СПОСОБ ОЦЕНКИ РЕПРОДУКТИВНОЙ ФУНКЦИИ МУЖЧИН С ИДИОПАТИЧЕСКИМ БЕСПЛОДИЕМ Российский патент 2021 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно урологии, иммунологии репродукции (репродуктологии) и клинической лабораторной диагностике, и может быть предложено в качестве метода диагностики мужского бесплодия неустановленного генеза.

В настоящее время бесплодие приобрело статус глобальной социально-демографической проблемы, с которой сталкивается 15% пар во всем мире при планировании семьи (Agarwal A, Mulgund A, Hamada А, Chyatte MR. A unique view on male infertility around the globe; 2 Reprod Biol Endocrinol 2015; 13(1):37. doi:10.1186/s12958-015-0032-1.). Показатель встречаемости «мужского» фактора, то есть, количественных и качественных нарушений сперматогенеза, при обследовании пары на бесплодие приближается к 50% и является критическим для популяционной репродуктологии (Лебедев Г.С., Голубев Н.А., Шадеркин И.А., Шадеркина В.А., Аполихин О.И., Сивков А.В., Комарова В.А. Мужское бесплодие в Российской Федерации: статистические данные за 2000-2018 годы. Экспериментальная и клиническая урология 2019; (4): 4-12). Структурно-биохимические основы нарушения мужской репродуктивной функции остаются не до конца изученными, что отражается в крайне высоком показателе количества мужчин с диагнозом «идиопатическое бесплодие»: по разным данным этот показатель составляет от 31 до 75% (Галимов Ш.Н. и др. Идиопатическое бесплодие у мужчин: проблемы и перспективы // Материалы 12-го Российского научно-образовательного Форума «Мужское здоровье и долголетие». - Москва, 19-20 февраля, 2014, с. 7).

Известно, что у мужчин с диагностированным идиопатическим бесплодием при обследовании не выявляются анатомические или функциональные патологии репродуктивной системы, однако наблюдаются отклонения от нормы в параметрах спермограммы, а именно - олигоастенотератозооспермия, или ОАТ-синдром (Dohle GR, Colpi GM, Hargreave ТВ, Papp GK, Jungwirth A, Weidner W. EAU guidelines on male infertility. Eur Urol 2015; 48(5): 703-711). Показатель подвижности сперматозоидов зависит от разнообразных факторов, и наиболее существенными являются морфология клетки и структура ее гликокаликса. Спермограмма является общепризнанным интегральным и оптимальным способом оценки репродуктивной функции мужчины и функционально-морфологического состояния его сперматозоидов, но этот метод не позволяет установить причину бесплодия неясного генеза в виду визуальности и субъективности данного исследования, а также не учитывает биохимические особенности изучаемых клеток (WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. - 5th ed. - WHO (Geneva), 2010. - Vol. 270; Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пер. с англ. Н.П. Макаровой под научн. ред. Л.Ф. Курило. 5-е изд. - М.: Изд-во "Капитал принт", 2012).

Лечение идиопатического бесплодия является крайне непростой задачей вследствие неустановленной этиологии заболевания, и, хотя применение вспомогательных репродуктивных технологий снижает количество бесплодных семей, эта проблема не теряет своей актуальности во всем мире.

В последние годы активно изучается вклад компонентов врожденной иммунной системы не только в протекание беременности и ее исходы, но и процессы миграции половых клеток, капацитации и оплодотворения.

Среди многочисленных компонентов гликокаликса сперматозоидов выделяют белок DEFB126, принадлежащий к системе врожденного иммунитета. Он относится к семейству β-дефензинов, являющихся первой линией защиты организма, поскольку обладают прямой противомикробной активностью, оказывают иммуномодулирующий эффект, выступают в роли медиаторов воспаления и усиливают хемотаксис в зону воспаления (Ковальчук Л.В., Ганковская Л.В., Мешкова Р.Я. Клиническая иммунология и аллергология с основами общей иммунологии. Учебник, ГЭОТАР-Медиа, 2014 г.).

Показано, что белок DEFB126 специфически экспрессируется клетками мужского репродуктивного тракта и входит в состав структуры гликокаликса сперматозоидов млекопитающих. Помимо иммунной защиты от патогенов и реализации воспалительной реакции этот β-дефензин обеспечивает эффективное продвижение сперматозоида внутри женского полового тракта, успешное оплодотворение яйцеклетки и препятствует распознаванию сперматозоидов компонентами женской иммунной системы (Yudin, А.I., Тгеесе, С.A., Tollner, Т.L., Overstreet, J. W. & Cherr, G. N. The carbohydrate structure of DEFB126, the major component of the cynomolgus Macaque sperm plasma membrane glycocalyx. J. Membr. Biol. 207, 119-129, 2005). При наличии двунуклеотидной делеции во втором экзоне (rs11468374) в структуре гена, кодирующего молекулу DEFB126, образуется дефектная мРНК, лишенная стоп-кодона, которая быстро подвергается деградации по внутриклеточному механизму контроля качества образующихся мРНК, в результате чего структура гликокаликса сперматозоидов лишена молекул β-дефензина.

Известен способ прогнозирования риска нарушений фертильности у мужчин с ожирением (RU 2498314 С1, Гамидов, 10.11.2013). Методом алелль-специфичной полимеразной цепной реакции с использованием флуоресцентно-меченного олигонуклеотидного зонда выявляли аллель А полиморфных вариантов rs2414096 и rs749292 гена ароматазы CYP19A, обеспечивающей превращение тестостерона в эстрадиол в различных тканях организма. Так же определяли уровни половых гормонов ЛГ, ФСГ и ТТГ и показатели спермограммы обследуемых мужчин с ожирением в зависимости от генотипов полиморфизмов гена ароматазы. При наличии генотипа АА полиморфизмов rs2414096 и rs749292 происходит более активное превращение тестостерона в эстрадиол, что ведет к снижению концентрации тестостерона и других половых гормонов и нарушению сперматогенеза. Недостатком данного способа является ограничение его применения в отношении мужчин без нарушений метаболизма.

В другом известном способе для диагностирования нарушений фертильности сперматозоидов мужчин с астенозооспермией (RU 2314530 С1, Фетисова, 2008-01-10) предложено проводить анализ аллельного полиморфизма генов семейства глутатион-S-трансфераз M1 и P1 и подсчет риска нарушения фертильности сперматозоидов в виде астеноспермии при выявлении генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С. Предложенная методика основывается на доказанной роли экзогенных токсических веществ в патогенезе мужского бесплодия и том, что функционально неполноценные аллели генов семейства глутатион-S-трансфераз (GSTM1, GSTP1), участвующие во второй фазе биотрансформации, могут обусловливать повышенную чувствительность сперматоцитов к токсическим воздействиям, что негативно сказывается на их подвижности. Недостатком метода является сосредоточенность на негативном воздействии факторов окружающей среды, ведущем к биохимическим изменениям в организме, и не берущиеся во внимание эндогенные причины снижения подвижности и фертильности сперматозоидов.

В качестве прототипа была взята работа иранских ученых «The role of DEFB126 variation in male infertility and medically assisted reproduction technique outcome» (Boroujeni, P.В., Ebrahimian, S., Abedini, M., Chayjan, M.R., Hassani, M., Gourabi, H. Meybodi, A.M. (2019). Reproductive BioMedicine Online. doi:10.1016/j.rbmo.2019.05.012). Было проведено исследование ассоциации между наличием мутации в гене DEFB126 с исходами вспомогательных репродуктивных технологий в популяции иранских мужчин с нарушением репродуктивной функции. Ученые продемонстрировали, что двунуклеотидная делеция в гене DEFB126 встречается достоверно чаще в группе бесплодных пациентов в сравнении с группой контроля.

Преимуществом заявляемого метода в сравнении с прототипом является исследование распространенности мутантного аллеля гена DEFB126 в популяции русских мужчин и определение его ассоциации с экпрессией гена и подвижностью сперматозоидов.

Нами была поставлена задача оценить уровень экспрессии гена противомикробного пептида DEFB126 и распространенность его мутантного аллеля (del) в популяции русских мужчин, имеющих нарушения репродуктивной функции неустановленного генеза, и ассоциацию этого аллеля с показателем подвижности сперматозоидов.

Техническим результатом, достигаемым при осуществлении предлагаемого изобретения, является усовершенствование диагностики мужского бесплодия неустановленного генеза.

Использование изобретения позволяет диагностировать причину снижения фертильности сперматозоидов мужчин, связанную с наличием мутации в гене противомикробного пептида DEFB126, являющегося структурным компонентном гликокаликса сперматозоидов и влияющего на их подвижность, и снижением его экспрессии, и таким образом, позволяет увеличить точность диагностики мужского бесплодия неясного генеза и расширить спектр прогностических маркеров мужского бесплодия.

Целью изобретения является разработка способа диагностики мужского бесплодия, основанного на определении уровня экспрессии гена молекулы белка гликокаликса сперматозоидов и наличия в нем генетической мутации, ведущей к значительной редукции подвижности мужских половых клеток в женском репродуктивном тракте.

Сущность изобретения заключается в следующем.

Для увеличения точности диагностики мужского бесплодия неясного генеза определяют наличие двунуклеотидной делеции (rs11468374) гена противомикробного пептида DEFB126 и уровень его экспрессии в клетках подвижной фракции эякулята методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Для оценки показателя подвижности сперматозоидов проводят анализ спермограммы. Далее оценивается ассоциация подвижности клеток и наличие или отсутствие мутантного аллеля del гена DEFB126. При одновременном выявлении генотипа del/del гена DEFB126, снижении его экспрессии, по меньшей мере, в 3,4 раза по сравнению с его уровнем, выявляемым у здоровых фертильных доноров, и сниженном показателе подвижности (при нормальном показателе 50%) предлагается диагностировать астенозооспермию, опосредованную мутацией гена β-дефензина DEFB126.

Предложенный нами способ осуществляют следующим образом.

Для оценки подвижности сперматозоидов используют следующую методику, которая включает в себя несколько последовательных этапов: стерильный сбор эякулята для диагностических или исследовательских целей, его разжижение, оценку морфофункциональных свойств эякулята (анализ спермограммы). Для изучения экспрессии гена DEFB126 после стерильной сборки эякулята и его разжижения проводят отделение фракции подвижных сперматозоидов от семенной жидкости и других клеточных составляющих эякулята и инфекционных агентов, выделение из полученных клеток нуклеиновых кислот, проводят постановку реакции обратной транскрипции для синтеза на матрице РНК копии кДНК и проведение ПЦР-РВ для оценки экспрессии исследуемого гена.

Сбор эякулята в диагностических и исследовательских целях проводится в соответствии с рекомендациями ВОЗ (Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. 5-е изд. М.: Капитал-Принт, 2012; с. 292). После соблюдения всех подготовительных рекомендаций, эякулят собирают путем мастурбации в сосуд с широким горлом из нетоксичного для сперматозоидов пластика в специальной комнате вблизи лаборатории во избежание температурных флуктуаций. Далее для разжижения эякулята контейнер помещают в термостат +37 С° на 25-30 мин, где перемешивают раз в 8-10 мин колебательными движениями. Через 25-30 мин нужно убедиться, что разжижение произошло, вращая контейнер 20 с.

Подвижность сперматозоидов оценивается сразу после разжижения образца методом фазово-контрастной микроскопии. Для этого берут две аликвоты спермы и готовят два влажных препарата, и затем изучают их при увеличении ×200 или ×400. На каждую аликвоту подсчитывается примерно 200 сперматозоидов в не более чем 5 случайно выбранных полях зрения. Сначала необходимо оценивать выбранную область на клетки категории А - сперматозоиды с быстрым поступательным движением, затем ведется подсчет клеток категории В - сперматозоиды с медленным поступательным движением, и затем клеток категории С - неподвижные сперматозоиды или сперматозоиды с непоступательным движением. Далее с помощью лабораторного счетчика проводят подсчет клеток каждой категории и вычисляют средний процент и различия между двумя процентными значениями для самой часто встречающейся категории в каждой аликвоте.

Далее в соответствии с рекомендациями, описанными в «Руководстве ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека» с использованием коммерческого набора «SPERMGRAD™» (Vitrolife Sweden АВ) в строгом соответствии с протоколом производителя методом центрифугирования эякулята в градиенте плотностей производят отделение фракции подвижных сперматозоидов от округлых клеток, лейкоцитов, дегенерирующих половых клеток и клеточного дебриса. Данный метод позволяет получить фракцию наиболее подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией.

Для выделения нуклеиновых кислот из полученной фракции сперматозоидов используют набор реактивов для выделения ДНК/РНК методом аффинной сорбции на частицах силикагеля «АмплиПРАИМ Рибо-сорб» (ИнтерЛабСервис, РФ) строго в соответствии с протоколом. В пробирки на 1,5 мл вносят по 150 мкл фракции сперматозоидов и добавляют 450 мкл прогретого до 60°С лизирующего буфера. Содержимое перемешивают на вортексе и центрифугируют при 5000 об/мин в течение 5 сек. Затем в пробирки вносят по 25 мкл ресуспензированного сорбента, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 10000 об/мин в течение 30 секунд, после чего сливают надосадочную жидкость. Далее в пробирки добавляют 400 мкл раствора для отмывки 1, перемешивают, центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд и удаляют надосадочную жидкость. Далее добавляют 500 мкл раствора для отмывки 3, перемешивают и центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд, удаляют надосадочную жидкость. Повторяют отмывку раствором 3. Затем в пробирку вносят 400 мкл раствора для отмывки 4, перемешивают, центрифугируют при 10000 об/мин 30 секунд, удаляют надосадочную жидкость. Осажденный на дне пробирок сорбент сушат в термостате при температуре 60°С 15 минут с открытыми крышками. После в пробирки вносят по 50 мкл РНК-буфера, перемешивают на вортексе и помещают в термостат на 3 минуты при температуре 60°С с закрытыми крышками, снова перемешивают и центрифугируют при 13000 об/мин в течение 60 секунд. Полученные образцы хранят при -70°С.

Для изучения экспрессии гена DEFB126 осуществляется постановка реакции обратной транскрипции (ОТ) в объеме 25 мкл с использованием «Набора для проведения реакции обратной транскрипции» (Синтол, РФ) для синтеза копий кДНК на матрице РНК исследуемого гена. В качестве отрицательного контроля в пробирку добавляли деионизированную воду (ddH2O), входящую в состав набора.

Постановка реакции ОТ проводится в два последовательных этапа с приготовлением смеси №1 и смеси №2. Смесь №1 содержит 1 мкл праймера Oligo(dT) [15 ОЕ/мл] и 14 мкл ddH2O. Приготовленную смесь №1 раскапывают по пробиркам по 15 мкл на одну пробу и вносят по 4 мкл РНК, в пробирку с отрицательным контролем - 4 мкл ddH2O. Проводят отжиг Random гексамеров и праймера Oligo(dT) на матрице мРНК при температуре 75°С в течение 3 минут. Пробирки после инкубации охлаждают до 4°С и вносят по 11 мкл смеси №2, содержащей 10 мкл 2,5х Реакционной смеси, 1 мкл ревертазы MMLV-RT с концентрацией 50 ед/мкл, и инкубируют 40 минут при температуре 37°С. Далее инактивацию ревертазы проводят при 95°С в течение 5 минут. Полученную после проведения реакции ОТ кДНК хранят при температуре -70°С.

В качестве контроля прохождения реакции ОТ и для стандартизации метода используют ПЦР-систему на определение экспрессии гена β-актина.

ПЦР в режиме реального времени ставят с использованием наборов реактивов для проведения ПЦР-РВ в присутствии SYBR Green I (Синтол, РФ) и специфических праймеров. В готовую смесь добавляют 4 мкл кДНК, полученной при реакции ОТ. Использованные в реакции праймеры были подобраны в программном обеспечении Vector NTI Designer и синтезированы фирмой Синтол (РФ). Отрицательным контролем служит проба с реакционной смесью, не содержащая мРНК. ПЦР в реальном времени проводят на приборе ДТ-96 (ДНК-Технология, РФ) по следующей схеме:

• денатурация 95°С - 5 минут,

• амплификация (отжиг 94°С - 20 сек, элонгация 64°С - 30 сек) - 35 циклов,

• финальная экстенция 72°С 5 минут.

Программа для определения полиморфизма гена DEFB126 rs11468374 представлена ниже:

• денатурация 94°С - 3 минуты,

• амплификация (отжиг 94°С - 60 секунд, элонгация 60°С - 20 секунд, экстенция 72°С - 1 мин) 35 циклов,

• финальная экстенция 72°С 7 минут.

Уровень экспрессии гена DEFB126 оценивался по методу 2^-ΔΔCt в относительных единицах относительно активности гена домашнего хозяйства - β-актина.

Полученные результаты были обработаны с использованием программного обеспечения Microsoft Excel 2016 и STATISTIC А 10.0. Данные были проверены на нормальность распределения, определены их дисперсии. Сравнение исследуемых групп проводили с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с апостериорным критерием Тьюки. Уровень достоверности принимали 0,05.

В таблице 1 представлено распределение показателей подвижности сперматозоидов пациентов и здоровых доноров в соответствии с их генотипами. Среди доноров без нарушений фертильной функции генотип DEFB126 del/del выявлен не был. Подвижность сперматозоидов доноров здоровой группы достоверно выше подвижности сперматозоидов пациентов с бесплодием (р<0,0001). Показано, что у пациентов с генотипом DEFB126 del/del подвижность сперматозоидов снижена в 5,71 раз в сравнении с подвижностью пациентов с генотипом DEFB126 wt/wt и в 4,67 раз в сравнении с пациентами с генотипом DEFB126 wt/del (р<0,0001). Также показано статистически значимое различие показателей подвижности сперматозоидов пациентов с генотипом DEFB126 wt/del и доноров здоровой группы с генотипом DEFB126 wt/del (р<0,05).

В таблице 2 представлено распределение по генотипам пациентов и уровням экспрессии гена DEFB126 среди пациентов с идиопатическим бесплодием и доноров здоровой группы.

Показано достоверное снижение экспрессии гена DEFB126 среди пациентов с бесплодием в 12,4 раза в сравнении с группой здоровых доноров (р=0,00012 по критерию Тьюки). Показана достоверная разница между показателями экспрессии больных пациентов с генотипом DEFB126 wt/wt в сравнении со здоровыми донорами с генотипами DEFB126 wt/wt и DEFB126 wt/del (р<0,001 и р<0,005, соответственно); разница между показателями пациентов с генотипом DEFB126 wt/del и показателями экспрессии здоровых доноров с генотипами DEFB126 wt/wt и DEFB126 wt/del (р<0,0001); и разница между показателями экспрессии пациентов с генотипом DEFB126 del/del и показателями доноров здоровой группы с генотипами DEFB126 wt/wt и DEFB126 wt/del (р<0,001 и р<0,01, соответственно).

Таким образом, получены следующие результаты:

1. У пациентов с идиопатическим бесплодием снижена экспрессия гена DEFB126 в 12,4 раза в сравнении с группой здоровых доноров (р=0,00012 по критерию Тьюки);

2. У пациентов с генотипом DEFB126 del/del подвижность сперматозоидов снижена в 5,71 раз в сравнении с подвижностью пациентов с генотипом DEFB126 wt/wt и в 4,67 раз в сравнении с пациентами с генотипом DEFB126 wt/del (р=0,00013).

Для доказательства возможности реализации заявленного назначения и достижения указанного технического результата приводим также следующие данные.

Пример 1.

Супруги Т. обратились в клинику в связи с первичным бесплодием в течение 2 лет. У супруги при обследовании был выявлен трубно-перитонеальный фактор бесплодия. При стандартном лабораторном исследовании эякулята супруга не было выявлено отклонений от нормы: показатель подвижности составил 50% (категория А - 20%, категория В - 30%), показатель сперматозоидов с нормальной морфологией 30%, концентрация 95 млн/мл. Заключение: нормозооспермия. При проведении молекулярно-генетического анализа на определение полиморфизма гена DEFB126 мутантный аллель выявлен не был, генотип DEFB126 wt/wt. Уровень относительной экспрессии гена DEFB126 данного пациента составил 1,96 относительных единиц, что соответствует значениям этого показателя здоровых доноров. Диагностирован женский фактор бесплодия.

Пример 2.

Пациент X. с супругой Б. проходил обследование по поводу бесплодного брака. При обследовании супруги патологических нарушений со стороны репродуктивной системы выявлено не было. При проведении лабораторного исследования эякулята была выявлена выраженная олигоастенотератозооспермия и диагностирован мужской фактор бесплодия: в поле зрения единичные сперматозоиды с нормальной морфологией категории В, концентрация составила 1 млн/мл. В результате проведенного молекулярно-генетического обследования был определен генотип DEFB126 del/del, что свидетельствует о наличии мутации в обоих аллелях гена DEFB126. Уровень экспрессии гена DEFB126 составил 0,199 относительных единиц, что в 24,5 раз ниже в сравнении с показателями экспрессии группы контроля. Результат проведенного генетического анализа позволяет установить причину нарушения подвижности сперматозоидов пациента и нарушения фертильной функции, связанную с мутацией в гомозиготном положении гена DEFB126 и нарушением его экспрессии.

Пример 3.

Супруги А. обратились в клинику вспомогательных репродуктивных технологий по поводу бесплодного брака. При обследовании было выявлено сочетание женского и мужского фактора бесплодия: трубно-перитонеальный фактор у супруги и астенотератозооспермия с показателями спермограммы: сперматозоиды группы А - 10%, группы В - 31%, процент сперматозоидов с нормальной морфологией 20%, концентрация составила 72 млн/мл. При проведении молекулярно-генетического анализа был выявлен генотип DEFB126 wt/del. Уровень экспрессии гена DEFB126 у пациента Б. составил 0,074 относительных единицы, что в 3,4 раза ниже в сравнении с показателем здоровых мужчин. Можно сделать вывод, что наличие мутантного аллеля может быть ассоциировано со снижением показателя подвижности сперматозоидов в условиях отсутствия патологических нарушений мужского репродуктивного тракта.

Таким образом, приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый метод позволяет выявить генетическое нарушение, ассоциированное со снижением подвижности сперматозоидов, что позволяет повысить эффективность диагностики мужского бесплодия при отсутствии патологии репродуктивной системы.

Таким образом, приведенные примеры демонстрируют, что предлагаемый метод позволяет выявить генетическое нарушение, ассоциированное со снижением подвижности сперматозоидов, что позволяет повысить эффективность диагностики мужского бесплодия при отсутствии патологии репродуктивной системы.

Преимущества заявляемого метода:

1. может использоваться в качестве скринингового метода прогнозирования нарушения фертильности;

2. позволяет повысить точность и эффективность диагностики идиопатического бесплодия;

3. нетравматичен и требует минимального количества эякулята (150 мкл клеточной фракции);

4. является быстровыполнимым методом.

Изобретение относится к биотехнологии, медицине, а именно клинической лабораторной диагностике, и может быть предложено в качестве метода диагностики мужского бесплодия неустановленного генеза. Способ состоит в том, что в клетках подвижной фракции эякулята пациентов с идиопатическим бесплодием и астенозооспермией с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени определяют двунуклеотидный полиморфизм гена противомикробного пептида DEFB126 (rs11468374) и уровень экспрессии его гена. Выявление мутации в гомозиготном состоянии и снижение экспрессии по меньшей мере в 3,4 раза по сравнению с уровнем экспрессии, установленным у здоровых мужчин с нормозооспермией, позволяет конкретизировать причину нарушения репродуктивной функции мужчин, увеличить точность диагностики идиопатического бесплодия. 2 табл., 3 пр.

Способ оценки репродуктивной функции мужчин с идиопатическим бесплодием и астенозооспермией, отличающийся тем, что с помощью полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в клетках подвижной фракции эякулята определяют уровень экспрессии и мутантный аллель гена противомикробного пептида DEFB126 и при снижении уровня экспрессии по меньшей мере в 3,4 раза в сравнении с экспрессией группы здоровых доноров и выявлении мутантного генотипа del/del DEFB126 диагностирируют астенозооспермию, обусловленную нарушением белковой структуры гликокаликса сперматозоидов.