СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МИНИМАЛЬНОЙ ПОДАВЛЯЮЩЕЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОГО ПРЕПАРАТА Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/04 C12N1/00 

Изобретение относится к медицине, а точнее к медицинской микробиологии, и может быть использовано для определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемого микроорганизма-возбудителя воспалительных заболеваний микробной этиологии и формируемых им микробных ассоциаций.

Воспалительные заболевания могут быть вызваны широким спектром возбудителей: Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Corynebacterium diphtheriae gravis tox+, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus vulgaris, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes и др. (Туровский А.Б., Баландин А.В. Антибактериальная терапия острого среднего отита в современных условиях // Вестник оториноларингологии. - 2010. - №1. - С.35-38). Для подавления роста указанных выше микроорганизмов-возбудителей используют различные антибактериальные препараты (АБП) (Методические указания 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам», утвержденные и введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Онищенко Г.Г. 04.03.2004 г. (далее - МУК с.69-91).

Основным количественным показателем характеризующим микробиологическую активность антибактериального препарата является величина его минимальной подавляющей концентрации (МПК). МПК - минимальная концентрация АБП, подавляющего рост исследуемого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной среде (МУК с.7).

Проведенными исследованиями по патентной и научно-медицинской литературе найдены различные способы определения МПК антибактериального препарата.

В патенте РФ №2158926 «Способ оценки чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам в диске» (опубликован 10.11.2000) приведен способ определения МПК антибактериального препарата. На питательную среду с посевом тест-культуры наносят диски с антибактериальными препаратами, измеряют диаметр зон задержки роста с помощью специального приспособления и оценивают чувствительность микроорганизмов к антибактериальным препаратам по коэффициенту чувствительности как чувствительные, умеренно чувствительные и нечувствительные. Концентрацию АБП в диске, к которому наиболее чувствителен микроорганизм принимают за МПК.

В патенте РФ №2262533 «Способ определения эффективности антибактериального препарата при лечении гнойно-воспалительного заболевания микробной этиологии» (опубликован 20.10.2005) также приведен способ определения МПК антибактериального препарата. Способ предусматривает культивирование в сахарном бульоне гнойного отделяемого из очага воспаления, введение стандартных дисков с антибактериальными препаратами, инкубирование не менее двух часов при плюс 37°C и определение концентрации антибактериального препарата подавляющего видимый рост микроорганизма - возбудителя. Концентрацию АБП подавляющего видимый рост микроорганизма принимают за МПК.

Недостатком указанных выше способов является недостаточная эффективность определения МПК антибактериального препарата, подавляющего рост этиологически значимого микроорганизма в бульонной культуре или на плотной питательной среде.

Наиболее близким техническим решением, принятым нами за прототип, является способ определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемого микроорганизма-возбудителя воспалительных заболеваний микробной этиологии (МУК с.7-17). Способ предусматривает выделение возбудителя воспалительного заболевания, приготовление стандартной суспензии выделенного микроорганизма-возбудителя и двукратных разведении антибактериальных препаратов с известной активностью, инокуляцию, инкубацию, контроль жизнеспособности микроорганизма-возбудителя и интерпретацию результатов. Интерпретацию результатов исследования осуществляют на основании сопоставления содержимого контрольной и опытных лунок 96-луночного планшета для культуральных исследований. МПК антибактериального препарата определяют по отсутствию видимого роста в опытной лунке при условии роста микроорганизмов в контрольной лунке. При этом рост микроорганизма-возбудителя в контрольной лунке характеризуется помутнением среды; при отсутствии роста - среда остается прозрачной (МУК, с.15).

Недостатком прототипа является недостаточная достоверность результатов определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемого микроорганизма возбудителя воспалительных заболеваний и формируемых им микробных ассоциаций, обусловленная субъективностью интерпретации результатов исследования, выполняемого с целью определения МПК.

Задачей настоящего изобретения является разработка достоверного способа определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемого микроорганизма-возбудителя воспалительных заболеваний микробной этиологии и формируемых им микробных ассоциаций.

Этиологическим фактором развития воспалительных заболеваний являются микроорганизмы, способные образовывать биопленки - смешанные микробные ассоциации, обладающие общей оболочкой, препятствующие диффузии антибактериальных препаратов подавляющих рост микроорганизмов (Costerton J.W. The Biofilms Primer, vol.1 / Costerton J.W. - Berlin, Springen. - 2007. - P.200).

Определение МПК антибактериального препарата, предлагается осуществлять на основе измерения оптической плотности содержимого контрольной и опытных лунок на микропланшетном ридере. Биопленка формируется при условии наличия жизнеспособных микроорганизмов, показателем которого при измерении оптической плотности среды в контрольной лунке планшета является полученный нами критерий - ОПк>0,2 о.е. Величина МПК антибактериального препарата определяется в опытной лунке планшета с наибольшим двукратным разведением антибактериального препарата при отсутствии жизнеспособных микроорганизмов, то есть там, где оптическая плотность менее 0,2 о.е.

Техническим результатом, представляющим собой характеристику технического эффекта, явления, свойства, объективно проявляющимся при осуществлении данного способа, является повышение достоверности определения МПК антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемого микроорганизма-возбудителя воспалительных заболеваний микробной этиологии и формируемых им микробных ассоциаций.

Технический результат достигается тем, что выделяют возбудитель воспалительного заболевания, приготавливают стандартную суспензию выделенного микроорганизма-возбудителя и двукратные разведения антибактериальных препаратов с известной активностью, выполняют инокуляцию, инкубацию, окрашивание, контроль жизнеспособности возбудителя и интерпретацию результатов. Стандартную суспензию выделенного возбудителя объемом 0,1 мл смешивают с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды, инкубируют 24 часа при температуре плюс 37°C, после чего из нее готовят опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же специфичной жидкой питательной среде. Каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения вносят в опытные лунки планшета для культуральных исследований, в контрольную лунку которого вносят 0,150 мл контрольного разведения и инкубируют 48 часов при температуре плюс 37°C. Жидкую фракцию суспензии удаляют из контрольной и опытных лунок. Затем в каждую опытную, а также в контрольную лунки добавляют по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета, выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут. После этого содержимое контрольной и опытных лунок трижды промывают дистиллированной водой и добавляют в каждую лунку по 0,2 мл 99% раствора димексида, выдерживают при комнатной температуре 15 минут. Далее на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм в оптических единицах (о.е.) измеряют оптическую плотность среды в контрольной (ОПк) и опытных лунках. При выполнении условия ОПк>0,2 о.е., наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата в опытной лунке с оптической плотностью среды менее 0,2 о.е. определяют как минимальную подавляющую концентрацию.

Подробное описание способа.

Возбудитель воспалительного заболевания выделяют из исследуемого биологического материала больного согласно известной методике, описанной в МУК (с.6-8).

Стандартную суспензию выделенного микроорганизма-возбудителя приготавливают согласно известной методике, описанной в МУК (с.8-9).

Приготавливают двукратные разведения антибактериальных препаратов с известной активностью по известной методике (МУК. - с.10-13).

Стандартную суспензию выделенного возбудителя объемом 0,1 мл смешивают с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды, инкубируют 24 часа при температуре плюс 37°C в термостате, например, «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производство фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники». После этого из стандартной суспензии выделенного возбудителя готовят опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же жидкой питательной среде согласно методике, описанной в МУК (с.12-13).

Выполняют инокуляцию, для чего при помощи пипетки-дозатора со сменным наконечником, например «Пипетка-дозатор переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия), каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения вносят в опытные лунки планшета для культуральных исследований, используя при этом, например, «Планшет для культуральных исследований 96-луночный», производства фирмы «COSTAR» (США); в контрольную лунку этого планшета вносят 0,150 мл контрольного разведения и инкубируют 48 часов при температуре плюс 37°C в термостате, например, «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производства фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники».

Жидкую фракцию суспензии удаляют из контрольной и опытных лунок многоканальной пипеткой-дозатором, например «Пипетка-дозатор многоканальная переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия). Затем в каждую опытную, а также в контрольную лунки добавляют по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета, например, производства фирмы «Ростовский фармацевтический завод» (Россия); выполняют окрашивание, выдерживают при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого содержимое контрольной и опытных лунок трижды промывают дистиллированной водой, добавляют в каждую лунку по 0,2 мл 99% раствора димексида и выдерживают при комнатной температуре 15 минут. Димексид - «Dimexidum» - 99% раствор для наружного применения (Россия, регистрационный номер 75.244.9).

Контроль жизнеспособности микроорганизма-возбудителя осуществляют измерением оптической плотности среды (о.е.) в контрольной (ОПк) лунке на микропланшетном ридере, например, «Микропланшетный ридер для диагностики in vivo» производства фирмы «Labsystem Multiskam MS» (Финляндия) при длине волны 540 нм. При выполнении условия ОПк>0,2 о.е. возбудитель считают жизнеспособным.

Интерпретацию результатов проводят измерением оптической плотности среды (о.е.) в опытных лунках на том же микропланшетном ридере при длине волны 540 нм. Наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата в опытной лунке с оптической плотностью среды менее 0,2 о.е. определяют как минимальную подавляющую концентрацию.

Практическая реализуемость предлагаемого способа иллюстрируется примерами из практики.

Пример 1: в лабораторию микробиологических методов исследования кафедры микробиологии и вирусологии №2 Ростовского государственного медицинского университета (РостГМУ) поступил биологический материал, взятый из зева больного А., которому был поставлен диагноз: «Острое респираторное заболевание, острый тонзиллит, катаральная форма».

Из исследуемого биологического материала больного А. согласно известной методике, описанной в МУК (с.6-8) и Приказе МЗ СССР от 22 апреля 1985 г. №535 «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений» (с.35), был выделен микроорганизм-возбудитель воспалительного заболевания Staphylococcus aureus. Для подавления роста Staphylococcus aureus были выбраны ванкомицин или рифампицин (МУК, с.85).

Для определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост Staphylococcus aureus, согласно известной методике, описанной в МУК (с.8-9), была приготовлена стандартная суспензия выделенного микроорганизма-возбудителя Staphylococcus aureus.

Приготовили двукратные разведения антибактериальных препаратов ванкомицина и рифампицина по известной методике (МУК, с.10-13).

Стандартную суспензию Staphylococcus aureus объемом 0,1 мл смешали с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды - мясопептонный бульон, инкубировали 24 часа при температуре плюс 37°C в термостате «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производство фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники». После этого из стандартной Staphylococcus aureus приготовили опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же жидкой питательной среде согласно методике, описанной в МУК (с.12-13).

Выполнили инокуляцию, для чего при помощи пипетки-дозатора со сменным наконечником «Пипетка-дозатор переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия) каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов ванкомицин и рифампицин, каждый в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения внесли в 11 опытных лунок соответственно первого и второго рядов планшета для культуральных исследований «Планшет для культуральных исследований 96-луночный» производства фирмы «COSTAR» (США). В контрольную лунку, в качестве которой была выбрана 12-я лунка первого ряда этого планшета, внесли 0,150 мл контрольного разведения. Инкубировали 48 часов при температуре плюс 37°C в термостате «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производство фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники».

Жидкую фракцию суспензии удалили из контрольной и опытных лунок многоканальной пипеткой-дозатором «Пипетка-дозатор многоканальная переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия). Затем в каждую опытную, а также в контрольную лунки добавили по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета, производство фирмы «Ростовский фармацевтический завод» (Россия) - выполнили окрашивание, выдержали при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого содержимое контрольной и опытных лунок трижды промыли дистиллированной водой, добавили в каждую лунку по 0,2 мл 99% раствора димексида («Dimexidum» - 99% раствор для наружного применения, производство России, регистрационный номер 75.244.9) и выдержали при комнатной температуре 15 минут.

Контроль жизнеспособности микроорганизма-возбудителя осуществили измерением оптической плотности среды в оптических единицах (о.е.) в контрольной (ОПк) лунке на микропланшетном ридере «Микропланшетный ридер для диагностики in vivo» производства фирмы «Labsystem Multiskam MS» (Финляндия) при длине волны 540 нм.

В контрольной - 12-й лунке первого ряда планшета для культуральных исследований, было получено: ОПк=0,248 о.е. Поскольку было выполнено условие ОПк=0,248>0,2 (о.е.), возбудитель Staphylococcus aureus был признан жизнеспособным.

Измерение оптической плотности среды (о.е.) в опытных лунках на микропланшетном ридере «Микропланшетный ридер для диагностики in vivo» производства фирмы «Labsystem Multiskam MS» (Финляндия) при длине волны 540 нм дало следующие результаты:

- в 11 опытных лунках с двукратными разведениями ванкомицина первого ряда планшета для культуральных исследований: 1-я лунка - 0,107 о.е., 2-я лунка - 0,105 о.е., 3-я лунка - 0,115 о.е., 4-я лунка - 0,107 о.е., 5-я лунка - 0,110 о.е., 6-я лунка - 0,105 о.е., 7-я лунка - 0,105 о.е., 8-я лунка - 0,211 о.е., 9-я лунка - 0,215 о.е., 10-я лунка - 0,244 о.е., 11-я лунка - 0,237 о.е.;

- в 11 опытных лунках с двукратными разведениями рифампицина второго ряда планшета для культуральных исследований: 1-я лунка - 0,126 о.е., 2-я лунка - 0,111 о.е., 3-я лунка - 0,105 о.е., 4-я лунка - 0,101 о.е., 5-я лунка - 0,102 о.е., 6-я лунка - 0,103 о.е., 7-я лунка - 0,102 о.е., 8-я лунка - 0,103 о.е., 9-я лунка - 0,108 о.е., 10-я лунка - 0,257 о.е., 11-я лунка - 0,248 о.е.

Наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата с оптической плотностью среды менее 0,2 о.е. имело место в опытной 9-й лунке второго ряда планшета, где находилось 35,84 мкг/мл рифампицина.

Это значение и было принято в качестве минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибактериального препарата рифампицин, подавляющего рост возбудителя Staphylococcus aureus и формируемые им микробные ассоциации.

Для подтверждения достоверности определения МПК антибактериального препарата рифампицин согласно заявляемому способу нами был осуществлен контрольный высев содержимого 9-й лунки второго ряда планшета на плотную питательную среду - мясопептонный агар. Роста микроорганизма Staphylococcus aureus обнаружено не было, что подтвердило достоверность определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата - рифампицин, подавляющего рост возбудителя Staphylococcus aureus.

Пример 2: в лабораторию микробиологических методов исследования кафедры микробиологии и вирусологии №2 РостГМУ поступил биологический материал, взятый из зева больного Б. с диагнозом: «Дифтерия, токсическая форма».

Из исследуемого биологического материала больного Б. согласно известной методике, описанной в МУК (с.6-8) и методических указаниях МУ 4.2.698-98 «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции» Минздрав России, Москва, 1995 г. (с.7-13) был выделен микроорганизм-возбудитель воспалительного заболевания Corynebacterium diphtheriae gravis tox+, для подавления роста которого были выбраны антибактериальные препараты цефазолин и рифампицин (Дифтерия у детей. В.В. Иванова, О.В. Родионова, О.А. Аксенов и др., Санкт-Петербург, 2000, с.220-221).

Для определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата, подавляющего рост Corynebacterium diphtheriae gravis tox+, согласно известной методике, описанной в МУК (с.8-9) была приготовлена стандартная суспензия выделенного микроорганизма-возбудителя Corynebacterium diphtheriae gravis tox+.

Приготовили двукратные разведения антибактериальных препаратов цефазолина и рифампицина с известной активностью по известной методике (МУК, с.10-13).

Стандартную суспензию выделенного возбудителя объемом 0,1 мл смешали с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды - 20% сывороточным бульоном, инкубировали 24 часа при температуре плюс 37°C в термостате «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производство фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники». После этого из стандартной суспензии выделенного возбудителя приготовили опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же жидкой питательной среде согласно методике, описанной в МУК (с.12-13).

Выполнили инокуляцию, для чего при помощи пипетки-дозатора со сменным наконечником «Пипетка-дозатор переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия) каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов цефазолин и рифампицин, каждый в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения внесли в 11 опытных лунок соответственно первого и второго рядов планшета для культуральных исследований «Планшет для культуральных исследований 96-луночный» производства фирмы «COSTAR» (США). В контрольную лунку, в качестве которой была выбрана 12-я лунка первого ряда этого планшета, внесли 0,150 мл контрольного разведения. Инкубировали 48 часов при температуре плюс 37°C в термостате «Термостат электрический суховоздушный ТС-80», производство фирмы «Одесский экспериментальный завод лабораторной медицинской техники».

Жидкую фракцию суспензии удалили из контрольной и опытных лунок многоканальной пипеткой-дозатором «Пипетка-дозатор многоканальная переменного объема», производство фирмы «Колор» (Россия). Затем в каждую опытную, а также в контрольную лунки добавили по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета, производство фирмы «Ростовский фармацевтический завод» (Россия) - выполнили окрашивание, выдержали при комнатной температуре в течение 30 минут.

После этого содержимое контрольной и опытных лунок трижды промыли дистиллированной водой, добавили в каждую лунку по 0,2 мл 99% раствора димексида («Dimexidum» - 99% раствор для наружного применения, производства России, регистрационный номер 75.244.9) и выдержали при комнатной температуре 15 минут.

Контроль жизнеспособности микроорганизма-возбудителя осуществили измерением оптической плотности среды в оптических единицах (о.е.) в контрольной (ОПк) лунке на микропланшетном ридере «Микропланшетный ридер для диагностики in vivo» производства фирмы «Labsystem Multiskam MS» (Финляндия) при длине волны 540 нм.

В контрольной - 12-й лунке первого ряда планшета для культуральных исследований, было получено: ОПк=0,223 о.е. Поскольку было выполнено условие ОПк=0,223>0,2 (о.е.), возбудитель был признан жизнеспособным.

Измерение оптической плотности среды (о.е.) в опытных лунках на микропланшетном ридере «Микропланшетный ридер для диагностики in vivo» производства фирмы «Labsystem Multiskam MS» (Финляндия) при длине волны 540 нм дало следующие результаты:

- в 11 опытных лунках с двукратными разведениями цефазолина первого ряда планшета для культуральных исследований: 1-я лунка - 0,115 о.е., 2-я лунка - 0,115 о.е., 3-я лунка - 0,105 о.е., 4-я лунка - 0,103 о.е., 5-я лунка - 0,104 о.е., 6-я лунка - 0,112 о.е., 7-я лунка - 0,109 о.е., 8-я лунка - 0,111 о.е., 9-я лунка - 0,115 о.е., 10-я лунка - 0,244 о.е., 11-я лунка - 0,237 о.е.;

- в 11 опытных лунках с двукратными разведениями рифампицина второго ряда планшета для культуральных исследований: 1-я лунка - 0,136 о.е., 2-я лунка - 0,118 о.е., 3-я лунка - 0,124 о.е., 4-я лунка - 0,117 о.е., 5-я лунка - 0,110 о.е., 6-я лунка - 0,111 о.е., 7-я лунка - 0,202 о.е., 8-я лунка - 0,205 о.е., 9-я лунка - 0,234 о.е., 10-я лунка - 0,240 о.е., 11-я лунка - 0,251 о.е.

Наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата с оптической плотностью среды менее 0,2 о.е. имело место в опытной 9-й лунке первого ряда планшета, где находилось 0,52 мкг/мл цефазолина.

Это значение и было принято в качестве минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибактериального препарата цефазолин, подавляющего рост возбудителя Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ и формируемые им микробные ассоциации.

Для подтверждения достоверности определения минимальной подавляющей концентрации (МПК) антибактериального препарата цефазолин согласно заявляемому способу нами был осуществлен контрольный высев содержимого 9-й лунки первого ряда планшета на плотную питательную среду - кровяно-теллуритовый агар. Роста микроорганизма Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ обнаружено не было, что подтвердило достоверность определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата - цефазолин, для подавления роста возбудителя Corynebacterium diphtheriae gravis tox+ и формируемых им микробных ассоциаций.

В лаборатории микробиологических методов исследования кафедры микробиологии и вирусологии №2 Рост ГМУ с помощью заявляемого способа было проведено определение минимальной подавляющей концентрации антибактериальных препаратов, подавляющих рост микроорганизмов и формируемых ими микробных ассоциаций, выделенных из биологического материала 24 больных с различными воспалительными заболеваниями, такими как острое респираторное заболевание, острый и хронический тонзиллит, дифтерия. Возбудителями этих заболеваний являлись Staphylococcus aureus, Corynebacterium diphtheriae gravis tox+, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes. В каждом конкретном случае была определена минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибактериального препарата, подавляющего рост исследуемых микроорганизмов-возбудителей, указанных выше заболеваний. В результате контрольных высевов во всех случаях роста микроорганизмов-возбудителей обнаружено не было, что подтвердило высокую достоверность заявляемого способа.

С целью определения минимальной подавляющей концентрации антибактериальных препаратов, подавляющих рост тех же самых микроорганизмов, выделенных из биологического материала этой же группы из 24 больных, нами было проведено исследование, с помощью прототипа. В каждом конкретном случае была определена минимальная подавляющая концентрация (МПК) антибактериального препарата. В 16,7% случаев результаты контрольного высева показали наличие роста микроорганизмов-возбудителей, взятых из лунок, в которых согласно прототипу была определена минимальная подавляющая концентрация антибактериальных препаратов подавляющих рост исследованных микроорганизмов, что было расценено нами как недостоверный результат.

Таким образом, заявляемый "Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата», подавляющего рост исследуемого микроорганизма-возбудителя воспалительных заболеваний микробной этиологии и формируемых им микробных ассоциаций, по сравнению с прототипом позволяет на 16,7% повысить достоверность определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата.

Выделяют микроорганизм-возбудитель из биологического материала больного. Готовят стандартную суспензию выделенного микроорганизма-возбудителя и двукратные разведения антибактериальных препаратов с известной активностью. Проводят инокуляцию. Стандартную суспензию выделенного возбудителя объемом 0,1 мл смешивают с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды. Инкубируют 24 ч при +37°C. Готовят опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же питательной среде. Каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения вносят в опытные лунки планшета. В контрольную лунку вносят 0,150 мл контрольного разведения и инкубируют 48 ч при +37°C. Жидкую фракцию суспензии удаляют из лунок. Для окрашивания в каждую лунку добавляют по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета. Выдерживают при комнатной температуре в течение 30 мин. Содержимое лунок трижды промывают дистиллированной водой и добавляют в каждую лунку по 0,2 мл 99% раствора димексида. Выдерживают при комнатной температуре 15 мин. Измеряют оптическую плотность среды в контрольной (ОПк) и опытных лунках в оптических единицах (о.е.) на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм. При выполнении условия ОПк>0,2 о.е. наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата в опытной лунке с оптической плотностью менее 0,2 о.е. определяют как минимальную подавляющую концентрацию (МПК). Изобретение позволяет повысить достоверность определения МПК на 16,7%. 2 пр.

Способ определения минимальной подавляющей концентрации антибактериального препарата (МПК), предусматривающий выделение микроорганизма-возбудителя из биологического материала больного, приготовление стандартной суспензии выделенного микроорганизма-возбудителя и двукратных разведений антибактериальных препаратов с известной активностью, инокуляцию, инкубацию, контроль жизнеспособности возбудителя и интерпретацию результатов, отличающийся тем, что 0,1 мл стандартной суспензии выделенного возбудителя смешивают с 5,0 мл специфичной для данного возбудителя жидкой питательной среды, инкубируют 24 ч при температуре плюс 37°C, готовят опытное 1:100 и контрольное 1:200 разведения в той же специфичной жидкой питательной среде, каждое из двукратных разведений антибактериальных препаратов в объеме 0,075 мл с равным объемом опытного разведения вносят в опытные лунки планшета для культуральных исследований, в контрольную лунку которого вносят 0,150 мл контрольного разведения, инкубируют 48 ч при температуре плюс 37°C, жидкую фракцию суспензии удаляют из контрольной и опытных лунок, после чего в них добавляют по 0,2 мл 1% раствора кристалл-виолета, выдерживают 30 мин при комнатной температуре, трижды промывают дистиллированной водой, во все лунки добавляют по 0,2 мл 99% раствора димексида, выдерживают при комнатной температуре 15 мин, далее на микропланшетном ридере при длине волны 540 нм измеряют оптическую плотность среды в контрольной (ОПк) и опытных лунках, и, при выполнении условия ОПк>0,2 о.е., наибольшее двукратное разведение антибактериального препарата в опытной лунке с оптической плотностью менее 0,2 о.е. определяют как МПК.