СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА НАРУШЕНИЙ ФЕРТИЛЬНОСТИ У МУЖЧИН С ОЖИРЕНИЕМ Российский патент 2013 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к урологии, и может быть использовано для прогнозирования нарушения фертильности мужчин с ожирением.

Известен способ определения фертильности мужчин (RU 2052202 C1, Посисеева и др., 10.01.1996). В спермальной жидкости исследуют содержание термостабильного альфа-1-гликопротеина и при уровне последнего выше 16 мкг/мл диагностируют сниженную фертильность спермы. Описан также способ диагностики ранних нарушений репродуктивной функции у мужчин (RU 2413949 C1, Тарасова и др., 10.03.2011). В сыворотке крови методом иммуноферментного анализа определяют концентрации цитокинов IL-8, IL-10 и IL-1RA, затем вычисляют диагностический индекс DI. При DI более 0 диагностируют ранние нарушения репродуктивной функции у мужчин, а при DI менее 0 делают заключение об отсутствии лабораторных признаков нарушений мужской репродуктивной функции. Однако указанные способы не предполагают выявления группы риска развития бесплодия у мужчин с ожирением.

В изобретении (RU 2342660 C2, Семенов, 27.12.2008) описан способ прогнозирования нарушений фертильности у мужчин. Путем проточной цитометрии спермы исследуют соотношение лимфоцитов с фенотипом CD25+ и CD95+. При его значениях менее 0,71 и более 1,20 прогноз фертильности признается неблагоприятным. Однако и этот способ не позволяет выявить группу риска развития бесплодия среди мужчин с ожирением.

Наиболее близким к патентуемому, является способ прогнозирования нарушения фертильности спермы у мужчин в виде астенозооспермии, в котором исследуют периферическую кровь посредством анализа генов (RU 2314530 C1, Фетисова и др., 10.01.2008 - прототип). На выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз M1 и Р1. При выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С и GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии. Однако указанный способ дает возможность определить только нарушение подвижности сперматозоидов и не касается морфологии и концентрации.

Вместе с тем известно, что бесплодие развивается не у всех мужчин с ожирением. Одним из возможных факторов, который может объяснить гормональные изменения у мужчин с ожирением, а также различия во влиянии ожирения на конкретного индивидуума, является полиморфизм гена ароматазы, который ответственен за превращение тестостерона в эстрадиол в различных тканях организма, в том числе и жировой ткани (см. обзор литературы в ст. Гамидова С.И и др. в ж. Проблемы репродукции, 2010, N 6, с.79-88). Показано существование полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1, который локализуется в хромосоме 15q21.2. Доказано, что у мужчин с большей частотой повторов ТТТА концентрация эстрадиола в сыворотке крови была значительно выше и зависела от веса. Кроме того, показано, что только мужчины с большей частотой повторов ТТТА в гене ароматазы CYP19A1 имеют шанс снижения уровня эстрадиола после похудения (Hammoud A et al. An aromatase polymorphism modulates the relationship between weight and estradiol levels in obese men. Fertil steril; 2009; 10: 37).

M.R. Sowers и соавт. (Sowers M.R. et al. Aromatase gene (CYP 19) polymorphisms and endogenous androgene concentrations in a multiracial/multiethnic, multisite study of women at midlife. Am J Med. 2006 Sep; 119 (9 Suppl 1): S 23-30)) изучали связь полиморфизма гена ароматазы с концентрацией андрогенов у женщин среднего возраста. Проанализированы пять однонуклеотидных полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 (rs2414096, rs936306, rs2446405, rs1008805, rs749292). Три из пяти полиморфизмов были связаны с изменениями концентрации андрогенов. Однако прямая корреляция связи полиморфизмов указанного гена с фертильностью у мужчин с ожирением в литературе не описана.

Задачей настоящего изобретения является поиск критериев прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, в чем и состоит технический результат изобретения.

Патентуемый способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением включает отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления, определение генотипов полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, выявление аллеля А полиморфизмов rs2414096 и rs749292, при наличии которого прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением.

Для определения роли полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 в развитии бесплодия у мужчин с ожирением было обследовано 85 мужчин с ожирением, которым производилось генетическое исследование. Описание полиморфизмов гена ароматазы CYP19A1 приведено в табл.1.

Таблица 1 Полиморфизмы гена ароматазы CYP19A1 Полиморфизм Замена Позиция в хромосоме Локализация в гене rs2414096 A>G 15q21.1: 51529779 Интрон rs749292 A>G 15q21.1: 51558731 Интрон rs936306 C>Т 15q21.1: 51579598 3'UTR

Обследованные мужчины с ожирением были разделены на две группы. В основную группу (группа 1) были включены 50 мужчин с ИМТ более 30 кг/м² и идиопатической патозооспермией; в контрольную группу (группа 2) были включены 35 фертильных пациентов с ИМТ более 30 кг/м².

Сравнительный анализ пациентов двух групп не выявил статистически достоверных различий в антропометрических показателях, наличии или отсутствии вредных привычек.

Данные, представленные в табл.2, обосновывают наличие связи бесплодия у мужчин с ожирением и присутствием аллеля А полиморфизма rs2414096. У мужчин с ожирением и бесплодием почти в 2 раза чаще, чем у фертильных мужчин, выявляется носительство гомозиготного генотипа АА. Встречаемость аллеля А у бесплодных мужчин составила 60% по сравнению с 42,9% в контрольной группе (p=0,027). Риск развития бесплодия (OR) у мужчин с ожирением при наличии у них аллеля А в геторо- или гомозиготной форме составил 2,0 (95% ДИ: 1,1-3,7).

Таблица 2 Частота полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 Генотип Фертильные Бесплодные количество % количество % АА 7 20,00 19 38,00 AG 16 45,70 22 44,00 GG 12 34,30 9 18,00 Частота аллелей         А 30 42,90 60 60,00* G 40 57,10 40 40,00 Примечание: * - достоверность различия p=0,027.

Аналогичная ассоциация была обнаружена также и для полиморфизма rs749292. У бесплодных мужчин с ожирением гомозиготный генотип АА встречался в 1,7 раз чаще, чем у мужчин контрольной группы (38,0% и 22,9%, соответственно). Риск развития бесплодия при наличии аллеля А полиморфизма rs749292 составил 1,92 (95% ДИ: 1,04-3,55). Данные о частоте полиморфизма rs749292 в группах представлены в табл.3.

Таблица 3 Частота полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1 Генотип Фертильные Бесплодные количество % количество % АА 8 22,9 19 38 AG 14 40 21 42 GG 13 31,1 10 20 Частота аллелей         А 30 42,9 59 59,0* G 40 57,1 41 41,0 Примечание: * - достоверность различия p=0,038.

Частота аллелей С и Т полиморфизма rs936306 у бесплодных и фертильных мужчин с ожирением была практически одинаковой: 81,4 и 18,6% у фертильных пациентов и 83,0 и 17,3% у пациентов с идиопатическим бесплодием. Данные о частоте полиморфизма rs936306 в группах представлены в табл.4.

Таблица 4 Частота полиморфизма rs936306 в группах Генотип Фертильные Бесплодные количество % количество % СС 23 65,7 35 70 СТ 11 31,4 13 26 ТТ 1 2,9 2 4 Частота аллелей         С 57 81,4 83 83,0 Т 13 18,6 17 17,0

После определения частоты встречаемости полиморфизмов гена ароматазы и их связи с развитием бесплодия у мужчин с ожирением нами проведено сравнение показателей спермограммы и уровня гормонов у пациентов основной группы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs2414096 и rs749292, т.е. тех полиморфизмов, для которых была выявлена связь с развитием бесплодия у мужчин с ожирением.

При обследовании пациенты с полиморфизмом rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были разделены нами в зависимости от генотипа: генотип АА (19 мужчин), генотип AG (21 мужчина) и генотип GG (10 мужчин).

При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (p<0,05). Вышеописанные данные представлены в табл.5.

Таблица 5 Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1 Гормон Генотип АА (N=19) Генотип AG (N=21) Генотип GG (N=10) ЛГ, мЕд/мл 2,8±0,2* 4,0±0,3 4,9±0,5 ФСГ, мЕд/мл 3,1±0,3* 6,1±0,5 6,0±0,7 ТТГ, мЕд/л 2,4±0,2 2,0±0,2 1,9±0,3 Тироксин, нмоль/л 96,1±4,8 103,8±4,3 93,8±6,8 Эстрадиол, пмоль/л 134,9±3,7* 97,2±4,4 86,8±5,2 Прогестерон, нмоль/л 1,4±0,1 1,3±0,1 1,2±0,2 Пролактин, мЕд/л 253,4±25,9 244,7±21,9 222,6±26,5 Тестостерон, нмоль/л 11,1±0,7* 17,2±0,9 20,1±1,0 Кортизол, нмоль/л 305,6±28,2 352,0±30,0 388,5±37,3 Лептин, нг/мл 13,6±1,3 12,6±1,0 10,5±1,2 Примечание: * - p<0,05 при сравнении показателей гормонов у пациентов в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.

При анализе особенностей показателей спермограммы у мужчин с ожирением и идиопатической патозооспермией в зависимости от генотипа полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1 были обнаружены следующие особенности. Все три группы были сопоставимы по объему эякулята и подвижности сперматозоидов (p>0,05). В то же время, концентрация сперматозоидов у мужчин с генотипом АА была достоверно ниже, чем у мужчин с генотипом GG, а показатели концентрации сперматозоидов у мужчин с генотипом AG являлись промежуточными. Аналогичная ситуация была отмечена при анализе количества нормальных форм сперматозоидов - 14,1±1,3% и 20,8±2,5% соответственно (p<0,05) (см. табл.6).

Таблица 6 Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма гена ароматазы rs749292 Показатели спермограммы Генотип АА (N=19) Генотип AG (N=21) Генотип GG (N=10) Объем эякулята, мл 3,2±0,2 2,9±0,2 2,6±0,2 Концентрация сперматозоидов, млн/мл 34,8±7,9 42,3±8,3 46,8±9,1* Подвижность категория А, % 11,2±1,1 12,7±1,2 13,5±1,5 Подвижность категория А+В, % 26,7±2,0 30,1±2,1 31,5±3,2 Морфология, % 14,1±1,3 18,3±2,1 20,8±2,5* Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs749292 гена ароматазы CYP19A1.

При оценке гормонального профиля у мужчин с идиопатической патозооспермией и ожирением, в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1, получены результаты, которые представлены в табл.7.

Таблица 7 Уровни гормонов в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 Гормон Генотип АА (N=19) Генотип AG (N=22) Генотип GG (N=9) ЛГ, мЕд/мл 2,5±0,2* 4,3±0,2 4,7±0,6 ФСГ, мЕд/мл 2,5±0,2* 6,4±0,4 6,1±0,8 ТТГ, мЕд/л 2,3±0,2 2,2±0,2 1,8±0,3 Тироксин, нмоль/л 98,9±4,8 99,6±4,4 96,9±7,0 Эстрадиол, пмоль/л 137,9±2,8* 96,9±3,7 84,8±6,4 Прогестерон, нмоль/л 1,4±0,1 1,4±0,1 1,2±0,2 Пролактин, мЕд/л 255,4±27,5 242,4±20,5 223,3±27,3 Тестостерон, нмоль/л 11,2±0,8* 17,0±0,9 20,1±1,3 Кортизол, нмоль/л 318,5±30,0 342,8±27,3 386,7±42,9 Лептин, нг/мл 14,5±1,3 11,4±0,9 11,7±1,3 Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1

При математической обработке данных у пациентов с генотипом АА уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона были достоверно ниже, чем аналогичные показатели гормонов у пациентов с генотипами AG и GG. Средний уровень эстрадиола оказался выше у пациентов с генотипом АА (р<0,05).

Данные спермиологического исследования при анализе влияния генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 представлены в табл.8.

Таблица 8 Показатели спермограммы в зависимости от генотипа полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1 Показатели спермограммы Генотип АА (N=19) Генотип AG (N=22) Генотип GG (N=9) Объем эякулята, мл 3,2±0,2 2,8±0,2 2,8±0,3 Концентрация сперматозоидов, млн/мл 38,3±6,7 42,9±8,4 52,5±12,6* Подвижность сперматозоидов (категория А), % 11,0±1,0 12,1±1,5 14,3±1,1 Подвижность сперматозоидов (категория А+В), % 25,0±1,9 27,1±2,3 33,3±2,2* Морфология, % 13,0±1,2 18,0±1,2 23,2±4,2 ** Примечание: * - p<0,05 при сравнении генотипов АА и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1; ** - p<0,05 при сравнении генотипа АА с генотипами AG и GG полиморфизма rs2414096 гена ароматазы CYP19A1.

У пациентов с генотипом АА этих полиморфизмов уровни ЛГ, ФСГ и тестостерона достоверно выше, чем у мужчин с генотипами AG и GG. Одновременно с этим, у мужчин с генотипом АА отмечаются более высокие показатели эстрадиола.

При оценке показателей спермограммы у пациентов с гомозиготной формой полиморфизмов гена ароматазы rs2414096 и rs749292 отмечается снижение концентрации сперматозоидов и количества сперматозоидов с активной подвижностью (категория А и А+В) в эякуляте. Кроме этого, у пациентов с генотипом АА полиморфизма гена ароматазы rs2414096 достоверно ниже содержание в эякуляте количества сперматозоидов с нормальным строением (морфология).

При наличии генотипа АА полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A1 происходит более активная ароматизация тестостерона в эстрадиол, что приводит к относительному снижению концентрации тестостерона и соответствующему повышению уровня эстрадиола, что в свою очередь приводит к снижению ФСГ и ЛГ, при этом замыкается порочный круг, так как снижение концентрации ЛГ уменьшает выработку тестостерона клетками Лейдига. Эти гормональные сдвиги и приводят к снижению сперматогенеза, особенности изменения которого описаны выше.

Таким образом, представленные экспериментальные данные доказывают достижение технического результата: выявлена связь бесплодия у мужчин с ожирением с присутствием аллеля А полиморфизмов rs749292 и rs2414096, которая может использоваться в качестве прогностического критерия риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением.

Изобретение относится к области медицины. Предложен способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, включающий отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления. При выявлении аллеля А полиморфных вариантов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением. Изобретение обеспечивает новые прогностические критерии для оценки риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением. 8 табл.

Способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением, включающий отбор венозной крови, проведение аллель-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда и анализа кривой плавления, определение генотипов полиморфизмов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, выявление аллеля А полиморфизмов rs2414096 и rs749292, при наличии которого прогнозируют риск нарушения фертильности у мужчин с ожирением.