АТТЕНУИРОВАННЫЙ ШТАММ "КЭМ-7" ВИРУСА ОСПЫ КУР Fowlpox virus ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПРЕПАРАТОВ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ И ДИАГНОСТИКИ ОСПЫ ПТИЦ Российский патент 2013 года по МПК C12N7/00 A61K39/275 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности, к получению нового штамма вируса оспы кур, который пригоден для изготовления средств диагностики и специфической профилактики оспы птиц.

Оспа птиц - контагиозная, медленно распространяющаяся вирусная болезнь птиц, которая характеризуется образованием локализованных пролиферативно-некротических поражений на коже и дифтеритического воспаления слизистой оболочки ротовой полости, верхних дыхательных путей и конъюнктивы глаз [1, 2]. Болезнь распространена по всему миру, в том числе и в РФ, и наносит существенный экономический ущерб птицеводческим хозяйствам в связи со снижением яйценоскости, замедлением роста птиц, повышением смертности и вынужденным убоем [3, 4, 5, 6, 7, 8].

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), вирус оспы птиц относится к роду Avipoxvirus, семейства Poxviridae.

Основным способом борьбы с этим заболеванием является специфическая профилактика. С этой целью применяют живые вакцины на основе аттенуированных штаммов вируса.

Известен штамм «НР-В», на основе которого готовится импортная коммерческая противооспенная вакцина [9].

Известен штамм «Gibbs», который входит в состав ассоциированной вакцины против инфекционного энцефаломиелита птиц и оспы [10]. Однако на территории РФ данные импортные препараты имеют высокую стоимость.

Известен штамм «ВГНКИ-3/7», используемый для изготовления отечественного варианта живой вакцины против оспы птиц [11]. Однако для культивирования данного штамма необходимо использование культуры клеток, что в данном случае рассматривается как усложнение технологии приготовления вакцины.

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является аттенуированный штамм «К» (прототип) вируса оспы кур, используемый для изготовления отечественной вирус-вакцины.

Недостатком штамма-прототипа также является необходимость использования для его культивирования клеточных культур [12, 13], что в свою очередь существенно усложняет технологический процесс изготовления на его основе вирус-вакцин.

В задачу создания настоящего изобретения входило получение нового штамма вируса оспы кур, обладающего аттенуированным фенотипом и высокой иммуногенной активностью, способного к культивированию на эмбрионах кур как на более технологически простой системе и обеспечивающего изготовление высокоиммуногенных и безвредных биопрепаратов для профилактики и диагностики оспы птиц.

Технический результат от использования предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала вакцинных штаммов вируса оспы кур, генетически аутентичных, безвредных, обладающих аттенуированным фенотипом и высокой иммуногенностью, способных к культивированию на эмбрионах кур как на более технологически простой системе, и пригодных для изготовления биопрепаратов специфической профилактики оспы птиц, тем самым, усиливая в данном аспекте биологическую безопасность государства.

Указанный технический результат достигнут получением штамма «КЭМ-7» (авторское наименование) вируса оспы кур.

Штамм «КЭМ-7» является вариантом вакцинного штамма «К» вируса оспы кур (ФГУ «ВГНКИ»), который был получен в 2005 г. в ФГУ «ВНИИЗЖ» путем многократных пассажей материнского вируса на развивающихся эмбрионах кур до стадии достижения стабильной величины накопления вируса в ткани ХАО.

Полученный штамм «КЭМ-7» депонирован 02 июня 2011 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - штамм «КЭМ-7» - ДЕП вируса оспы кур.

Генетическая аутентичность штамма.

Проводили генетическую идентификацию полученного вируса и сравнительный анализ последовательности ДНК генома. Использовали полимеразно-цепную реакцию (ПЦР) и секвенирование. Нуклеиновую кислоту выделяли из 0,1 мл суспензии вирусного материала с помощью набора с сорбентом NudeoS+ (ООО «БиоКом», г.Москва), согласно инструкции изготовителя. ПЦР проводили с праймерами на ген 241ext (Jarmin S.A., 2006).

Условия проведения ПЦР. В пробирку емкостью 0,5 мл вносили следующие компоненты: деионизованная вода (9 мкл), растворы праймеров (по 1,0 мкл), дНТФ (0,5 мкл), 25 мМ р-р хлорида магния (3,5 мкл), 5х буфер для ПЦР (5,0 мкл), Taq ДНК-полимераза (1-2 ед.), ДНК (исследуемый образец, 5 мкл).

Смесь переносили в амплификатор и проводили ПЦР при следующих режимах: 95°С - 5 мин, 30 циклов с параметрами: 95°С - 20 с, 58°С - 30 с, 72°С - 120 с, финальный прогрев 72°С - 5 мин. Далее проводили электрофорез ПЦР-фрагментов в геле 2% агарозы с последующей очисткой для определения нуклеотидной последовательности. Секвенирование очищенной кДНК осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, США).

Установленную структуру участка гена 241ext штамма «КЭМ-7» сравнивали с нуклеотидной последовательностью данного участка 5 коммерческих вакцинных штаммов вируса оспы кур, используемых для производства вакцин известными фирмами: «Diftosec» (Merial), «Nobilis» (Intervet), «HP-B» (Avinova), а также штаммов «К» и «ВГНКИ-3/7» (ОАО «ПЗБ»). Последовательности участка генома 241 ext штаммов «Diftosec» и «Nobilis» получены из базы данных GenBank ресурса EMBL он-лайн, а для штаммов «ВГНКИ-3/7», «HP-B» и «К» были установлены в ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Для анализа полученных последовательностей использовали программы BioEdit (версия 7.0, в свободном доступе на сайте http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html) и MEGA (версия 4, в свободном доступе на сайте http://www.megasoftware.net). Для построения филогенетического дерева применяли метод «ближайшего соседа» (neighbor-joining). Достоверность проверяли способом «бутстреп» (bootstrap) с 500 репликациями. Достоверным считали «бутстреп» индекс >60.

В результате сравнения полученной последовательности участка гена 241ext штамма «КЭМ-7» была построена дендрограмма (Фиг.1), отражающая отличия по этому гену данного штамма от других исследованных штаммов вируса оспы кур.

Анализ последовательности указанного гена показал, что геном полученного штамма «КЭМ-7» отличался от всех сопоставляемых штаммов на 2-13 нуклеотидных позиции (0,2-1,3% отличий), при этом генетически более близкими к штамму «КЭМ-7» оказались штаммы «НР-В», «К» и «Nobilis», для которых выявлены 1-2 нуклеотидных отличия (0,2%). Полученные данные позволяют считать штамм «КЭМ-7» генетически аутентичным.

Штамм «КЭМ-7» вируса оспы кур характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм «КЭМ-7» вируса оспы кур относится к семейству Poxviridae, роду Avipoxvirus и обладает морфологическими признаками, характерными для возбудителя вируса оспы кур: вирион кирпичеобразной формы с проекционными размерами приблизительно 330×280×200 нм имеет суперкапсидную оболочку. Геном вируса представлен молекулой ДНК длиной 288 тысяч пар нуклеотидов, который содержит более 250 генов.

Культуральные свойства штамма.

Использовали развивающиеся эмбрионы кур международной категории SPF (Specific Pathogen Free). Эмбрионы заражали осветленной фильтрованием вируссодержащей суспензией ткани хориоаллантоисной оболочки (ХАО) в дозе 3 Ig ЭИД₅₀/0,2 см³. Определяли параметры культивирования: возраст эмбрионов, способ заражения, место локализации вируса. Критерием оценки являлась величина инфекционного титра в экстраэмбриональной жидкости (ЭЭЖ), в суспензии ткани тела эмбриона и ткани ХАО. Результаты представлены в таблице 1.

Результаты, приведенные в таблице 1, указывают на то, что для культивирования штамма «КЭМ-7» необходимо использовать эмбрионы в возрасте от 7 до 10 суток, которые следует заражать на ХАО. При этом продолжительность культивирования должна составлять от 4 до 5 суток. В качестве вирусного сырья использовать ткань ХАО, где возбудитель накапливается в титре 6,3±0,18 Ig ЭИД₅₀/см³.

Характеристика вирусного материала.

Относящийся к семейству Poxviridae, вирус штамма «КЭМ-7» может находиться внутри инфицированных клеток ХАО, имеющих размеры 30÷100 мкл. Следовательно, для получения корпускулярного вируса требуется разрушение клеточных структур путем высокой степени дезинтеграции указанной ткани.

В таблице 2 приведена характеристика необходимой дисперсности тканевой взвеси, получаемой после осветления гомогената ткани вируссодержащих ХАО.

Данные, приведенные в таблице 2, демонстрируют, что все наблюдаемое представительство тканевых элементов суспензии имеет проекционные размеры менее 20 мкм (средневзвешенная оценка диаметра частиц составила величину 5,76 мкм). Таким образом, большинство клеток ткани ХАО являются разрушенными и основная масса вируса не ограничена клеточными стенками. Данный тип вирусного материала использовали для исследований иммунобиологических свойств штамма «КЭМ-7». При этом для работы на эмбрионах необходимые разведения материала выполняли на физиологическом растворе, для работы на птице материал разбавляли физиологическим раствором с добавлением 40% глицерина.

Сущность предлагаемого изобретения поясняется следующими графическими материалами:

Фиг.1 - Дендрограмма, отражающая отличия штамма «КЭМ-7» по последовательности участка гена 241ext от вакцинных штаммов вируса оспы кур «Diftosec», «Nobilis», «НР-В», «К» и «ВГНКИ-3/7»;

Фиг.2 - Диаграмма значений долей защищенных птиц (с) соответственно испытанным прививным дозам вируса (IgD) через 21÷28 суток после вакцинации; пунктиром показан график зависимости исследуемых параметров, построенный по регрессионному уравнению вида "c=f["y=1,21(IgD)-0,25];

Фиг.3 - Диаграмма распределения долей защищенных птиц (с) в подопытных группах соответственно времени после вакцинации.

Сущность предлагаемого изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Инфекционность штамма.

В параллельных экспериментах определяли соотношение инфекционных титров вируса, установленных для 25-45-суточных цыплят методом интрадермальной прививки в перепонку крыла (Ig ИД₅₀/см³) и для СПФ-эмбрионов путем введения инфицирующей жидкости на ХАО (Ig ЭИД₅₀/см³). В экспериментах были использованы вируссодержащие материалы различной биологической активности. Соответствующие результаты приведены в таблице 3.

Было установлено, что соотношение титров данного варианта вируса для кур и СПФ-эмбрионов составило среднюю логарифмическую разность Δ±m=1,0065±0,081, которая находилась в границах доверительного интервала [0,828÷1,185]p≤0,05. Развивающиеся СПФ-эмбрионы были приняты как референтная тест-система для оценки инфекционной активности вируса штамма «КЭМ-7».

Пример 2.

Безвредность вируса для птиц.

Проводили оценку воздействия различных доз вируса на физиологическое состояние птиц. Цыплятам в возрасте старше 25 суток инъецировали интрадермально вирусный материал в дозах 0÷3,7 Ig ИД₅₀. Результаты клинических наблюдений представлены в таблице 4.

Результаты, представленные в таблице 4, показывают, что инъекция вируса штамма «КЭМ-7» в диапазоне доз (1≤D≤3,7) IgИД₅₀ не обусловила каких-либо изменений в общем состоянии птиц. Величина прививной дозы в определенной степени влияла на время проявления, продолжительность и интенсивность местной воспалительной реакции. Однако ни при какой из испытанных доз образование вторичных воспалительных процессов отмечено не было, т.е. исследуемый штамм генерализации инфекционного процесса не проявил. Полученные результаты подтверждают умеренную реактогенность и безвредность штамма для кур.

Пример 3.

Иммунизирующая доза вируса, обеспечивающая защиту 95% привитых птиц (ИмД₉₅).

Оценивали напряженность протективного иммунитета птиц в зависимости от прививной дозы штамма «КЭМ-7». С этой целью группы цыплят (5≤n≤12) были вакцинированы различными прививными дозами (-1,22÷2,09 IgИД₅₀) интрадермально в перепонку крыла. Через 21÷28 суток после вакцинации птицам провели интрадермальную инъекцию вирулентного штамма «Кучинский» вируса оспы кур в дозе 3 Ig ИД₅₀ в крыло, противоположное тому, в которое была ранее сделана прививка. Птицу считали защищенной, если воспалительная реакция на месте инъекции вирулентного штамма отсутствовала.

Для заданных прививных доз (D) определяли долю защищенных птиц в группе (с). Полученные величины с преобразовывали в табличные пробит-эквиваленты (y=f(c)) для построения линейной модели вида "y=y₀+k(IgD), где "y - прогнозируемый пробит-эквивалент с для заданной величины IgD. На основании построенной модели определяли прогнозируемую величину прививной дозы, гарантирующую защиту 95% иммунизированных птиц. Далее по таблице производили обратное преобразование по типу "c=f("y). Полученные результаты в графическом виде представлены виде диаграммы (Фиг.2).

Проведенный анализ системы «прививная доза → протективный эффект» позволил определить, что для защиты 95% иммунизированной птицы необходима доза вакцинного вируса в размере IgD₉₅=1,567IgИД₅₀ (или D₉₅=37 ИД₅₀). Учитывая статистические характеристики исследуемой системы и ориентируясь на более осторожный прогноз, в качестве гарантирующей протективной дозы приняли верхнюю границу соответствующего доверительного интервала (р≤0,05), которая составила приближенную величину IgD⁺ ₉₅=2 IgИД₅₀ (или D⁺ ₉₅=100 ИД₅₀), что соответствует 3 IgЭИД₅₀ или 10³ ЭИД₅₀.

Пример 4.

Динамика напряженности иммунитета у цыплят, вакцинированных штаммом.

Оценивали напряженность иммунитета через заданные интервалы времени в группах птиц (n≥8), вакцинированных в дозе 3 Ig ЭИД₅₀/0,004 см³. С этой целью использовали повторную прививку штамма «КЭМ-7» в той же дозе, выполненной в противоположное крыло на 3, 5, 7, 14, 21, 30, 60, 120, 200, 270 и 360 сутки после вакцинации. Отсутствие воспалительной реакции на повторную прививку свидетельствовало о наличии иммунной защиты у птицы. В подопытных группах определяли доли защищенных птиц. На основании полученных данных построили диаграмму (Фиг.3).

Приведенные на диаграмме результаты иллюстрируют, что протективная фаза иммунитета наступает на 14 сутки после иммунизации. Далее происходит плавное снижение напряженности иммунитета. В продолжение эксперимента (360 суток) показатель напряженности иммунитета превышал значение 0,8, что указывает на высокую иммуногенность штамма «КЭМ-7».

Пример 5.

Устойчивость аттенуированного фенотипа вируса при пассажах в системе культивирования.

Провели 8 пассажей штамма «КЭМ-7» на развивающихся СПФ-эмбрионах кур. В качестве вирусного материала использовали осветленный высокодисперсный гомогенат ХАО. Для каждого четного пассажа определяли следующие иммунобиологические показатели: инфекционный титр (IgЭИД₅₀/см³), иммуногенное действие вируса в дозе 3 IgЭИД₅₀/0,004 см³ (по исключению местной воспалительной реакции при контрольном заражении через 21 сутки после вакцинации); безвредность вируса в дозе 3,7 IgИД₅₀/0,004 см³ (по исключению эффекта генерализации). Полученные результаты представлены в таблице 5.

Приведенные в таблице 5 результаты показывают, что вирусная популяция штамма «КЭМ-7» в течение 8 пассажей, проведенных на СПФ-эмбрионах кур, по изученным признакам не показала видимых изменений своего фенотипа. Установленные соответственно пассажам величины инфекционных титров, характеризующие накопление вируса в данной системе культивирования, существенных различий не имели.

Пример 6.

Устойчивость аттенуированного фенотипа штамма при пассажах на птице.

Провели шесть последовательных пассажей штамма «КЭМ-7» на цыплятах путем интрадермальных инъекций в перепонку крыла. Для каждого пассажа образовывали группу цыплят в возрасте 30-45 суток (n≥6), которых на 7 сутки после прививки подвергали эвтаназии и отбирали пробы дермы, имеющей признаки воспаления с места инъекции вируссодержащего препарата. Из полученных образцов ткани готовили 10%-ную суспензию, которую использовали для следующего пассажа.

В группе цыплят 6 пассажа в течение 28 суток проводили клинический контроль. Установили, что на 7 сутки после введения препарата развивалась обычная для данного вакцинного штамма картина местного воспалительного процесса, где присутствовали стадии розеолы, папулы, крусты. Признаки угнетения, отказа от корма у подопытных птиц отсутствовали. Диаметр очага воспаления находился в диапазоне от 8 до 17 мм. Признаков генерализации инфекции (возникновение вторичных очагов воспаления) не отмечено. Был сделан вывод, что фенотип вакцинного штамма «КЭМ-7» при пассажах на естественно восприимчивых объектах по совокупности исследованных признаков изменений не претерпел.

Пример 7.

Сравнение иммунологического действия двух штаммов «КЭМ-7» и «Gibbs» (в составе вакцины «Нобилис АЕ+РОХ», «Интервет»).

Использовали 50 голов цыплят 30-суточного возраста, которых разделили на 3 группы. Цыплят первой группы (20 голов) вакцинировали штаммом «КЭМ-7» интрадермально в дозе 3 Ig ЭИД₅₀. Цыплят второй группы (20 голов) привили препаратом «Нобилис АЕ+РОХ» согласно инструкции. У цыплят первой и второй группы через 5-7 суток на месте прививки наблюдали воспалительную реакцию, характерную для вакцин против оспы. Цыплята третьей группы служили в качестве контроля. На 21 сутки после вакцинации в обеих опытных группах десяти цыплятам в противоположное крыло провели повторную гомологичную прививку. Остальных десять цыплят в каждой подопытной группе, а также в контрольной, инфицировали в дозе 10³ ИД₅₀ полевым изолятом вируса оспы кур, выделенным из патологического материала, присланного в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (первый пассаж на эмбрионах кур). За птицей установили ежедневный клинический контроль. Птицу считали защищенной, если воспалительная реакция на месте повторной прививки или инъекции вирулентного штамма отсутствовала. В подопытных группах определяли долю защищенных птиц, в контрольной группе оценивали заболеваемость. Результаты проведенных исследований представлены в таблице 6.

Результаты, приведенные в таблице 6, демонстрируют, что напряженность иммунитета у птиц на штамм «КЭМ-7» и «Gibbs» была одинаковой как при оценке путем повторной гомологичной прививки, так и при контрольном заражении патогенным полевым изолятом. Все цыплята подопытных групп имели протективный уровень иммунитета. При этом все цыплята контрольной группы в той или иной степени демонстрировали развитие инфекционного процесса.

Проведенный эксперимент показал, что по изученным признакам иммунный ответ птицы на прививку штамма «КЭМ-7» не уступает иммунной реакции, индуцированной штаммом «Gibbs», входящим в состав коммерческого препарата «Нобилис АЕ+РОХ», «Интервет».

Пример 8.

Клинические исследования эмбрион-вакцины против оспы птиц из штамма «КЭМ-7» с разбавителем.

На основе штамма «КЭМ-7» был изготовлен препарат «Эмбрион-вакцина против оспы птиц из штамма «КЭМ-7» с разбавителем».

Препарат состоит из сухого компонента (эмбрион-вакцина), который представляет собой лиофилизированный гомогенат ткани ХАО, содержащий вирус оспы кур штамм «КЭМ-7», и жидкого компонента (разбавителя) - изотонического фосфатно-буферного раствора с добавлением глицерина.

Клинические исследования препарата «Эмбрион-вакцина против оспы птиц из штамма «КЭМ-7» с разбавителем» проводили в хозяйствах ЗАО «Белгородский бройлер» (Белгородская область) и ЗАО «Птицефабрика Александровская» (Владимирская область).

Препарат применяли однократно методом внутрикожной инъекции в перепонку крыла с помощью двухигольного инъектора в соответствии с прилагаемой инструкцией. На протяжении 21 суток после прививки за птицей вели клиническое наблюдение.

На предприятии ЗАО «Белгородский бройлер» было привито 38923 кур кросса «F15» в возрасте 70 суток. Полученные результаты клинического исследования препарата представлены в таблице 7.

На предприятии ЗАО «Птицефабрика Александровская» было привито 241215 кур-несушек в возрасте 250-807 суток.

Препарат оценивали по следующим показателям:

1. Оценка эффективности вакцинации. Показателем результативности прививки (приживления вируса) являлась воспалительная реакция на месте инъекции. Определяли представительство (процент) птицы с поствакцинальной реакцией. Соответствующие результаты представлены в таблице 8. Критерием эффективности вакцинации (наличие поствакцинального иммунитета) считали отсутствие местной воспалительной реакции у птиц после вторичной прививки препарата, проведенной в противоположное крыло через 21-67 суток после первой вакцинации. С этой целью в каждом цехе выделяли группу вакцинированных птиц в количестве 40-70 голов, которым производили повторную прививку и в течение 10 суток вели клиническое наблюдение. Определяли процент иммунных птиц. Полученные результаты по оценке эффективности вакцинации представлены в таблице 8.

В вакцинированном поголовье иммунная птица составила 100%. Эмбрион-вакцина является иммуногенной.

2. Оценка сохранности и продуктивности птицепоголовья. Сопоставили показатели продуктивности птиц и сохранности (яйценоскость и среднесуточный падеж за 7 суток) до и после проведения вакцинации. Полученные результаты представлены в таблице 9.

Данные, представленные в таблице 9, демонстрируют, что применение эмбрион-вакцины не оказывает выраженного влияния на показатели сохранности и продуктивности иммунизированного птицепоголовья.

На основании результатов проведенных клинических исследований препарата в ЗАО «Птицефабрика Александровская» и в ЗАО «Белгородский бройлер» установлено, что приготовленная эмбрион-вакцина на основе штамма «КЭМ-7» вируса оспы кур является безвредной и иммуногенной. Применение данного препарата не повлияло на показатели сохранности и продуктивности вакцинированного птицепоголовья.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на изобретение «Аттенуированный штамм «КЭМ-7» вируса оспы кур Fowlpox virus для изготовления препаратов специфической профилактики и диагностики оспы птиц»:

Таблица 1 Накопление вируса оспы кур штамма «КЭМ-7» (титр, Ig ЭИД₅₀/см³) в разных частях эмбрионов соответственно их возрасту и способу заражения Способ заражения Тестируемый материал Возраст эмбрионов, сутки 5 7 9 11 в аллантоисную полость ЭЭЖ 5,25±0,31* 5,0±0,18 5,3±0,30 5,1±0,28 тушка эмбриона 4,35±0,26 5,17±0,23 5,2±0,18 4,0±0,23 ХАО 5,1±0,31 5,6±0,26 6,1±0,30 5,8±0,26 на ХАО ЭЭЖ 3,5±0,18 5,0±0,11 5,2±0,18 4,7±0,23 тушка эмбриона 5,3±0.24 4,9±0,31 4,7±0,21 3,9±0,28 ХАО 5,3±0,21 6,2±0,20 6,3±0,18 6,2±0,18 Примечание: * - даны средние величины титров (n=3) и их стандартные ошибки (±m)

Таблица 2 Состав осветленной фильтрованием суспензии ткани ХАО СПФ-эмбрионов, инфицированных вирусом оспы кур штамма «КЭМ-7» Распределение частоты встречаемости соответственно линейному диаметру частиц* Накопительный процент Размеры, мкм 10,00 2,092 20,00 4,18 30.00 4,80 40,00 5,21 50,00 5,76 60,00 7,80 70,00 14,12 80,00 15,90 90,00 17,65 95,00 18,97 Примечание: * - Passing (%) - кумулята частоты встречаемости; Channel (%) - частота встречаемости соответственно классам; Size - размеры частиц в микрометрах.

Таблица 3 Соотношение инфекционных титров вируса штамм «КЭМ-7», установленных на цыплятах (IgИД₅₀/см³) и СПФ-эмбрионах кур (IgЭИД₅₀/см³) Номер опыта Величина титра Δ=IgT₂-IgT₁ IgИД₅₀/см³ (IgT₁) IgЭИД₅₀/см³ (IgT₂) 1 5,89 6,92 1,03 2 4,14 5,33 1,19 3 4,56 5,76 1,2 4 5,89 6,83 0,94 5 5,49 6,59 1,1 6 3,81 4,6 0,79 7 5,89 6,48 0,59 8 4,06 5,36 1,3 9 6,03 7,02 0,99 10 6,19 6,72 0,53 11 4,32 5,82 1,5 12 4,88 5,82 0,94 Средняя оценка (Δ±m) 1,0065±0,081

Таблица 4 Результаты клинических наблюдений птиц, привитых различными дозами штамма «КЭМ-7» Клинические признаки Прививная доза (D, IgИД₅₀/0,004 см³) 0≤D<1 1≤D<2 2≤D<3 3≤D≤3,7 угнетение, отказ от корма -* - - - начало воспалительной реакции (сут) 7-12** 6-8 5-6 4-5 завершение воспалительной реакции (сут) 10-16 9-16 11-18 14-20 диаметр очага воспаления, (мм) 2-3 2-4 8-10 8-12 генерализация инфекции - - - - Примечание: * - признак отсутствует; ** - даны минимальные и максимальные показатели по группе

Таблица 5 Иммунологические показатели штамма «КЭМ-7» соответственно пассажам на развивающихся СПФ-эмбрионах кур № пассажа Инфекционный титр, IgЭИД₅₀/см³ Иммуногенность** Реактогенность*** 2 6,08±0,13* 6/6 0/4 4 6,29±0,15 4/4 0/4 6 6,32±0,09 8/8 0/6 8 6,26±0,13 6/6 0/4 Примечание: * - дано среднее значение инфекционного титра (IgЭИД₅₀/см³) и его стандартная ошибка (n=3) в осветленном гомогенате ткани ХАО; ** - отсутствие местной воспалительной реакции при контрольном заражении вирусом оспы кур штамма «Кучинский» (3 Ig ЭИД₅₀ интрадермально) через 21 сут после вакцинации; *** - признаки генерализации инфекционного процесса, где: в числителе - количество заболевших, в знаменателе - общее число подопытных цыплят.

Таблица 6 Результаты сравнения иммунологического действия двух штаммов «КЭМ-7» и «Gibbs» (в составе вакцины «Нобилис АЕ+РОХ», «Интервет») Подопытные группы: Доля иммунных птиц способ оценки наличия иммунитета повторная прививка контрольное заражение группа 1: цыплята, привитые штаммом «КЭМ-7» 10/10* 10/10 группа 2: цыплята, привитые штаммом «Gibbs» 10/10 10/10 группа 3: контрольные цыплята н.и.** 0/10 Примечание: * - доля иммунных птиц (с=a/n, где: а - количество птиц без воспалительной реакции, n - объем группы); ** - данную позицию не исследовали.

Таблица 7 Результаты клинического исследования эмбрион-вакцины против оспы птиц из штамма «КЭМ-7» с разбавителем в ЗАО «Белгородский бройлер» Иммунобиологические показатели вакцины, их характеристики, нормы и фактические оценки Показатели Характеристики и нормы (ожидаемый результат) Оценка препарата Безвредность (исключение генерализации инфекционного процесса) вторичные очаги инфекционного процесса должны отсутствовать вторичные очаги инфекционного процесса отсутствуют Реактогенность (продолжительность местной воспалительной реакции после прививки), сут, не более 21 14-20 Продолжительность допротективного периода иммунитета (отсутствие местной воспалительной реакции на повторную прививку), сут, не более 14 15 Сохранность поголовья сопоставление показателя сохранности до и после проведения вакцинации сохранность до прививки 99,9%, после прививки 99,9%

Таблица 8 Определение эффективности вакцинации методом повторной прививки штамма «КЭМ-7» № птичника Процент птиц с поствакцинальной реакцией Процент иммунных птиц 1 89 100 2 100 100 3 93 100 4 82 100 5 97,5 100

Таблица 9 Сопоставление показателей сохранности и продуктивности до и после вакцинации кур-несушек по птичникам № птичника Яйценоскость, % Среднесуточный падеж птицы, гол. до вакцинации после вакцинации до вакцинации после вакцинации 1 94 91 2 5 2 83 86 27 26 3 81 81 10 10 4 67 62 13 25 5 85 83 16 17

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии. Новый штамм «КЭМ-7» вируса оспы кур получен путем многократных пассажей материнского вируса на развивающихся эмбрионах кур. Штамм депонирован в коллекцию ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - штамм «КЭМ-7» - ДЕП вируса оспы кур. Штамм генетически аутентичен по последовательности нуклеотидов гена 241ext. Адаптирован к организму развивающихся эмбрионов кур. Является иммуногенным, умеренно реактогенным и безвредным для птицы при интрадермальной инъекции. Сохраняет аттенуированный фенотип при пассажах как в системе культивирования, так и на естественно восприимчивой птице. Изобретение расширяет арсенал вакцинных штаммов вируса оспы птиц. Штамм пригоден для изготовления биопрепаратов специфической профилактики и диагностики оспы птиц. 5 з.п. ф-лы, 3 ил., 9 табл., 8 пр.

1. Аттенуированный штамм «КЭМ-7» вируса оспы кур Fowlpox virus, депонированный в ФГБУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) «КЭМ-7»-ДЕП, генетически аутентичный по последовательности нуклеотидов гена 241ext, для изготовления биопрепаратов специфической профилактики и диагностики оспы птиц.

2. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он адаптирован к организму развивающихся эмбрионов кур, где способен накапливаться в ткани ХАО в среднем титре (6,3±0,18) Ig ЭИД₅₀/см³.

3. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он является умеренно реактогенным и безвредным для птицы при интрадермальной инъекции в дозах до 3,7 IgИД₅₀/0,004 см³.

4. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он является иммуногенным с иммунизирующей дозой 3 Ig ЭИД₅₀/0,004 см³, обеспечивающей защиту 95% привитых птиц при контрольном заражении вирулентным вирусом оспы кур.

5. Штамм по п.4, характеризующийся тем, что он индуцирует поствакцинальный иммунитет (не менее 80% защищенности поголовья) продолжительностью 360 суток после прививки.

6. Штамм по п.1, характеризующийся тем, что он сохраняет аттенуированный фенотип при пассажах как в системе культивирования, так и на естественно восприимчивой птице.