ПЕПТИДНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ - МИМЕТИК ЭРИТРОПОЭТИНА И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ СОЛИ, ИХ ПОЛУЧЕНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2013 года по МПК C07K17/08 C07K14/505 A61K47/48 A61P7/06 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к пептидному производному - миметику эритропоэтина (ЭПО) и его фармацевтическим солям, которые связываются с рецептором ЭПО и активируют рецептор ЭПО или обладают агонистическим действием в отношении ЭПО. Конкретно, настоящее изобретение относится к пептидному производному - миметику ЭПО, модифицированному активным метоксиполиэтиленгликолем, и способам его получения; также оно относится к лечению расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной или дефектной популяцией эритроцитов с использованием указанного пептидного производного - миметика и его фармацевтических солей.

Предшествующий уровень техники

ЭПО представляет собой гликопротеиновый гормон, имеющий молекулярную массу приблизительно 34 кДа. ЭПО в плазме крови состоит из 165 аминокислот с высокой степенью гликозилирования, где основной компонент гликозила представляет собой сиаловую кислоту. На основе углеводородного содержания встречающиеся в природе ЭПО делятся на два типа, а именно α и β-тип, где α-тип содержит 34% углеводородов и β-тип содержит 26% углеводородов. Эти два типа обладают одними и теми же биологическими характеристиками, антигенностью и клиническим действием. Человеческий ген ЭПО располагается в хромосоме 7 long-Area 22. Его кДНК успешно клонирована в 1985 году, и рекомбинантный человеческий ЭПО (rНиЭПО) в основном продуцируют с использованием генетической рекомбинантной технологии и широко используют в клинической практике. ЭПО биосинтезировали с использованием технологии рекомбинантной ДНК (Egrie, JC, Strickland, TW, Lane, J etc. (986) Immunobiology (Immunobiol)72: 213-224), которая представляет собой продукт клонированного человеческого гена ЭПО, встроенного в клетки яичника китайского хомячка (клетки СНО) и экспрессирующегося в них. Природный человеческий ЭПО сначала транслируется в полипептидные цепи, содержащие 166 аминокислот, где позиция 166 представляет собой аргинин. При посттрансляционной модификации аргинин в позиции 166 деградируют с использованием гидроксилпептидазы. Молекулярная масса человеческого ЭПО без гликозила составляет 18236 Да. В интактной молекуле ЭПО гликозил составляет приблизительно 40% от общей молекулярной массы (J. Biol. Chem. 262: 12059).

ЭПО представляет собой первый цитокин, примененный в клинической практике, и до настоящего времени представляет собой наилучший увеличивающий уровень гемоглобина препарат, обладающий единичным и безопасным действием. Он обладает некоторым действием при почечной анемии, апластической анемии, множественной миеломе и пароксизмальной ночной гематурии; дополнительно, применение ЭПО может уменьшить степень переливания крови при хирургическом вмешательстве и до некоторой степени лечить анемию, вызванную злокачественной опухолью, химиотерапией и ревматоидным артритом. Поскольку ЭПО прежде всего производится эндотелиальными клетками почечных канальцев, то анемия, вызванная почечными заболеваниями, представляет собой первое показание для применения ЭПО; эффективность ЭПО при лечении почечной анемии составляет почти 100%, но ЭПО не улучшает функцию почек. Лечение ЭПО безопасно, эффективно и подходит для длительного лечения; дополнительно, оно решает проблему ускорения доставки крови. На глобальном рынке биотехнологических лекарств в 2006 году рекомбинантные лекарства ЭПО составляли 11,9 миллиардов долларов США. Имеется огромная емкость рынка.

В 1989 году рекомбинантный человеческий ЭПО (ЭПОGЕN) был одобрен U.S. FDA (Комиссия по контролю за лекарствами и питательными веществами) для лечения почечной анемии, но только с 1992 г. ЭПОGЕN поступил на китайский рынок. Ежегодная смертность от хронического нефрита составляет приблизительно 0,25% в Китае, из которой у значительной доли пациентов по существу развивается почечная недостаточность. Количество пациентов, страдающих от почечной анемии, составляет 500-600 тысяч ежегодно. В соответствии с консервативными оценками потребления вместе с потреблением при других вызванных раком анемиях емкость домашнего рынка составляет приблизительно 1,2-1,6 миллиардов или даже больше (рассчитанная при текущей цене, составляющей 30-40 CNY/дозу, средней массе пациентов 50 кг). С конца 1990-х ЭПО признали как наиболее хорошо продающиеся лекарства в основных областях Китая. Величина потребления составляет 62,13 миллионов юаней в рассмотренных госпиталях основных районов по всему Китаю в 2003 году, по занимаемому месту 56. Расходы на ЭПО в рассмотренных госпиталях основных районах по всему Китаю увеличилась до 80,49 миллионов CNY в 2004, с ежегодным ростом 30%.

В качестве эндогенного гормона, действующего на гематопоэтические клетки костного мозга, способствуя пролиферации, дифференцировке и созреванию эритроидных клеток-предшественников, ЭПО играет важную роль в регуляции кислородного статуса в организме. На ранней эмбриональной стадии ЭПО образуется в печени и затем постепенно перемещается в почки. ЭПО в основном секретируется интерстициальными клетками почечных канальцев после рождения.

Во время индукции дифференцировки клеток-предшественников эритроцитов под действием ЭПО индуцируется глобулин, который дает клеткам возможность рекрутировать больше гемоглобина с железосодержащей функциональной группой, которая может связываться с кислородом в зрелых эритроцитах; таким образом, эритроциты и гемопоэтин играют важную роль в снабжении кислородом организма. Последнее вызвано путем взаимодействия между ЭПО и поверхностным рецептором эритроцитов.

Когда организм здоров, тогда ткань может получать достаточно кислорода из уже существующих эритроцитов. В этот момент концентрация ЭПО в организме очень низка. Эта низкая, но нормальная концентрация ЭПО достаточна для того, чтобы способствовать генерации эритроцитов, что обычно утрачивается при старении.

Когда уровень кислородного транспорта эритроцитами в системе кровообращения уменьшается и возникает гипоксия, тогда количество ЭПО в организме увеличивается. Состояние гипоксии в организме может быть вызвано следующими причинами: избыточная радиация, уменьшенное поступление кислорода вследствие высоты или длительной комы, различные типы анемии и т.п. Как реакция на гипоксический стресс в организме, более высокий уровень ЭПО может стимулировать дифференцировку клеток-предшественников эритроцитов, увеличивая их способность продуцировать эритроциты. Когда количество эритроцитов в организме превышает потребность нормальной ткани, тогда уровень ЭПО в системе кровообращения уменьшается. Последнее точно возникает потому, что ЭПО играет критическую роль для формирования эритроцитов, поэтому эти гормоны обладают очень широкой перспективой для лечения и диагностики заболеваний крови, характеризующихся низким формированием и дефектом эритроцитов. Недавние исследования подвели основание для предсказания эффекта терапии ЭПО при множестве заболеваний, расстройств и гематологических аномалий, эти заболевания включают: применение ЭПО в лечении анемии у пациентов, страдающих от хронической почечной недостаточности (CRF), и введение ЭПО пациентам, страдающим от AIDS (синдром приобретенного иммунодефицита) и получающим химиотерапию (Danna, RP, Rudnick, SA, Abels, RI: edited by MB, Garnick, ЭПО in Clinical Applications-An International Perspective. Marcel Dekker; 1990, p.301-324).

Часть биологических действий ЭПО могут регулироваться внутренней ролью поверхностных рецепторов на клеточной мембране. Ранее, при исследовании связывания белка ЭПО с клеточной поверхностью с использованием незрелых эритроцитов, выделенных из селезенки мышей, обнаружили, что этот белок состоит из двух полипептидов и его молекулярная масса составляет приблизительно 85000-100000 кДа (более подробное описание смотри в Sawyer, et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3690-3694). Количество сайтов связывания ЭПО также подсчитано. Каждая клеточная мембрана содержит приблизительно 800-1000 сайтов. Среди этих сайтов связывания приблизительно 300 сайтов связывания имеют уровень Kd 90 пМ. Связывание оставшихся сайтов связывания является низким, составляя приблизительно 570 пМ. В некоторых исследованиях продемонстрировано, что по ответу на ЭПО эритроцитов из селезенки мышей, инфицированных дружественным штаммом вируса анемии, идентифицировано приблизительно 400 сайтов связывания, где некоторые имеют уровень Kd 100 пМ, а некоторые имеют низкий уровень Kd 800 пМ.

Последующая работа заключалась в том, что два типа рецептора ЭПО транскрибировались на одном гене. В настоящее время указанный ген клонирован. Например, последовательности ДНК и последовательности, кодирующие пептид, мышиного и человеческого рецептора ЭПО описаны в WO90/08822. В данной модели показано, что связывание ЭПО с рецептором ЭПО приводит к активации и димеризации двух рецепторов ЭПО. Эта димеризация дополнительно ведет к инициации проведения сигнала.

Применение клонированного гена ЭПО полезно при нахождении агонистов и антагонистов этих важных рецепторов. Пептид, который в некоторой степени может действовать на рецептор ЭПО, идентифицирован и описан. Конкретно, идентифицирована группа пептидов, содержащих основной пептидный фрагмент, который связывается с рецептором ЭПО и стимулирует дифференцировку и пролиферацию клеток ЭПО. Тем не менее ЕС₅₀ пептида, который может стимулировать дифференцировку и пролиферацию клеток ЭПО очень низка, находясь в пределах от 20 нМ до 250 нМ. Таким образом, клинические применения этих пептидов весьма ограничены. Для преодоления сложностей существующих технологий в настоящем изобретении предложено пептидное производное - миметик ЭПО, обладающее более хорошей биологической активностью и более высокой биодоступностью, а также его фармацевтические соли и способ его получения.

Описание изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в том, чтобы предложить пептидное производное - миметик ЭПО, обладающий лучшей биологической активностью и более высокой биодоступностью, а также его фармацевтические соли и способ его получения.

Изобретение также нацелено на то, чтобы предложить фармацевтическую композицию, содержащую вышеупомянутое пептидное производное - миметик ЭПО и его фармацевтические соли для лечения расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной или дефектной популяцией эритроцитов.

В изобретении раскрыто пептидное производное - миметик ЭПО общей формулы (I) и его фармацевтические соли, обладающие биологической активностью in vivo,

где R₁, R₅ выбраны из мономерного пептида-миметика ЭПО и его аналогов, обладающих биологической активностью in vivo; n₁, n₂ представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10; R₂, R₄ выбраны из -СО или -СН₂; R₃ выбран из О, S, CH₂, N(CH₂)_n3NHR₆, NCO(СН₂)_n4NHR₆, CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, CHSCON(CH₂)_n5NHR₆ или CHNHCON(CH₂)_n5NHR₆; где n₃ представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n₄ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₅ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₆ выбран из Н или производных метоксиполиэтиленгликоля.

В этом аспекте предпочтительное воплощение представляет собой: R₁, R₅ независимо выбраны из мономерного пептида-миметика ЭПО и его аналогов общей формулы Y₁X₁X₂X₃GX₄X₅TWX₆X₇Y₂Y₃, которые обладают биологической активностью in vivo, где каждая аминокислота обозначена стандартно одной буквой, аминокислотные последовательности R₁, R₅ могут быть похожи или не похожи, и дополнительные предпочтительные аминокислотные последовательности R₁, R₅ могут быть постоянными или непостоянными, и N-концы R₁, R₅ ацетилизированы; Х₂, Х₃, Х₄, X₅, Х₆, Y₃ независимо выбраны из любой из 20 генетически кодируемых L-аминокислот или неприродных аминокислот;

Y₁, Y₂ независимо выбраны из любой из 20 генетически кодируемых L-аминокислот или неприродных аминокислот или пептидов, образованных этими аминокислотами; X₁, Х₇ выбраны из С, K, D, Е, Orn (L-орнитина) или Hoc (L-гомоцистеина).

В дополнительной оптимизации вышеупомянутого предпочтительного воплощения R₁, R₅ представляют собой циклический пептид, циклизованный дисульфидными связями или амидными связями; где если R₁, R₅ представляют собой циклический пептид, циклизованный дисульфидными связями, то X₁, X₇ независимо выбраны из С или Нос; аналогично, если R₁, R₅ представляют собой циклический пептид, циклизованный амидными связями, то X₁, X₇ независимо выбраны из K, D, Е или Orn.

В аспекте, охватывающем вышеупомянутое предпочтительное воплощение, Y₃ предпочтительно выбран из K, Н или R, более предпочтительно Y₃ представляет собой K.

В аспекте, охватывающем вышеупомянутое предпочтительное воплощение, длина аминокислотных последовательностей R₁, R₅ дополнительно оптимизирована, а именно предпочтительно выбрана из 13~40 аминокислот, более предпочтительно составляет 22 аминокислоты, еще более предпочтительно, но не ограничена следующей структурой с циклическим пептидом, наиболее предпочтительно, но без ограничения, циклическими пептидами NO:1-NO:8, а именно

В этом аспекте существуют четыре предпочтительных воплощения:

[1] n₁, n₂ равны 2, R₂, R₄ представляют собой -СО, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, n₅ равно 2, R₆ представляет собой Н или производные метоксиполиэтиленгликоля.

[2] n₁, n₂ равны 1, R₂, R₄ представляют собой -СО, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, n₄ равно 2, R₆ представляет собой Н или метоксиполиэтиленгликолевые производные.

[3] n₁, n₂ равны 2, R₂, R₄ представляют собой -СН₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, n₅ равно 2, R₆ представляет собой Н или метоксиполиэтиленгликолевые производные.

[4] n₁, n₂ равны 1, R₂, R₄ представляют собой -CH₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, n₄ равно 2, R₆ представляет собой Н или метоксиполиэтиленгликолевые производные.

Вышеупомянутые четыре предпочтительных воплощения приведены параллельно, не включая друг друга или не находясь в прогрессивной взаимосвязи.

Вышеупомянутые четыре предпочтительных воплощения могут быть дополнительно оптимизированы, R₆ представляет собой метоксиполиэтиленгликолевые производные, наиболее предпочтительно R₆ представляет собой метоксиполиэтиленгликолевые производные, где молекулярная масса метоксиполиэтиленгликолевых производных составляет от 5000 до 100000 дальтон, структура метоксиполиэтиленгликолевых производных выбрана из разветвленных или имеющих линейный тип производных.

В этом аспекте для дополнительной исчерпывающей оптимизации авторы изобретения смогли получить следующие четыре предпочтительных воплощения:

[1] n₁, n₂ представляют собой 2, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, где n₅ выбран из 2-10, предпочтительно равен 2; R₆ представляет собой метоксиполиэтиленгликолевое производное, имеющее линейную структуру и молекулярную массу 20000 дальтон.

[2] n₁, n₂ равны 1, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8, R₂, R₄ выбраны из -CO, -CH₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, где n₄ выбран из 2-10 и предпочтительно равен 2; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее линейную структуру и молекулярную массу 20000 дальтон.

[3] n₁, n₂ равны 2, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -CH₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, где n₅ выбран из 2-10 и предпочтительно равен 2; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее разветвленную структуру и молекулярную массу 40000 дальтон.

[4] n₁, n₂ равны 1, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, где n₄ выбран из 2-10 и предпочтительно равен 2; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее разветвленную структуру и молекулярную массу 40000 дальтон.

Структура наиболее предпочтительных пептидных производных - миметиков ЭПО и их фармацевтической соли выбрана из:

Приведенные пептидные производные - миметики ЭПО представляют собой амфифильные соединения, которые могут образовывать соли, путем взаимодействия с кислотными или щелочными соединениями при помощи общеизвестного специалистам в данной области техники способа. Обычно используемые кислоты выбраны из соляной кислоты, бромистоводородной кислоты, йодистоводородной кислоты, серной кислоты, ортофосфорной кислоты, пара-толуолсульфоновой кислоты, метансульфоновой кислоты, щавелевой кислоты, пара-бромфенилсульфоновой кислоты, карбоновой кислоты, янтарной кислоты, лимонной кислоты, бензойной кислоты, уксусной кислоты; образующиеся соли включают сульфат, пирофосфат, трифлютат, сульфит, бисульфит, фосфат, бифосфат, дигидрофосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, пропионат, каприлат, акрилат, формиат, изобутират, капроат, энантат, пропиолат, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, фумарат, малеат, бутин-1,4-диолат, гексин-1,6-диоат, бензоат, хлорбензоат, метилбензоат, динитробензоат, гидроксибензоат, метоксибензоат, фенилацетат, фенпропионат, фенилбутират, цитрат, лактат, γ-гидроксибутират, гликолят, тартрат, метансульфонат, пропилсульфонат, нафталин-1-сульфонат, нафталин-2-сульфонат, манделат и подобные, предпочтительно трифлютат.

Щелочные вещества также могут взаимодействовать с пептидными производными - миметиками ЭПО с образованием солей. Эти щелочные вещества выбраны из аммония, гидроксидов щелочных металлов или щелочноземельных металлов, а также карбоната, бикарбоната, типично выбраны из гидроксида натрия, гидроксида калия, гидроксида аммония, карбоната натрия, карбоната калия и тому подобных.

В изобретении также раскрыты программы получения вышеупомянутых пептидных производных - миметиков ЭПО и их фармацевтических солей, включающие следующие стадии:

(1) получение R₁, R₅ путем генетической инженерии или способа химического синтеза. R₁, R₅ представляют собой мономерный пептид пептидного миметика и его аналоги, обладающие биологической функцией ЭПО;

(2) получение функциональной небольшой молекулы общей формулы (II)

где n₁, n₂ представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10;

R₇, R₈ выбраны из ОН или Н;

Z₂ выбран из О, S, CH₂, N(СН₂)_n6NHR₉, NCO(CH₂)_n7NHR₉, CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉, CHSCON(CH₂)_n8NHR₉ или CHNHCON(CH₂)_n8NHR₉, где n₆ представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n₇ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₈ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₉ выбран из Boc (трет-бутоксикарбонил) или Cbz (карбамазепин),

(3) получение производного R₁, R₅ с функциональной небольшой молекулой формулы (II) с получением соединения формулы (III);

,

где R₂, R₄ независимо выбраны из -СО или -CH₂,

(4) связывание с активным метоксиполиэтиленгликолем при помощи ковалентных связей после удаления Boc или Cbz.

Изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей:

(1) терапевтические количества вышеупомянутых пептидных производных - миметиков ЭПО и их фармацевтических солей общей формулы (I);

(2) фармацевтически приемлемый лекарственный носитель.

В изобретении также раскрыто применение лекарств, а именно применение любого из указанных пептидных производных - миметиков и его фармацевтических солей в терапевтически эффективном количестве для лечения расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной или дефектной группой эритроцитов, в особенности для лечения следующих заболеваний: прогрессирующей почечной недостаточности или диализа; анемии, связанной со СПИДом (синдромом приобретенного иммунодефицита), аутоиммунных заболеваний или злокачественной опухоли; кистозного фиброза; анемии при недоношенности; анемии, связанной с хроническим воспалительным заболеванием; повреждения спинного мозга; острой потери крови; старения и рака, сопровождающегося аномальной продукцией эритроцитов.

Пептидные производные - миметики ЭПО и их фармацевтические соли, полученные в настоящем изобретении, способны значительно способствовать увеличению количества ретикулоцитов периферической крови мышей, свидетельствуя о том, что они стимулируют эритропоэз; одновременно они также способны значительно удлинять период полувыведения конъюгатов из организма. Пептидные производные - миметики ЭПО и белок ЭПО - не оказывают существенного влияния на зрелые эритроциты, гематокрит клеток крови, содержание гемоглобина и также не оказывают существенного влияния на количество лейкоцитов периферической крови.

Для синтеза пептидных мономеров-миметиков ЭПО используется твердофазный синтез, основной принцип которого заключается в следующем: сначала связывают гидроксил C-концевой аминокислоты синтезируемой пептидной цепи с нерастворимой полимерной смолой путем ковалентной связи. Затем аминокислоты, присоединенные к твердофазному носителю, используют в качестве аминокомпонента для удлинения полипептидной цепи путем удаления защитной группы для аминогруппы и взаимодействия с чрезвычайно активным карбоксильным компонентом. Операцию (конденсация → отмывка → снятие защиты → отмывка → следующий раунд конденсации) повторяют для достижения желаемой длины цепи синтетического пептида. Наконец пептидную цепь отделяют от смолы. После очистки получают желаемый пептид. В промежуточном контроле реакционных стадий конденсации и удаления защиты используют способ нингидринового обнаружения, а именно когда пептидная цепь на смоле имеет свободную аминогруппу, тогда появляется голубая окраска после окрашивания нингидриновым реагентом. При отсутствии свободной аминогруппы цветная реакция не развивается (сам нингидриновый реагент имеет желтый цвет). Таким образом, после проведения реакции конденсации и обнаружения при помощи нингидрина, в том случае если присутствует желтое окрашивание (цвет самого нингидринового реагента), то это означает, что данная стадия связывания завершена и может быть осуществлена операция снятия защиты перед связыванием следующей аминокислоты. Если присутствует голубое окрашивание, тогда это означает, что все еще присутствует некоторое количество свободных аминогрупп на пептидной цепи. Необходимо дополнительно повторить связывание или заменить текущий конденсирующий реагент до тех пор, пока смола-пептид не продемонстрирует желтое окрашивание после обнаружения нингидрином.

Способ циклизования мономерного пептида хорошо известен специалистам в данной области техники. Циклизование дисульфидных связей в основном осуществляют путем окисления сульфгидрила в боковой цепи аминокислоты мономерного пептида до дисульфидных связей при помощи окислителя. Конкретно, мономерные пептиды помещают в раствор ДМСО (диметилсульфоксида) или 5% раствор бикарбоната амина для самоокисления, или добавляют к раствору уксусной кислоты, содержащему окисляемый I₂, предпочтительно добавляют к раствору уксусной кислоты, содержащему окисляемый I₂. Циклизование амидной связи в основном осуществляют путем образования амидной связи между карбоксильной группой и аминогруппой боковой цепи мономерного пептида в присутствии конденсирующего агента. Добавляемый конденсирующий агент хорошо известен специалисту в данной области техники, обычно включая DIC (N,N'-диизопропилкарбодиимид), EDC (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид), HATU (2-(1Н-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат), Pybop (бензотриазол-1-ил-окси-трис-пирролидино-фосфоний гексафторфосфат) и тому подобные.

Синтез димерного пептида в основном осуществляют путем образования -NH-СН₂-связи или -NH-CO-связи между аминогруппой боковой цепи аминокислотного остатка пептидного мономера-миметика ЭПО и функциональной небольшой молекулой. Специалист в данной области техники легко может синтезировать функциональную небольшую молекулу и связать ее с мономерным циклическим пептидом при помощи известного способа.

Получают димерный пептид и активное производное метоксиполиэтиленгликоля. Реакционная система может быть выбрана из органического растворителя или имеющейся буферной системы. Когда осуществляют реакцию PEG(полиэтиленгликоль)-илирования димерного пептида в органическом растворителе, тогда следующие щелочи могут быть добавлены в подходящем количестве, включая, но не ограничиваясь ими, триэтиламин, диизопропилэтиламин, пиридин, 2,4,6-триметилпиридин, но не ограничивающиеся ими. Когда осуществляют реакцию полиэтиленгликолевой дериватизации в буферной системе, тогда буферная система может быть выбрана из различных доступных буферов, предпочтительно фосфатного буфера с рН 7,7.

Биологическая активность ЭПО или пептидных производных - миметиков ЭПО и их фармацевтических солей, предложенных в данном изобретении, может быть определена при помощи различных анализов, известных в данной области. Тест активности in vivo осуществляют следующим образом: мышам подкожно инъецируют ЭПО и пептидные производные - миметики ЭПО, а также их фармацевтические соли, предложенные в данном изобретении, в течение трех последующих суток. Затем мышей умерщвляют. Цельную кровь отбирают для осуществления подсчета клеток периферической крови и ретикулоцитов. Подсчет клеток крови осуществляют при помощи автоматического счетчика клеток крови. Фармакодинамическое исследование осуществляют путем внутривенного введения макакам дозы 1,35 мг/кг. Доза белка ЭПО в качестве контрольного лекарства составляет 240 мкг/кг. Лекарства вводят три раза в неделю, и введение продолжают в течение шести недель. Образцы крови отбирают для осуществления связанного анализа гематологического индекса.

Обзор сокращений, используемых в изобретении:

Сокращения Название Структура Orn L-орнитин Нос L-гомоцистеин DIC N,N'-диизопропилкарбодиимид EDC 1-Этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид

РуВОР Бензотриазол-1-ил-окситрипирролидинофосфоний гексафторфосфат HATU 2-(1Н-7-Азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3-тетраметилуроний гексафторфосфат метанаммоний DMAP 4-Диметиламинопиридин Nle Норлейцин mPEG₂-OSU(40k) Разветвленный метоксиполиэтиленгликолевый N-гидроксисукцинимид (40к)

Описание графических материалов

Фиг.1 демонстрирует влияние пептидных производных - миметиков ЭПО (НН-ЭПО-018) на гематокрит макаки.

Фиг.2 демонстрирует влияние пептидных производных - миметиков ЭПО (НН-ЭПО-018) на гемоглобин макаки.

Предпочтительные воплощения

Для более подробного описания настоящего изобретения приведены следующие примеры, не ограничивающие объем настоящего изобретения.

Пример 1: синтез мономерного пептида - миметика ЭПО

Синтез мономерного пептида - миметика ЭПО осуществляют при помощи способа твердофазного пептидного синтеза. Этот способ пептидного синтеза приведен во множестве литературных источников, смотри Stewart, J.M., and Young, J.D., solid phase peptide synthesis 2d edition, novabiochem peptide synthesis notes. Синтез мономерного пептидного производного - миметика ЭПО осуществляют при помощи способов ручного синтеза. Смола представляет собой амидную смолу Ринка. α-Аминогруппу аминокислотных производных защищают при помощи Fmoc (флуорен-формил-карбонил). Тиоловую группу цистеиновой боковой цепи, аминогруппу глутаминовой боковой цепи и имидазольную группу гистидиновой боковой цепи защищают при помощи Trt (тритила). Гуанидиновую группу аргининовой боковой цепи защищают при помощи Pbf (2,2,4,6,7- пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонила). Индольную группу триптофановой боковой цепи, аминогруппу лизиновой боковой цепи защищают при помощи Boc (трет-бутокискарбонила). Гидроксильную группу треониновой боковой цепи, фенольную группу тирозиновой боковой цепи, гидроксильную группу сериновой боковой цепи защищают при помощи tBu (трет-бутил). Карбоксил С-конца пептидной цепи мономерного синтезируемого пептидного производного - миметика ЭПО присоединяют к нерастворимой смоле (амидной смоле Ринка) при помощи ковалентной связи. Затем аминокислоты, присоединенные к твердофазному носителю, используют в качестве аминокомпонента для удлинения полипептидной цепи путем удаления защитных групп амино при помощи раствора 20% пиперидин/DMF и взаимодействия с чрезвычайно активным карбоксильным компонентом. Операцию (конденсация → отмывка → удаление защиты → отмывка → следующий раунд конденсации) повторяют для достижения желаемой длины цепи синтетического пептида. Наконец пептидную цепь удаляют со смолы с использованием смешанного раствора трифторуксусной кислоты, воды, этиленмеркаптана, 3-изопропилсилана (92.5: 2.5: 2.5: 2.5). После осаждения в простом эфире получают неочищенное мономерное пептидное производное - миметик ЭПО. Неочищенный мономерный пептид выделяют и очищают при помощи С18 обращенно-фазовой препаративной колонки. Затем получают мономерное пептидное производное - миметик ЭПО. В промежуточном контроле реакционных стадий конденсации и удаления защиты используют способ нингидринового обнаружения, а именно когда пептидная цепь на смоле имеет свободную группу амино, тогда появляется голубая окраска после окрашивания нингидриновым реагентом. При отсутствии свободной аминогруппы цветная реакция не развивается (сам нингидриновый реагент имеет желтый цвет). Таким образом, после проведения реакции конденсации и обнаружения при помощи нингидрина, в том случае если присутствует желтое окрашивание (цвет самого нингидринового реагента), то это означает, что данная стадия связывания завершена и может быть осуществлена операция удаления защиты перед связыванием следующей аминокислоты. Если присутствует голубое окрашивание, тогда это означает, что все еще присутствует некоторое количество свободных аминогрупп на пептидной цепи. Необходимо дополнительно повторить связывание или заменить текущий конденсирующий реагент до тех пор, пока смола-пептид не продемонстрирует желтое окрашивание после обнаружения нингидрином.

Пример 2: Получение функциональных небольших молекул (LG-1)

Стадия 1: получение LG-1-A

Растворяют диэтиловый эфир иминодиуксусной кислоты (10,0 г, 52,8 ммоль), Вос-β-аланин (10,0 г, 52,8 ммоль) в 100 мл дихлорметана, добавляют DIC (8,0 мл, 52,8 ммоль), смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, реакционный раствор фильтруют, фильтрат промывают 100 мл насыщенного NaHCO₃, 50 мл 0,5 Н раствора HCl, 100 мл насыщенного физиологического раствора, органический слой отделяют, органический слой сушат над безводным MgSO₄. Органический слой фильтруют, его концентрируют и получают бесцветное маслянистое жидкое вещество LG-1-A: 17 г.

Стадия 2: получение LG-1-B

Растворяют 17 г LG-1-A в 100 мл МеОН: ТГФ = смесь 1:1, и затем добавляют 25 мл воды, 5 г NaOH (125 ммоль). Величину рН доводят до 1 с использованием 6 Н раствора HCl после перемешивания в течение 2 ч при комнатной температуре. Реакционный раствор экстрагируют четыре раза этилацетатом. Органический слой промывают физиологическим раствором, сушат над безводным сульфатом магния, концентрируют при пониженном давлении с получением белого полутвердого вещества. Растворяют продукты в 50 мл дихлорметана и добавляют 300 мл н-гексана. Раствор представляет собой белую пасту. После концентрирования при пониженном давлении получают белое твердое вещество LG-1-B: 14 г (Выход составляет приблизительно 90%).

Стадия 3: Получение LG-1-C

Растворяют 7 г LG-1-B (23 ммоль) в 80 мл тетрагидрофурана, и при перемешивании добавляют 4,6 г N,N-метокси-метиламин гидрохлорида (46 ммоль) и 5,1 г триэтиламина (51 ммоль), и затем добавляют 4,4 г DIC (32 ммоль), 4,7 г НОВТ (32 ммоль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. На следующие сутки реакционную жидкость добавляют в воду и экстрагируют 350 мл этилацетата. Органический слой промывают 200 мл 2 н. водного раствора HCl, 200 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, 100 мл насыщенного физиологического раствора. Органический слой отделяют и сушат над безводным сульфатом магния в течение 2 часов и затем фильтруют. Фильтрат превращается в маслянистое вещество после концентрирования при пониженном давлении. После колоночной хроматографии получают желаемый продукт LG-1-C: 4,2 г, выход: 70%.

Стадия 4: Получение LG-1

Растворяют 4,0 г LG-1-C (10,2 ммоль) в 60 мл тетрагидрофурана, охлаждают до 0°С при помощи бани лед-соль. Добавляют LiAlH₄ (340 мг, 8,9 ммоль). После взаимодействия при 0°С в течение 30 минут добавляют 4 мл воды, 4 мл 15% раствора NaOH. Реакционный раствор фильтруют. Фильтрат промывают тетрагидрофураном. После концентрирования досуха и колоночной хроматографии на силикагеле получают LG-1: 1,63 г (6 ммоль, Выход: 58,8%)

Пример 3: Получение функциональных небольших молекул (LG-2)

Растворяют 4 г LG-1-B (13 ммоль) в 100 мл N,N-диметилформамида и добавляют гидроксисукцинимид (3,1 г, 21 ммоль), DIC (4 мл, 26 ммоль) и DMAP (4-диметиламинопиридин) (12 мг, 0,08 ммоль). После перемешивания в течение ночи реакционный раствор концентрируют при пониженном давлении. Растворяют остаток в 80 мл этилацетата. Нерастворимые вещества отфильтровывают. Органическую фазу промывают 40 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия, 40 мл насыщенного физиологического раствора, 40 мл 0,5 н. раствора HCl, 40 мл насыщенного физиологического раствора однократно. Органический слой отделяют и сушат над безводным сульфатом магния. Органический слой фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении. Получают белое твердое вещество LG-2: 4,4 г (Выход составляет приблизительно 68%).

Пример 4: Получение функциональных небольших молекул (LG-3)

Стадия 1: Получение LG-3-A

Растворяют 7,0 г пентанона пимелиновой кислоты (0,04 моль) в 100 мл метанола. Добавляют 5% CsCO₃ в метанольном растворе при перемешивании и контролируют добавляемое количество для получения рН реакционного раствора приблизительно 8,5 (определяемого при помощи бумаги для точного определения рН). Его перемешивают в течение 30 минут после полного добавления. Затем реакционный раствор фильтруют. Фильтрат превращается в маслянистое вещество после концентрирования в вакууме. Маслянистое вещество растворяют в приблизительно 100 мл ДМСО и нагревают до 60°С. Добавляют 14 г (0,08 моль) бензилбромида. После взаимодействия в течение 8 часов реакционный раствор фильтруют, твердое вещество промывают небольшим количеством простого эфира. Добавляют 400 мл эфира в маточный раствор, его промывают 200 мл насыщенного физиологического раствора. Отделяют органический слой и его сушат над безводным сульфатом магния в течение 2 часов. Затем его фильтруют. Когда фильтрат концентрируют при пониженном давлении до 1/5 от исходного объема, его помещают в морозильник на -20°С на ночь для кристаллизации. На следующие сутки отфильтровывают твердые вещества, сушат и получают белое твердое вещество LG-3-A: 10,5 г (Выход 74%).

Стадия 2: Получение LG-3-B

Растворяют 2 г LG-3-A (0,0056 моль) в 20 мл тетрагидрофурана. Внутреннюю температуру раствора поддерживают ниже -10°С, его перемешивают и добавляют 626 мг NaBH₄ (0,0168 моль). После взаимодействия в течение 1 ч добавляют 200 мл охлажденного простого эфира, а затем добавляют 150 мл насыщенного раствора бикарбоната натрия для прекращения взаимодействия. Оставляют для расслаивания. Органический слой промывают однократно насыщенным физиологическим раствором и затем сушат над безводным Na₂SO₄ в течение 2 часов и фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением LG-3-B: 1,9 г (Выход: 94,6%).

Стадия 3: Получение LG-3-C

Растворяют 3,2 г LG-3-B (0,009 моль) в 50 мл дихлорметана. Добавляют 4,34 г триэтиламина (0,043 моль) при температуре ниже 0°С при перемешивании. Растворяют 1,33 г (0,0045 моль) трифосгена в 25 мл дихлорметана. Затем его добавляют в вышеприведенный раствор по каплям. Через 1 час добавляют 2,8 г трет-бутоксикарбонил-этилендиамина через 1 час. После взаимодействия в течение 3 ч реакционную смесь затем доводят до нейтрального значения с использованием ледяной уксусной кислоты, и в этот момент образуется осадок. Осадок отфильтровывают. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении и затем растворяют в простом эфире. Затем промывают водой трижды, насыщенным физиологическим раствором однократно. Органический слой отделяют и сушат над безводным сульфатом магния в течение 2 часов и затем фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении до маслянистого вещества. Маслянистые вещества очищают путем колоночной хроматографии на силикагеле (подвижная фаза: петролейный эфир:этилацетат = 10:1). Желаемый продукт комбинируют и собирают, и концентрируют с получением белого твердого вещества LG-3-C: 1,5 г (выход 38,8%).

Стадия 4: Получение LG-3-D

Растворяют 13 г LG-3-C (0,031 моль) в 8 мл метанола и добавляют приблизительно 200 мг 10% Pd-C при перемешивании. После взаимодействия в Н₂ при атмосферном давлении в течение 4 ч активированный углерод отфильтровывают, и фильтрат концентрируют с получением маслянистого вещества LG-3-D: 8,28 г (выход: 96,7%).

Стадия 5: Получение LG-3

Растворяют 5 г LG-3-D (0,018 моль) в 10 мл тетрагидрофурана. Добавляют 4,7 г пара-нитрофенола (0,043 моль) и добавляют раствор DIC 4,2 г (0,043) при перемешивании. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи. На следующие сутки отфильтровывают получающийся в результате осадок, осадок на фильтре промывают небольшим количеством этилацетата, фильтрат сушат путем концентрирования при пониженном давлении. К остатку добавляют 100 мл этилацетата и растворяют его. Однократно промывают 50 мл насыщенного физиологического раствора. Органический слой отделяют и его сушат над безводным сульфатом магния в течение 2 часов. Затем его фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением маслянистого вещества. Маслянистое вещество очищают путем колоночной хроматографии на силикагеле (элюэнт: гексан/этилацетат 20:1 = 10:1). Желаемый продукт комбинируют и собирают, и концентрируют при пониженном давлении с получением белого твердого вещества LG-3: 3,5 г (выход: 32%).

Пример 5: Получение функциональной небольшой молекулы (LG-4)

Стадия 1: Получение LG-4-A

Растворяют 5 г LG-3-D (0,018 моль) в 60 мл тетрагидрофурана. Добавляют 3,51 г N,N-метокси-метиламин гидрохлорида (0,036 моль) и 4,0 г триэтиламина (0,04 моль) при перемешивании. Затем добавляют 3,4 г DIC (0,027 моль) и 3,65 г НОВТ (0,027 моль). Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. На следующие сутки добавляют реакционный раствор в 200 мл воды, и его дважды экстрагируют этилацетатом, каждый раз 200 мл. Органический слой комбинируют. Его промывают 50 мл 2 н. раствора HCl, 100 мл насыщенного раствора NaHCO₃, 100 мл насыщенного физиологического раствора однократно. Органический слой отделяют, его сушат в течение 2 часов над безводным сульфатом магния. Затем его фильтруют. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении с получением маслянистого вещества. Маслянистое вещество очищают путем колоночной хроматографии (элюэнт: гексан/этилацетат 10:1). Желаемый компонент комбинируют с получением белого твердого вещества LG-4-A: 6,24 г (выход: 80%).

Стадия 2: Получение LG-4

Растворяют 4,0 г LG-4-A (9 ммоль) в 50 мл тетрагидрофурана. Добавляют 300 мг LiAlH₄ (7,9 ммоль) при температуре ниже нуля градусов с помощью бани лед-соль. Реакционную смесь поддерживают при 0°С в течение 30 минут. Затем добавляют 0,3 мл воды, 0,9 мл 15% раствора NaOH, 0,3 мл воды, и в этот момент образуется осадок. Осадок отфильтровывают. Осадок на фильтре однократно промывают тетрагидрофураном. Фильтрат комбинируют и концентрируют при пониженном давлении для сушки. Остаток очищают путем колоночной хроматографии с получением 1,65 г LG-4 (Выход: 55,5%).

Пример 6: Получение НН-ЭПО-005

Стадия 1: Получение циклического пептида SEQ ID NO:5

Растворяют 9 г пептидного мономерного производного - миметика ЭПО SEQ ID NO:5 (синтез в соответствии со способом, приведенным в Примерах) в 3000 мл 20% ледяной уксусной кислоты, и затем медленно по каплям добавляют 5% раствор йодного метанола до исчезновения желтого окрашивания. Реакционный раствор непосредственно подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°C и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении путем лиофилизации получают 3,0 г циклического пептида SEQ ID NO:5 (Выход: 15,6%).

Стадия 2: Получение НН-ЭПО-005

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:5 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл N,N-диметилформамида. Добавляют триэтиламин 147 мг (1,46 ммоль), 368 мг функциональных небольших молекул (LG-3) (0,61 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 6 часов концентрируют часть N,N-диметилформамида. К остатку добавляют 200 мл простого эфира, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Затем это белое твердое вещество растворяют в 50 мл 20% раствора трифторуксусная кислота/дихлорметан. После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут часть растворителя концентрируют при пониженном давлении. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Белое твердое вещество подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии, с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-005: 1,0 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 33%).

Пример 7: Получение НН-ЭПО-006

Стадия 1: Получение циклического пептида SEQ ID NO:6

Растворяют 9 г пептидного мономерного производного - миметика ЭПО SEQ ID NO:6 (синтез в соответствии со способом, приведенным в Примерах) в 3000 мл 20% ледяной уксусной кислоты, и затем медленно добавляют 5% раствор йодного метанола по каплям до исчезновения желтого окрашивания. Реакционный раствор непосредственно подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении 3,0 г циклического пептида SEQ ID NO:6 получают путем лиофилизации (Выход: 15,3%).

Стадия 2: Получение НН-ЭПО-006

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:6 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл N,N-диметилформамида. Добавляют триэтиламин 147 мг (1,46 ммоль), 368 мг функциональных небольших молекул (LG-3) (0,61 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 6 часов концентрируют часть DMF. К остатку добавляют 200 мл простого эфира, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Затем это белое твердое вещество растворяют в 50 мл 20% раствора трифторуксусная кислота/дихлорметан. После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут часть растворителя концентрируют при пониженном давлении. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Белое твердое вещество подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии, с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-006: 3,98 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 32,7%).

Пример 8: Получение НН-ЭПО-007

Стадия 1: Получение циклического пептида SEQ ID NO:7

Растворяют 9 г пептидного мономерного производного - миметика ЭПО SEQ ID NO:7 (синтез в соответствии со способом, приведенным в Примерах) в 3000 мл 20% ледяной уксусной кислоты, и затем медленно добавляют 5% раствор йодного метанола по каплям до исчезновения желтого окрашивания. Реакционный раствор непосредственно подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении 3,15 г циклического пептида SEQ ID NO: 7 получают путем лиофилизации (Выход: 16,4%).

Стадия 2: Получение НН-ЭПО-007

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:7 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл N,N-диметилформамида. Добавляют триэтиламин 147 мг (1,46 ммоль), 368 мг функциональных небольших молекул (LG-3) (0,61 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 6 часов концентрируют часть N,N-диметилформамида. К остатку добавляют 200 мл простого эфира, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Затем это белое твердое вещество растворяют в 50 мл 20% раствора трифторуксусная кислота/дихлорметан. После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут часть растворителя концентрируют при пониженном давлении. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Белое твердое вещество подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии, с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-007: 1,0 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 33%).

Пример 9: Получение НН-ЭПО-008

Стадия 1: Получение циклического пептида SEQ ID NO:8

Растворяют 27 г пептидного мономерного производного - миметика ЭПО SEQ ID NO:8 (синтез в соответствии со способом, приведенным в Примерах) в 3000 мл 20% ледяной уксусной кислоты, и затем медленно добавляют 5% раствор йодного метанола по каплям до исчезновения желтого окрашивания. Реакционный раствор непосредственно подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении 9,3 г циклического пептида SEQ ID NO:8 получают путем лиофилизации (Выход: 15,7%).

Стадия 2: Получение НН-ЭПО-008

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:8 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл N,N-диметилформамида. Добавляют триэтиламин 147 мг (1,46 ммоль), 368 мг функциональных небольших молекул (LG-3) (0,61 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 6 часов концентрируют часть N,N-диметилформамида. К остатку добавляют 200 мл простого эфира, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Затем это белое твердое вещество растворяют в 50 мл 20% раствора трифторуксусная кислота/дихлорметан. После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут часть растворителя концентрируют при пониженном давлении. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Белое твердое вещество подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии, с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-008: 1,12 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 33%).

Пример 10: Получение НН-ЭПО-008А

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:8 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл 20 ммоль буфера уксусной кислоты (рН 5,0), и затем добавляют 201 мг функциональных небольших молекул (LG-4) (0,61 ммоль) и 10 мл ацетонитрила. После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 30 минут реакционный раствор подвергают препаративной путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-008А: 0,75 г получают путем лиофилизации (Выход: 25%).

Пример 11: Получение НН-ЭПО-008В

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:8 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл N,N-диметилформамида. Добавляют триэтиламин 147 мг (1,46 ммоль), 322 мг функциональных небольших молекул (LG-2) (0,61 ммоль). После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 6 часов, концентрируют часть N,N-диметилформамида. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Затем это белое твердое вещество растворяют в 50 мл 20% раствора трифторуксусная кислота/дихлорметан. После перемешивания при комнатной температуре в течение 30 минут часть растворителя концентрируют при пониженном давлении. Добавляют 200 мл простого эфира к остатку, его помещают в морозильник на 2 часа и затем центрифугируют. Белое твердое вещество получают путем вакуумной сушки. Белое твердое вещество подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии, с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-008: 1,3 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 43%).

Пример 12: Получение НН-ЭПО-008С

Растворяют циклический пептид SEQ ID NO:8 3,0 г (1,22 ммоль) в 150 мл 20 ммоль буфера уксусной кислоты (рН 5,0), и затем добавляют 165 мг функциональных небольших молекул (LG-1) (0,61 ммоль) и 10 мл ацетонитрила. После перемешивания реакционной смеси при комнатной температуре в течение 30 минут реакционный раствор подвергают препаративной очистке путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-008А:

0,8 г получают путем лиофилизации (Выход: 27%).

Пример 13: Получение НН-ЭПО-018

Растворяют 0,5 г НН-ЭПО-008 (0,98 ммоль) в 100 мл N,N-диметилформамида, добавляют триэтиламин 39,6 мг (0,196 ммоль), 3,8 г mPEG₂-OSU(40K) (0,96 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакционный раствор помещают непосредственно в 600 мл охлажденного простого эфира. Твердое вещество осаждается. После помещения в морозильник на 2 часа его центрифугируют и неочищенное НН-ЭПО-018 получают путем вакуумной сушки. Неочищенный НН-ЭПО-018 очищают путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-0018; 1,8 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 47%).

Пример 14: Получение НН-ЭПО-018А

Растворяют 0,5 г НН-ЭПО-008 (0,98 ммоль) в 100 мл N,N-диметилформамида, добавляют триэтиламин 39,6 мг (0,196 ммоль), 3,8 г mPEG₂-OSU(40K) (0,96 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакционный раствор помещают непосредственно в 600 мл охлажденного простого эфира. Твердое вещество осаждается. После помещения в морозильник на 2 часа его центрифугируют и неочищенное НН-ЭПО-018 получают путем вакуумной сушки. Неочищенный НН-ЭПО-018 очищают путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-0018А: 1,5 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 39%).

Пример 15: Получение НН-ЭПО-018В

Растворяют 0,5 г НН-ЭПО-008 (0,98 ммоль) в 100 мл N,N-диметилформамида, добавляют триэтиламин 39,6 мг (0,196 ммоль), 3,8 г mPEG₂-OSU(40K) (0,96 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакционный раствор помещают непосредственно в 600 мл охлажденного простого эфира. Твердое вещество осаждается. После помещения в морозильник на 2 часа его центрифугируют и неочищенное НН-ЭПО-018 получают путем вакуумной сушки. Неочищенный НН-ЭПО-018 очищают путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-0018: 1,7 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 45%).

Пример 16: Получение НН-ЭПО-018С

Растворяют 0,5 г НН-ЭПО-008 (0,98 ммоль) в 100 мл N,N-диметилформамида, добавляют триэтиламин 39,6 мг (0,196 ммоль), 3,8 г mPEG₂-OSU(40K) (0,96 ммоль). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 6 часов. Реакционный раствор помещают непосредственно в 600 мл охлажденного простого эфира. Твердое вещество осаждается. После помещения в морозильник на 2 часа его центрифугируют и неочищенное НН-ЭПО-018 получают путем вакуумной сушки. Неочищенный НН-ЭПО-018 очищают путем обращенно-фазовой хроматографии с использованием связанного с октадецилсиланом силикагеля в качестве наполнителя колонки (Waters SymmetryShield™ RP18 3,5µm, 4,6*100 мм), где температура колонки составляет 60°С и длина волны для детекции составляет 214 нм; воду (содержащую 0,05% трифторуксусную кислоту) и ацетонитрил (содержащий 0,05% трифторуксусную кислоту) в различных пропорциях используют в качестве подвижной фазы. Желаемые фракции комбинируют и собирают. После отгонки большей части ацетонитрила при пониженном давлении НН-ЭПО-0018: 1,4 г получают путем лиофилизации (Выход составляет приблизительно 37%).

Пример 17: Действия пептидных производных - миметиков ЭПО на мышей

Задача этого эксперимента

Оценить и сравнить действия пептидных производных - миметиков ЭПО и белка ЭПО на эритропоэз у мышей.

Материалы и способы

Пептидные производные - миметики ЭПО, включающие НН-ЭПО-001, НН-ЭПО-002, НН-ЭПО-003, НН-ЭПО-004, НН-ЭПО-005, НН-ЭПО-006, НН-ЭПО-007, НН-ЭПО-008, НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-016, НН-ЭПО-017 и НН-ЭПО-018 предоставлены Jiangsu Hansoh Pharmaceutical со.,LTD. ЭПО приобретали в Shenyang Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd. Мыши Kunming, приобретенные в Chinese Academy of Sciences Shanghai Experimental Animal Center, имели массу 25-30 г, ♀. Количество животных в каждой группе составляло 10.

Мышам подкожно инъецировали пептидные производные - миметики ЭПО и белок ЭПО в течение трех последующих суток. Затем мышей умерщвляли, цельную кровь отбирали для подсчета периферических клеток крови и ретикулоцитов. Подсчет клеток крови осуществляли с использованием автоматических счетчиков клеток крови.

Результаты и обсуждение

В соответствии с данной схемой введения доз, как пептидные производные - миметики ЭПО, так и белок ЭПО могут значительно способствовать увеличению количества ретикулоцитов в периферической крови мышей, что свидетельствует о том, что они стимулируют эритропоэз (Смотри Таблицу 1). В качестве сравнения в Таблице 1 также приведены данные об активности соединения последовательности SEQ ID NO:599, известного из WO 2006/062685. Пептидные производные - миметики ЭПО и белок ЭПО не оказывают существенного влияния на количество зрелых эритроцитов, гематокрит клеток крови, содержание гемоглобина (Смотри Таблицу 2) и также не оказывают существенного влияния на количество лейкоцитов периферической крови (Смотри Таблицу 3).

Пример 18: Действия пептидных производных - миметиков ЭПО на макак

Задача данного эксперимента

Оценить действия пептидных производных - миметиков ЭПО на эритропоэз у макак.

Материалы и способы

Пептидные производные - миметики ЭПО НН-ЭПО-018 предоставлены Jiangsu Hansoh Pharmaceutical со.,LTD. ЭПО приобретенными в Shenyang Sansheng Pharmaceutical Co., Ltd. Их разбавляли в физиологическом растворе, содержащем 0,1% BSA (БСА - бычий сывороточный альбумин) перед применением.

Макак, имеющих массу 5,5-8,5 кг, самцов или самок, приобретали в Suzhou Xishan Zhongke Laboratory Animal Center. Макак группировали на основе содержания гемоглобина в каждой из групп по три макаки. НН-ЭПО-018 1,35 мг/кг однократно инъецировали внутривенно; ЭПО 240 мкг/кг, трижды/неделю, непрерывное введение на протяжении пяти недель. Измеряли гематологические индексы 1-2 раза в неделю.

Результаты и обсуждение

Разовая внутривенная инъекция НН-ЭПО-018 макакам приводит к увеличению содержания гемоглобина в периферической крови, увеличению гематокрита клеток крови, свидетельствуя о том, что НН-ЭПО-018 стимулирует эритропоэз. Стимуляция максимальна через 35 суток после введения и затем медленно уменьшается. Стимулирующее действие на гемоглобин составляет 33%. В качестве положительного контроля ЭПО также обеспечивал то же самое увеличение содержания гемоглобина в периферической крови макак и гематокрит клеток крови, и его действия уменьшались после прекращения введения лекарственного средства. В соответствии с настоящей схемой введения доз стимуляция НН-ЭПО-018 и ЭПО на продукцию гемоглобина у макак является значительной (смотри Фиг.1, 2).

Пример 19: Оценка и сравнение действий пептидных производных - миметиков ЭПО НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-018, НН-ЭПО-018 В и положительного контроля AF37702 на мышей.

Материалы и способы

НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-018, НН-ЭПО-018 В и AF37702 предоставлены Jiangsu Hansoh Pharmaceutical со., LTD, где AF37702 также представляет собой пептидное производное - миметик ЭПО, производимый Affymax (торговое название: Hematide). Образец готовили в физиологическом растворе, содержащем 0,1% BSA перед применением. Kunming, приобретенные в Chinese Academy of Sciences Shanghai Experimental Animal Center, имели массу 25-30 г, ♀. Количество животных в каждой группе составляло 10. После адаптации животным подкожно инъецировали НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-018, НН-ЭПО-018 В, AF37702. Мышей умерщвляли на шестые сутки после первой дозы, цельную кровь отбирали для подсчета периферических клеток крови и ретикулоцитов. Подсчет клеток крови осуществляли с использованием автоматических счетчиков клеток крови ADVIA.

Результаты и обсуждение

Разовая подкожная инъекция каждого из НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-018, НН-ЭПО-018В, AF37702 значительно увеличивала процентную долю и количество ретикулоцитов в периферической крови мышей; где действия НН-ЭПО-018В были относительно сильными; действия НН-ЭПО-018, AF37702 следовали далее; действия НН-ЭПО-015 самыми слабыми; действия НН-ЭПО-018 и AF37702 почти равными (смотри Таблицу 4). НН-ЭПО-015, НН-ЭПО-018, НН-ЭПО-018В и AF37702 увеличивали гематокрит периферической крови мышей, содержание гемоглобина. Их действия были почти равными, но они не оказывали значительного действия на количество эритроцитов в периферической крови (Смотри Таблицу 5).

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к получению пептидного производного - миметика ЭПО, имеющего формулу (I):

и его фармацевтических солей, где R₁, R₅ выбраны из циклических пептидов, имеющих последовательности SEQ ID NO:5, 6, 7 и 8; n₁, n₂ представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10; R₂, R₄ выбраны из -СО или -CH₂; R₃ выбран из О, S, CH₂, N(CH₂)_n3NHR₆, NCO(CH₂)_n4NHR₆, CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, CHSCON(CH₂)_n5NHR₆ или CHNHCON(CH₂)_n5NHR₆; где n₃ представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n₄ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₅ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₆ выбран из Н или производных метоксиполиэтиленгликоля. Полученный пептид или его фармацевтически приемлемую соль используют в составе фармацевтической композиции для лечения расстройств, характеризующихся недостаточностью ЭПО, низкой или дефектной популяцией эритроцитов. Изобретение позволяет получить агонист рецептора ЭПО, обладающий повышенной биологической активностью по сравнению с уже существующими миметиками ЭПО. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 2 ил., 5 табл., 19 пр.

1. Пептидное производное - миметик эритропоэтина (ЭПО) общей формулы (I) и его фармацевтически приемлемые соли,

где R₁, R₅ выбраны из циклических пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No:5, 6, 7 и 8:

n₁, n₂ представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10; R₂, R₄ выбраны из -СО или -СН₂; R₃ выбран из О, S, CH₂, N(CH₂)_n3NHR₆, NCO(CH₂)_n4NHR₆, CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, CHSCON(CH₂)_n5NHR₆ или CHNHCON(CH₂)_n5NHR₆; где n₃ представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n₄ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₅ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₆ выбран из Н или производных метоксиполиэтиленгликоля.

2. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.1 и его фармацевтически приемлемые соли, где N-концы R₁, R₅ ацетилированы.

3. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.1 или 2 и его фармацевтически приемлемые соли, где R₁, R₅ представляют собой циклический пептид, циклизованный с помощью дисульфидных связей.

4. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.1 или 2 и его фармацевтически приемлемые соли, где указанный пептид-миметик ЭПО выбран из следующего пептида, где
n₁, n₂ равны 2, R₂, R₄ представляют собой -СО, R₃ представляет собой СНОСОNН(СН₂)_n5NНR₆, n₅ равно 2;
n₁, n₂ равны 1, R₂, R₄ представляют собой -СО, R₃ представляет собой NСО(СН₂)_n4NНR₆, n₄ равно 2;
n₁, n₂ равны 2, R₂, R₄ представляют собой -СН₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, n₅ равно 2; или
n₁, n₂ равны 1, R₂, R₄ представляют собой -СН₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, n₄ равно 2.

5. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.1 или 2 и его фармацевтически приемлемые соли, отличающиеся тем, что R₆ представляет собой Н.

6. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.1 или 2 и его фармацевтически приемлемые соли, где R₆ представляет собой производные метоксиполиэтиленгликоля и где молекулярная масса производных метоксиполиэтиленгликоля предпочтительно выбрана из диапазона 5000-100000 Да (дальтон).

7. Пептидное производное - миметик ЭПО по п.6 и его фармацевтически приемлемые соли, где структура производных метоксиполиэтиленгликоля выбрана из разветвленных или линейных производных, предпочтительно из производных метоксиполиэтиленгликоля линейной структуры и имеющих молекулярную массу 20000 Да, или производных метоксиполиэтиленгликоля с разветвленной структурой и молекулярной массой 40000 Да.

8. Пептидное производное - миметик ЭПО по любому из пп.1, 2 или 7 и его фармацевтически приемлемые соли, где:
n₁, n₂ равны 2, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID No:5 - SEQ ID No:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, где n₅ представляет собой целое число, выбранное из 2-10; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее линейную структуру и молекулярную массу 20000 Да;
n₁, n₂ равны 1, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID No:5 - SEQ ID No:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, где n₄ представляет собой целое число, выбранное из 2-10; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее линейную структуру и молекулярную массу 20000 Да;
n₁, n₂ равны 2, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID No:5 - SEQ ID No:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой CHOCONH(CH₂)_n5NHR₆, где n₅ представляет собой целое число, выбранное из 2-10; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее разветвленную структуру и молекулярную массу 40000 Да; или
n₁, n₂ равны 1, R₁, R₅ выбраны из SEQ ID No:5 - SEQ ID No:8, R₂, R₄ выбраны из -СО, -СН₂, R₃ представляет собой NCO(CH₂)_n4NHR₆, где n₄ представляет собой целое число, выбранное из 2-10; R₆ представляет собой производное метоксиполиэтиленгликоля, имеющее разветвленную структуру и молекулярную массу 40000 Да.

9. Пептидное производное - миметик ЭПО по любому из пп.1, 2 или 7 и его фармацевтически приемлемые соли, где указанное пептидное производное - миметик ЭПО и его фармацевтически приемлемые соли представляют собой:



.

10. Способ получения пептидного производного - миметика ЭПО по любому из пп.1-9 и его фармацевтически приемлемых солей, включающий:
(1) получение R₁H, R₅H, где R₁, R₅ выбраны из циклических пептидов, имеющих последовательности SEQ ID No:5, 6, 7 и 8,
(2) получение функциональной небольшой молекулы общей формулы (II)

где n₁, n₂ представляют собой целые числа, независимо выбранные из 0-10;
R₇, R₈ выбраны из ОН или Н;
Z₂ выбран из О, S, CH₂, N(CH₂)_n6NHR₉, NCO(CH₂)_n7NHR₉, CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉, CHSCON(CH₂)_n8NHR₉ или CHNHCON(CH₂)_n8NHR₉, где n₆ представляет собой целое число, выбранное из 1-10, n₇ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₈ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₉ выбран из Воc (трет-бутоксикарбонила) или Cbz (карбамазепина),
(3) взаимодействие R₁, R₅ с функциональной небольшой молекулой формулы (II) путем амидирования или восстановительного аминирования с получением соединения формулы (III):

где R₂, R₄ независимо выбраны из -СО или -CH₂,
(4) проведение реакции амидирования с активным метоксиполиэтиленгликолем после удаления Воc или Cbz.

11. Способ получения по п.10, отличающийся тем, что в указанной общей формуле (II)
n₁, n₂ равны 1 или 2, R₇, R₈ представляют собой ОН, Z₂ выбран из NCO(CH₂)_n7NHR₉ или CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉, n₇ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₈ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₉ представляет собой Воc; или
n₁, n₂ равны 1 или 2, R₇, R₈ представляют собой Н, Z₂ выбран из NCO(CH₂)_n7NHR₉ или CHOCONH(CH₂)_n8NHR₉, n₇ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, n₈ представляет собой целое число, выбранное из 2-10, R₉ представляет собой Воc.

12. Фармацевтическая композиция для лечения расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной или дефектной популяцией эритроцитов, содержащая:
(1) терапевтически эффективное количество пептидного производного - миметика ЭПО по любому из пп.1-9 или его фармацевтически приемлемых солей, и
(2) фармацевтически приемлемые носители.

13. Применение пептидного производного - миметика ЭПО по любому из пп.1-9 или его фармацевтически приемлемых солей в изготовлении лекарственного средства для лечения расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной, или дефектной группой эритроцитов.

14. Применение фармацевтической композиции по п.12 для изготовления лекарственного средства для лечения расстройств, характеризующихся низким уровнем ЭПО или недостаточной, или дефектной группой эритроцитов.

15. Применение по п.13 или 14, где указанные расстройства, характеризующиеся низким уровнем ЭПО или недостаточной, или дефектной группой эритроцитов, представляют собой прогрессирующую почечную недостаточность или диализ; анемию, связанную со СПИДом (синдромом приобретенного иммунодефицита), аутоиммунные заболевания или злокачественную опухоль; кистозный фиброз; анемию при недоношенности; анемию, связанную с хроническим воспалительным заболеванием; повреждение спинного мозга; острую потерю крови; старение и рак, сопровождающийся аномальной продукцией эритроцитов.