клетки, в свою очередь обеспечивает более эффективное лечение PTK7-ассоциированных расстройств посредством ингибирования опухолегенеза, ингибирования поддержания опухоли и/или ингибирования метастазирования и повторного появления.

Среди методов, которые могут быть использованы для оценки такого снижения частоты опухоль-инициирующих клеток, имеется анализ с ограничением разведений либо in vitro, либо in vivo, предпочтительно с последующим подсчетом с использованием статистики распределения Пуассона, или оценка частоты предопределенных характерных событий, таких как способность генерировать опухоли in vivo или отсутствие такой способности. Снижение значений частоты можно также определять общеизвестными проточными цитометрическими или иммуногистохимическими методами. Информацию о всех вышеупомянутых методах смотри, например, в публикациях Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 и Hoey et al. 2009, PMID: 19664991, каждая из которых во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки. Другие методы, согласующиеся с настоящим изобретением, которые могут быть использованы для вычисления частоты опухоль-инициирующих клеток, включают поддающиеся количественному определению методы проточной цитометрии и иммуногистохимические методики окрашивания.

С использованием вышеупомянутых методов затем можно количественно определить снижение частоты TIC (или ТРС в них), обеспеченное раскрытыми конъюгатами антитело к PTK7-лекарственное средство в соответствии с представленной в данном описании информацией. В некоторых случаях конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по настоящему изобретению могут снижать частоту TIC (по различным механизмам, указанным выше, включая элиминацию, индуцированную дифференциацию, разрушение ниши, сайлесинг и т.д.), на 10%, 15%, 20%, 25%, 30% или даже на 35%. В других аспектах изобретения снижение частоты TIC может составлять порядка 40%, 45%, 50%, 55%, 60% или 65%. В некоторых аспектах изобретения раскрытые соединения могут снижать частоту TIC на 70%, 75%, 80%, 85%, 90% или даже 95%. Будет понятно, что любое снижение частоты TIC приводит к соответствующему снижению опухолегенности, персистентности, рекуррентности и агрессивности неоплазии.

Накопленные данные подкрепляют гипотезу, что рост опухоли, резистентность к терапии и рецидив болезни контролируются ТРС. Частота ТРС может варьировать в зависимости от типа опухоли или между пациентами с одинаковым типом опухоли как результат стадии расстройства и/или степень дифференцировки в опухоли. ТРС могут быть идентифицированы и обогащены с использованием панелей маркеров клеточной поверхности, которые часто перекрываются по их экспрессии среди пациентов с некоторыми типами рака. ТРС лучше всего определяются по их функциональной способности инициировать опухоли после последовательной трансплантации, поскольку клетки, не являющиеся опухолегенными (NTG), лишены этой способности. Клетки солидных опухолей, обогащенные для определения их способности инициировать опухоль, впервые были идентифицированы в раке молочной железы; однако рак молочной железы включает в себя целый спектр злокачественных образований. К настоящему времени научное сообщество не связывает конкретные ТРС идентичности с конкретными подтипами расстройств, которые могут лежать в основе противоречивых результатов как между, так и внутри групп и могут также увеличивать вероятность не состоявшегося перевода в клинику.

Согласно настоящему изобретению предложена комбинация новых маркеров клеточной поверхности, которые улучшают обогащение ТРС. В конкретном аспекте изобретения предложена комбинация новых маркеров клеточной поверхности, которые способствуют обогащению ТРС трижды негативного рака молочной железы (TNBC). Настоящее изобретение предусматривает также идентификацию PTK7 в качестве новой ТРС-ассоциированной терапевтической мишени при TNBC, уровень экспрессии которой значительно выше, чем при других подтипах рака молочной железы и в нормальной ткани.

Фармакокинетика конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство можно оценивать и сравнивать с фармакокинетикой неконъюгированного антитела у различных животных. Например, это может быть сделано после введения однократного внутривенного болюса самкам мышей NOD/SCID, "голых" (nu/nu) мышей или мышей другой линии с ослабленным иммунитетом, самцам крыс Sprague-Dawley и самкам яванского макака. Фармакокинетика конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство обычно характеризуется низким клиренсом, низким объемом распределения и длительным видимым конечным сроком жизни у различных видов. Ожидается, что концентрации в сыворотке крови неконъюгированных производных ауристатина будут ниже предела количественного определения. Ожидается, что профиль токсичности для этих конъюгатов в исследованиях в диапазоне токсичности одной дозы будет сходен с профилем, полученном для других конъюгатов антитело-лекарственное средство в сравнимых дозах.

Антитело, конъюгат антитело-лекарственное средство или другой агент, которое(ый) "индуцирует апоптоз", является антителом, конъюгатом антитело-лекарственное средство или другим агентом, которое(ый) индуцирует запрограммированную гибель клеток, определенную по связыванию аннексина V, фрагментации ДНК, сжатию клетки, расширению эндоплазматического ретикулума, клеточной фрагментации и/или образованию мембранных везикул (называемых апоптическаими тельцами). Клетка представляет собой клетку опухоли, например молочной железы, яичника, опухоли ободочной кишки и прямой кишки, опухоли предстательной железы, печени и легкого. Различные методы доступны для оценки клеточных событий, ассоциированных с апоптозом. Например, транслокация фосфатидилсерина (PS) может быть измерена посредством связывания аннексина; фрагментация ДНК может быть оценена посредством расщепления ДНК (эффект "лестницы); и ядерная/хроматиновая конденсация одновременно с фрагментацией ДНК может быть оценена по увеличению гиподиплоидных клеток.

В данном документе "антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность", или "ADCC", относится к клеточно-опосредованной реакции, в которой неспецифические цитотоксические клетки, которые экспрессируют Fc рецепторы (FcR) (например природные клетки-киллеры (NK), нейтрофилы и макрофаги) распознают связанное антитело на клетке-мишени и после этого вызывают лизис клетки-мишени. ADCC активность молекулы, представляющей интерес, может быть оценена с использование анализа ADCC in vitro, такого как анализ, описанный в патенте США № 5500362 или 5821337. Полезные эффекторные клетки для такого анализа включают мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и NK клетки. Альтернативно, или дополнительно, ADCC активность молекулы, представляющей интерес, может быть оценена in vivo, например в животной модели, такой как модель, раскрытая в Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).

"Комплемент-зависимая цитотоксичность", или "CDC", относится к лизированию мишени в присутствии комплемента. Путь активации комплемента инициируется связыванием первого компонента системы комплемента (C1q) с молекулой (например антителом) в комплексе с родственным антигеном. Для оценки активации комплемента может быть осуществлен анализ CDC, который описан, например, в Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163-171 (1997).

"Эффекторные клетки человека" представляют собой лейкоциты, которые экспрессируют один или более FcR и осуществляют эффекторные функции. Эти клетки могут экспрессировать FcyRIII и выполнять эффекторую функцию антиген-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Примеры человеческих лейкоцитов, опосредующих ADCC, включают, но не ограничены ими, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), природные клетки-киллеры (NK), моноциты, макрофаги, эозинофилы и нейтрофилы, причем РВМС и NK клетки являются предпочтительными. Антитела, которые обладают ADCC активностью, типично являются антителами изотипа IgG1 или IgG3. Такие ADCC-опосредующие антитела также могут быть получены путем конструирования вариабельной области от не-ADCC антитела или фрагмента вариабельной области до константной области изотипа IgG1 или IgG3.

IV. Применение конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство

Антитела и конъюгаты антитело лекарственное средство по настоящему изобретению полезны в различных применениях, включая, без ограничения, способы терапевтического лечения и способы диагностического лечения.

IV.A. Применение in vitro

Согласно настоящему изобретению предложены способы in vitro с использованием конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство. Например, раскрытые антитела могут быть использованы, либо сами по себе, либо в комбинации с цитотоксическим и агентами или другими лекарственными средствами, для специфического связывания PTK7-положительных раковых клеток с целью истощения таких клеток из клеточного образца. Предложены также способы индуцирования апоптоза и/или ингибирования клеточной пролиферации посредством приведения PTK7-экспрессирующих клеток в контакт с конъюгатом антитело к PTK7-лекарственное средство. Репрезентативные способы in vitro описаны в данном документе выше под заголовком "Функциональные анализы для определения характеристик конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство".

Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению также полезны в обнаружении PTK7-положительных клеток in vitro на основе их способности специфически связывать PTK7 антиген. Способ обнаружения PTK7-экспрессирующих клеток может включать: (а) получение биологического образца, имеющего клетки; (б) приведение конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство в контакт с биологическим образцом in vitro, где лекарственное средство представляет собой детектируемую метку; и (в) детектирование связывания конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство.

Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытые в данном документе, также полезны для снижения частоты опухоль-инициирующих клеток в образце опухоли. Например, способ может включать стадии in vitro приведения популяции опухолевых клеток, содержащей опухоль-инициирующие клетки и опухолевые клетки, иные, чем опухоль-инициирующие клетки, в контакт с конъюгатом антитело к PTK7-лекарственное средство, в результате чего процент опухоль-инициирующих клеток в популяции клеток снижается. В данном документе термин "опухоль-инициирующая клетка" также относится к раковым стволовым клеткам различных гематологических злокачественностей, которые не характеризуются опухолью per se. Репрезентативные образцы опухолей включают любой биологический или клинический образец, который содержит опухолевые клетки, например образец ткани, биопсию, образец крови, плазму, слюну, мочу, семенную жидкость и т.д.

IV.B. Терапевтическое применение

РТК7-ассоциированные расстройства или состояния включают, но не ограничены ими, мезотелиому, гепатобилиарную (печеночную и желчного протока), печеночноклеточную карциному, первичную или вторичную опухоль CNS, первичную или вторичную опухоль головного мозга, рак легкого (NSCLC и SCLC), рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак в области головы или шеи, меланому, рак яичника, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, желудочно-кишечный рак (такой как рак желудка, рак ободочной кишки и прямой кишки и дуоденальный рак), рак молочной железы (такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы), рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечника, саркому мягкой ткани, рак мочеточника, рак пениса, рак предстательной железы, рак яичка, лейкозы (такие как острый миелоидный лейкоз (AML) и острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический миелоидный лейкоз), лимфоцитарные лимфомы, рак мочевого пузыря, рак почки или уретры, почечноклеточную карциному, карциному почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (CNS), первичную лимфому CNS, неходжкинскую лимфому, опухоли позвоночника, глиому ствола головного мозга, гипофизарную аденому, рак коры надпочечников, рак желчного пузыря, множественную миелому, холангиокарциному, фибросаркому, нейробластому, ретинобластому и все виды рака, представленные PTK7-экспрессирующими типами клеток, указанными в Таблицах 8 и 9, или комбинацию одного или более видов рака, раскрытых в данном описании.

Фразы "эффективное количество", "эффективная дозировка" или относятся к количеству лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции, необходимому для достижения любого одного или более полезных или желаемых терапевтических результатов. Для профилактического применения полезные или желаемые результаты включают элиминацию или снижение риска, уменьшение тяжести или задержку начала расстройства, включая биохимические, гистологические и/или поведенческие симптомы расстройства, его осложнения и промежуточные патологические фенотипы, присутствующие во время развития расстройства. Для терапевтического применения полезные или желаемые результаты включают клинические результаты, такие как снижение инцедентности или ослабление одного или более симптомов различных PTK7-ассоциированных расстройств, уменьшение дозы других лекарственных средств, необходимых для лечения расстройства, усиление эффекта другого лекарственного средства и/или задержка прогрессирования расстройства, ассоциированного с PTK7, у пациентов.

В одном аспекте изобретения предложен способ лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, у субъекта. Согласно изобретению предложен также конъюгат антитело-лекарственное средство или фармацевтическая композиция, как описано в данном документе, для применения в способе лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, у субъекта. Согласно изобретению предложено также применение конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, как описано в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, у субъекта.

В некоторых аспектах изобретения способ лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, у субъекта включает введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции (например, фармацевтической композиции), имеющей конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, которые описаны в данном документе. Расстройства, ассоциированные с экспрессией PTK7, включают, без ограничения, аномальную экспрессию PTK7, измененную или аберрантную экспрессию PTK7, сверхэкспрессию PTK7 и пролиферативное расстройство (например, рак).

В одном аспекте изобретения расстройство представляет собой рак, включая, без ограничения, мезотелиому, гепатобилиарную (печеночную и желчного протока), печеночноклеточную карциному, первичную или вторичную опухоль CNS, первичную или вторичную опухоль головного мозга, рак легкого (NSCLC и SCLC), рак кости, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак в области головы или шеи, меланому, рак яичника, рак ободочной кишки, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, желудочно-кишечный рак (такой как рак желудка, рак ободочной кишки и прямой кишки и дуоденальный рак), рак молочной железы (такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы), рак матки, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, cancer of the рак надпочечника, саркому мягкой ткани, cancer мочеточника, рак пениса, рак предстательной железы, рак яичка, лейкозы (такие как острый миелоидный лейкоз (AML) и острый лимфобластный лейкоз (ALL), хронический миелоидный лейкоз), лимфоцитарные лимфомы, рак мочевого пузыря, рак почки или уретры, почечноклеточную карциному, карциному почечной лоханки, новообразования центральной нервной системы (CNS), первичную лимфому CNS, неходжкинскую лимфому, опухоли позвоночника, глиому ствола головного мозга, гипофизарную аденому, рак коры надпочечников, рак желчного пузыря, множественную миелому, холангиокарциному, фибросаркому, нейробластому, ретинобластому и все виды рака, представленные PTK7-экспрессирующими типами клеток, указанными в Таблицах 8 и 9, или комбинацию одного или более видов рака, раскрытых в данном документе.

В другом воплощении виды рака, подходящие для направленного воздействия с использованием конъюгата анти-РТК7 антитело-лекарственное средство, включают PTK7-экспрессирующие первичные и матастазирующие виды рака, такие как рак молочной железы (такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы); рак яичника; рак ободочной кишки и прямой кишки; рак пищевода; рак желудка; меланому; саркому; рак почки; рак поджелудочной железы; рак предстательной железы; рак печени, такой как печеночноклеточная карцинома (НСС); и рак легкого, такой как немелкоклеточный рак легкого (NSCLC) и мелкоклеточный рак легкого (SCLC).

В более конкретном воплощении виды рака, подходящие для направленного воздействия с использованием конъюгата анти-РТК7 антитело-лекарственное средство, включают PTK7-экспрессирующие первичные и метастазирующие виды рака, такие как рак молочной железы (такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC), прогестероновый рецептор-позитивный рак молочной железы (PR+), эстрогеновый рецептор-позитивный рак молочной железы (ER+) и дважды позитивный рак молочной железы) NSCLC, рак предстательной железы и рак пищевода. В более конкретном воплощении виды рака, подходящие для направленного воздействия с использованием конъюгата анти-РТК7 антитело-лекарственное средство, включают PTK7-экспрессирующие первичные и метастазирующие виды рака, такие как рак молочной железы (такой как трижды негативный рак молочной железы (TNBC)) и NSCLC.

В некоторых аспектах изобретения предложен способ ингибирования роста опухоли или прогрессирования у субъекта, имеющего PTK7-экспрессирующую опухоль, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, имеющей конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе. В других аспектах изобретения предложен способ ингибирования метастазирования PTK7-экспрессирующих раковых клеток у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, имеющей конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе. В других аспектах изобретения предложен способ регрессии PTK7-экспрессирующей опухоли у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту эффективного количества композиции, имеющей конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе. В других аспектах изобретения предложен конъюгат антитело-лекарственное средство или фармацевтическая композиция, как описано в данном документе, для применения в способе, который описан выше. В других аспектах изобретения предложено применение конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, как описано в данном документе, в изготовлении лекарственного средства для применения в способах, описанных выше.

Таким образом, пациенты, подлежащие лечению конъюгатами антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению, могут быть выбраны на основе экспрессии биомаркера, включая, без ограничения, мРНК (кПЦР) образцов объемной опухоли и повышенную экспрессию PTK7 антигена, которая приводит к популяции пациентов, выбранных для обогащенной экспрессии мишени, а не гистологии или происхождения опухоли. Экспрессия мишени может быть измерена как функция количества окрашивающихся клеток в совокупности с интенсивностью окрашивания клеток. Например, классификация высокой экспрессии PTK7 включает тех пациентов, у которых более чем 30% (т.е. 40%, 50% или 60%) клеток, протестированных иммуногистохимическим окрашиванием, являются положительным в отношении PTK7 на уровне 3+ (по шкале от 1 до 4), тогда как умеренная экспрессия PTK7 может включать тех пациентов, у которых более чем 20% клеток с окрашивание на уровне от 1+ до 2+. Экспрессия мишени может быть также измерена путем детектирования экспрессии PTK7 на опухоль-инициирующих клетках (TIC), как описано в данном документе.

Для выбора пациентов могут быть использованы также биомаркеры, иные чем экспрессия PTK7, в том числе характеристика опухоли, исходя из множественной лекарственной устойчивости (MDR), например. Почти 50% видов рака человека являются либо полностью устойчивыми к химиотерапии, либо реагируют только временно, после чего обычно используемые противораковые лекарственные средства на них больше не действуют. Это явление называется MDR и по своей сути выражается некоторыми типами опухолей, хотя другие приобретают MDR после химиотерапевтического лечения. Р-гликобелок эффлюксного насоса лекарственного средства опосредует большинство MDR, ассоциированных с цитотоксическими химиотерапиями. Фенотипический и функциональный анализ механизмов MDR, имеющих место в видах раковых опухолей пациентов, может быть проведен, чтобы соотнести специфический(ие) механизм(ы) MDR с устойчивостью к химиотерапии при конкретных типах опухолей.

Рост и аномальная пролиферация раковых клеток относится к любому из множества показателей, которые свидетельствуют об изменениях в клетках до более развившейся формы рака или болезненного состояния. Ингибирование роста раковых клеток или клеток не являющегося неопластическим пролиферативным расстройством, такое как задержанный рост опухоли и ингибирование метастазирования, может быть проанализировано методами, известными в данной области. Другие показатели для измерения ингибирования роста рака включают снижение жизнеспособности раковых клеток, уменьшение объема опухоли или морфология (например, определяемая с использованием компьютерной томографии (СТ), сонографии или другого метода визуализации), деструкция сосудистой сети опухоли, улучшенные показатели теста на гиперчувствительность кожи замедленного типа, увеличение активности цитолитических Т-лимфоцитов и снижение уровней опухоль-специфических антигенов.

Желаемыми результатами раскрытых терапевтических способов являются, как правило, количественные показатели по сравнению с показателями контрольных или исходных измерений. Использованные в данном документе родственные термины, такие как "улучшать", "увеличивать" или "снижать", указывают значения по отношению к контролю, такие как показатели измерений у одного и того же индивидуума до начала лечения, описанного в данном документе, или показатели измерений у контрольного индивидуума (или множества контрольных индивидуумов) в отсутствие лечения, описанного в данном документе. Репрезентативным контрольным индивидуумом является индивидуум, пораженный той же формой гиперпролиферативного расстройства, что и индивидуум, которого лечат, примерно того же возраста, как и индивидуум, которого лечат (чтобы гарантировать, что стадии расстройства у индивидуума, которого лечат, и контрольного индивидуума были сравнимыми).

Изменения или улучшение ответной реакции на терапию, как правило, являются статистически значимыми. В данном документе термин "значимость" или "значимый" относится к статистическому анализу вероятности того, что имеется неслучайная связь между двумя или более объектами. Чтобы определить, является или не является взаимосвязь "значимой" или имеется ли "значимость", статистическая обработка данных может представлять собой "р-значение". Эти р-значения, которые опускаются ниже определенной пользователем точки отсечки, считаются значимыми. р-Значение менее или равное 0,1, менее 0,05, менее 0,01, менее 0,005 или менее 0,001 можно считать значимым.

Как описано в данном документе выше под заголовком "III. Функциональные анализы для определения характеристик конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство", согласно настоящему изобретению предложены также способы направленного воздействия на опухоль-инициирующие клетки. Более конкретно, конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению могут истощать, подавлять, нейтрализовать, элиминировать или ингибировать рост, размножение или выживание опухолевых клеток, включая опухоль-инициирующие клетки.

Таким образом, конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытые в данном документе, полезны также для снижения частоты опухоль-инициирующих клеток в образце опухоли. Например, данный способ может включать стадии приведения популяции опухолевых клеток, содержащие опухоль-инициирующие клетки и опухолевые клетки, иные, чем опухоль-инициирующие клетки, в контакт с конъюгатом антитело к PTK7-лекарственное средство, в результате чего процент опухоль-инициирующих клеток в популяции клеток снижается. В данном документе термин "опухоль-инициирующая клетка" также относится к раковым стволовым клеткам различных гематологических злокачественностей, которые не характеризуются опухолью per se. Стадия приведения в контакт может быть осуществлена in vitro, где популяция опухолевых клеток содержится в биологическом образце, как описано в данном документе выше. Альтернативно, стадия приведения в контакт может быть осуществлена in vivo после введения конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство субъекту.

IV.C. Обнаружение и диагностика in vivo

В другом аспекте предложено способ обнаружения, диагностики и/или мониторинга расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7. Например, антитела к PTK7, как описано в данном документе, могут быть мечены детектируемой группировкой, такой как визуализирующий агент и метка фермент-субстрат. Антитела, как описано в данном документе, могут быть также использованы для диагностического анализа in vivo, такого как визуализация in vivo (например, методом PET или SPECT) или анализа с использованием окрашивающего реагента.

После введения конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство субъекту, где лекарственное средство представляет собой детектируемую метку, и после периода времени, достаточного для связывания, биораспределение PTK7-экспрессирующих клеток, связанных антителом может быть визуализировано. Раскрытые диагностические способы могут быть использованы в комбинации со способами лечения. Кроме того, конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению можно вводить с двойной целью обнаружения и терапии.

Репрезентативные неинвазивные способы обнаружения включают сцинтиграфию (например, SPECT (однопротонная эмиссионная компьютерная томография), PET (позитронная эмиссионная томография), гамма-камерная визуализация и линейная развертка), магнитно-резонансная визуализация (например, конвенционная магнитно-резонансная визуализация, визуализация переноса намагничивания (MTI), протонная магнитно-резонансная спектроскопия (MRS), диффузионно-взвешенная визуализация (DWI) и функциональная MR визуализация (fMRI)) и ультразвук.

IV.D. Композиция

Согласно настоящему изобретению предложены также фармацевтические композиции, содержащие любой из конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, раскрытых в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Дополнительно, композиции могут содержать больше чем одно антитело к PTK7 или больше чем один конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство (например, смесь антител к PTK7, которые распознают разные эпитопы PTK7). Другие иллюстративные композиции содержат больше чем одно антитело PTK7 или больше чем один конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, которые распознают один и тот же эпитоп(ы), или разные виды антител к PTK7 или конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство, которые связываются с разными эпитопами PTK7 (например, PTK7 человека).

Композиция, используемая в настоящем изобретении, может дополнительно содержать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. К. E. Hoover), в форме лиофилизированных препаратов или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиента в определенных дозировках и концентрациях и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкил-парабены, такие как метил- или пропил-парабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу, или декстраны; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ионы натрия; металлические комплексы (например комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG). "Фармацевтически приемлемая соль" в данном документе относится к фармацевтически приемлемым органическим или неорганическим солям молекулы или макромолекулы. Фармацевтически приемлемые эксципиенты также описаны в данном документе.

Различные композиции антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство могут быть использованы для введения. В некоторых аспектах изобретения антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство можно вводить чистым. Антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство и фармацевтически приемлемый эксципиент могут быть в различных формах. Фармацевтически приемлемые эксципиенты известны в данной области и представляют собой относительно инертные вещества, которые облегчают введение фармакологически эффективного вещества. Например, эксципиент может придавать форму или консистенцию или может действовать в качестве разбавителя. Подходящие эксципиенты включают, но не ограничены ими, стабилизирующие агенты, увлажняющие и эмульгирующие агенты, соли для варьирования осмоляльности, инкапсулирующие агенты, буферы и усилители проницаемости через кожу. Эксципиенты, а также композиции для парентеральной и непарентеральной доставки лекарственного средства изложены в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000.

В некоторых аспектах изобретения эти агенты приготовлены в форме для введения инъекциями (например, интраперитонеально, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Соответственно, эти агенты могут быть объединены с фармацевтически приемлемыми носителями, такими как физиологический раствор, раствор Рингера, раствор декстрозы и т.п. Конкретный режим дозировки, т.е. доза, распределение по времени и многократность будут зависеть от конкретного индивидуума и истории болезни индивидуума.

Терапевтические композиции антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство, используемые в соответствии с настоящим изобретением, готовят для хранения путем смешивания антитела, имеющего желаемую степень чистоты, с возможными фармацевтически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и могут содержать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; соли, такие как хлорид натрия; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония, хлорид бензетония; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкил-парабены, такие как метил- или пропил-парабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (менее примерно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу, или декстраны; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как ионы натрия; металлические комплексы (например комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, PLURONICS™ или полиэтиленгликоль (PEG).

Липосомы, содержащие антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, получают способами, известными в данной области, такими как способы, описанные в Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); и патенты США №№ 4485045 и 4544545. Липосомы с повышенными временем циркуляции в крови описаны в патенте США № 5013556. Особенно полезные липосомы могут быть изготовлены методом обращенно-фазного выпаривания с использованием липидной композиции, содержащей фосфатидилхолин, холестерин и PEG-дериватизированный фосфатидилэтаноламин (PEG-PE). Липосомы экструдируют через фильтры с определенным размером пор с получением липосом желаемого диаметра.

Активные ингредиенты могут быть также заключены в микрокапсулы, изготовленные, например, методами коацервации или посредством межфазной полимеризации, например гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидных системах доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы описаны в Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.

Могут быть приготовлены препараты длительного высвобождения. Подходящие примеры препаратов длительного высвобождения включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие антитело, причем эти матрицы находятся в форме сформованных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц длительного высвобождения включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтил-метакрилат) или поли(виниловый спирт)), полиактиды (патент США № 3773919), сополимеры L-глутаминовой кислоты и 7-этил-L-глутамата, неразлагаемый этиленвинилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты и гликолевой кислоты, такие как LUPRON DEPOT™ (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной кислоты и гликолевой кислоты и лейпролидацетата), изобутират-ацетат сахарозы и поли-D-(-)-3-гидроксимасляную кислоту.

Композиции, предназначенные для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко осуществляется, например, фильтрованием через стерильные фильтрационные мембраны. Терапевтические композиции антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство обычно помещают в контейнер, имеющий порт стерильного доступа, например мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, протыкаемую иглой для подкожных инъекций.

Композиции согласно настоящему изобретению могут находиться в стандартных лекарственных формах, таких как таблетки, пилюли, капсулы, порошки, гранулы, растворы или суспензии или суппозитории, для перорального, парентерального или ректального введения или введения ингаляцией или инсуффляцией.

Для изготовления твердых композиций, таких как таблетки, активный ингредиент смешивают с фармацевтическим носителем, например обычными таблетирующими ингредиентами, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарат магния, дикальцийфосфат или камеди, и другими фармацевтическими разбавителями, например водой, с образованием предварительной твердой композиции, содержащей гомогенную смесь соединения по настоящему изобретению или его нетоксичной фармацевтически приемлемой соли. При упоминании этих предварительных композиций как гомогенных имеется в виду, что активный ингредиент диспергирован равномерно по всей композиции, так что композиция может быть разделена на эффективные в равной степени стандартные лекарственные формы, такие как таблетки, пилюли и капсулы. Эту твердую предварительную композицию затем разделяют на стандартные лекарственные формы типа, описанного выше, содержащие от 0,1 до примерно 500 мг активного ингредиента по настоящему изобретению. Таблетки или пилюли новой композиции могут быть покрыты оболочкой или иным образом компаундированы с получением лекарственной формы, обеспечивающей преимущество пролонгированного действия. Например, таблетка или пилюля может включать в себя внутренний дозировочный компонент и внешний дозировочный компонент, причем последний в форме оболочки, покрывающей первый. Эти два компонента могут быть разделены энтеросолюбильным слоем, который служит для того, чтобы противостоять распаду в желудке и давать возможность внутреннему компоненту проходить в двенадцатиперстную кишку или замедлять высвобождение. Множество различных веществ можно использовать для таких энтеросолюбильных слоев или покрытий, и такие вещества включают ряд полимерных кислот и смесей полимерных кислот с таким веществами, как шеллак, цетиловый спирт и ацетат целлюлозы.

Подходящие поверхностно-активные агенты включают, в частности, неионные агенты, такие как полиоксиэтилесорбитаны (например TWEEN™ 20, 40, 60, 80 или 85) и другие сорбитаны (например Span™ 20, 40, 60, 80 или 85). Композиции с поверхностно-активным агентом обычно будут содержать от 0,05 до 5% поверхностно-активного агента и могут содержать от 0,1 до 2,5%. Будет понятно, что могут быть добавлены другие ингредиенты, например маннит, или другие фармацевтически приемлемые носители, если необходимо.

Подходящие эмульсии могут быть получены с использованием коммерчески доступных жировых эмульсий, таких как INTRALIPID™, LIPOSYN™, INFONUTROL™, LIPOFUNDIN™ и LIPIPHYSAN™. Активный ингредиент может быть либо растворен в предварительно смешанной эмульсионной композиции, либо, альтернативно, он может быть растворен в масле (например соевом масле, подсолнечном масле, хлопковом масле, кунжутном масле, кукурузном масле или миндальном масле), и эмульсия образуется при смешивании с фосфолипидом (например яичными фосфолипидами, соевыми фосфолипидами или соевым лецитином) и водой. Будет понятно, что могут быть добавлены другие ингредиенты, например глицерин или глюкоза, для регулирования тоничности эмульсии. Подходящие эмульсии обычно будут содержать вплоть до 20% масла, например от 5 до 20%. Жировая эмульсия может содержать жировые капли размером от 0,1 до 1,0 мкм, в частности от 0,1 до 0,5 мкм и иметь рН в диапазоне от 5,5 до 8,0.

Эмульсионные композиции могут представлять собой композиции, приготовленные путем смешивания антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство с INTRALIPID™ или его компонентами (соевое масло, яичные фосфолипиды, глицерин и вода).

Композиции для ингаляции или инсуффляции включают растворы и суспензии в фармацевтически приемлемых водных или органических растворителях или их смесях и порошки. Жидкие или твердые композиции могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые эксципиенты, которые описаны выше. В некоторых аспектах изобретения композиции вводят пероральным или назально-респираторным путем для местного или системного воздействия. Композиции в предпочтительно стерильных фармацевтически приемлемых растворителях можно распылять с использованием газов. Распыленные растворы можно вдыхать непосредственно из распыляющего устройства, или распыляющее устройство может быть присоединено к лицевой маске, тенту или дыхательной системе с положительным перемежающимся давлением. Композиции в форме раствора, суспензии или порошки можно вводить, предпочтительно перорально или назально, из устройств, которые доставляют композицию соответствующим образом.

Согласно изобретению предложены также наборы для использования в настоящих способах. Наборы по изобретению включают один или более контейнеров, содержащих антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе, и инструкции по применению в соответствии с любым из способов по изобретению, описанных в данном документе. Как правило, эти инструкции содержат описание введения антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство для описанного выше терапевтического лечения.

Инструкции, относящиеся к применению антител к PTK7 или конъюгатов антител к PTK7, как описано в данном документе, обычно содержат информацию о дозировке, схеме введения доз и пути введения для назначенного лечения. Контейнеры могут представлять собой контейнеры для стандартных доз, объемные упаковки (например, многодозовые упаковки) или контейнеры для субдоз. Инструкции, поставляемые в наборах по изобретению, обычно представляют собой письменные инструкции на этикетке или вкладыше в упаковку (например, бумажный листок, вложенный в набор), но машинописные инструкции (например, инструкции на магнитном или оптическом запоминающем диске) также приемлемы.

Наборы по изобретению находятся в подходящей упаковке. Подходящие упаковки включают, без ограничения, флаконы, бутылочки, баночки, гибкие упаковки (например, герметичные майларовые или пластиковые пакеты) и т.п. Предусмотрены также упаковки для использования в комбинации с конкретным устройством, таким как ингалятор, устройство для назального введения (например, распылитель) или инфузионное устройство, такое как мининасос. Набор может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). Контейнер также может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой мешок для внутривенного раствора или флакон, имеющий пробку, прокалываемую иглой для подкожных инъекций). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство. Контейнер может также содержать второй фармацевтически активный агент.

Наборы возможно могут предоставлять дополнительные компоненты, такие как буферы, и пояснительную информацию. В норме набор включает в себя контейнер и этикетку или вкладыш(и) в упаковку на контейнере или совместно с контейнером.

IV.E. Доза и введение

Для применений in vitro и in vivo конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство предоставляют или вводят в эффективной дозировке. В клиническом контексте эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции представляет собой количество, достаточное для осуществления профилактического или терапевтического лечения непосредственно или опосредованно. Эффективную дозировку можно вводить за одно введение или более чем одним введениями. Эффективная дозировка лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции может быть осуществлена или не осуществлена в сочетании с другим лекарственным средством, соединением или фармацевтической композицией. Таким образом, "эффективную дозировку" можно рассматривать в контексте введения одного или более терапевтических агентов, и можно считать, что единственный агент вводят в эффективном количестве, если в сочетании с одним или более другими агентами достигается желаемый результат. Для обнаружения PTK7-положительных клеток с использованием раскрытых конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство детектируемое количество композиции по изобретению вводят субъекту, т.е. такую дозу конъюгата, чтобы присутствие конъюгата можно было определить in vitro или in vivo.

Например, при введении раковому субъекту эффективное количество включает в себя количество, достаточное для того, чтобы вызывать противораковую активность, включая цитолиз раковых клеток, ингибирование пролиферации раковых клеток, индуцирование апоптоза раковых клеток, снижение антигенов раковых клеток, замедление роста опухоли и/или ингибирование метастазирования. Уменьшение размеров опухоли является общепринятым клиническим суррогатным маркером эффективности. Другим общепринятым маркером эффективности является выживаемость без прогрессирования.

Антитело к PTK7 или конъюгаты антитело к PTK7-лекарствеНное средство можно вводить индивидууму любым подходящим путем. Специалистам в данной области должно быть понятно, что примеры, описанные в данном документе, не являются ограничительными, а только иллюстрируют имеющиеся методы. Соответственно, в некоторых аспектах изобретения антитело к PTK7 или конъюгат антитела к PTK7 вводят индивидууму в соответствии с известными методами, такими как внутривенное введение, например в виде болюса или непрерывной инфузией в течение некоторого периода времени, внутримышечным, интраперитонеальным, интрацереброспинальным, интракраниальным, трансдермальным, подкожным, интра-артрикулярным, сублингвальным, интрасиновиальным путем, инсуффляцией, интратекальным, пероральным, ингаляционным или местным путем. Введение может быть системным, например внутривенное введение, или локализованное. Для введения используют коммерчески доступные небулайзеры для жидких форм композиций, в том числе струйные небулайзеры и ультразвуковые небулайзеры. Жидкие композиции можно распылять непосредственно, а лиофилизированный порошок можно распылять после разведения. Альтернативно, антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство можно вводить в виде аэрозоля с использованием фторуглеродного препарата и дозирующего ингалятора или ингалировать в виде лиофилизированного или измельченного порошка.

В некоторых аспектах изобретения антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство вводят методами введения в конкретный участок или методами направленной локальной доставки. Примеры методов введения в конкретный участок или методов направленной локальной доставки включают различные имплантируемые депо-источники антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство или катетеры локальной доставки, такие как инфузионные катетеры, постоянные катетеры или игольные катетеры, синтетические трансплантаты, адвентициальные манжеты, шунты и стенты или другие имплантируемые устройства, сайт-специфические носители, прямое инъецирование или прямая аппликация (смотри, например, публикацию международной заявки РСТ № WO 2000/53211 и патент США № 5981568).

Антитела к PTK7 или конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе, можно вводить с использованием любого подходящего способа, включая инъекции (например, интраперитонеально, внутривенно, подкожно, внутримышечно и т.д.). Антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство можно также вводить ингаляцией, как описано в данном документе. Как правило, для введения антитела к PTK7 и конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство начальная предполагаемая дозировка может составлять примерно 2 мг/кг. Для целей настоящего изобретения типичная суточная дозировка может находиться в диапазоне от примерно 3 мкг/кг до 30 мкг/кг до 300 мкг/кг до 3 мг/кг, до 30 мг/кг, до 100 мг/кг или более в зависимости от факторов, упомянутых выше. Например, может быть использована дозировка примерно 1 мг/кг, примерно 2,5 мг/кг, примерно 5 мг/кг, примерно 10 мг/кг и примерно 25 мг/кг. Для повторных введений на протяжении нескольких суток или дольше в зависимости от расстройства лечение продлевают до желаемого подавления симптомов или до достижения достаточных терапевтических уровней, например для ингибирования или замедления роста/прогрессирования опухоли или метастазов раковых клеток. Иллюстративный режим введения доз включает введение начальной дозы примерно 2 мг/кг, затем еженедельной поддерживающей дозы примерно 1 мг/кг антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство, или последующей поддерживающей дозы примерно 1 мг/кг один раз в две недели. Другие иллюстративные режимы введения доз включают введение с увеличением доз (например, начальная доза 1 мг/кг и постепенное увеличение на одну или более доз еженедельно или реже). Другие режимы введения доз также могут быть полезны в зависимости от паттерна фармакокинетического ослабления, которого практикующий специалист желает достичь. Например, в некоторых аспектах изобретения предусматривается введение доз от одного до четырех раз в неделю. В других аспектах предусматривается введение доз один раз в месяц, или один раз в два месяца, или каждые три месяца, а также еженедельно, раз в две недели и раз в три недели. Прогресс этой терапии легко можно контролировать стандартными методами и анализами. Режим введения доз (включающий используемое антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство) можно варьировать во времени.

В целях настоящего изобретения подходящая дозировка антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство будет зависеть от используемого антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство (или их композиций), типа и тяжести симптомов, которые лечат, от того, вводят ли агент в терапевтических целях, от предыдущей терапии, истории болезни пациента и ответной реакции на агент, скорости клиренса у пациента для вводимого агента и мнения лечащего врача. Клиницист может вводить антитело к PTK7 или конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство до достижения дозировки, которая дает желаемый результат и за его пределами. Доза и/или частота могут варьировать на протяжении курса лечения, но может быть также оставаться постоянной. Эмпирические факторы, такие как срок полужизни, обычно будут вносить вклад в определение дозировки. Например, антитела, которые совместимы с иммунной системой человека, такие как гуманизированное антитела или полностью антитела человека, могут быть использованы для пролонгирования срока жизни антитела и для предотвращения атаки иммунной системы хозяина на антитело. Частота введения может быть определена и отрегулирована в ходе курса терапии и, как правило, но необязательно, исходя из лечения, и/или подавления, и/или ослабления, и/или замедления симптомов, например ингибирования или замедления роста опухоли и т.д. Альтернативно, могут быть целесообразными препараты длительного непрерывного высвобождения антител к PTK7 или конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство. Различные препараты и устройства для достижения длительного высвобождения известны в данной области.

В некоторых аспектах изобретения дозировки для антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство могут быть определены эмпирически у индивидуумов, которые получали одно или более введений антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство. Индивидуумам дают постепенно увеличивающиеся дозировки антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство. Для оценки эффективности можно отслеживать признаки расстройства.

Введение антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство в соответствии со способом по настоящему изобретению может быть непрерывным или с перерывами в зависимости, например, от физиологического расстройства реципиента, будь целью введения терапевтическое или профилактическое введение, и других факторов, известных практикующим специалистам. Введение антитела к PTK7 или конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство может быть, главным образом, непрерывным на протяжении предварительно выбранного периода времени или может представлять собой серию доз через определенные промежутки времени.

IV.F. Комбинированные терапии

В некоторых аспектах изобретения способы, описанные в данном документе, дополнительно включают стадию лечения субъекта дополнительной формой терапии. В некоторых аспектах дополнительная форма терапии представляет собой дополнительную противораковую терапию, включая, без ограничения, химиотерапию, лучевую терапию, хирургию, гормональную терапию и/или дополнительную иммунотерапию.

Раскрытые конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство можно вводить в качестве начального лечения или для лечения расстройств, которые не реагируют на общепринятые терапии. Кроме того, конъюгаты антитело к РТК7-лекарственное средство могут быть использованы в комбинации с другими видами терапии (например, хирургической операцией, облучением, дополнительными противораковыми лекарственными средствами и т.д.), чтобы в результате вызывать аддитивные или усиленные терапевтические эффекты и/или снижать гепатоцитотоксичность некоторых противораковых агентов. Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению можно совместно вводить, или они могут быть совместно приготовлены с дополнительными агентами или могут быть приготовлены для последовательного введения с дополнительными агентами в любом порядке.

Репрезентативные агенты, полезные для комбинированной терапии, включают любые лекарственные средства, описанные в данном документе выше, которые полезны для получения конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство под подзаголовком "Лекарственные средства". Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство по изобретению могут быть также использованы в комбинации с другими терапевтическими антителами и конъюгатами антитело-лекарственное средство, включая анти-РТК7 антитела, иные, чем раскрытые анти-РТКТ антитела, а также антитела и конъюгаты, направленно воздействующие на другой антиген. Репрезентативные антитела, которые могут быть использованы сами по себе или в виде конъюгата антитело-лекарственное средство, включают анти-5Т4 антитела (например, А1, А2 и A3), анти-CD19 антитела, анти-CD20 антитела (например, RITUXAN^®, ZEVALIN^®, BEXXAR_®), анти-CD22 антитела, анти-CD33 антитела (например, MYLOTARG^®), конъюгаты анти-CD33 антитело-лекарственное средство, анти-Lewis Y антитела (например, Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), анти-НЕР-2 антитела (например, HERCEPTIN^® (трастузумаб), MDX-210, OMNITARG^® (пертузумаб, rhuMAb 2С4)), анти-СР52 антитела (например, САМРАТН^®), анти-EGFR антитела (например, ERBITUX^® (цетуксимаб), ABX-EGF (панитумумаб)), анти-VEGF антитела (например, AVASTIN^® (бевацизумаб)), антитела к ДНК/гистоновым комплексам (например, ch-TNT-1/b), анти-СЕА антитела (например, CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, анти-CD47 антитела (например, 6Н9), антитела к VEGFR2 (или рецептору, содержащему домен вставки киназы, KDR) (например, IMC-1C11), анти-Ер-САМ антитела (например, ING-1), анти-FAP антитела (например, сибротузумаб), анти-DR4 антитела (например, TRAIL-R), антитела к прогестероновым рецепторам (например, 2С5), анти-СА19.9 антитела (например, GIVAREX^®) и анти-фибриновые антитела (например, МН-1).

Раскрытые конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство можно вводить также вместе с одной или более комбинациями цитотоксических агентов в качестве части схемы лечения. Полезные цитотоксические препараты для этой цели включают СНОРР (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, преднизон и прокарбазин); CHOP (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, и преднизон); СОР (циклофосфамид, винкристин, преднизон); САР-ВОР (циклофосфамид, доксорубицин, прокарбазин, блеомицин, винкристин и преднизон); m-BACOD (метотрексат, блеомицин, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, дексаметазон и лейковорин; ProMACE-МОРР (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, лейковорин, мехлорэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин); РгоМАСЕ-CytaBOM (преднизон, метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, этопозид, лейковорин, цитарабин, блеомицин и винкристин); МАСОР-В (метотрексат, доксорубицин, циклофосфамид, винкристин, преднизон, блеомицин и лейковорин); МОРР (мехлорэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин); ABVD (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин); МОРР (мехлорэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин) поочередно с ABV (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин); МОРР (мехлорэтамин, винкристин, преднизон и прокарбазин) поочередно с ABVD (адриамицин/доксорубицин, блеомицин, винбластин и дакарбазин); ChIVPP (хлорамбуцил, винбластин, прокарбазин, преднизон); IMVP-16 (ифосфамид, метотрексат, этопозид); MIME (метил-gag, ифосфамид, метотрексат, этопозид); DHAP (дексаметазон, высокая-dose цитарабин и цисплатин); ESHAP (этопозид, метилпреднизолон, HD цитарабин, и цисплатин); СЕРР(б) (циклофосфамид, этопозид, прокарбазин, преднизон и блеомицин); CAMP (ломустин, митоксантрон, цитарабин и преднизон); и CVP-1 (циклофосфамид, винкристин и преднизон); DHAP (цисплатин, высокая-dose цитарабин и дексаметазон); САР (циклофосфамид, доксорубицин, цисплатин); PV (цисплатин, винбластин или виндезин); СЕ (карбоплатин, этопозид); ЕР (этопозид, цисплатин); MVP (митомицин, винбластин или виндезин, цисплатин); PFL (цисплатин, 5-фторурацил, лейковорин); IM (ифосфамид, митомицин); IE (ифосфамид, этопозид); IP (ифосфамид, цисплатин); MIP (митомицин, ифосфамид, цисплатин); ICE (ифосфамид, карбоплатин, этопозид); PIE (цисплатин, ифосфамид, этопозид); виорелбин и цисплатин; карбоплатин и паклитаксел; CAV (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин); CAE (циклофосфамид, доксорубицин, этопозид); CAVE (циклофосфамид, доксорубицин, винкристин, этопозид); ЕР (этопозид, цисплатин); и CMCcV (циклофосфамид, метотрексат, ломустин, винкристин).

Конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство могут быть использованы в комбинации с системными противораковыми лекарственными средствами, такими как эпитилоны (BMS-247550, Еро-906), новые препараты таксанов (абраксан, ксиотакс), ингибиторы микротубулина (MST-997, TTI-237), или с таргетными цитотоксинами, такими как CMD-193 и SGN-15. Дополнительные полезные противораковые агенты включают TAXOTERE^®, TARCEVA^®, GEMZAR^® (гемцитабин), 5-FU, AVASTIN^® ERBITUX^®, TROVAX^®, анатумомаб мафенатокс, летразол, доцетаксел и антрациклины.

Для комбинированных терапий конъюгат антитело к PTK7-лекарственное средство и/или один или более дополнительных терапевтических или диагностических агентов вводят в течение промежутка времени, подходящего для осуществления назначенной терапии или диагностики. Так, отдельные агенты можно вводить по существу одновременно (т.е. в виде единого препарата или в пределах минут или часов) или последовательно в любом порядке. Например, отдельные агенты можно вводить в пределах примерно 1 года друг от друга, например в пределах примерно 10, 8, 6, 4 или 2 месяцев, или в пределах 4, 3, 2 недель или 1 недели, или в пределах примерно 5, 4, 3, 2 суток или 1 дня. Введение конъюгата антитело к PTK7-лекарственное средство в комбинации со вторым терапевтическим агентом предпочтительно оказывает более сильное воздействие, чем введение любого одного из них.

В некоторых аспектах изобретения дополнительная форма терапии включает введение одного или более терапевтических агентов в дополнение к антителам к PTK7 или конъюгатам антитело к PTK7-лекарственное средство, как описано в данном документе. Терапевтические агенты включают, без ограничения, второе антитело (например, анти-VEGF антитело, an анти-HER2 антитело, анти-С025 антитело и/или анти-СР20 антитело), ингибитор ангиогенеза, цитотоксический агент, противовоспалительный агент (например, паклитаксел, доцетаксел, цисплатин, доксорубицин, преднизон, митомицин, прогестерон, тамоксифен или фторурацил).

В некоторых аспектах изобретения могут присутствовать антитела к PTK7 в количестве больше одного или конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство в количестве больше одного. Могут присутствовать по меньшей мере одно(один), по меньшей мере два, по меньшей мере три, по меньшей мере четыре, по меньшей мере пять разных или более антител к PTK7 или конъюгатов антитело к PTK7-лекарственное средство. Как правило, комплементарной активностью могут обладать те антитела к PTK7 или конъюгаты антитело к PTK7-лекарственное средство, которые не воздействуют друг на друга неблагоприятным образом. Например, одно или более из следующих антител к PTK7 могут быть использованы: первое антитело к PTK7, направленное на один эпитоп на PTK7, и второе антитело к PTK7, направленное на другой эпитоп на PTK7.

Раскрытые комбинированные терапии могут вызывать синергетический терапевтический эффект, т.е. эффект больше, чем сумма их индивидуальных эффектов или терапевтических результатов. Измеримые терапевтические результаты описаны в данном документе. Например, синергетический терапевтический эффект может представлять собой эффект по меньшей мере примерно в два раза выше, чем терапевтический эффект, вызываемый отдельным агентом, или сумма терапевтических эффектов, вызываемых отдельными агентами данной комбинации, или по меньшей мере примерно в пять раз больше, или по меньшей мере примерно в десять раз больше, или по меньшей мере примерно в двадцать раз больше, или по меньшей мере примерно в пятьдесят раз больше, или по меньшей мере примерно в сто раз больше. Синергетический терапевтический эффект можно также наблюдать как увеличение терапевтического эффекта по меньшей мере на 10% по сравнению с терапевтическим эффектом, вызываемым отдельным агентом, или с суммой терапевтических эффектов, вызываемых отдельными агентами данной комбинации, или по меньшей мере на 20%, или по меньшей мере на 30%, или по меньшей мере на 40%, или по меньшей мере на 50%, или по меньшей мере на 60%, или по меньшей мере на 70%, или по меньшей мере на 80%, или по меньшей мере на 90%, или по меньшей мере на 100%, или более. Синергетический эффект также представляет собой эффект, который позволяет снизить дозировку терапевтических агентов, когда их используют в комбинации.

По всему тексту подробного описания термин "примерно" означает значение +/-1% от значения, указанного после термина "примерно", если не указано иное.

Примеры

Приведенные ниже примеры представлены только в иллюстративных целях и никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения. Несомненно, различные модификации изобретения, помимо тех, которые показаны и описаны в данном документе, будут очевидны специалистам в данной области из приведенного описания и входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Пример 1

Образование и гуманизирование анти-РТК7 антител

Антитела к PTK-7 в форме мышиных антител получали в соответствии с методиками, известными в данной области, и как описано в публикации международной заявки РСТ № WO 2012/112943. Образованные мышиные антитела гуманизировали с использованием прививки области, определяющей комплементарность (CDR). Человеческие каркасные области для тяжелых и легких цепей выбирали исходя из сходства последовательности и структуры относительно функциональных генов зародышевой линии человека. Структурное сходство оценивали путем сравнения мышиной канонической структуры CDR с человеческими кандидатами с такими же каноническими структурами, как описано в Chothia et al. (см. выше).

Более конкретно, мышиные антитела, обозначенные здесь mu23, mu24 и mu58, описанные в публикации международной заявки РСТ № WO 2012/112943, гуманизировали компьютеризированным методом CDR-прививки (Abysis Database, UCL Business Plc.) и стандартными методами молекулярного инжиниринга с получением гуманизированных mu23, mu24 и mu58, далее hu23, hu24 и hu58 соответственно. Человеческие каркасные области вариабельных областей выбирали на основе их наивысшей гомологии последовательности с последовательностью мышиной каркасной области и ее канонической структурой. В целях анализа отнесение аминокислот каждому из доменов CDR соответствовало нумерации согласно Kabat et al. Несколько вариантов гуманизированных антител были получены для создания оптимального гуманизированного антитела с использованием гуманизированных антител, обычно сохраняющих антигенсвязывающие области, определяющие комплементарность (CDR), из мышиной гибридомы в ассоциации с человеческими каркасными областями. mAbs hu23, hu24 и hu58, связанные с человеческим антигеном PTK7 со сходной аффинностью к их мышиным аналогам, измеренной с использованием системы BIACORE^®.

Методики молекулярного инжиниринга осуществляли с использованием известных в данной области методов. Общую мРНК экстрагировали из гибридом согласно протоколу производителя (TRIZOL^® Plus RNA Purification System, Life Technologies). Последовательность-специфичный праймер 5 лидерной последовательности, сконструированный для амплификации каждой гибридомы, использовали в комбинации с 3' Сγ/праймером человека для амплификации и клонирования вариабельных областей каждого гуманизированного антитела. Аналогично, 5' Vk лидерная последовательность, сконструированная специально для амплификации каждой из Vk областей совместно с единственным обратным праймером, специфичным к человеческой константной области каппа, использовали для амплификации и клонирования легкой цепи каппа. Амплифицированные фрагменты клонировали в виде химерных цепей гамма/каппа человека, и они служили в качестве отправной точки для каждого гуманизированного mAb.

Из информации о нуклеотидных последовательностях были получены данные, касающиеся V, D и J сегментов генов тяжелых и легких цепей мышиных антител mu23, mu24 и mu58. На основе этих данных о последовательностях новые наборы праймеров, специфичных к лидерной последовательности Ig VH и Vk цепи антител, были сконструированы для клонирования рекомбинантного моноклонального антитела. Затем последовательности V-(D)-J выравнивали с последовательностями мышиной зародышевой линии Ig.

Гены тяжелых цепей mu23 были идентифицированы как VH3609 (V), DSP2.3 (D) и JH3. Гены тяжелых цепей mu24 были идентифицированы как VHJ558 (V), DSP2.7 (D) и JH4. Гены тяжелых цепей mu58 были идентифицированы как IGHV 4-1 (V), DFL 16.1 (D) и JH4. Все три легкие цепи были класса каппа. Гены легких цепей были идентифицированы как IGKVI4-111 и JK5 для mu23, IGKV3-5 и JK1 для mu24, и IGKV17-121 и JK4 последовательности зародышевой линии для mu58. Эти результаты суммированы в Таблице 2 ниже.

Полученные последовательности тяжелых и легких цепей из всех трех клонов выравнивали с функциональными последовательностями вариабельных областей человека и анализировали на предмет гомологии и канонической структуры. Результаты анализа гуманизированных тяжелых и легких цепей представлены ниже в Таблицах 3 и 4 соответственно для гуманизированных анти-РТК7 антител hu23, hu24 и hu58.

Аминокислотные последовательности и ассоциированная последовательность нуклеиновой кислоты hu23, hu24 и hu58 представлены выше в Таблице 1. Аминокислотные последовательности области VH для hu23, hu24 и hu58 такие, как указано в SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 49 соответственно, с соответствующими последовательностями нуклеиновых кислот, определенных в SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 26 и SEQ ID NO: 50 соответственно. Аминокислотная последовательность каппа области VL hu23, hu24 и hu58 такие, как указано в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 39 и SEQ ID NO: 63 соответственно, с соответствующими последовательностями нуклеиновых кислот, определенных в SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 64 соответственно.

Как продемонстрировано в Примерах, приведенных ниже, каждое из вышеупомянутых гуманизированных антител функционирует как эффективный конъюгат анти-РТК7 антитело-лекарственное средство в соответствии с приведенными в данном описании данными.

Пример 2

Экспрессия гуманизированных антител

Анти-РТК7 антитела hu23, hu24 и hu58 экспрессировали и выделяли с использованием известных в данной области методов и как описано в публикации международной заявки РСТ № WO 2012/112943. Синтетические гуманизированные вариабельные ДНК фрагменты (Integrated DNA Technologies) тяжелых цепей клонировали в векторы экспрессии IgG1 человека. Фрагменты вариабельных легких цепей клонировали в векторы экспрессии С-каппа человека. Каждое антитело экспрессировали посредством ко-трансфекции соответствующей тяжелой и легкой цепи в клетки СНО.

Более конкретно, для продуцирования антител предпринимали направленное клонирование продуктов ПЦР гуманизированного вариабельного гена в векторы экспрессии на основе иммуноглобулина человека. Все праймеры, использованные в Ig ген-специфических ПЦР, включали в себя сайты рестрикции, Agel и Xhol для IgH, Xmal и Dralll для Igk, которые обеспечивали прямое клонирование в векторы экспрессии, содержащие IgG1 человека и Igk константные области соответственно. Кратко, продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки Qiaquick PCR (Qiagen, Inc.) с последующим гидролизом с использованием Agel и Xhol (IgH), Xmal и Dralll (Igk) соответственно. Гидролизованные продукты ПЦР очищали перед лигированием в векторы экспрессии. Реакции лигирования осуществляли в общем объеме 10 мкл с Т4-ДНК лигазой 200 ед. (New England Biolabs), 7,5 мкл гидролизованного и очищенного ген-специфического продукта ПЦР и 25 нг линеаризованного ДНК-вектора. Компетентные бактерии Е. coli DHI0B (Life Technologies) трансформировали посредством теплового шока при 42°С с использованием 3 мкл продукта лигирования и наносили на ампициллиновые чашки (100 мкг/мл). Фрагмент Agel-EcoRI области VH затем вставляли в те же сайты вектора экспрессии pEE6.4HulgG1 (Lonza AG), а синтетическую вставку Vk Xmal-Dralll клонировали в сайты Xmal-Dralll соответствующего вектора экспрессии рЕЕ12.4 Hu-Карра.

Клетки, продуцирующие гуманизированные антитела, создавали путем трансфекции клеток НЕК 293 подходящими плазмидами, используя 293fectin. Плазмидную ДНК очищали на колонках QIAprep Spin (Qiagen). Клетки эмбриональной почки человека (НЕК) 293Т (АТСС No CRL-11268) культивировали в 150 мм планшетах (Falcon, Becton Dickinson) в стандартных условиях в среде Игла, модифицированной по Дульбекко (DMEM), дополненной 10% инактивированной теплом FCS, 100 мкг/мл стрептомицина, 100 ед./мл пенициллина G (все от Life Technologies).

Для временных трансфекций клетки выращивали до 80%-ной конфлюентности. Равные количества IgH и соответствующей векторной ДНК на основе цепи IgL (12,5 мкг каждой векторной ДНК) добавляли к 1,5 мл Opti-MEM, смешанной с 50 мкл реагента для трансфекции НЕК 293 в 1,5 мл Opti-MEM.

Смесь инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре и распределяли поровну в чашки для культивирования. Супернатанты собирали через три дня после трансфекции, заменяли 20 мл свежей DMEM, дополненной 10% FBS, и собирали еще раз на 6 сутки после трансфекции. Культуральные супернатанты очищали от клеточного дебриса центрифугированием при 800xg в течение 10 мин и хранили при 4°С. Рекомбинантные химерные и гуманизированные антитела очищали с помощью гранул белка G (GE Healthcare). Дополнительная очистка hu23 и hu24 ионообменной хроматографией требовалась для того, чтобы достичь согласованного, воспроизводимого биоконъюгирования с vc0101 и mc8261. Без стадии дополнительной очистки эффективность восстановления тиола и, следовательно, результирующее в ADC соотношение лекарственного средства к антителу (DAR), описанное в Примере 10, менялось резко и непредсказуемо. Требование для дополнительной очистки не было ожидаемым, но определялось эмпирически.

Пример 3

Определение характеристик связывания hu24

Сравнительные характеристики химерных и гуманизированных mAB клона 24 определяли методом SPR с использованием Biacore™ 2000 (GE Healthcare). Набор для захвата античеловеческих антител использовали для захвата mAb на СМ5 биосенсорной чипе. Перед каждым циклом инъецирования антигена гуманизированное mAb в концентрации 2 мкг/мл захватывали на поверхности с временем контакта 2 минуты и скоростью потока 5 мкл/мин. Нагрузка захваченного mAb от исходного значения была постоянной при 80-120 единицах ответа. После захвата тестируемого образца и 1-минутного исходного значения мономерный белок PTK7 человека пропускали над поверхностью в концентрациях 50, 25 и 12,5 нМ в течение 2-минутной фазы ассоциации, затем 2-минутной фазы диссоциации при скорости потока 5 мкл/мин. После каждого цикла захвата античеловеческих антител поверхность регенерировали с временем контакта 30 секунд с использованием 3М MgCl₂ при 10 мкл/мин.

Данные Biacore™ обрабатывали первоначально вычитанием контрольной IgG поверхности из поверхности специфического связывания mAb. Данные ответной реакции затем округляли до фазы ассоциации и диссоциации. Полученные кривые ответной реакции с тремя разными концентрациями антигена использовали для приведения в соответствие с 1:1 лангмюровской моделью связывания и для получения видимой аффинности по вычисленным кинетическим константам K_on и K_off с константой равновесной диссоциации, определяемой как Kd = K_off/K_on. Стадии анализа всех данных заканчивали в BiaEvaluation Software 3.1 (GE Healthcare).

Было определено, что вычисленные аффинность и кинетические константы находятся в пределах 2-кратного различия между химерными и гуманизированными mAb (Таблица 5).

Для того чтобы определить эпитоп, распознаваемый hu24 mAb, оценивали его связывание с несколькими вариантами эктодомена PTK7. Эктодомен PTK7 состоит из 7 Ig доменов, и были сконструированы варианты, включающие в себя два или более смежных Ig доменов. Варианты экспрессировали в виде слитых белков Fc, и связывание hu24 определяли методом анализа ELISA.

Конструкции были разработаны с праймерами, которые амплифицировали различные смежные Ig домены PTK7, которые были спрогнозированы по структурной гомологии. Полученные последовательности были слиты внутри рамки считывания с и выше Fc домена иммуноглобулина человека G2 (IgG2) с использованием стандартных методов молекулярной биологии. Слитые белки Fc трансфицировали в клетки млекопитающего, и супернатанты собирали через 72 часа. Анти-РТК7 mAb hu24 тестировали методом ELISA в отношении его способности связываться с вариантами белка PTK7 с определенными Ig доменами.

Результаты показывают, что Ig домены 1-4 требуются для связывания hu24 с PTK7 (Таблица 6) и свидетельствуют о том, что mAb распознает характеристики третичной структуры PTK7.

Осуществляли эксперименты для характеризации свойств связывания с клетками анти-РТК7 mAb hu24. Для подтверждения специфичности к антигену связывание оценивали в линиях клеток либо с существенной, либо с незначительной экспрессией PTK7, которую определяли посредством иммуноблотинга.

Экстракты цельных клеток разделяли гель-электрофорезом и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Мембрану инкубировали с hu6M024 в Tris-забуференном физиологическом растворе с 0,1% Tween-20 (TBST)) с 5% масс/об. обезжиренного молока, затем промывали TBST, инкубировали с пероксидаза хрена-конъюгированным козьим античеловеческим антителом (Santa Cruz Biotechnology No sc-2453) и промывали интенсивно, после чего подвергали воздействию хемилюминисцентного субстрата.

Иммуноблоттинг показал существенную экспрессию PTK7 в линиях клеток ВхРС3 и MDAMB436 и несущественную экспрессию PTK7 в линии клеток ASPC1 (ФИГ. 2А). Результаты проточной цитометрии по связыванию клеток с hu24 полностью согласовывались с данными иммуноблоттинга (ФИГ. 2В), которые продемонстрировали антигенную специфичность hu24.

Дополнительные эксперименты методом проточной цитометрии проводили для оценки связывания mAb hu24 с линиями раковых клеток с эндогенной экспрессией PTK7. Кратко, сцепленные клетки разъединяли с использованием TrypLE™ Express (Gibco^® No 12604-021), затем нейтрализовали культуральной средой. Суспендированные клетки собирали центрифугированием. Клетки ресуспендировали в окрашивающем буфере (PBS с 3% BSA) с установленной концентрацией mAb и инкубировали на льду в течение 30 минут. Клетки промывали в окрашивающем буфере, ресуспендировали в окрашивающем буфере с фикоэритрин (РЕ)-меченым анти-человеческим антителом (Jackson ImmunoResearch No 109-115-098) и инкубировали на льду в течение 30 минут. Клетки промывали, ресуспендировали в окрашивающем буфере с витальным красителем 7-AAD (BD Biosciences, Pharmingen No 51-68981Е) и анализировали методом проточной цитометрии с BD FACSCalibur™. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) в РЕ канале популяции жизнеспособных клеток определяли для каждого образца.

mAb hu24 продемонстрировало связывание с различными линиями раковых клеток в наименьшей протестированной концентрации (0,1 мкг/мл). Напротив, контрольное антитело не показало заметного связывания в наибольшей протестированной концентрации (10 мкг/мл) (Таблица 7).

Пример 4

Экспрессия PTK7 в различных раковых клеточных линиях

Анти-РТК7 антитела hu23 и hu24 продемонстрировали специфическое связывание с культивированными линиями раковых клеток, которые были получены из широкого спектра типов опухолей, включая солидные опухоли и гематологические заболевания (смотри Таблицу 8, приведенную ниже). Сцепленные клетки разъединяли с использованием TrypLE Express (GIBCO), нейтрализовали клеточной культуральной средой и подсчитывали. Клетки вносили в 96-луночный планшет с U-образным дном в количестве 5×10⁵ клеток/100 мкл среды/лунка. Планшет центрифугировали при 300xg в течение 5 минут при 4°С для осаждения клеток, и супернатант сливали. Каждый осадок после центрифугирования ресуспендировали в 10 мкг/мл hu23, hu24 или несвязывающем контрольном антителе в 3%-ном BSA в PBS, и планшет инкубировали на льду в течение 30 минут. Планшет центрифугировали, и клеточные осадки промывали в 200 мкл охлажденного на льду 3%-ного BSA в PBS. Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 100 мкл R-фикоэритрин (РЕ)-конъюгированного козьего антитела против человеческого IgG Fc фрагмента, которое был разведено в соотношении 1:50 в 3%-ном BSA в PBS, и планшет инкубировали на льду в течение 30 минут. Планшет центрифугировали, и клеточные осадки после центрифугирования промывали в 200 мкл 3%-ного BSA в PBS при 4°С. Каждый осадок ресуспендировали в 100 мкл 3%-ного BSA в PBS и переносили в 5-миллилитровую поликарбонатную пробирку, содержащую 250 мкл 3%-ного BSA в PBS. Образцы анализировали методом проточной цитометрии с использованием 5 мкл окрашивающего раствора 7-амино-актиномицина D (7-AAD) на каждый образец в качестве витального красителя. Нежизнеспособные клетки исключали из анализа.

Данные, приведенные в Таблице 8, показывают средние интенсивности флуоресценции (MFI) связывания антител с линиями раковых клеток, полученные методом проточной цитометрии. Связывание клеток гуманизированными антителами hu23 и hu24 свидетельствует об экспрессии PTK7 в многочисленных линиях клеток. Экспрессия PTK7 является заметной в линиях клеток немелкоклеточного рака легкого (NSCLC), мелкоклеточного рака легкого (SCLC), рака ободочной кишки, рака молочной железы, рака поджелудочной железы и эритролейкемической линии раковых клеток. Антитело-отрицательный контроль, которое не связывается с PTK7, использовали для сравнения.

Микроматричные данные, показанные в Таблице 9 для 29 опухолевых линий PDX, были получены с использованием матриц Agilent SurePrint GE 8×60 v2 с использованием общей РНК, выделенной из опухолевых клеток PDX. Обработка исходных микроматричных данных, собранных с использованием одного цвета, включала вычитание фона и квантильную нормализацию. Нормализованные данные преобразовывали в log по основанию 2, получая значения экспрессии генов для использования в последующих анализах. Эти данные отражают относительное количество экспрессии PTK7, ассоциированной с указанной линией клеток PDX. BR = молочная железа, LU = легкое, OV = яичник, SK = меланома, CR = ободочная кишка и прямая кишка, LIV = печень.

Экспрессию PTK7 также оценивали иммуногистохимическим методом в семи PDX-моделях на мышах с ослабленным иммунитетом: четыре PDX трижды негативного рака молочной железы (BR13, BR22, BR31 и BR5); один PDX прогестероновый рецептор-позитивного (PR+) рака молочной железы (BR36); и два PDX NSCLC (NSCLC135 и NSCLC176).

Кратко, фрагмент ткани из каждого ксентрансплантата фиксировали в формалине, обрабатывали и заделывали в парафин (FFPE) с использованием стандартных гистологических методик. Пятимикронные срезы нарезали на заряженные предметные стекла, сушили, депарафинизировали в ксилоле и регидратировали набором спиртов повышающейся концентрации до дистиллированной воды. Вызванное нагревом извлечение эпитопа осуществляли в Borg Decloaker (Biocare Medical) с использованием автоклава Retriever 2100 (Electron Microscopy Sciences) и охлаждали до комнатной температуры (RT) в течение 20 минут (мин). Эндогенную пероксидазу гасили Peroxidazed 1 (Biocare Medical) в течение 10 мин при RT. Неспецифические взаимодействия белков блокировали Background Punisher (Biocare Medical) в течение 10 мин при RT. Срезы ткани инкубировали с первичным антителом при 0,5 мкг/мл в течение 1 часа при RT. Первичными антителами были либо кроличий анти-РТК7 клон (Stem CentRx™ Inc), либо кроличий изотипический контроль (DA1E) mAb иммуноглобулин G (IgG) ХР^® (Cell Signaling Technologies no. 3900). Связывание первичного антитела детектировали с использованием реагента для детектирования SignalStain^® Boost IHC (Cell Signaling Technologies no. 8114) в течение 30 мин при RT. Окраску проявляли с использованием DAB+ (3' .3' -диаминобензидин; DAKO) в течение 5 мин при RT. Стекла быстро подвергали контрастному окрашиванию в CAT гематоксилине (Biocare Medical), промывали в воде, дегидратировали в спиртах с повышающейся концентрацией, очищали в ксилоле и накрывали покровными стеклами с использованием заливочной среды Permount™ (Fisher Chemicals).

РТК7 наблюдали на плазматической мембране во всех PDX-моделях (ФИГ. 3).

Пример 5

Экспрессия PTK7 в тканях различных опухолей

Экспрессию мРНК PTK7 определяли в первичных опухолях человека. Кратко, замороженные опухолевые и нормальные ткани фрагментировали, и мРНК выделяли с использованием мининабора Qiagen RNeasy Mini kit (Qiagen, cat# 74106). Количественную и качественную оценку РНК осуществляли с использованием анализа НТ RNA по микрофлюидной технологии LabChip и прибора микрофлюидного капиллярного электрофореза LabChip GX (Perkin Elmer). РНК для каждого образца разводили таким образом, чтобы количество попадало в пределы линейного диапазона прибора (25-250 нг/мкл). Образцы выделенной РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора Life Technologies, High Capacity RNA-to-cDNA (каталожный номер 4387406), следуя протоколу, описанному в инструкциях производителя. Реакцию qRT-PCR (количественная ПЦР в режиме реального времени ) осуществляли с использованием систем для анализа экспрессии генов на основе зонда TaqMan и проведения ПЦР в реальном времени ABI ViiA7 (Life Technologies). Ген-мишень и эндогенные контроли исследовали в четырех повторах для каждого набора зондов на заводских картах-матрицах низкой плотности TaqMan. Программное обеспечение ExpressionSuite Software v1.0.3 (Life Technologies) использовали для получения автоматических пороговых значений для амплификации сигнала для большинства образцов. Почти никогда автоматические пороги не корректировали вручную. Графики амплификации, дающие в результате значения Ct >35, отбрасывали, поскольку это были те графики, которые генерировали значение Ct, но не отображали тенденцию логарифмической амплификации. Все значения Ct экспортировали из программного обеспечения ExpresssionSuite, и относительные количественные вычисления выполняли в Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Inc).

ФИГ. 4A-C демонстрируют уровни мРНК PTK7 в (А) раковой опухоли молочной железы, (б) NSLC и (С) раковых опухолях яичника. Количественное определение экспрессии PTK7 оценивали с использованием метода относительных кратных различий (RQ) или сравнительного Ct метода, (2^-ΔΔCt) метода с использованием уравнения RQ = 2^-ΔΔCt Данные по RQ представляют собой кратное различие экспрессии PTK7 относительно контрольных образцов РНК. Для образцов карциномы молочной железы образец РНК нормальной молочной железы, приобретенный у BioChain (Newark, СА, каталожный номер R1234086-50, номер лота В610189, женщина 75 лет), использовали для получения данных по RQ. Для рака легкого указанные данные по RQ представляют собой кратные различия экспрессии PTK7 относительно РНК нормального легкого RNA, приобретенной у Life Technologies (каталожный номер АМ7968, номер лота 1308017, женщина 80 лет). Для образцов карциномы яичника указанные данные по RQ представляют собой кратные различия экспрессии PTK7 относительно РНК, выделенной из ткани нормального яичника (ID (идентификационный) номер ткани 0204С011С), предоставленной Cleveland Clinic (Cleveland, ОН). Значения RQ для всех опухолей также вычисляли относительно пула РНК из нормальных тканей человека (BioChain, каталожный номер R4234565, номер лота В611043), а также относительно универсального эталонного пула РНК человека (Agilent, каталожный номер 740000), который состоял из равных частей РНК из 10 уникальных линий раковых клеток.

Опухоли молочной железы, NSCLC и яичника продемонстрировали повышенную экспрессию мРНК PTK7 по сравнению с соответствующей нормальной тканью (ФИГ. 4А-С). Сверхэкспрессия в TNBC была самой заметной, а сверхэкспрессия в опухолях яичников была умеренной.

ФИГ. 5 демонстрирует корреляцию между более высокой экспрессией мРНК PTK7 и худшим общим выживанием пациентов с NSCLC. Чтобы определить, связана ли экспрессия PTK7 с пределом выживания при раке легкого, анализ Каплана-Мейера применяли к набору данных по биоинформатике с бесплатным программным обеспечением http://kmplot.com/analysis (Gyorffy et al., 2013, PloS One. 18;8(12):e82241). Уровни мРНК PTK7 и данные по выживанию пациентов наносили на график для 719 пациентов с NSCLC-аденокарциномой, используя лучшее пороговое значение инструментального автоматического выбора. Высокая экспрессия PTK7 ассоциировалась с более коротким сроком выживания (коэффициент опасности HR = 4,06, логранговый критерий Р = 1,1×10^-16).

Экспрессия белка PTK7 наблюдалась в раковой опухоли пищевода. Тканевую микроматрицу (ES1502 от US Biomax) использовали для иммуногистохимии. Кратко, срезы из блоков с фиксированными формалином, заделанными в парафин опухолями нарезали по 5 микрон и закрепляли на предметных стеклах. Стекла очищали в ксилоле и регидратировали промывками спиртами с повышающимися концентрациями, заканчивая промывкой в деионизированной воде. Стекла возвращали в прежнее состояние в цитратном буфере рН6 Citrate HIER в Retriever 2100 (Electron Microscopy). Пероксидазированный, блокирующий раствор перекиси водорода (Biocare Medical), наносили на предметные стекла на 10 мин. Стекла промывали дважды TBST, затем Background Punisher, белковым блоком (Biocare Medical) в течение 10 мин. Первичное антитело, Н.235 (номер лота: 110325ММ, исходная концентрация: 12,7 мг/мл), наносили на 60 мин в концентрации 2 мкг/мл. После промывки TBST (2х) вторичное антитело, DAKO анти-мышиное Envision+, наносили на 30 мин. После промывки снова TBST (2х) стекла проявляли с использованием Betazoid DAB+ (Biocare Medical) в течение 5 мин. Стекла затем подвергали контрастному окрашиванию в CAT гематоксилине (Biocare Medical) в течение 30 секунд и накрывали покровными стеклами.

Сорок из 70 образцов опухолей были оценены как положительные в отношении экспрессии PTK7 на клеточной мембране. Из этих 40 образцов, которые были PTK7-положительными, 1 образец продемонстрировал высокую экспрессию, 11 продемонстрировали умеренную экспрессию и 28 продемонстрировали низкую экспрессию.

Экспрессия белка PTK7 наблюдалась в раковой опухоли предстательной железы. Тканевую микроматрицу (ВС19013 от Biomax) использовали для иммуногистохимии, как описано выше для рака пищевода. Одиннадцать из 26 образцов опухолей были оценены как положительные в отношении экспрессии PTK7. Из 11 образцов, которые были PTK7-положительными, 2 продемонстрировали умеренную экспрессию и 9 продемонстрировали низкую экспрессию.

Пример 6 Измерение белка PTK7 в сыворотке

Сообщения в литературе характеризовали расщепление PTK7 на плазматической мембране, которое приводит к шеддингу ("слущиванию") части внеклеточного домена (Golubkov et al., 2010, J Biol Chem 285(46):35740-9; Golubkov et al., 2012, J Biol Chem 287(50):42009-18; Na et al., 2012, J Biol Chem 287(30):25001-9). Циркулирующий антиген может сильно воздействовать на фармакокинетику терапевтических соединений, таких как ADC против PTK7. Циркулирующие уровни подвергшейся шеддингу PTK7 оценивали из различных источников сыворотки. Уровни белка PTK7 измеряли количественным анализом с использованием платформы Meso Scale Discovery (MSD®).

Образцы сыворотки здоровых людей были приобретены у Stanford University Blood Bank. Образцы сыворотки раковых пациентов были приобретены у Asterand Inc и Bioreclamation Inc. Образцы сыворотки яванского макака были приобретены у Bioreclamation Inc.

Образцы мышиной сыворотки были получены от мышей с ослабленным иммунитетом, которые имели ксенотрансплантаты опухоли человека. Самки не страдающих ожирением мышей с диабетическим тяжелым сочетанным иммунодефицитом (NOD-scid) были приобретены у Harlan Laboratories^® и содержались в соответствии с руководствами Институционального комитета по использованию и уходу за животными (Institutional Animal Care и Use Committee (IACUC)). Ксенотрансплантаты пациентов (PDX) создавали путем прямой имплантации образцов свежевырезанной опухоли человека и размножали, пересаживая ксенотрансплантаты в животных, не использовавшихся ранее в экспериментах. Ксенотрансплантаты имели происхождение из образцов после резекции первичных опухолей, которые получали из клинических учреждений после разрешения Институционального наблюдательного совета по соблюдению прав пациентов (Institutional Review Board for the Protection of Human Subjects) и в соответствии с правилами Закона о передаче данных и ответственности в системе медицинского страхования (Health Insurance Portability and Accountability Act (HIPAA)).

В анализе для измерения уровней белка PTK7 использовали два специфических анти-РТК7 моноклональных антитела (mAb), которые были получены по гибридомной технологии. Эти mAb связывают PTK7 человека и яванского макака, но не мышиную PTK7. Анализ был разработан на платформе MSD^® и был оптимизирован для линейной ответа. Планшет MSD^® High Bind покрывали PTK7-специфическим mAb Н2.35 при 1 мкг/мл в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS). Планшет инкубировали при 4°С в течение ночи. На следующий день планшет промывали и добавляли второе mAb. Для образцов человека и обезьяны добавляли 25 мкл сульфо-меченого PTK7-специфического mAb 6М38 при 0,5 мкг/мл в разбавителе MSD^® Diluent2 (MSD #R51BB-4), а для образцов опухолей мышей добавляли биотинилированный 6М38 при 0,5 мкг/мл в MSD^® Diluent 2 (MSD #R51BB-4) и затем добавляли конъюгированный с пероксидазой хрена стрептавидин. Планшет инкубировали при встряхивании в течение 30 минут. После инкубирования, без промывки, образцы сыворотки или различные количества рекомбинантного белка PTK7 добавляли в лунки и инкубировали в течение 2 часов на шейкере для планшетов. Образцы сыворотки разводили 4х до конечной концентрации 25% в MSD^® Diluent 2. Планшеты промывали 3 раза забуференным фосфатами физиологическом растворе с 0,2% Tween-20. Буфер MSD^® 1× Read (MSD #R92TC-3) добавляли в планшеты (150 мкл на лунку), и планшеты считывали на MSD^® Sector Imager. Значения для образцов сыворотки интерполировали из стандартной кривой на основе рекомбинантного белка.

Уровни белка PTK7 в сыворотке человека измеряли в образцах, взятых у здоровых людей и раковых пациентов, у которых имелось 8 типов опухолей. Результаты суммированы в Таблице 10. Указанное значение в каждой категории представляет собой среднее значение из всех индивидуальных образцов. Среднее значение PTK7 в сыворотке здоровых людей составляло 12,4±3,3 нг/мл. В общем, средние значения для раковых пациентов были слегка выше, вплоть до 24,6±3,8 нг/мл, и с более широким распределением отдельных значений (ФИГ. 6).

Показатели измерений приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение среднего значения для независимых биологических образцов.

Уровни белка PTK7 в сыворотке яванского макака, ранее не подвергавшегося экспериментам, измеряли в образцах, взятых у 29 животных. Среднее значение составляло 35,8±13,4 нг/мл (Таблица 11), т.е. выше, чем соответствующие значения для здоровых людей и раковых пациентов.

Показатели измерений приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение среднего значения для независимых биологических образцов.

Образцы мышиной сыворотки были получены от мышей с ослабленным иммунитетом, которые имели ксенотрансплантаты опухолей человека. Конкретно, ксенотрансплантаты представляли собой PDX, которые типично сохраняют архитектуру и генотип опухолей человека, из которых они получены (DeRose et al, 2011, Nat Med 17(11):1514-20). Средние значения белка PTK7 в сыворотке для всех 11 типов опухолей составляли <1 нг/мл для всех типов опухолей (Таблица 12) и, следовательно, были значительно ниже, чем значения, полученные для человека и обезьяны. Поскольку mAb, использованные в данном анализе, не взаимодействуют перекрестно с мышиной PTK7, значения интерпретируют как белок PTK7 человека, который подвергся шеддингу из опухолевых ксенотрансплантатов, а не из нормальных тканей.

Показатели измерений приведены в виде среднего значения ± стандартное отклонение среднего значения для моделей опухолей. Значения для индивидуальных моделей представляли собой медиану измерений от 1 до 12 имеющих опухоль животных.

Пример 7 Интернализация

Интернализация антитела является важной характеристикой для доставки ADC для цитотоксичности в клетках, экспрессирующих PTK7. Было определено, что анти-РТК7 антитело hu24 интернализуется в раковые клетки, что свидетельствует о том, что это антитело является подходящим носителем для доставки токсина в клетки. Сцепленные клетки разъединяли с использованием TrypLE Express (Gibco), нейтрализовали клеточной культуральной средой и затем подсчитывали. Аликвоты клеток помещали в 96-луночный планшет с U-образным дном в количестве 5×10⁵ клеток/100 мкл среды на лунку. Планшет центрифугировали при 300xg в течение 5 минут при 4°С для осаждения клеток, и супернатанты аспирировали. Все реагенты хранили на льду для следующих стадий.

Каждый клеточный осадок ресуспендировали в 3 мкг/мл hu24 или несвязывающего антитела (IgG человека, Thermo Scientific) в 100 мкл 3%-ного BSA в PBS. Планшет инкубировали на льду в течение 30 минут, затем центрифугировали, и клеточные осадки промывали в 200 мкл 3%-ного BSA в PBS. Клеточные осадки ресуспендировали в 100 мкл предварительно подогретой до 37°С клеточной культуральной среды и помещали в инкубатор с температурой 37°С на 1 час или на 4 часа. Клеточные осадки, которые инкубировали при 4°С, аналогичным образом ресуспендировали и затем помещали на лед. После инкубирований образцы центрифугировали, супернатанты аспирировали и промывали 200 мкл/лунка охлажденного на льду 3%-ного BSA в PBS и ресуспендировали в 100 мкл/лунка охлажденного на льду 3%-ного BSA в PBS и помещали на лед. Все образцы затем центрифугировали, супернатанты аспирировали, каждый клеточный осадок после центрифугирования ресуспендировали в 100 мкл аллофикоцианин (АРС)-конъюгированного антитела против IgG Fc фрагмента человека, который был разведен в соотношении 1:50 в холодном ледяном 3%-ном BSA в PBS. Планшет инкубировали на льду в течение 30 минут, затем центрифугировали, и клеточные осадки после центрифугирования промывали в 200 мкл 3%-ного BSA в PBS, ресуспендировали в 100 мкл 3%-ного BSA в PBS и переносили в 5-миллилитровую поликарбонатную пробирку, содержащую 250 мкл 3%-ного BSA в PBS. Образцы анализировали методом проточной цитометрии с использованием 5 мкл 7-AAD на образец в качестве витального красителя. Среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) измеряли для каждого образца, исключая нежизнеспособные клетки из анализа. Значение "% интернализованного" вычисляли как (100% - [MFI после инкубирования/MFI до инкубирования]). Результаты в Таблице 13 показывают, что антитело hu24 было интернализовано во все протестированные линии клеток, и что интернализация была температура-зависимой, что свидетельствует об активной (не пассивной) интернализации клеткой.

Пример 8

Цитотоксичность, опосредованная сапорин-конъюгированным Fab-фрагментом антитела против IgG человека

Анализ цитотоксичности in vitro проводили, чтобы определить, может ли антитело hu23 или hu24 опосредовать доставку цитотоксического агента в линии клеток. Для этого Fab-фрагмент антитела против IgG человека, ковалентно связанный с токсином сапорином (Advanced Targeting Systems), объединяли с немеченым hu23, hu24 или 8.84 Ab (несвязывающее, антитело-отрицательный контроль) и затем инкубировали с клетками в течение 4 суток (РТК7-эксперессирующие клетки Н446 и DMS114) или 7 суток (клетки ОЕ19, не экспрессирующие PTK7; клетки ОЕ21, экспрессирующие PTK7), после чего измеряли жизнеспособность клеток.

В одном эксперименте линии раковых клеток Н446 или DMS114 вносили в прозрачный плоскодонный планшет для тканевой культуры при 9600 клеток на лунку (Н446) или 6400 клеток на лунку (DMS114) в 100 мкл клеточной культуральной среды. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂. На следующий день 50 мкл hu23, hu24 или 8.84 Ab, предварительно смешанного с сапорин-конъюгированным Fab антитела против IgG человека (Fab-ZAP; Advanced Targeting Systems) в молярном соотношении 1:2, добавляли к клеткам по 10-точечной кривой концентрации с использованием образцов в трех повторах, начиная с 1 мкг/мл с 1:3 разведениями в клеточной культуральной среде. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, в течение 4 суток. Для измерения жизнеспособности клеток использовали MTS анализ (Promega Cell Titer 96 Aqueous Non-Радиoactive Cell Proliferation Assay(BOflHbM нерадиоактивный анализ клеточной пролиферации)) согласно инструкциям поставщика. 30 мкл комбинированного MTS реагента добавляли в каждую лунку. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, в течение 2 часов. Оптическую плотность (OD) определяли при 490 нм с использованием ридера для 96-луночных планшетов. Средний показатель для лунок только со средой вычитали из показателей для лунок с клетками и контролями для фоновой OD. Данные подвергали логистическому нелинейному регрессионному анализу (GraphPad Prism Software), чтобы определить концентрацию первичного антитела, при которой жизнеспособность клеток ингибируется на 50% (IC50).

Данные в Таблице 14 свидетельствуют о том, что оба анти-РТК7 антитела hu23 и hu24 придавали сапорин-опосредованную цитотоксичность клеткам Н446 и DMS114, тогда как антитело-отрицательный контроль 8.84 нет. Результаты демонстрируют, что активность hu23 и hu24 была специфической к PTK7-экспрессирующим клеткам.

В другом эксперименте сапориновый анализ осуществляли на двух линиях клеток рака пищевода, ОЕ19 и ОЕ21 (Sigma Aldrich). Для определения экспрессии PTK7 на этих линиях клеток клетки культивировали, и суспензии отдельных клеток выделяли с использованием Versene (Invitrogen). Клетки промывали в PBS/2%FCS и инкубировали с антителом hu24 или HulgG1 (изотип-контроль) в концентрации 5 мкг/мл в течение 30 минут. Клетки снова промывали в PBS/2% FCS, затем инкубировали при 1:200 с античеловеческим Alexa Fluor647 (Jackson Immunoresearch) в течение 20 минут. Клетки снова промывали, ресуспендировали в DAPI и затем анализировали на BD FACSCanto для определения изменения средней интенсивности флуоресценции (ΔMFI). Клетки ОЕ19 не продемонстрировали флуоресценцию окрашивания по сравнению с изотипом-контролем (ΔMFI = 0), а клетки ОЕ21 продемонстрировали почти два-log увеличение интенсивности флуоресценции (ΔMFI = 5976), что свидетельствует об экспрессии PTK7 на поверхности клеток ОЕ21 плоскоклеточного рака пищевода.

Чтобы определить, может ли hu24 оспосредовать доставку цитотоксических агентов, 2500 клеток на лунку диссоциированной суспензии отдельных клеток либо из ОЕ21, либо ОЕ19 наносили на планшеты для культур тканей BD Tissue Culture (BD Biosciences) в культуральной среде. Через сутки после нанесения различные концентрации очищенного hu24 и фиксированную концентрацию 4 нМ анти-HulgG Fab-фрагмента, ковалентно связанного с сапорином (Advanced Targeting Systems), добавляли к культурам. После 7 суток инкубирования количество жизнеспособных клеток подсчитывали с использованием CELL TITER GLO^® (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Исходные импульсы люминесценции при использовании культур, содержащих клетки с сапорин-Fab-фрагментом, были приняты за 100%-ные референсные значения, и все остальные импульсы были вычислены соответственно ("нормализованные RLU (относительная световая единица)"). Используя этот анализ, было определено, что hu24 опосредовало цитотоксичность против клеток ОЕ21, но не клеток ОЕ19, и изотип-контроль не влиял на количество клеток, как показано в Таблице 15. Эти результаты показывают, что связывание с клетками антитела hu24 требуется, чтобы вызывать сапорин-опосредованную цитотоксичность по отношению к PTK7-экспрессирующим клеткам, но не оказывать эффект на клетку, не экспрессирующую PTK7.

Пример 9

Синтез vc0101 и mc8261

Синтез vc0101 (vc означает линкер, и 0101 означает лекарственное средство) и mc8261 (тс означает линкер, и 8261 означает лекарственное средство) проводили способами, описанными в международной публикации WO/2013/072813, которая во всей ее полноте включена в данное описание посредством ссылки.

А. Экспериментальный способ синтеза vc0101

Получение N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[(21S,24S,25R)-24-[(2S)-бутан-2-ил]-25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-2-оксоэтил)-18,18,23-триметил- 3,16,19,22-тетраоксо-21-(пропан-2-ил)-2, 7, 10, 13, 26-пентаокса-4, 17, 20, 23-тетраазагептакоз-1-ил]фенил}-N~5~-карбамоил-L-орнитинамида (vc0101).

Стадия 1. Синтез N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-2-метилаланил-N-[(3R,45,58)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (#53). В раствор соединения #32 (2,05 г, 2,83 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (20 мл, 0,1М) и N,N-диметилформамиде (3 мл) добавляли амин #19 (2,5 г, 3,4 ммоль, 1,2 экв.), HATU (1,29 г, 3,38 ммоль, 1,2 экв.) и триэтиламин (1,57 мл, 11,3 ммоль, 4 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре, при этом протекание реакции отслеживали методом ЖХ/МС и ТСХ. Сразу после завершения реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток подвергали три раза азеотропной перегонке с гептанами, и полученный неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 55% ацетона в гептане), с получением соединения #53 (2,42 г, 74%) в виде твердого вещества. ЖХ/МС: m/z 965,7 [М+Н⁺], 987,6 [M+Na⁺], время удерживания = 1,04 минут (Протокол Н, приведенный ниже); HPLC (Протокол А, приведенный ниже): m/z 965,4 [М+Н⁺], время удерживания = 11,344 минут (чистота >97%); ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆), предположительно смесь ротамеров, характеристические сигналы: δ 7.86-7.91 (m, 2Н), [7.77 (d, J=3.3 Гц) и 7.79 (d, J=3.2 Гц), общий 1Н], 7.67-7.74 (m, 2Н), [7.63 (d, J=3.2 Гц) и 7.65 (d, J=3.2 Гц), общий 1Н], 7.38-7.44 (m, 2Н), 7.30-7.36 (m, 2Н), 7.11-7.30 (m, 5Н), [5.39 (ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Гц) и 5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Гц), общий 1Н], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Гц) и 4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Гц), общий 1Н], 3.13, 3.17, 3.18 и 3.24 (4 s, общий 6Н), 2.90 и 3.00 (2 br s, общий 3Н), 1.31 и 1.36 (2 br s, общий 6Н), [1.05 (d, J=6.7 Гц) и 1.09 (d, J=6.7 Гц), общий 3Н].

Стадия 2. Синтез 0101: 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (#54).

В раствор соединения #53 (701 мг, 0,726 ммоль) в дихлорметане (10 мл, 0.07М) добавляли диэтиламин (10 мл), и эту реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре, одновременно отслеживая протекание реакции методами ЖХ/МС и ТСХ. Сразу после завершения реакции реакционную смесь концентрировали в вакууме, остаток подвергали три раза азеотропной перегонке с гептанами, и полученный неочищенный продукт очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 10% метанола в дихлорметане). Остаток разбавляли диэтиловым эфиром и гептаном и концентрировали в вакууме с получением #54 (406 мг, 75%) в виде белого твердого вещества. ЖХ/МС: m/z 743,6 [М+Н⁺], время удерживания = 0,70 минут (Протокол F, приведенный ниже); HPLC (Протокол А, приведенный ниже): m/z 743,4 [М+Н⁺], время удерживания = 6,903 минут, (чистота > 97%); ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆), предположительно смесь ротамеров, характеристические сигналы: δ [8.64 (br d, J=8.5 Гц) и 8.86 (br d, J=8.7 Гц), общий 1Н], [8.04 (br d, J=9.3 Гц) и 8.08 (brd, J=9.3 Гц), общий 1Н], [7.77 (d, J=3.3 Гц) и 7.80 (d, J=3.2 Гц), общий 1Н], [7.63 (d, J=3.3 Гц) и 7.66 (d, J=3.2 Гц), общий 1Н], 7.13-7.31 (m, 5Н), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Гц) и 5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Гц), общий 1Н], [4.49 (dd, J=9, 8 Гц) и 4.60 (dd, J=9, 7 Гц), общий 1Н], 3.16, 3.20, 3.21 и 3.25 (4 s, общий 6Н), 2.93 и 3.02 (2 brs, общий 3Н), 1.21 (s, 3Н), 1.13 и 1.13 (2 s, общий 3Н), [1.05 (d, J=6.7 Гц) и 1.10 (d, J=6.7 Гц), общий 3Н], 0.73-0.80 (m, 3Н).

Стадия 3. Синтез vc0101: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N-{4-[(21S,24S,25R)-24-[(2S)-бутан-2-ил]-2S-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-2-метил-3-оксо-3-{[(1S)-2-фенил-1-(1,3-тиазол-2-ил)этил]амино}пропил]пирролидин-1-ил}-2-оксоэтил)-18, 18, 23-триметил-3, 16, 19, 22-тетраоксо-21-(пропан-2-ил)-2, 7, 10, 13, 26-пентаокса-4, 17, 20, 23-тетраазагептакоз-1-ил]фенил}-N~5~-карбамоил-L-орнитинамида

Реакцию сочетания соединения 0101 (#54) с линкером vc (N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамид) (MalcValCitPABC-PNP) осуществляли согласно Общей методике Е (описанной ниже) с использованием соответствующих количеств DMA в качестве растворителя и НОАТ и 2,6-лутдина в качестве добавок, и полученное целевое неочищенное вещество очищали согласно Способу D (описанному ниже) с получением 33 мг (36%) целевого продукта. В условиях, конкретно указанных в Протоколе А (приведенном ниже) с использованием колонки, поддерживаемой при 45°С, это вещество дало HPLC время удерживания 9,114 минут (Протокол А, приведенный ниже); ЖХ/МС: m/z 1342,6 [М+Н⁺], время удерживания 3,48 минут (Протокол Н, приведенный ниже).

В. Экспериментальный способ синтеза mc8261

Получение N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (mc8261)

Стадия 1. Синтез метил-N-{(2R,3R)-3-метокси-2-метил-3-[(2S)-пирролидин-2-ил]пропаноил}-L-фенилаланината, гидрохлоридной соли (#67). Согласно Общей методике С (описанной ниже) из #37 (2,39 г, 5,33 ммоль, 1 экв.), диоксана (10 мл, 0.53М) и 4М раствора соляной кислоты в диоксане (10 мл, 40 ммоль, 7,5 экв.) было синтезировано соединение #67 (2,21 г) в виде белого твердого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. ЖХ/МС: m/z 349,2 [М+Н⁺], время удерживания = 0,53 минут; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 9.45-9.58 (br m, 1Н), 8.63 (d, J=8.1 Гц, 1H), 8.51-8.62 (br m, 1H), 7.25-7.33 (m, 4H), 7.18-7.25 (m, 1H), 4.50 (ddd, J=10.8, 8.1, 4.5 Гц, 1H), 3.65 (s, 3Н), 3.54 (dd, J=6.8, 4.5 Гц, 1H), 3.20 (s, 3Н), 3.11 (dd, J=13.8, 4.5 Гц, 1H), 2.99-3.14 (br m, 3Н), 2.89 (dd, J=13.8, 10.9 Гц, 1H), 2.44-2.50 (m, 1H, предполагаемый; частично скрыт пиком растворителя), 1.77-1.89 (m, 1Н), 1.60-1.73 (m, 2Н), 1.46-1.57 (m, 1Н), 1.05 (d, J=6.8 Гц, 3Н).

Стадия 2. Синтез N-[(9Н-флуорен-9-илметокси)карбонил]-2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-3-метокси-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-метокси-3-{[(2S)-1-метокси-1-оксо-3-фенилпропан-2-ил]амино}-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида (#68)

Согласно Общей методике D (описанной ниже) из #32 (353 мг, 0,488 ммоль, 1 экв.) в дихлорметане (10 мл, 0,04М), амина #67 (271 мг, ≤0,588 ммоль, 1,3 экв.), HATU (223 мг, 0,586 ммоль, 1,2 экв.) и диизопропилэтиламина (238 мкл, 1,71 ммоль, 3,5 экв.) было синтезировано неочищенное целевое вещество, которое очищали хроматографией на силикагеле (градиент: от 0% до 40% ацетона в гептане) с получением #68 (404 мг, 88% за две стадии) в виде твердого вещества. ЖХ/МС: m/z 940,7 [М+Н⁺], 962,7 [M+Na⁺], время удерживания = 1,04 минут; HPLC (Протокол С, приведенный ниже): время удерживания = 9,022 минут; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆). предположительно смесь ротамеров, характеристические сигналы: δ [8.25 (br d, J=8 Гц) и 8.48 (br d, J=8 Гц), общий 1Н], 7.89 (d, J=7.4 Гц, 2H), 7.67-7.75 (m, 2Н), 7.38-7.44 (m, 2Н), 7.31-7.36 (m, 2Н), 7.14-7.24 (m, 5Н), 4.43-4.69 (m, 3Н), 4.17-4.26 (m, 3Н), 3.91-3.99 (br m, 1H), 3.63 и 3.65 (2 s, общий 3Н), 3.19 и 3.24 (2 s, общий 3Н), 3.14 и 3.15 (2 s, общий 3Н), 2.90 и 2.99 (2 br s, общий 3Н), 1.36 и 1.37 (2 br s, общий 3Н), 1.30 и 1.32 (2 s, общий 3Н), [1.02 (d, J=6.8 Гц) и 1.06 (d, J=6.6 Гц), общий 3Н].

Стадия 3А. Синтез 8261: 2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида, соли с трифторуксусной кислотой (#69)

В раствор #68 (143 мг, 0,152 ммоль, 1 экв.) в тетрагидрофуране (5 мл, 0.02М) добавляли раствор гидроксида лития (9,10 мг, 0,378 ммоль, 2,5 экв.) в воде (3 мл). Через 5 часов реакционную смесь концентрировали в вакууме, подвергали три раза азеотропной перегонке с гептаном, растворяли в диметилсульфоксиде (2,2 мл) и очищали обращенно-фазной хроматографией (Метод С, описанный ниже) с получением #69 (56 мг, 52%). HPLC (Протокол А, приведенный ниже, при 45°С): 704,4 [М+Н⁺], время удерживания = 6,623 минут; ¹Н ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆), предположительно смесь ротамеров, характеристические сигналы: δ 8.08-8.22 и 8.37-8.49 (2 m, общий 5Н), 7.12-7.28 (m, 5Н), 3.18, 3.20 и 3.24 (3 s, общий 6Н), 2.95 и 3.04 (2 br s, общий 3Н), 1.52 и 1.53 (2 s, общий 3Н), 1.39 и 1.41 (2 s, общий 3Н), [1.02 (d, J=6.8 Гц) и 1.05 (d, J=6.6 Гц), общий ЗН], 0.74-0.81 (m, 3Н).

Стадия 4: Синтез mc8261: N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1Н-пиррол-1-ил)гексаноил]-2-метилаланил-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1- карбокси-2-фенилэтил]амино}-1-метокси-2-метил-3-оксопропил]пирролидин-1-ил}-3-метокси-5-метил-1-оксогептан-4-ил]-N-метил-L-валинамида

Реакцию сочетания соединения 8261 (#69) с линкером малеимидокапроилом (mc):

осуществляли согласно Общей методике D (описанной ниже), и полученное неочищенное целевое вещество очищали согласно Методу С (описанному ниже) с получением 30,2 мг (24%) целевого продукта. В условиях, указанных в Протоколе А (приведенном ниже), с использованием колонки, поддерживаемой при 45°С, это вещество дало HPLC время удерживания 9,058 минут (Протокол А, приведенный ниже); ЖХ/МС: m/z 897,7 [М+Н⁺], время удерживания 0,81 минут (Протокол Н, приведенный ниже).

С. Общие методики, методы и протоколы

Общая методика С: Удаление Boc или расщепление трет-бутилового эфира (именуемого также t-Bu-эфиром) с использованием соляной кислоты в диоксане. В раствор либо Вос-содержащего соединения, либо трет-бутиловый эфир-содержащего соединения в диоксане (или в некоторых случаях не в раствор или в раствор в другом релевантном растворителе) добавляли 4М раствор соляной кислоты в диоксане. Протекание реакции отслеживали методом ЖХ/МС (или HPLC, или ТСХ). Реакционную смесь концентрировали в вакууме и в некоторых случаях подвергали азеотропной перегонке от одного до четырех раз с гептанами.

Общая методика D: сочетание с O-(7-азабензотриазол-1-ил)-N,N,N',N'-тетраметилурония гексафторфосфатом (HATU). В перемешиваемый раствор амина (1,0 экв.) и кислоты (1,0-2,0 экв.) в дихлорметане, N,N- диметилформамиде (также упоминаемом как DMF) или в смеси обоих растворителей добавляли HATU (1,0-2,0 экв.), затем добавляли триэтиламин (2,0-4,0 экв.) или диизопропилэтиламин (2,0-4,0 экв., также упоминаемый как основание Хюнига). Протекание реакции отслеживали методом ЖХ/МС (или HPLC, или ТСХ); реакция обычно заканчивалась не позднее трех часов. Растворители удаляли в вакууме. Остаток очищали хроматографией на силикагеле или обращенно-фазной хроматографией, или в некоторых случаях подвергали три раза азеотропной перегонке с гептанами, разбавляли небольшим количеством этилацетата, после чего наносили на диоксид кремния или С18 связанный диоксид кремния и очищали хроматографией на силикагеле или обращенно-фазной хроматографией.

Общая методика Е: сочетание с N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамидом (MalcValCitPABC-PNP). В смесь являющегося полезной нагрузкой амина (1 экв.) и N-[6-(2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)гексаноил]-L-валил-N⁵-карбамоил-N-[4-({[(4-нитрофенокси)карбонил]окси}метил)фенил]-L-орнитинамида (MalcValCitPABC-PNP, Европейская патентная заявка (1994), ЕР624377, 1,0-2,0 экв.) в N,N-диметилформамиде или диметилацетамиде (также упоминаемом как DMA), добавляли пиридин (0,0-4,0 экв.), диизопропилэтиламин (0,0-4,0 экв.), 2,6-диметилпиридин (0,0-4,0 экв., также упоминаемый как 2,6-лутидин) и гидрат 1-гидроксибензотриазола (0,01-1,1 экв., также упоминаемый как НОВТ) или 3Н-[1,2,3]триазоло[4,5-b]пиридин-3-ол (0,01-1,1 экв., также упоминаемый как НОАТ). После перемешивания при 40°С-50°С в течение 1-48 часов реакционную смесь концентрировали в вакууме и подвергали три раза азеотропной перегонке с гептаном. Неочищенное вещество очищали обращенно-фазной хроматографией согласно конкретно указанному методу с получением целевого вещества.

Метод С: Колонка: Phenomenex Luna С18, 100×30 мм, 10 мкм; Подвижная фаза А: 0,02% трифторуксусной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,02% трифторуксусной кислоты в метаноле (об./об.); Градиент: от 10% до 90% В за 20 минут; Скорость потока: 20 мл/мин. Температура: не контролировали; Детектирование: DAD (детектировние на диодной матрице) 210 нм, 254 нм; Впрыскиваемый объем: вариабельный;

Прибор: Gilson.

Метод D: Колонка: Phenomenex Synergi Max-RP, 150×21,2 мм, 4 пм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде; Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле; Градиент: 30% В в течение 1,5 минут, от 30% до 60% В за 8,5 минут, от 60 до 100% В за 0,5 минут, затем 100% В в течение 2 минут; Скорость потока: 27 мл/мин; Детектирование: DAD 210-360 нм; МС (+) диапазон 150-20005 дальтон; Прибор: Waters FractionLynx.

Протокол А. Колонка: Phenomenex Luna С18 (2), 150×3,0 мм, 5 мкм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 5% В в течение 1,5 минут, от 5% до 100% В за 8,5 минут, затем 100% В в течение 1 минуты; Скорость потока: 0,75 мл/мин. Температура: 25°С; Детектирование: DAD 215 нм; МС (+) диапазон 150-2000 дальтон; Впрыскиваемый объем: 10 мкл Прибор: Agilent 1200 LCMS.

Протокол С: Колонка: Phenomenex Luna С18 (2), 150×3,0 мм, 5 мкм; Подвижная фаза А: 0,02% трифторуксусной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,02% трифторуксусной кислоты в метаноле (об./об.); Градиент: от 50% до 100% В за 10 минут; Скорость потока: 0,75 мл/мин. Температура: не контролировали; Детектирование: DAD 215 нм, 254 нм; Впрыскиваемый объем: 10 мкл; Прибор: Agilent 1100 HPLC.

Протокол F: Колонка: Waters Acquity UPLC ВЕН, С18, 2,1×50 мм, 1,7 мкм; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: 5% В в течение 0,1 минуты, от 5% до 95% В за 0,7 минуты, 95% В в течение 0,1 минуты; Скорость потока: 1,25 мл/мин. Температура: 60°С; Детектирование: 200-450 нм; МС (+) диапазон 100-1200 дальтон; Впрыскиваемый объем: 5 мкл; Прибор: Waters Acquity.

Протокол Н: Колонка: Phenomenex Gemini-NX, С18, 4,6×50 мм, 3 мкм, 110А; Подвижная фаза А: 0,1% муравьиной кислоты в воде (об./об.); Подвижная фаза В: 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле (об./об.); Градиент: от 0% до 100% В за 4,10 минуты, линейно затем 100% В в течение 0,4 минуты; Скорость потока: 1,5 мл/мин. Температура: 60°С; Детектирование: DAD 200-450 нм; МС (+) диапазон 100-2000 дальтон; Впрыскиваемый объем: 5 мкл; Прибор: Agilent.

Пример 10

Биоконъюгирование анти-РТК7 антител

А. Конъюгаты анти-РТК7-ус0101 антитело-лекарственное средство

В настоящем изобретении анти-РТК7 антитела hu23, hu24 и hu58 конъюгировали с vc0101 с образованием hu23-vc0101 ADC, hu24-vc0101 ADC и hu58-vc0101 ADC, или конъюгировали с mc8261 с образованием hu23-mc8261 ADC, hu24-mc8261 ADC и hu58 mc8261 ADC. Конъюгирование hu23, hu24 и hu58 с vc0101 или mc8261 достигалось за счет дериватизации боковых цепей цистеиновых остатков. Эти цистеины обычно образуют пары, связанные межцепочечными цистеиновыми дисульфидными мостиками, и имеется 4 консервативных пары (включающие в себя 8 цистеинов остатков) на антителе IgG1. Частичное восстановление этих дисульфидных связей обеспечивает распределение свободных тиолов, которые могут быть функционализированы малеимидным концом на vc линкере. Конкретно, анти-РТК7 антитела по настоящему изобретению частично восстанавливали посредством добавления 2,4 молярного избытка трис(2-карбоксиэтил)фосфина (ТСЕР) в 100 мМ HEPES (буферный раствор 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты), рН 7,0, и 1 мМ диэтилентриаминпентауксусной кислоты (DTPA) в течение 2 часов при 37°С. vc0101 или mc8261 линкер-полезная нагрузка затем добавляли в реакционную смесь при малярном соотношении линкер-полезная нагрузка/антитело, равном 7, и подвергали взаимодействию в течение еще 1 часа при 25°С в присутствии 15% (об./об.) диметилацетамида (DMA). После периода инкубации 1 час добавляли 3-кратный избыток N-этилмалеимида, чтобы кэпировать непрореагировавшие тиолы, и оставляли взаимодействовать в течение 15 минут, после чего добавляли 6-кратный избыток L-Cys, чтобы погасить непрореагировавшую конструкцию линкер-полезная нагрузка.

Реакционную смесь подвергали диализу в течение ночи при 4°С в забуференном фосфатами физиологическом растворе (PBS), рН 74, и очищали посредством эксклюзионной хроматографии (SEC; АКТА explorer, Superdex 200). Конечное ADC лекарственное вещество представляли в буфере из 20 мМ гистидина, 85 мг/мл сахарозы, рН 5,8.

Далее определяли характеристики конъюгатов анти-РТК антитело-лекарственное средство методами SEC в отношении чистоты и хроматографии гидрофобного взаимодействия (HIC), и жидкостной хроматографии/масс спектрометрии с электораспылительной ионизацией (ЖХ-/ЭРИ МС), которую использовали для вычисления соотношения лекарственного средства к антителу (лекарственная нагрузка). Концентрацию белка определяли методом ультрафиолетовой (УФ) спектрофотометрии. Этот способ обеспечивает получение конъюгата антитело-лекарственное средство в виде гетерогенной смеси функционализированных антител, имеющего среднее соотношение лекарственного средства к антителу (DAR) приблизительно 4 моль/моль.

Профиль распределения лекарственного средства оценивали методом HIC для hu24-vc0101, и он представлен на хроматограмме на ФИГ. 7. Кратко, аналитическую HIC проводили на колонке TSK gel butul-NPR. ADC связывали с колонкой в 1,5М сульфате аммония, 50 мМ двухосновном фосфате калия, рН 7, и элюировали 50 мМ двухосновным фосфатом калия и 20% изопропанолом (IPA), рН 7.

Б. Конъюгаты антитело-лекарственное средство анти-PTK7-AcBut СМ

В настоящем изобретении анти-РТК7 антитела hu23, hu24 и hu58 конъюгировали с OSu эфиром диметилгидразида AcBut-N-ацетил-γ-калихеамицина (AcButCM) с образованием hu23-AcButCM ADC, hu24-AcButCM ADC и hu58-AcButCM ADC, которые показаны ниже, где X может представлять собой любое антитело, такое как hu23, hu24 и hu58.

Реакционная смесь содержала 10 мг/мл или меньше OSu эфира анти-РТК7 антитела и AcButCM в молярном соотношении 4-4,5 к 1. Во время добавления AcButCM осуществляли сильное перемешивание для создания смешивающего вихря. рН реакционной смеси составлял 8,3, и концентрации реакционных компонентов были следующие: 180 мМ буфера HEPES, 41 мМ деканоата натрия и 8% (об./об.) этанола. Реакцию проводили при 33°С в течение 5 минут. После завершения реакции конъюгирования реакционную смесь медленно разбавляли 1,3 объемами 1М K₂HPO₄, доводя до рН 8,5 при перемешивании.

Для очистки вышеуказанную разбавленную смесь загружали двумя партиями на колонку Butyl Sepharose-4 Fast Flow HIC (GE Healthcare), которая была предварительно уравновешена пятью колоночными объемами (cv) 0,52М калийфосфатного буфера, рН 8,5. Белок, загруженный на колонку, составлял 3,5 мг/мл объема слоя. Скорость потока через загруженный образец составляла 15 мл/мин и 22 мл/мин на этапе промывки и элюирования при хроматографии. Этот усовершенствованный градиент позволяет отделять ADC с более высокими значениями DAR, которые были связаны с колонкой.

Несвязанная фракция во время загрузки представляла собой преимущественно реакционные реагенты и большую часть неконъюгированного антитела, которое отбрасывали. Колонку затем промывали 0,3 cv 0,52М калийфосфатного буфера, рН 8,5, для удаления любых оставшихся реагентов. Ступенчатый градиент с 1 cv от 0,52М до 0,4М калийфосфатного буфера, рН 8,5, затем использовали для элюирования любого слабо связанного неконъюгированного антитела вместе с анти-РТК7-AcButCM с низкой нагрузкой, если он присутствует. Основную фракцию затем элюировали, используя ступенчатый градиент 1 cv от 0,4М до 5 мМ калийфосфатного буфера, рН 8,5, с получением анти-РТК7-AcButCM, имеющего DAR в пределах от 3 до 5 к концу градиента. Если присутствовали анти-РТК7-AcButCM конъюгаты с более высоким DAR, то фракцию элюировали, используя градиент 2 cv 5 мМ калийфосфатного буфера, рН 8,5, и затем элюировали чистой деионизированной водой. Любые конъюгаты анти-РТК7-AcButCM с более высоким DAR, которые оставались связанными после элюирования деионизированной водой, элюировали, используя 2 cv 10 мМ гидроксида натрия, содержащего 20% этанола. Очищенные партии содержали анти-РТК7-AcButCM конъюгаты с DAR от 3 до 5.

Эти усовершенствованные способы конъюгирования и очистки обеспечивали получение ADC, имеющих DAR менее 6, и в некоторых аспектах в диапазоне от 3 до 5. Кроме того, эти способы обеспечивали более узкое распределение нагрузки, например меньшую гетерогенность в продукте.

Усовершенствования в способах конъюгирования и очистки также включали: 1) снижение соотношения AcButCM к анти-РТК7 антителу до 4-4,5 к 1 с образованием ADC, имеющего более низкое DAR, 2) проведение энергичного перемешивания во время добавления AcButCM к анти-РТК7 антителу с образованием ADC с малыми количествами неконъюгированного антитела (свободного антитела), 3) сокращение времени инкубирования до 5 минут, по сравнению с 60-90 минутами, обеспечивающее низкое агрегирование; и 4) снижение количества этанола до 6-8%, обеспечивающее снижение содержания агрегатов. Очищенные объединенные максимумы веществ из обеих партий подвергали диализу дважды против приготовленного буфера для облегчения хранения в замороженном состоянии. Приготовленная буферная композиция представляла собой 20 мМ Tris, 7,5% сахарозы, 0,01% полисорбата 80, 10 мМ NaCI, рН 8,0.

Пример 11

Характеристика связывания hu24 mAb и hu24 ADC

Чтобы определить, связывается ли hu24 mAb и hu24-vc0101 ADC с ортологом PTK7 яванского макака, белок PTK7 яванского макака клонировали и экспрессировали. Анализ последовательности выявил, что этот белок на 97,9% идентичен белку PTK7 человека.

Анализ методом поверхностного плазмонного резонанса (SPR) проводили, чтобы определить характеристики связывания mAb и ADC с эктодоменами белка PTK7 человека и яванского макака. Определяли связывание, которое сравнивали методом SPR анализа. Не было значительной разницы в аффиностях mAb и ADC к белку PTK7 человека или яванского макака (Таблица 16). Все измерения K_on находятся в пределах 3-кратных диапазонов, и все измерения K_off находятся в пределах 2-кратных диапазонов, которые считаются находящимися в области типичной систематической ошибки, и поэтому не могут быть физиологически значимыми.

Способность анти-РТК7 mAb связываться с ортологами PTK7 также оценивали методом сэндвич ELISA. Кратко, человеческий, яванского макака, крысиный или мышиный PTK7-His меченый белок иммобилизировали на планшете для ELISA прямым нанесением. Все антигены иммобилизовали в концентрации 1 мкг/мл, 100 мкл на лунку. Hu24 mAb и hu24-vc0101 ADC последовательно разводили, начиная с 810 нг/мл, и добавляли в промытые и блокированные лунки для тестирования связывания с антигеном. Связывание mAb и ADC детектировали с помощью конъюгата поликлонального антитела против IgG человека с пероксидазой хрена, и данные считывали с использованием ТМВ субстрата.

Оба mAb и ADC сравнимо связывались с белками PTK7 человека и яванского макака по результатам ELISA (Таблица 17). Вместе с результатами SPR эти результаты подтвердили перекрестную реакционную способность с PTK7 яванского макака и продемонстрировали, что процесс биоконъюгирования не изменяет измеренные характеристики связывания mAb. Однако ни mAb, ни ADC не продемонстрировали детектируемое связывание с крысиным или мышиным белком PTK7 при концентрации антигена, в 100 раз более высокой, чем необходимо для измерения связывания с PTK7 человека (Таблица 17). Было подтверждено, что крысиные и мышиные антигены должным образом связываются при связывании с известными перекрестно реакционноспособными антителами (данные не показаны).

Неконъюгированное hu24 и hu24, конъюгированное с vc0101, сравнивали по их способности связываться с PTK7-экспрессирующими клетками методом проточной цитометрии, описанным в Примере 3. Кратко, культивированные клетки Н1975 или EKVX собирали и инкубировали при 4°С с hu24-vc0101 ADC или неконъюгированным hu24 mAb, затем с фторофор-конъюгированным вторичным mAb и витальным красителем и затем анализировали методом проточной цитометрии.

В Таблице 18 представлена средняя канальная флуоресценция популяции жизнеспособных клеток. Сравнимые данные были получены в независимом повторном эксперименте, следовательно конъюгирование hu24 с группировкой линкер-полезная нагрузка не изменяет его связывание с PTK7-экспрессирующими клетками.

Пример 12

Анализы на цитотоксичность in vitro

Цитотоксичность конъюгата антитело-лекарственное средство hu24-vc0101 оценивали на линиях клеток, которые экспрессируют PTK7-мишень. Сконструированную НЕК293Т-РТК7 сверхэкспрессирующую линию клеток высевали в планшет с плоским дном для культуры ткани (BD Falcon) при 500 клеток на 180 мкл среды для клеточной культуры на лунку. Линии раковых клеток человека также тестировали в этом анализе и высевали при плотности, которая предварительно была определена как оптимальная для каждой линии клеток в соответствии с их скоростью роста (Н661 1500 клеток на лунку и Н446 9600 клеток на лунку в 150 мкл). Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе с 5% CO₂. На следующий день hu24-vc0101 ADC и 8.84 Ab-vc0101 ADC (отрицательный контроль) добавляли к клеткам по 10-точечной кривой концентрации в образцах в трех повторах, начиная с 3 или 10 мкг/мл с 1:3 разведениями в среде для культивирования клеток. Планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, в течение 4 суток. MTS анализ (Promega CellTiter 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Assay) использовали согласно инструкциям производителя. 30 мкл (Н446, Н661) или 40 мкл (HEK293T-РТК7) объединенного MTS реагента добавляли в каждую лунку, и планшет инкубировали в инкубаторе при 37°С, 5% СО₂, в течение 2 часов. OD определяли при 490 нм с использованием ридера для 96-луночных планшетов. Среднее показание из лунок только со средой вычитали из показаний лунок с клетками и контролем для фоновой OD. Данные подвергали логистическому нелинейному регрессионному анализу (программное обеспечение GraphPad Prism) с целью определения концентрации конъюгата антитело-лекарственное средство, при которой жизнеспособность клеток ингибируется на 50% (IC50).

В Таблице 19 приведены значения IC50 для hu24-vc0101 ADC в анализе цитотоксичности. Во всех трех линиях клеток hu24-vc0101 вызывал сильную цитотоксичность, тогда как несвязывающее 8.84 Ab-vc0101 нет; эти данные демонстрируют, что сильная цитотоксичность hu24-vc0101 зависит от анти-РТК7 антитела.

Пример 13

Эффективность конъюгатов анти-РТК7 антитело-лекарственное средство in vivo

Эффекты конъюгатов анти-РТК7 антитело-лекарственное средство дополнительно оценивали in vivo по росту ксенотрансплантатов из опухолей пациентов-людей (PDX). Образцы первичных опухолей после резекции получали из клинических учреждений после разрешения Институционального наблюдательного совета по соблюдению прав пациентов и в соответствии с правилами HIPAA. Фрагменты опухолей хранили и перевозили в гипотермазоле (Biolife Растворы) на льду и заделывали в матригель (BD), содержащий собственную смесь факторов роста, и имплантировали подкожно в жировую прослойку молочной железы самок мышей NOD/SCID не позднее, чем через 24 часа после резекции. Мышей контролировали на предмет их состояния здоровья ежедневно и на предмет роста опухоли изначально визуальным осмотром дважды в неделю. Сразу после пальпирования опухолей начинали измерение объема опухолей, чтобы проследить рост опухолей и оценить время удваивания клеток. Объем опухоли оценивали с использованием уравнения V = (А*В²)/2, где А означает длинную ось, и В означает короткую ось. Когда опухоли достигали объема от 500 мм³ до 1500 мм³, тогда их собирали для исследования и для ретрансплантации в качестве ксенотрансплантата, имеющего происхождение из пациента (PDX). В зависимости от линии механическую и/или химическую диссоциацию можно использовать для выделения индивидуальных клеток для пересева. Живые клетки инокулировали в животных, ранее не подвергавшихся экспериментам, в количестве 10000-50000 клеток на животное.

Для исследований эффективности опухоли собирали из исследований с пересеванием, и клетки диссоциировали в суспензию отдельных клеток. Препараты считывали на предмет наличия живых клеток с исключением с использованием трипанового синего, и инокулировали 10000-50000 клеток на мышь в матригеле. Для оценки скоростей дифференциального роста PDX по меньшей мере более 25% животных были допущены с минимальным несоответствием объема опухоли при рандомизации. Рост опухоли изначально сопровождался пальпацией с измерениями, начиная сразу после того, как опухоль достигла примерно 30 мм³. Исследования рандомизировали на основе размера опухоли сразу после того, как в когорте опухоль-несущих мышей размеры опухолей достигали от 140 мм³ до 180 мм³. Дозы животным вводили интраперитонеальной инъекцией дважды в неделю в течение двух недель (q4dx4). За группами исследования продолжали наблюдать до тех пор, пока индивидуальные мыши или размеры всех опухолей группы не достигли 1200 мм³, и тогда их умерщвляли в соответствии с протоколом IACUC. Для выбранных фармакокинетических исследований с введением доз осуществляли подчелюстной отбор крови через 2 часа, 36 часов и 72 часов. Объем крови 10 мкл немедленно пипетировали в 90 мкл HBS-P (GE Healthcare). Образцы хранили при -80°С до анализа. При каждом измерении опухолей приводят в виде объема опухоли ± стандартная погрешность среднего (SEM). GT = группа, аннулированная из-за большого размера опухоли. Все исследования включали контрольный конъюгат антитело-лекарственное средство, состоящий из несвязывающегося антитела hlgG1, конъюгированного с такой же группировкой линкер-полезная нагрузка, как и анализируемая и с сравнимыми соотношением лекарственного средства к антителу (DAR) и распределением нагрузки.

Таблицы 20-37 демонстрируют эффективность конъюгатов антитело - лекарственное средство hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-AcButCM, hu24-AcButCM и hu58-AcButCM в PDX-моделях, созданных с использованием различных опухолевых клеток человека, которые имеют относительную экспрессию PTK7, определенную как низкая, средняя или высокая.

А. Рак молочной железы (BR)

Таблица 20 и ФИГ. 8 демонстрируют, что hu23-vc0101, hu24-vc0101 и hu58-vc0101 ADC все являются эффективными в PDX-модели с использованием PDX-модели трижды негативного рака молочной железы (TNBC) человека Breast-13 (BR13) (высокая экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. hu24-vc0101 ADC был более эффективен, чем оба hu23-vc0101 и hu58-vc0101 в PDX-модели BR13. Все протестированные PTK7 ADC были более эффективными, чем доксорубицин, который является стандартом лечения при TNBC.

ФИГ. 9 и 10 демонстрируют эффективность hu23-mc8261, hu24-mc8261 и hu58-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR13 (высокая экспрессия PTK7) в сравнении с hu24-vc0101. Лечение hu24-vc0101 обеспечило длительную регрессию опухоли в течение 200 суток и продемонстрировало большее ингибирование роста опухоли по сравнению с анти-РТК7-mc8261 ADC.

Таблица 21 и ФИГ. 11 демонстрируют, что hu23-vc0101, hu24-vc0101 и hu58-vc0101 ADC все являются эффективными в PDX-модели с использованием человека PDX-модели TNBC Breast-22 (BR22) (высокая экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. В этой модели hu23-vc0101 и hu24-vc0101 ADC были более эффективными, чем hu58-vc0101, демонстрируя, что сходные антитела к одной и той же мишени (РТК7) имеют различные степени эффективности. Все протестированные PTK7 ADC были более эффективными, чем доцетаксел, который является стандартом лечения при TNBC. Примечательно, что доцетаксел и лекарственный компонент ADC, ауристатин 0101, имеют сходные механизмы действия в том, что они ингибируют полимеризацию тубулина.

Таблица 22 показывает, что hu23-AcButCM, hu24-AcButCM и hu58-AcButCM ADC все были эффективными в PDX-модели TNBC BR22 (высокая экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Однако hu58-AcButCM был более эффективен, чем оба hu23-AcButCM и hu24-AcButCM, что иллюстрирует непредсказуемый характер использования различных полезных нагрузок со сходными антителами к одной и той же мишени. hu23-vc0101 и hu24-vc0101 ADC были более эффективными, чем hu58-vc0101, a hu58-AcButCM был более эффективным, чем оба hu23-cButCM и hu24-AcButCM ADC. Все протестированные PTK7 ADC были более эффективными, чем доксорубицин, который является стандартом лечения при TNBC.

ФИГ. 12 и 13 демонстрируют эффективность hu23-mc8261, hu24-mc8261 и hu58-mc8261 ADC в PDX-модели TNBC BR22 (высокая экспрессия PTK7) в сравнении с hu23-vc0101. Лечение hu23-vc0101 обеспечило длительную регрессию опухоли в течение свыше 200 суток и продемонстрировало большее ингибирование роста опухоли по сравнению с анти-РТК7-mc8261 ADC.

Таблицы 23-25 и ФИГ. 14 демонстрируют эффективность hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-mc8261 и hu24-mc8261, hu58-mc8261 и hu23-AcButCM, hu24-AcButCM, hu58-AcButCM ADC in PDX-модели TNBC Breast-31 (BR31) (высокая экспрессия PTK7). В этой модели все три ADC, имеющие группировку линкер-полезная нагрузка vc0101, были более эффективными, чем ADC, имеющие AcButCM или mc8261. Этот результат был неожиданным, поскольку группировка линкер-полезная нагрузка AcButCM обычно была более эффективной, чем группировка линкер полезная нагрузка vc0101b протестированных in vivo PDX-моделях. Кроме того, PTK7-vc0101 ADC были более эффективными, чем доцетаксел, и PTK7-AcButCM ADC были более эффективными, чем доксорубицин. Оба доцетаксел и доксорубицин являются стандартами лечения при TNBC.

Таблица 26 и ФИГ. 15 демонстрируют, что hu24-vc0101 ADC был эффективным в PDX-модели TNBC человека Breast-64 (BR64) (средняя экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Данные демонстрируют, что hu24-vc0101 эффективно направленно воздействовал на PDX-модель, имеющую умеренную экспрессию PTK7-мишени. Hu24-vc0101 был более эффективным, чем доцетаксел, стандарт лечения при TNBC.

ФИГ. 16 демонстрирует эффективность hu24-vc0101 и отсутствие эффективности неконъюгированного hu24 в PDX-модели TNBC BR5. Мышам с ксенотрансплантатами рака молочной железы человека Br5 вводили каждые четыре дня в течение четырех циклов (Q4Dx4) hu24-vc0101 ADC, неконъюгированное hu24 mAb или носитель. Определение размеров опухолей выполняли дважды в неделю, используя штангенциркуль с цифровой индикацией, и эти размеры показаны в виде среднего значения ± SEM. Доза 3 мг/кг hu24-vc0101 ADC вызывала регрессию опухоли без роста опухоли через 49 дней. Напротив, неконъюгированное mAb hu24 не ингибировало рост опухоли (ФИГ. 16). Таким образом, наблюдаемая эффективность зависит от доставки группировки линкер-полезная нагрузка.

ФИГ. 17 демонстрирует эффективность hu24-vc0101 в сравнении с паклитакселом в PDX-модели PR+ TNBC BR36. Мышам с ксенотрансплантатами рака молочной железы человека BR36 вводили Q4Dx4 hu24-vc0101 ADC, паклитаксел, ADC-отрицательный контроль или носитель. Определение размеров опухолей выполняли дважды в неделю, используя штангенциркуль с цифровой индикацией, и эти размеры показаны в виде среднего значения ± SEM. Доза 3 мг/кг hu24-vc0101 ADC вызывала регрессию опухоли без роста опухоли через 103 дня. Hu24-vc0101 в отсутствии подготовленного паклитаксела вводили при MTD. ADC-отрицательный контроль демонстрировал только умеренную активность (ФИГ. 17). В.

Мелкоклеточный рак легкого (SCLC)

Данные в Таблицах 27-28 иллюстрируют эффективность hu24-vc0101 и hu24-AcButCM ADC в PDX-модели мелкоклеточного рака легкого-64 (LU64) (низкая экспрессия PTK7). Было показано, что в этой модели оба ADC эффективны в этой PDX-модели с низкой экспрессией PTK7, хотя ADC, имеющие группировку AcButCM линкер-полезная нагрузка были более эффективными, чем ADC, имеющие группировку vc0101 линкер-полезная нагрузка. Оба hu24-vc0101 и hu24-AcButCM были более эффективными, чем стандарт лечения при SCLC (который представляет собой цисплатин плюс этопозид).

Таблица 29 демонстрирует эффективность hu23-mc8261, hu24-mc8261 и hu58-mc8261 ADC в PDX-модели LU64 (низкая экспрессия PTK7). Лечение hu24-vc0101 продемонстрировало большее ингибирование роста опухоли, чем анти-тс8261 ADC в этой модели.

Таблицы 30-31 демонстрируют эффективность hu24-vc0101, hu23-vc0101 и hu24-AcButCM ADC в PDX-модели мелкоклеточного рака легкого-86 (LU86) (высокая экспрессия PTK7). В этой модели оба hu24-vc0101and hu23-vc0101 были эффективными в подавлении роста опухоли. Hu24-vc0101 был более эффективным, чем контрольный vc0101 ADC. Однако hu24-AcButCM ADC был более эффективным, чем оба ADC, имеющих группировку vc0101 линкер-полезная нагрузка (Таблица 22), предоставляя дополнительный пример общей большей эффективности AcButCM по сравнению со vc0101 в моделях SCLC. Hu24-AcButCM был более эффективным, чем цисплатин плюс этопозид, который представляет собой стандарт лечения при SCLC.

Таблица 32 демонстрирует эффективность hu23-mc8261, hu24-mc8261 и hu58-mc8261 ADC в PDX-модели LU86 (высокая экспрессия PTK7). Лечение hu23-vc0101 обеспечивало длительную регрессию опухоли в PDX-модели LU86 и демострировало большее ингибирование роста опухоли по сравнению с анти-РТК7-mc8261 ADC.

ФИГ. 18А-В демонстрируют эффективность анти-РТК7 ADC, конъюгированных с либо 0101, либо СМ в двух разных PDX-моделях SCLC, в PDX-модели Н1048 (высокая экспрессия PTK7) и в PDX-модели SCLC 95 (высокая экспрессия PTK7) соответственно.

ФИГ. 19А-В демонстрируют эффективность hu24-AcBut СМ в двух разных PDX моделях SCLC, в PDX-модели SCLC 117 (умеренная экспрессия PTK7) и в PDX-модели SCLC 102 (низкая экспрессия PTK7) соответственно. Результаты демонстрируют, что hu24-AcButCM или hu23-AcButCM ADC более эффективны, чем hu24-vc0101 ADC, против SCLC. Это открытие является неожиданным в свете сильной противоопухолевой активности hu24-vc0101 в PDX-моделях других типов опухолей, таких как TNBC и NSCLC. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что активность ADC коррелирует с экспрессией PTK7, поскольку hu24-AcButCM ADC вызывал наислабейший ответ в модели SCLC102, которая имеет низкую экспрессию PTK7.

В. Немелкоклеточный рак легкого (NSCLC)

Таблица 33 и ФИГ. 20 демонстрируют, что hu24-vc0101 ADC был эффективным в PDX-модели человеческого немелкоклеточного рака легкого-135 (LU135) (высокая экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Эти данные демонстрируют эффективность hu24-vc0101 в подавлении роста опухоли в PDX-модели NSCLC. Hu24-vc0101 был более эффективным, чем паклитаксел, который является стандартом лечения при NSCLC.

Таблица 34 и ФИГ. 21 демонстрируют, что hu24-vc0101 ADC был эффективным в PDX-модели человеческого немелкоклеточного рака легкого-176 (LU176) (высокая экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Эти данные демонстрируют эффективность hu24-vc0101 в подавлении роста опухоли в PDX-модели NSCLC. Hu24-vc0101, был более эффективным, чем цисплатин, который является стандартом лечения при NSCLC.

Г. Рак яичника (OV)

Таблица 35 демонстрирует эффективность hu24-vc0101 и hu24-AcButCM ADC в PDX-модели человеческого рака яичника-55 (OV55) (средняя экспрессия PTK7) по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Эти данные демонстрируют, что ADC эффективно направленно воздействует на PDX-модель яичника, которая имеет умеренную экспрессию PTK7-мишени. Неожиданно, у животных, которых лечили hu24-vc0101, отсутствовала опухоль, когда эксперимент закончился. hu24-AcButCM ADC был менее эффективным в этой модели.

Д. Меланома (SK)

Таблица 36 демонстрирует, что hu24-vc0101 ADC был эффективным в PDX-модели (средняя экспрессия PTK7) меланомы-23 (SK23) человека по сравнению с контролем-носителем и контрольным лекарственным средством. Эти данные демонстрируют, что эффективность hu24-vc0101 в PDX-модели меланомы, имеющей умеренную экспрессию PTK7-мишени, обеспечивает потенциальное показание для использования ADC.

Е. Ингибирование роста опухоли в PDX-моделях рака молочной железы и NSCLC

Животным вводили дозы каждые четыре дня в течение четырех циклов (Q4Dx4) интраперитонеальными инъекциями, за исключением исследования BR5, в котором введение осуществляли внутривенными инъекциями по той же схеме. Измерения опухолей проводили один или два раза в неделю с использованием штангенциркуля с цифровой индикацией, и объем опухоли оценивали с использованием уравнения V=(A×В²)/2, где А означает длинную ось, и В означает короткую ось. Массы тела животных измеряли и записывали по меньшей мере один раз в неделю. Группы исследования вели до тех пор, пока индивидуальные мыши или измерения опухолей всей группы не достигали 1200 мм³, и в этой точке выполняли умерщвление в соответствии с протоколом IACUC. Для исследования BR5 животных умерщвляли, как только объем опухоли достигал 15% от массы тела при стадировании в соответствии с протоколом IACUC.

Ингибирование роста опухоли (TGI) вычисляли с использованием уравнения % TGI = [1-(средний объем опухоли при лечении)/(средний объем опухоли при введении носителя)]. TGI вычисляли в самой последней точке времени, которая обычно была точкой последнего измерения перед тем, как контрольная группа прекращала участие в исследовании, как описано выше. Регрессию опухоли определяли как сокращение среднего объема опухоли после введения доз. В случаях, когда опухоли регрессировали, время до прогрессирования (ТТР) означает количество дней между первым измерением и моментом времени, когда средний объем опухоли увеличился по сравнению с предыдущим измерением в статистически значимой степени. Если опухоль не возобнавляла рост в ходе эксперимента, то ТТР означает количество дней между первой дозой и концом эксперимента.

Для подтверждения воздействия hu24-vc0101 ADC в исследованиях эффективности концентрации ADC и общего антитела в плазме крови определяли для двух PDX-моделях, PDX-модели BR13 и PDX-модели BR22. Образцы собирали в трех точках времени после третьего введения ADC, и концентрации измеряли посредством анализа связывания лиганда (LBA) (данные не показаны). Данные свидетельствуют о том, что воздействия лекарственных средств были сравнимы в этих моделях опухолей.

Hu24-vc0101 ADC вызывал противоопухолевую активность в моделях рака молочной железы и моделях NSCLC. Опухоли регрессировали после лечения и обычно не возобновляли рост в течение месяцев после последнего введения ADC. Неконъюгированное mAb hu24 не вызывало противоопухолевую активность в протестированных моделях, которые продемонстрировали ауристатин-зависимый механизм действия. Результаты суммированы в Таблице 37.

Пример 14

Механизм действия 0101

Для исследования механизма действия hu24-vc0101 ADC клетки обрабатывали ADC, а затем оценивали структуру их микротрубочек. Ауристатин представляет собой полностью синтетический, основанный на доластатине пентапептидный ингибитор полимеризации тубулина, который индуцирует G2/M остановку клеточного цикла и гибель клеток при низких пикомолярных внутриклеточных концентрациях (Sapra et al., 2011, Expert Opin Investig Drugs 20(8):1131-49, и Turner et al., 1998, Prostate 34(3):175-81).

Клетки рака легкого H661 высевали на 4-луночную камерную слайдовую систему с покрытой СС2 поверхностью роста (Thermo Scientific) и обрабатывали в течение 48 часов hu24-vc0101, ADC-отрицательным контролем, неконъюгированным hu24mAb при 0-4 мкг/мл или свободным 0101 ауристатином при 0,1-10 нМ. Клетки затем фиксировали в 3%-ном параформальдегиде, промывали PBS, делали проницаемыми с использованием 0,5%-ного Triton-X^® (Sigma Chemical) в PBS, промывали PBS и инкубировали с блокирующим буфером (5% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Tween-20 в PBS). Клетки инкубировали с первичным антителом против а-тубулина (Sigma NoT9026, клон DM1A) в блокирующем буфере в течение 1 часа при комнатной температуре. После этого клетки промывали PBS и инкубировали в течение 30 минут с Alexa Fluor^® 488-конъюгированным вторичным антителом (Invitrogen Corp) и 4′ ,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для окрашивания ДНК. Клетки визуализировали на конфокальном микроскопе Zeiss LSM 510 Meta.

Обработка клеток свободным 0101 или hu24-vc0101 ADC разрушала структуру микротрубочек и приводила к остановке клеточного цикла G2/M. Напротив, ни неконъюгированное hu24 mAb, ни mAb-отрицательный контроль не вызывали такие ответные реакции (ФИГ. 22). Эти результаты демонстрируют, что hu24-vc0101 ADC может вызывать цитотоксичность антиген-зависимым образом в результате разрушения структуры микротрубочек и остановки G2/M. Этот механизм согласуется с предыдущими исследованиями на неконъюгированных ауристатинах.

Пример 15

Воздействие hu24-vc0101 ADC на эндотелиальные клетки

ФИГ. 23 показывает, что hu24-vc0101 ADC ингибирует ангиогенез в стандартном анализе разрастания HUVEC in vitro. Кратко, клетки HUVEC (Lonza- #СС-2517) использовали для нанесения на гранулы Cytodex (Sigma #C0646-5G) при соотношении приблизительно 1×10⁶ клеток на 2500 гранул и затем помещали на ночь в инкубатор с температурой 37°С/5% CO₂ с ростовой средой для эндотелиальных клеток (Lonza # СС-3162). На следующий день гранулы промывали ростовой средой для эндотелиальных клеток и ресуспендировали в растворе 2,0 мг/мл фибриногена типа I (стерилизованного фильтрацией) в DPBS и 0,15 ед./мл апротинина. В каждую лунку 24-луночного планшета добавляли 0,3125 единиц тромбина, затем добавляли 500 мкл раствора гранул. Для облегчения коагуляции планшеты помещали в инкубатор с температурой 37°С на 15 минут. В заключение, клетки, фиброкласты кожи, (Detroit 551 - АТСС #CCL-110), суспендированные в ростовой среде для эндотелиальных клеток, осторожно укладывали поверх сформировавшегося фибриногенного сгустка. Клетки подпитывали, с обработкой их соответствующим лекарственным средством, через день и выращивали в течение 8 суток. Определяли степень разрастания HUVEC и образования ветвящихся сосудов.

Hu24-vc0101 ADC ингибировал ангиогенез с разрастанием в этом анализе при 1 мкг/мл, а ADC-отрицательный контроль нет. Этот результат демонстрирует, что анти-РТК7 ADC может ингибировать ангиогенез мишень-специфическим образом.

Пример 16

Снижение опухоль-инициирующих клеток (TIC)

Чтобы определить, снижает ли лечение конъюгатами анти-РТК7 антитело-лекарственное средство частоту опухоль-инициирующих клеток (TIC) в опухолях, опухоли молочной железы TNBC BR13 обрабатывали 4 мг/кг hu24-vc0101 ADC, 4 мг/кг контрольного IgG ADC или 20 мг/кг доцетаксела в качестве химиотерапии дважды в неделю в сумме 3 дозы (Дни 0, 3 и 7). Живые остаточные опухолевые клетки человека (т.е. hESA⁺ mCD45^- mH-2Kd^-) выделяли из диссоциированных опухолей в день 10 и реимплантировали животным, ранее не подвергавшимся экспериментам, в анализе с предельным разведением (LDA). Результирующую инцидентность опухолей контролировали в течение вплоть до 40 недель после трансплантации. День сбора опухолей (день 10) и последовательную трансплантацию выбирали, основываясь на том, когда опухоли начинали регрессировать после воздействия hu24-vc0101. Опухоли диссоциировали и окрашивали анти-человеческим ESA, антимышиным CD45 и анти-мышиным H-2Kd антителами. По три опухоли на обрабатываемую группу объединяли, и живые опухолевые клетки человека сортировали проточной цитометрией. Группам по 10 мышей инъецировали 293, 73, 37 или 15 опухолевых клеток, сортированных из опухолей, обработанных контрольным IgG ADC; 159, 90, 40 или 10 опухолевых клеток, сортированных из опухолей, обработанных hu24-vc0101; или 257, 33 или 15 опухолевых клеток, сортированных из опухолей, обработанных доцетакселом. Опухоли в мышах-реципиентах измеряли еженедельно, и опухоли, размер которых превышал 200 мм³ в мышах-реципиентах, оценивали как положительные. Используя статистику распределения Пуассона, с помощью программного обеспечения L-Calc (Stemcell Technologies, Vancouver, ВС) инъецированные дозы клеток реципиентов с опухолями и без опухолей к 40 неделям после трансплантации использовали для вычисления частоты TIC после каждой обработки.

Частота TIC в опухолях, обработанных hu24-vc0101, была в 5,5 раз ниже, чем в опухолях, обработанных контрольным IgG ADC (р = 0,0013; Таблица 38). Частота TIC в опухолях, обработанных доцетакселом, была в 2,1 раза ниже, чем в опухолях, обработанных контрольным IgG ADC (р = 0,09; Таблица 38). Таким образом, мыши, которым инъецировали опухолевые клетки, обработанные hu24-vc0101, равным образом продуцировали меньше опухолей, чем мыши, которым инъецировали аналогичное количество опухолевых клеток, обработанных контрольным IgG ADC, что свидетельствует о том, что обработка hu24-vc0101 специфически снижала TIC.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к конъюгату антитело-лекарственное средство для доставки лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки, его применению в изготовлении лекарственного средства для лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, а также к способу его получения. Также раскрыта композиция для доставки лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки, содержащая эффективное количество вышеуказанного конъюгата. Изобретение также относится к способу лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, включающему введение субъекту вышеуказанного конъюгата антитело-лекарственное средство. Изобретение позволяет эффективно осуществлять доставку лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 23 ил., 38 табл., 16 пр.

1. Конъюгат антитело-лекарственное средство для доставки лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки формулы

Ab-(L-D),

где (а) Ab представляет собой антитело, которое связывается с протеинтирозинкиназой 7 человека (PTK7), содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 47; и

(б) L-D представляет собой группировку линкер-лекарственное средство, где L представляет собой линкер и D представляет собой ауристатин, где линкер представляет собой малеимидокапроил-валин-цитруллин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc) и ауристатин представляет собой 0101, имеющий формулу

где конъюгат антитело-лекарственное средство имеет отношение лекарственное средство к антителу (DAR) от 1 до 8.

2. Фармацевтическая композиция для доставки лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки, содержащая эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Композиция для доставки лекарственного средства в PTK7-экспрессирующие клетки, содержащая эффективное количество конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1 и возможно фармацевтический носитель, где указанная композиция имеет среднее DAR (отношение лекарственное средство к антителу) в диапазоне от 1 до 8.

4. Способ получения конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1, включающий:

(а) связывание линкера малеимидокапроил-валин-цитруллин-пара-аминобензилоксикарбонил (vc) с ауристатином 0101;

(б) конъюгирование указанной группировки линкер-лекарственное средство с антителом, которое связывается с протеинтирозинкиназой 7 человека (PTK7), содержащим тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 37, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, определенную как SEQ ID NO: 47; и

(в) очистку указанного конъюгата антитело-лекарственное средство.

5. Способ лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, включающий введение терапевтически эффективного количества композиции, содержащей конъюгат антитело-лекарственное средство по п. 1, нуждающемуся в этом субъекту.

6. Способ по п. 5, где расстройство, ассоциированное с экспрессией PTK7, представляет собой гиперпролиферативное расстройство.

7. Способ по п. 6, где гиперпролиферативное расстройство представляет собой неопластическое расстройство.

8. Способ по п. 7, где неопластическое расстройство представляет собой опухоль.

9. Способ по п. 8, где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичника, рака ободочной кишки и прямой кишки, рака пищевода, рака желудка, меланомы, саркомы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака печени и рака легкого.

10. Способ по п. 9, где рак молочной железы выбран из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы (TNBC), прогестеронового рецептор-позитивного рака молочной железы (PR+), эстрогенового рецептор-позитивного рака молочной железы (ER+) и дважды позитивного рака молочной железы.

11. Способ по п. 9, где рак печени представляет собой печеночноклеточную карциному (HCC).

12. Способ по п. 9, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

13. Способ по п. 7, где неопластическое расстройство представляет собой гематологическое злокачественное заболевание.

14. Способ по п. 13, где гематологическое злокачественное заболевание представляет собой лейкоз.

15. Способ по п. 14, где лейкоз представляет собой миелоидный лейкоз взрослых (AML) или острый лимфобластный лейкоз (ALL).

16. Применение конъюгата антитело-лекарственное средство по п. 1 в изготовлении лекарственного средства для лечения расстройства, ассоциированного с экспрессией PTK7, у субъекта.

17. Применение по п. 16, где расстройство, ассоциированное с экспрессией PTK7, представляет собой гиперпролиферативное расстройство.

18. Применение по п. 17, где гиперпролиферативное расстройство представляет собой неопластическое расстройство.

19. Применение по п. 18, где неопластическое расстройство представляет собой опухоль.

20. Применение по п. 19, где опухоль выбрана из группы, состоящей из рака молочной железы, рака яичника, рака ободочной кишки и прямой кишки, рака пищевода, рака желудка, меланомы, саркомы, рака почки, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака печени и рака легкого.

21. Применение по п. 20, где рак молочной железы выбран из группы, состоящей из трижды негативного рака молочной железы (TNBC), прогестеронового рецептор-позитивного рака молочной железы (PR+), эстрогенового рецептор-позитивного рака молочной железы (ER+) и дважды позитивного рака молочной железы.

22. Применение по п. 20, где рак печени представляет собой печеночноклеточную карциному (HCC).

23. Применение по п. 20, где рак легкого представляет собой немелкоклеточный рак легкого (NSCLC).

24. Применение по п. 18, где неопластическое расстройство представляет собой гематологическое злокачественное заболевание.

25. Применение по п. 24, где гематологическое злокачественное заболевание представляет собой лейкоз.

26. Применение по п. 25, где лейкоз представляет собой миелоидный лейкоз взрослых (AML) или острый лимфобластный лейкоз (ALL).