СПОСОБ ОЦЕНКИ КЛИНИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ Francisella tularensis И Brucella spp Российский патент 2011 года по МПК G01N33/569 

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и может быть использовано для лечения заболеваний, вызванных возбудителями особо опасных инфекций, в частности при выборе наиболее эффективных схем лечения туляремии и бруцеллеза.

Туляремия и бруцеллез отнесены к категории особо опасных инфекционных заболеваний человека и млекопитающих, эндемичные очаги которых широко распространены в различных странах, включая Россию.

Известна природная устойчивость Francisella tularensis к пенициллинам, цефалоспоринам, макролидам и полимиксину, что существенно ограничивает выбор средств этиотропной терапии инфекций. Кроме того, бруцеллез крайне плохо поддается антибактериальной терапии.

Поэтому оценка чувствительности этих возбудителей к антибактериальным препаратам является важным этапом, определяющим эффективность этиотропной терапии.

Известны способы определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (см. Методические указания МУК 4.2.1890-04, Москва, 2004 г., стр.47), включающие определение чувствительности микроорганизмов со сложными питательными потребностями с использованием метода серийных разведений и диско-диффузионного метода на среде Хинтон-Мюллера.

Однако недостатком известного способа является то, что предлагаемые в МУК среды для определения антибиотикочувствительности бактерий (Haemophilus, Pneumococcus, Neisseria) не обеспечивают рост туляремийного микроба и бруцелл в течение 24-48 часов. В связи с этим, приведенные критерии оценки чувствительности устойчивости прихотливых или неприхотливых микроорганизмов не соответствуют критериям, позволяющим оценить антибиотикочувствительность особо опасных возбудителей, как франциселла или бруцелла.

За прототип выбран способ прогнозирования клинической эффективности антибактериального средства методом разведения (см. пат. RU 2192642, кл. Q01N 33/569, 2000.09.07), включающий проведение в ячейках планшета инкубацию взвеси микробных клеток с антибактериальным средством, которое берут в двух концентрациях, соответствующих тем, которые создаются в органах-мишенях при введении средней и высшей терапевтических доз, учет результатов проводят визуально по появлению видимого роста в ячейках планшета.

Недостатком прототипа является то, что для корректной оценки необходимо проведение контрольного высева из помутневшего бульона для исключения контаминации посторонней микрофлорой, что удлиняет сроки учета метода еще на 24 часа.

Кроме того, при работе с возбудителями особо опасных инфекций человека, а именно возбудителями туляремии и бруцеллеза в соответствии с СП 1.3.1285-03.2003 г. «Безопасность работы с микроорганизмами I и II групп патогенности» использовать полистероловые пластины открытым способом не допускается.

При этом, чтобы выбрать концентрации, соответствующие среднетерапевтической и высшей дозам, необходимо иметь соответствующие таблицы, которых в лабораторной практике нет, поэтому в случае возникновения эпидемической вспышки заболевания необходимость поиска подобных сведений будет требовать дополнительного времени для выдачи достоверных результатов.

Техническая задача предлагаемого изобретения состояла в разработке способа, позволяющего достоверно и быстро получать оценку клинической эффективности антибактериальных препаратов при туляремийной и бруцеллезной инфекциях.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов для возбудителей особо опасных инфекций Francisella tularensis и Brucella spp., включающем выращивание микробных клеток на питательной среде используя методы: диско-диффузионный и серийных разведений, причем оценку проводят в три этапа, по первому этапу разрабатывают шкалу критериев антибиотикочувствительности для эталонных штаммов, по второму определяют чувствительность исследуемого материала к тем же антибиотикам, а третий заключается в сравнении последних показателей с полученной шкалой для данного вида микроба, при этом первый и второй этапы проводят одновременно по одной технологии путем посева микробной суспензии в объеме 0,3 мл (n·10⁷ КОЕ/мл) по диско-диффузионному методу и методу серийных разведений на питательной среде с ростовыми добавками, после посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов и проводят учет результатов, причем оценку клинической эффективности осуществляют, сопоставляя пограничные значения минимальной подавляющей концентрации и диаметров зон подавления роста возбудителя с соответствующей шкалой критериев, если показатели исследуемого материала входят в допустимый диапазон шкалы критериев, то антибиотик считают эффективным.

Кроме того, при создании шкалы критериев для Francisella tularensis используют штаммы subsp. nearctica., mediasiatica, holarctica.

При этом, разрабатывая шкалу критериев для Brucella spp., применяют штаммы трех видов: В. abortus, В. suis, В. melitensis.

Кроме того, в качестве ростовых добавок к агару Мюллер-Хинтона используют компоненты, содержащие в г/л среды:

сернокислый магний - 0,05;

сернокислое железо - 0,1;

L-цистеин - 0,6;

лимонный натрий - 1,2;

хлористый калий - 2;

фосфорнокислый калий - 4;

глюкоза - 15.

Предлагаемый способ осуществляют по следующим этапам:

I этап - разрабатывают шкалу критериев оценки антибиотикочувствительности для эталонных штаммов Francisella tularensis и Brucella spp.;

II этап - проводят оценку чувствительности исследуемого материала (культуры) к антибактериальным препаратам;

III этап - осуществляют сравнительный анализ полученных результатов исследуемого материала (по II этапу) со шкалой критериев (I этапа) для оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов.

Для разработки I этапа используют эталонные штаммы туляремийного микроба трех основных подвидов (F. tularensis subsp. nearctica, F. tularensis subsp. mediasiatica, F. tularensis subsp. holarctica) и штаммов возбудителя бруцеллеза трех видов (В. abortus, В. suis, В. melitensis) (см. таблицы 1, 3).

При проведении 1-ого и II-ого этапов в качестве оптимальной питательной среды используют агар Мюллера-Хинтона с добавлением следующих ростовых компонентов, содержащей в г/л среды: сернокислого магния - 0,05; сернокислого железа - 0,1; L-цистеина - 0,6; лимоннокислого натрия - 1,2; хлористого калия - 2; фосфорнокислого калия - 4; глюкозы - 15, рН 7,3.

В способе оценки применяют антибиотики: первого ряда (доксициклин, ципрофлоксан, офлоксацин, норфлоксацин, ломефлоксацин, левофлоксацин, стрептомицин, гентамицин, рифампицин) и второго ряда (амикацин, канамицин, налидиксовая кислота, тетрациклин).

Чувствительность микроорганизмов к антибиотикам определяют с помощью диско-диффузионного метода (ДДМ) и методом серийных разведений (МСР). Для последнего метода в плотной питательной среде готовят серии двукратно увеличивающихся концентраций антибактериальных препаратов, например: доксициклин 1-2-4-8-16, ципрофлоксацин 0,06-0,12-0,25-0,5-1.

Для определения антибиотикограмм бактерий диско-диффузионным методом используют проверенные коммерческие диски с определенными концентрациями антибактериальных препаратов.

1 и II этапы проводят по одной технологии.

При определении чувствительности с помощью ДДМ используют суспензию микробных клеток в 0,85% растворе хлорида натрия, приготовленного из 24 ч агаровой культуры исследуемых бактерий.

Суспензию

Суспензию стандартизируют по отраслевому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича на 5 ед. (n·10⁸ КОЕ/мл). Суспензию наносят на поверхность агара с ростовыми добавками в объеме 0,3 мл (n·10⁷ КОЕ/мл), равномерно распределяют шпателем и выдерживают до полного впитывания в агар. После этого накладывают диски (не более 6 на чашку диаметром 100 мм). Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Результаты учитывают только в случае появления сливного роста на контрольных чашках (без дисков). Диаметр зон задержки роста бактерий вокруг дисков (включая диаметр самого диска) измеряют с точностью до 1 мм линейкой-лекалом или штангенциркулем (см. таблицу 1, 3).

Для МСР используют суспензию той же концентрации (n·10⁷ КОЕ/мл), которую наносят небольшими каплями с помощью штампа-репликатора или касанием пипетки на чашки с питательной средой с ростовыми добавками, содержащей различные концентрации антибактериальных препаратов, начиная с чашки с минимальным содержанием антибиотика. Посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч. Учет результатов проводят при наличии роста культуры на контрольных чашках (без антибиотика).

Чувствительность/устойчивость культур оценивают по минимальной концентрации препарата, подавляющий рост микробов (МПК, мкг/л = мг/л) (см. таблицу 2, 4).

По III этапу проводят сравнительный анализ показателей (МПК и диаметр зон) исследуемого материала со шкалой критериев, разработанной для Francisella tularensis (таблица 2) и для Brucella spp. (таблица 4).

Оценку чувствительности штаммов туляремийного и бруцеллезного микроба осуществляют в соответствии с пограничными значениями МПК и диаметрами зон задержки роста для чувствительных и устойчивых культур (см. таблицу 2, 4), если показатели исследуемого материала входят в допустимый диапазон шкалы критериев, то антибиотик считают эффективным в виду того, что бактерии чувствительны к предлагаемому антибиотику.

Увеличение значений МПК препаратов или же уменьшение диаметров зон подавления роста изучаемого материала в сравнении с этими показателями для контрольных штаммов (шкалы критериев) свидетельствуют о тенденции к нарастанию устойчивости микроорганизмов и потребует использования максимальных терапевтических доз, удлинения сроков их применения или использования другого антибактериального препарата.

Применение способа для оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов при туляремийной и бруцеллезной инфекциях подтверждены примерами.

Пример 1

Из воды реки Дон выделена культура, идентифицированная в дальнейшем как Francisella tularensis (Р-13862). Проведено исследование устойчивости выделенной культуры туляремийного микроба к препаратам первого ряда - аминогликозидам (гентамицин), фторхинолонам (ципрофлоксацин), доксициклину и рифампицину с помощью диско-диффузионного метода и метода серийных разведений в агаре Хинтон-Мюллера с ростовыми добавками. Учет результатов проводили через 24 и 48 час. При использовании диско-диффузионного метода исследуемая культура возбудителя имела следующие показатели (зона задержки роста бактерий): для гентамицина - 27 мм, для ципрофлоксацина - 36 мм, для рифампицина - 32 мм, доксициклину - 30 мм. При использовании метода серийных разведений в агаре МПК антибиотиков составила (г/л): для гентамицина - 0,5, ципрофлоксацина - 0,06, рифампицина - 0,125, доксициклина - 1. В соответствии с разработанными РПЧИ критериями оценки устойчивости/чувствительности возбудителя туляремии к антибактериальным препаратам (см. таблицу 2) исследуемая культура чувствительна к данным антибиотикам. Полученные результаты (см. таблицу 5) позволили рекомендовать данные антибиотики для лечения больных туляремией людей.

Пример 2

При работе сотрудника в лаборатории с тремя экспериментальными штаммами туляремийного микроба с маркерами устойчивости к налидиксовой кислоте, гентамицину или рифампицину и доксициклину возникла ситуация, позволяющая предполагать возможность инфицирования человека. При исследовании чувствительности штаммов к антибиотикам первого ряда с помощью ДДМ получены следующие показатели (зона задержки роста бактерий): для гентамицина - 16 мм, ципрофлоксацина - 10 мм, рифампицина - 32 мм, доксициклина - 30 мм. При использовании метода серийных разведений в агаре МПК антибиотиков составила (г/л): для гентамицина - 8, ципрофлоксацина - 1, рифампицина - 0,125, доксициклина - 1.

В соответствии с разработанными критериями оценки (см. таблицу 2) устойчивости/чувствительности возбудителя туляремии к антибактериальным препаратам получены показатели, свидетельствующие о том, что исследуемые штаммы относятся к устойчивым к гентамицину и ципрофлоксацину и чувствительным к рифампицину и доксициклину (см. таблицу 6). Потенциально инфицированному сотруднику назначено профилактическое лечение рифампицином.

Пример 3

Из говядины - источника заражения человека бруцеллезом - выделена культура Brucella abortus. Чувствительность выделенной культуры к антибиотикам 1 ряда исследовали, как описано в примере 1. Результаты ДДМ показали следующие зоны задержки роста бактерий: для гентамицина - 28 мм, доксициклина - 15 мм, ципрофлоксацина - 42 мм и рифампицина - 20 мм. При использовании метода серийных разведений в агаре МПК антибитиков составила (г/л) для гентамицина - 1, ципрофлоксацина - 1, рифампицина - 2, доксициклина - 8. В соответствии с разработанной нами шкалой критериев оценки (см. таблицу 4) устойчивости/чувствительности возбудителя бруцеллеза к антибактериальным препаратам получили показатели (см. таблицу 7). Исследуемая культура чувствительна к гентамицину, ципрофлоксацину и рифампицину, но устойчива к доксициклину. Больному назначено лечение гентамицином и рифампицином.

Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет разработанных шкал критериев оценки антибиотикочувствительности штаммов Francusella tularensis и Brucella spp. осуществлять в кратчайшие сроки (24-48 час) и получать достоверные результаты для отбора наиболее эффективных антибактериальных препаратов для лечения этих особо опасных инфекций.

Таблица 1 Антибактериальные препараты Агар Мюллера-Хинтона с ростовыми добавками pH 7,3 Значение МПК, мг/л Диаметр зон подавления роста, мм Эталонные штаммы F.tularensis Эталонные штаммы F.tularensis subsp. tularensis Schu subsp. holarctica 503 subsp. media-asiatica 543 subsp. tularensis Schu subsp. holarctica 503 subsp. media-asiatica 543 Гентамицин 1 2 1 32 25 30 Амикацин 2 4 2 30 28 30 Канамицин 2 4 2 25 25 25 Стрептомицин 1 2 1 30 25 30 Доксициклин 0,5 1 0,5 30 25 25 Тетрациклин 0.5 1 0,5 30 25 30 Налидиксовая кислота 1 2 1 30 25 25 Ципрофлоксацин 0,06 0,12 0,06 35 30 35 Офлоксацин 0,12 0,25 0,12 32 30 35 Пефлоксацин 0,12 0,25 0,12 30 30 35 Ломефлоксацин 0,12 0,25 0,12 30 25 30 Левофлоксацин 0,03 0,06 0,03 35 30 35 Рифампицин 0,25 0,5 0,25 30 25 25

Таблица 2 Антибактериальные препараты Содержание препарата в диске (мкг) Диаметр зон ингибиции штаммов F.tularensis (мм) Значения МПК штаммов F.tularensis (мг/л) Чувствительные (S) Резистентные (R) Чувствительные (S) Резистентные (R) Гентамицин 10 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Амикацин 30 ≥25 ≤20 ≤8 ≥32 Канамицин 30 ≥25 ≤20 ≤8 ≥32 Стрептомицин 30 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Доксициклин 10 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Тетрациклин 30 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Налидиксовая кислота 30 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Ципрофлоксацин 5 ≥30 ≤25 ≤0,25 ≥1 Офлоксацин 5 ≥30 ≤25 ≤0,25 ≥1 Пефлоксацин 10 ≥30 ≤25 ≤0,25 ≥1 Ломефлоксацин 10 ≥25 ≤20 ≤1 ≥2 Левофлоксацин 5 ≥30 ≤25 ≤0,25 ≥1 Рифампицин 5 ≥25 ≤20 ≤2 ≥8

Таблица 3 Антибактериальные препараты Агар Мюллера-Хинтона с ростовыми добавками pH 7,3 Значение МПК, мг/л Диаметр зон подавления роста, мм Эталонные штаммы Brucella Эталонные штаммы Brucella В.abortus 544 B.melitensis 16 М B.suis 1330 В.abortus 544 B.melitensis 16 М B.suis 1330 Гентамицин 2 2 2 28 25 25 Амикацин 4 4 4 28 25 25 Канамицин 4 4 4 25 25 25 Стрептомицин 2 2 2 25 25 25 Доксициклин 2 0,5 1 25 30 25 Тетрациклин 1 0,5 1 25 30 25 Налидиксовая кислота 8 8 8 18 19 19 Ципрофлоксацин 0,5 0,5 0,5 30 30 30 Офлоксацин 1 1 0,5 30 30 30 Пефлоксацин 2 4 2 28 30 30 Ломефлоксацин 2 4 2 28 30 30 Левофлоксацин 0,5 0,5 0,5 32 30 30 Рифампицин 1 2 2 22 20 20

Таблица 4 Антибактериальные препараты Содержание препарата в диске (мкг) Диаметр зон ингибиции штаммов Brucella (мм) Значения МПК штаммов Brucella (мг/л) Чувствительные (S) Резистентные (R) Чувствительные (S) Резистентные (R) Гентамицин 10 ≥20 ≤15 ≤8 ≥32 Амикацин 30 ≥20 ≤15 ≤16 ≥64 Канамицин 30 ≥20 ≤15 ≤16 ≥64 Стрептомицин 30 ≥20 ≤15 ≤8 ≥32 Доксициклин 10 ≥20 ≤15 ≤8 ≥32 Тетрациклин 30 ≥25 ≤20 ≤4 ≥16 Налидиксовая кислота 30 ≥15 ≤10 ≤32 ≥128 Ципрофлоксацин 5 ≥30 ≤25 ≤4 ≥16 Офлоксацин 5 ≥25 ≤20 ≤8 ≥32 Пефлоксацин 10 ≥25 ≤20 ≤8 ≥32 Ломефлоксацин 10 ≥25 ≤20 ≤8 ≥32 Левофлоксацин 5 ≥30 ≤25 ≤2 ≥4 Рифампицин 5 ≥15 ≤10 ≤8 ≥16

Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской микробиологии, и касается способа оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов для возбудителей особо опасных инфекций Francisella tularensis и Brucella spp. Сущность способа заключается в том, что оценку клинической эффективности антибактериальных препаратов проводят в три этапа, по первому этапу разрабатывают шкалу критериев антибиотикочувствительности для эталонных штаммов, по второму определяют чувствительность исследуемого материала к тем же антибиотикам, а третий заключается в сравнении последних показателей с полученной шкалой для данного вида микроба, при этом первый и второй этапы проводят одновременно по одной технологии путем посева микробной суспензии в объеме 0,3 мл (n·10⁷ КОЕ/мл) по диско-диффузионному методу и методу серийных разведений на питательной среде с ростовыми добавками. После посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов и проводят учет результатов. Оценку клинической эффективности осуществляют, сопоставляя пограничные значения минимальной подавляющей концентрации и диаметров зон подавления роста возбудителя с соответствующей шкалой критериев. Если показатели исследуемого материала входят в допустимый диапазон шкалы критериев, то антибиотик считают эффективным. Использование способа позволяет достоверно и быстро получать оценку клинической эффективности антибактериальных препаратов против туляремийной и бруцеллезной инфекциях. 7 табл.

Способ оценки клинической эффективности антибактериальных препаратов для возбудителей особо опасных инфекций Francisella tularensis и Brucella spp, включающий выращивание микробных клеток на питательной среде используя методы: диско-диффузионный и серийных разведений, отличающийся тем, что оценку проводят в три этапа, по первому этапу разрабатывают шкалу критериев антибиотикочувствительности для эталонных штаммов, при этом при создании шкалы критериев для Francisella tularensis используют штаммы - F. tularensis subsp. nearctida., F. tularensis subsp. mediasiatica, F.tularensis subsp. holartia., при разработке шкалы критериев для Brucella spp, применяют В.abortus, B.suis, B.melitensis; пo второму этапу определяют чувствительность исследуемого материала к тем же антибиотикам, а третий этап заключается в сравнении последних показателей с полученной шкалой для данного вида микроба, при этом первый и второй этапы проводят одновременно по одной технологии путем посева микробной суспензии в объеме 0,3 мл (n·10⁷ КОЕ/мл) по диско-диффузионному методу и методу серийных разведений на питательной среде с ростовыми добавками, при этом в качестве ростовых добавок к агару Мюллер-Хинтона используют сернокислый магний - 0,05 г/л, сернокислое железо -0,1 г/л, L-цистеин - 0,6 г/л, лимонный натрий - 1,2 г/л, хлористый калий - 2 г/л, фосфорнокислый калий - 4 г/л, глюкозу - 15 г/л; далее посевы инкубируют при 37°С в течение 24-48 ч и проводят учет результатов, причем оценку клинической эффективности осуществляют сопоставляя пограничные значения минимальной подавляющей концентрации и диаметров зон подавления роста возбудителя с соответствующей шкалой критериев, если показатели исследуемого материала входят в допустимый диапазон шкалы критериев, то антибиотик считают эффективным.