СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ К КОМПЛЕКСНЫМ АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2014 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, ветеринарной микробиологии, и может найти применение для определения чувствительности выделенных из патологического материала (паренхиматозные органы, носовые, влагалищные смывы, сперма, молоко и т.д.) микроорганизмов, обладающих множественной лекарственной устойчивостью к любым сочетаниям антибактериальных препаратов или готовым комплексным.

Широкое, нерациональное применение антибактериальных препаратов в ветеринарной практике сопровождается увеличением устойчивости микроорганизмов к этим препаратам. Более половины культур возбудителей, выделенных от павших и больных животных, оказываются одновременно устойчивыми к 14-16 препаратам, а также повышается количество культур, усиливающих свой рост в присутствии целого ряда препаратов (Страчунский Л.С. Состояние антибиотикорезистентности в России //. Клиническая фармакология и терапия - 2000, №2. - С.6 - 9. Клиническая микробиология для ветеринарных врачей. - М.: Колосс, 2006).

В ветеринарной практике для антибактериальной терапии часто используют комплексные препараты, эффективность применения которых так же, как и отдельных компонентов препаратов, определяется чувствительностью к ним выделенных возбудителей инфекционных болезней.

Для определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам используют способ диффузии в агар с применением дисков, содержащих определенное количество (5, 10, 15, 30, 150, 300 мкг-ЕД) антибактериального препарата (МУК по определению чувствительности к антибиотикам возбудителей инфекционных болезней животных. Утверждено ГУВМСХ СССР 30.09.1971).

Способ с использованием дисков прост в исполнении, но дает информацию только о бактериостатической активности конкретного антибактериального препарата. Он позволяет по диаметру зоны задержки роста (ЗЗР) определить минимальную подавляющую концентрацию антибактериального препарата в отношении испытуемой культуры возбудителя и классифицировать микроорганизмы на чувствительные с промежуточной чувствительностью и устойчивые (резистентные). Однако нельзя определить этим способом чувствительность резистентных микроорганизмов к действию широко используемых в ветеринарной практике комплексных препаратов из-за отсутствия стандартных бумажных дисков, содержащих одновременно два (или более) препарата.

Прототипом предлагаемого изобретения является способ серийных разведений на жидкой питательной среде (Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. - М.: Медицина, 1973 г., с.177-178). Он заключается в том, что выделенная культура микроорганизма засевается в определенный объем среды (7-10 пробирок или чашек Петри на культуру), содержащей убывающие (от 125-500 до 0,03-0,1 мкг/мл) концентрации антибактериального препарата (или нескольких препаратов). Способ серийных разведений в жидкой питательной среде позволяет установить не только минимальную ингибирующую концентрацию (МИК), но и определить бактерицидную концентрацию (БАК) испытуемого препарата в отношении выделенного микроорганизма. Используя этот способ, определяется МИК и БАК вновь создаваемых комплексных препаратов в отношении различных культур микроорганизмов, в том числе с множественной лекарственной устойчивостью. Способ серийных разведений в жидкой питательной среде используется при исследовании чувствительности небольшого количества культур микроорганизмов, при этом устанавливается МИК антибактерального препарата. Для определения БАК необходим дополнительный посев из пробирок с наибольшим разведением препарата, где нет видимого роста культур на минимальную подавляющую концентрацию (МПА). Отсутствие роста на МПА свидетельствует о бактерицидном действии соответствующей концентрации препарата.

В клинической ветеринарной микробиологии способ серийных разведений в жидкой питательной среде имеет ограниченное применение из-за трудоемкости и громоздкости, тем более что чувствительность выделенных возбудителей необходимо определить не к одному, а к нескольким или даже 2-3 десяткам препаратов.

Предлагаемый способ решает задачу упрощения и снижения трудоемкости определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам. Достигаемый технический результат - сокращение времени определения чувствительности к любому количеству эффективных препаратов, которые могут быть использованы для лечения больного животного.

Для этого в способе определения чувствительности патогенных бактерий к комплексным антибактериальным препаратам, включающем разведение растворов антибактериальных препаратов стандартной питательной средой, внесение патогенных бактерий в приготовленные разведения, инкубирование их в термостате, визуальную оценку чувствительности патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, согласно изобретению внесение патогенных бактерий осуществляют в разведение антибактериального препарата, приготовленного в терапевтической концентрации, заявленной производителем, раскапанного в лунки планшета, инкубирование проводят в течение 3÷4 часов, затем в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями вводят бромкрезоловый пурпурный, проводят визуальную оценку окраски содержимого лунки и по изменению окраски с красной на желтую делают вывод о чувствительности патогенных бактерий к комплексному антибактериальному препарату, причем чувствительными к комплексным антибактериальным препаратам считают микроорганизмы, у которых отсутствует рост в питательной среде с антибиотиками и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится красным, как и в положительном контроле, а устойчивыми считают микроорганизмы, при культивировании которых в питательной среде с антибиотиками наблюдается рост и при добавлении индикатора цвет среды в лунке становится желтым, как и в отрицательном контроле. Бромкрезоловый пурпурный вводят в питательную среду с антибактериальным препаратом и патогенными бактериями в количестве 10 мкл 0,5% раствора.

Бромкрезоловый пурпурный - это аммонийная соль 5′,5′′-дибром-о-крезолсульфофталеина, химический реактив, индикатор, переход окраски раствора от желтой к пурпуровой в интервале рН 5,2-6,8.

Способ осуществляют следующим образом. Для испытания берут 12-18-часовые культуры возбудителей (микроорганизмов), выделенных из патологического материала и обладающих множественной лекарственной устойчивостью. Из 12-18-часовой агаровой культуры возбудителя готовят микробную взвесь на стерильном изотоническом растворе натрия хлорида, по стандарту мутности доводят ее концентрацию до 10 млн.м.т. в мл. В качестве питательной среды при определении чувствительности выделенного возбудителя к сочетаниям антибактериальных препаратов используют МПБ (рН 7,2-7,4) либо бульон Хоттингера (рН 7,4-7,6). В качестве индикатора, который добавляют в питательную среду с антибиотиком и культурой, используют 0,05÷1% бромкрезолового пурпурного, который при изменении среды в кислую сторону рН 5,2-6,8 меняет свой цвет с красного на желтый. В разборные (стрипованные) стерильные 96-луночные планшеты раскапывают раствор с терапевтическими концентрациями антибактериального препарата в 0,2 мл питательной среды +0,01 мл 10 миллиардной взвеси тестируемой культуры +0,01 мл 0,05÷0,1% раствора индикатора бромкрезоловый пурпурный. Количество лунок на каждую культуру испытуемого возбудителя соответствует числу сочетаний или комплексных антибактериальных препаратов, к которым определяется чувствительность, плюс одна пробирка для контроля, т.е. для каждого препарата или сочетания занимается одна лунка. В контрольную пробирку препарат не вносят.

Планшеты с заполненными лунками мясопептонным бульоном, антибиотиком, культурой и индикатором инкубируют в течение 3-4 часов в термостате при температуре 36±1°C. Проводят последующую визуальную оценку окраски содержимого лунки и по ее изменению делают вывод о чувствительности микроорганизма к антибактериальному препарату (при наличии изменения цвета контрольной лунки).

Изменение окраски с красной на желтую в контрольной лунке оценивается визуально, отсутствие изменения цвета в лунке с антибиотиками свидетельствует о чувствительности микроорганизмов к комплексным антибактериальным препаратам, изменение окраски бульона при росте испытуемой культуры в лунках с антибиотиками говорит об устойчивости микроорганизмов.

Эффективными считаются антибиотики или два антибактериальных препарата, или комплексные препараты (включают два и более антибактериальных препаратов), которые в растворе, содержащем их в терапевтической концентрации (заявленной производителем), задерживают рост испытуемых культур микроорганизмов. При отсутствии роста микроорганизма в питательной среде с добавленным антибактериальным средством отмечается стабильное состоянием рН, поэтому при добавлении индикатора цвет среды не изменяется.

В случае если антибактериальное средство неэффективно или недостаточно эффективно, его терапевтической концентрации недостаточно для задержки роста испытуемой культуры микроорганизма. Соответственно, при росте микроорганизма в питательной среде с добавлением антибактериального средства отмечается накопление кислых продуктов его жизнедеятельности и рН среды сменяется в кислую сторону, т.е. понижается, поэтому при добавлении индикатора цвет среды изменяется.

Проведенные микроскопические исследования мазков из лунок, где в присутствии антибактериальных препаратов не было изменения окраски бульона, показали отсутствие в мазках микробных клеток. При высеве из таких лунок 0,01 мл на МПА рост возбудителя отсутствовал либо на поверхности агара обнаруживали единичные колонии (до 10, редко больше).

Пример. Исследован патологический материал с крупного свинокомплекса от 60 павших и больных поросят разного возраста 26 групп. В 15 группах диагностирована смешанная кишечная инфекция, была вызвана в разных ассоциациях 46 микроорганизмами (энтеропатогенная Е. Coli, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, реже другие), в разной степени устойчивыми одновременно к 14-16 антибактериальным препаратам (ампициллин, амоксициллин, гентамицин, тилозин, тетрациклин, рифампицин, полимиксин, норфлоксацин, энрофлоксацин, фуразолидон, фурагин, эритромицин, левомицетин, доксициклин, стрептомицин, неомицин и др.). С учетом наличия зоны задержки роста (ЗЗР) вокруг диска с антибактериальным препаратом (меньше, чем для чувствительного микроорганизма, либо наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), совместимости (сенергидный либо аддитивный эффект) антибактериальных препаратов были подобраны и испытаны по предлагаемому способу следующие комплексные препараты (таблица 1).

В таблице 2 приведен пример чувствительности изолированных из 13 проб патматериала культур стрептококка группы Д Enterococcus faecalis на твердых питательных средах с использованием коммерческих дисков. Подобные таблицы составляются на каждую выделенную культуру микроорганизмов. Сочетания препаратов выбираются с учетом наличия ЗЗР (зоны задержки роста) на АГВ вокруг диска с антибактериальным препаратом (промежуточная чувствительность, наличие в ЗЗР отдельных колоний, «пленки»), либо берутся заранее известные компоненты, входящие в состав комплексного препарата (например, рифампицин и полимиксин, используемые в составе рифапола).

Полученную изолированную культуру микроорганизма испытывают на чувствительность к сочетанием антибактериальных препаратов, подобранных в лаборатории (таблица 3), взятых в заявленных для них стандартной бактерицидной концентрации, или к комплексным готовым коммерческим официнальным формам, в заявленной терапевтической концентрации (таблица 1).

В последнем варианте определение чувствительности выделенного возбудителя к комплексному препарату можно проводить параллельно с исследованием способа диффузии в агар (а не после него, как в первом случае).

Чувствительность возбудителей с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным препаратам оказалась различной. Наиболее эффективными были в конкретной ситуации диоксиген - 95,6%, диоксинор - 94,4% культур, кинокол 93,4%, микобаксан - 91,3, наименьшей была чувствительность к пульмокиту (41,3%), который проверялся не по результатам чувствительности выделенных культур к дискам антибиотиков (дисков с китасамицином, входящим в препарат, на момент исследований в наличии не было), а по просьбе из хозяйства, т.к. в нем этот препарат применяется. В целом, во всех группах быстро были подобраны от 4 до 12 препаратов используемых в хозяйстве, которые можно использовать для эффективной антибактериальной терапии.

Контроль полученных результатов - определение чувствительности выделенных культур (МПК) к антибактериальным препаратам проводили с помощью общепринятого метода определения чувствительности к антибиотикам серийных разведений в жидкой питательной среде. Полученные результаты исследования были сопоставимы с результатами, полученными при определении антибактериальной чувствительности стандартным общепринятым методом и подтверждены эффективной антибактериальной терапией в хозяйстве.

Результаты проведенных исследований показывают, что чувствительность микроорганизма с установленной множественной лекарственной устойчивостью можно дополнительно определить к имеющимся в наличии препаратам, например, к 14 антибактериальным препаратам, включая и их комплексные сочетания, за 3-4 часа.

Предложенный способ определения чувствительности патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью к комплексным антибактериальным препаратам позволяет в лаборатории значительно сократить время и количество расходных материалов, снизить трудоемкость определения чувствительности микроорганизмов с множественной лекарственной устойчивостью, а в хозяйстве более точно и в более ранние сроки назначать адекватную антибактериальную терапию.

Таблица 1 Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к комплексным антибактериальным препаратов. № п/п Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов) Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД) Кол-во исследованных культур Чувствительные к препарату (кол-во/%)* Устойчивые к комплексному препарату МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе) МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе) 1 Микобаксан ампициллина натриевая соль + окситетрациклина гидрохлорид + тетрациклина гидрохлорид + сульфадимезин + нистатин 10 мкг/мл 46 42/91,3 4 0,04-6,25 12,5-50 2 Колифлок колистина сульфат + энрофлоксацин 10 мкг/мл 46 39/84,8 7 3,7-6,25 12,5-50 3 Нифулин метронидазол + фуразолидон + хлортетрациклина гидрохлорид 10 мкг/мл 26 21/80,8 5 1,85-6,25 12,5-100 4 Квинокол Энрофлоксацин + гентамицин 10 мкг/мл 36 26/72,2 10 3,7-6,25 12,5-50 5 Диоксинор норфлоксацина гидрохлорид + диоксидин 10 мкг/мл 36 34/94,4 2 0,04-6,25 12,5-50 6 Амоксиклав амоксициллин + клавулановая кислота 10 мкг/мл 32 21/65,6 11 1,85- 6,25 12,5-100 7 Пульмокит китасамицин + триметоприм + сульфадиазина 10 мкг/мл 46 19/41,3 27 3,7-6,25 12,5-400

№ п/п Комплексный препарат (сочетание антибактериальных веществ/препаратов) Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД) Кол-во исследованных культур Чувствительные к препарату (кол-во/%)* Устойчивые к комплексному препарату МПК чувствительных культур мкг/мл (определена в прототипе) МПК устойчивых культур мкг/мл (определена в прототипе) 8 Фурамикс полимиксина сульфат + фуразолидон 10 мкг/мл 36 27/75 9 3,7-6,25 12,5-200 9 Тилоколин тилозин + колистина сульфат 10 мкг/мл 36 24/66,7 12 3,7-6,25 12,5-200 10 Рифапол полимиксин + рифампицин 10 мкг/мл 26 16/61,5 10 3,7-6,25 12,5-200 11 Диоксиген диоксидин + гентамицин 10 мкг/мл 46 44/95,6 2 1,85-6,25 12,5-50 12 Рифалекс левомицетин + рифампицин 10 мкг/мл 26 18/69,2 8 3,7-6,25 12,5-200 13 Гентаприм гентамицина сульфат + сульфадиметоксин + триметоприм 10 мкг/мл 46 34/73,9 12 1,85-6,25 12,5-100 14 Дизпаркол левомицетин + метронидазол + тилозин 10 мкг/мл 26 16/61,5 10 3,7-6,25 12,5-200 15 Кинокол (энрофлоксацин - колистина сульфат) 10 мкг/мл 46 43/93,4 3 3,7-6,25 12,5-100 16 Анзациклин рифампицин и тетрациклин 10 мкг/мл 46 38/82,6 8 1,85-6,25 12,5-200 Примечание - *расчет % чувствительных культур - 42 (чувствительные) : 46 (всего исследованных культур)*100=91,3%

Таблица 2 Результаты исследования чувствительности к антибактериальным препаратам на примере выделенных бактериальных культур Enterococcus faecalis. Исследование с помощью дисков с антибиотиками Наименование Зона задержки роста микроорганизмов, в мм Воспроизводство сосуны Воспроизводство свиноматки уч. доращивания уч. Откорма №1 уч. Откорма №2 0-1 дн 1-5 дн. 10-15 дн №1 №2 №3 35 дн. 60 дн. 70 дн. 88 дн. 128 дн. 150 дн. 180 дн. Ампициллин ус ус 17 ус ус ус 23р 22 30р 20р 23 - - Амоксициллин ус - 17 ус 12р ус 24 15 25р 17 15 - - Линкомицин ус - 25 ус 12р - 16пл - 30р 27пл ус - ус Эритромицин ус - ус ус - ус 13 - 11пл ус ус ус - Тетрациклин - 8р 20р ус - - - - ус 20р 12р 12р ус Левомицетин 10 - 20р 18пл ус ус 10пл 10 12 13 - - 8р Рифампицин ус 12р 18 11 12 13 12р 13 30пл 30р 30р 8р 10р Гентамицин 10р ус ус 10 10р ус - - 30пл 16 8р 11пл 15р Полимиксин - 18р ус ус 18р 10 13 - 10 10р ус 14р 10 Фуразолидон 10р 18 - 20р - 20 ус 10р 19 26 12р 14р 21р Фурадонин 13р 17р 12пл 13пл 14р 21 - 15 24р 30р 15р 19р 17 Норфлоксацин - ус 10 14 10р 13 10 - 25р 20 12 15р 18р Энрофлоксацин 12р - - - 10пл 11 - - 28 23р 17 10р 10р Тилозин - ус 13р ус ус ус ус - 15 15 ус - - Стрептомицин - ус - - - 11 - - 23р 22р ус 8р 10 Доксициклин 12 8р 15 10 10 10 13 10 12 20 13 12р 10р «-» - отсутствие задержки роста культуры вокруг диска; Р - в зоне задержки роста рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде отдельных колоний; Пл - в зоне задержки роста «газона» сплошной рост устойчивых рас микроорганизмов к антибактериальному препарату в виде пленки; Ус - усиление роста культур вокруг диска с антибактериальным препаратом.

Таблица 3 Результаты определения чувствительности культур с множественной лекарственной устойчивостью, выделенных из патологического материала, к сочетаниям антибактериальных препаратов в жидкой питательной среде. № п/п Сочетание антибактериальных препаратов Концентрация в 1 мл среды, мкг (ЕД) Кол-во исследованных культур Чувствительные к сочетанию Устойчивые к сочетанию 1 Ампициллин + полимиксин 7,5+75 5 4 1 2 рифампицин + доксициклин 1,25+2,5 11 11 0 3 Гентамицин + энрофлоксацин 2,5+1,25 8 6 2 4 Полимиксин + рифампицин 75+1,25 8 7 1 5 Энрофлоксацин + Фуразолидон 1,25+75 12 10 2

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ветеринарной микробиологии. Определяют чувствительность бактерий, вызывающих кишечные инфекции, к комплексным антибактериальным препаратам. Проводят разведение антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг/мл в питательной среде с рН 7,2-7,6. Подготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, содержащие приготовленные разведения. Вносят индикатор - 0,5% раствор бромкрезолового пурпурного в количестве 10 мкл. Инкубируют в течение 3-4 ч. Проводят визуальную оценку роста бактерий и оценку окраски среды в лунке при достижении рН 5,2-6,8 среды. Делают вывод о чувствительности бактерий к комплексным антибактериальным препаратам по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую. Чувствительными считают бактерии, у которых отсутствует рост и изменение цвета питательной среды с антибактериальными препаратами. Устойчивыми считаются бактерии, у которых наблюдается рост и изменение цвета среды с антибактериальными препаратами. Изобретение позволяет сократить время определения чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции у животных, к комплексным антибактериальным препаратам. 3 табл., 1 пр.

Способ определения чувствительности бактерий, вызывающих кишечные инфекции, к комплексным антибактериальным препаратам, характеризующийся тем, что проводят разведение антибактериальных препаратов в концентрации 10 мкг/мл в питательной среде с рН 7,2- 7,6, подготовленную взвесь бактерий вносят в лунки, содержащие приготовленные разведения, вносят индикатор, в качестве которого используют 10 мкл 0,5% раствора бромкрезолового пурпурного, инкубируют в течение 3-4 ч, при достижении рН 5,2-6,8 среды проводят визуальную оценку роста бактерий и оценку окраски среды в лунке, по наличию или отсутствию роста бактерий и изменению окраски среды с красной на желтую делают вывод о чувствительности бактерий к комплексным антибактериальным препаратам, при этом чувствительными считают бактерии, у которых отсутствует рост и изменение цвета питательной среды с антибактериальными препаратами, а устойчивыми считаются бактерии, у которых наблюдается рост и изменение цвета среды с антибактериальными препаратами.