СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ НАРУШЕНИЯ ФЕРТИЛЬНОСТИ У МУЖЧИН Российский патент 2008 года по МПК G01N33/53 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, медицинской генетике и андрологии, и может быть использовано для прогнозирования нарушения фертильности спермы у мужчин в виде астенозооспермии.

Актуальность. Нарушение деторождения в супружеской паре может быть обусловлено целым комплексом причин, нарушающих как женское, так и мужское репродуктивное здоровье. В 45-50% случаев причинами бесплодия являются количественные и качественные нарушения сперматогенеза. Одной из самых распространенных форм патозооспермии является астенозооспермия, среди бесплодных мужчин встречающаяся в 61,9% [1]. Микроскопическое исследование эякулята позволяет точно диагностировать данное состояние, но прогнозирование развития патозооспермии остается актуальной задачей [2].

Единственный обнаруженный нами метод прогнозирования мужского бесплодия следующий. М.И.Коган, Д.В.Сизякин и В.И.Коненков предложили способ прогнозирования бесплодия у мужчин с варикоцеле путем определения в крови антигенов HLA системы и по обнаружению в ней антигена А1 и отсутствию антигенов А9 и С3 прогнозировать высокий риск развития иммунологического бесплодия (Патент №2002267. Способ прогнозирования бесплодия у мужчин. / Коган М.И., Сизякин Д.В., Коненков В.И. - Изобретения. - 1993. - №39-40. - С.150). Недостатком метода является его узкое применение: прогнозируется риск лишь иммунологической формы бесплодия при варикоцеле.

Проведенный анализ специальной и патентной литературы показал, что предлагаемый нами способ не имеет аналогичных решений по прогнозированию нарушения репродуктивной функции у мужчин.

Заявляемый технический результат достигается тем, что в выделенной из лимфоцитов периферической венозной крови ДНК проводят анализ аллельного полиморфизма генов семейства глутатион-S-трансфераз M1 и P1 и при выявлении у мужчины генотипа GSTM1 0/0 риск развития нарушения фертильности спермы в виде астенозооспермии увеличивается в 2,52 раза, а при выявлении одного из генотипов GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С - в 4,17 раза.

Новизна заявляемого способа заключается в том, что впервые предлагается прогнозировать нарушения фертильности у мужчин в виде астенозооспермии по выявлению одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С.

Известно, что среди многих факторов негативного воздействия на организм человека все большее значение в промышленно-развитых странах приобретает антропогенное загрязнение окружающей среды, особенно усилившееся с середины XX века. Тяжесть токсических эффектов определяется генетически детерминированной способностью организма инактивировать экополлютанты в ходе метаболизма [3]. Доказана роль экзогенных токсических веществ в генезе мужского бесплодия. Возможно, неполноценные в функциональном отношении аллели генов семейства глутатион-S-трансфераз (GSTM1, GSTP1), участвующих во второй фазе процесса биотрансформации, могут обусловливать повышенную чувствительность сперматогенеза к токсическим воздействиям и предрасполагать к снижению фертильности спермы.

Ранее генотипы GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С связывались с развитием мультифакториальной патологии: эндометриоза у женщин [4], привычного невынашивания беременности [5], бронхиальной астмы [6], онкологических заболеваний [7], а также использовались для прогнозирования развития железодефицитной анемии (Патент № 2187812. Способ прогнозирования развития железодефицитной анемии (варианты). / Морозова А.А., Сафуанова Г.Ш., Хуснутдинова Э.К., Чепурная А.Н. - Изобретения. Полезные модели. - 2002. - №23. - С.475).

Заявляемый нами способ осуществляется следующим образом.

Образцы ДНК получают из лимфоцитов периферической крови, используя набор реагентов и протокол для выделения ДНК из различного биологического материала фирмы DIA-tom DNAPrep100 (Россия). В реакцию берут 100 мкл крови. Далее на полученных образцах проводят полимеразную цепную реакцию (ПЦР) фрагментов генов GSTM1, GSTP1 [8].

Смесь для мультиплексной ПЦР фрагментов генов GSTM1 и GSTP1 объемом 25 мкл включает 25 рМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCI, рН 8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 0,01% Tween 20,2 мМ MgCI, 200 мкМ каждого dNTP, 1U термофильной ДНК-полимеразы. В реакцию берется 200 нг ДНК. Мультиплексную ПЦР проводят на программируемом термоциклере МС-2 («ДНК-технология», Россия) с использованием ДНК-полимеразы Termus aquaticus.

Для амплификации фрагментов генов GSTM1 (213 п.н.) использовали следующие условия ПЦР: после денатурации (94°С, 5 мин) проводится 32 цикла в режиме 94°С/1с; 60°С/1с; 72°С/1с; финальная достройка 72°С/2 мин, алгоритм смены температур precise regulation. Амплификация фрагментов гена GSTP1 (174 и 131 п.н.) производилась по программе: горячий старт (95°С, 5 мин), 34 цикла в режиме 94°С/1с; 62°С/1с; 72°С/1с; заключительная элонгация 72°С/2 мин. После амплификации фрагменты гена GSTP1 подвергаются рестрикции специфической эндонуклеазой SmiMI, реакцию проводили согласно протоколу фирмы-производителя («СибЭнзим», Новосибирск).

Продукты реакции анализируются в 7%-ном полиакриламидном геле с последующей окраской в растворе бромистого этидия (конечная концентрация 0,1 мкг/мл) и визуализацией в проходящем УФ-свете при длине волны 312 нм. В качестве внутреннего контроля ПЦР используется фрагмент гена β-глобина (375 п.н.), наличие которого свидетельствует об успешном проведении ПЦР.

Наличие нормального аллеля «+» гена GSTM1 определяется присутствием на электрофореграммах продукта амплификации размером 213 п.н. Отсутствие фрагмента указывает на гомозиготность индивидуума по делеции в соответствующем гене (0/0). Анализ полиморфных аллелей гена GSTP1 осуществляется на основе регистрации длин рестрикционных фрагментов. Аллель А определяется по наличию на электрофореграммах продуктов размерами 152 и 131 п.н., аллель В - 174 и 131 п.н., аллель С - 174 и 112 п.н.

Проанализированы генотипы 45 мужчин из супружеских пар с нарушенной репродуктивной функцией и 55 мужчин с нормальной фертильностью. Все пациенты основной группы страдали астенозооспермией. Результаты проведенного статистического анализа с использованием критерия χ² выявили достоверное увеличение частоты встречаемости варианта GSTM1 0/0 у пациентов с нарушенной фертильностью по сравнению со здоровыми мужчинами (55,6% и 32,7% соответственно, р=0,022, χ²=5,26) (табл.1). У афертильных мужчин достоверно чаще регистрировался гомо- или гетерозиготный генотип по мутантным аллелям гена GSTP1 (В/В, В/С или С/С), среди здоровых эти генотипы встречались значительно реже (15,6% и 3,6% соответственно, р=0,038, χ²=4,29).

Проведен анализ соотношения шансов (OR) по стандартной методике с вычислением 95%-ного доверительного интервала [9].

Выявлено, что при генотипе GSTM1 0/0 относительный риск нарушения фертильности мужчины повышается в 2,52 раза, а при гомо- или гетерозиготности по мутантным аллелям гена GSTP1 (генотипы В/В, В/С или С/С) риск составляет 4,17. Данные генотипы являются диагностическими маркерами астенозооспермии и могут применяться для выявления группы риска возникновения данной патологии до обнаружения нарушения фертильности спермы.

Табл. 1.
Распределение генотипов по генам GSTM1 и GSTP1 у мужчин с нарушенной и нормальной репродукцией.ГенотипПациенты с нарушением фертильностиКонтрольная группа мужчинДостоверностьOR CI_95% (OR_min-OR_max)Nn%Nn%GSTM1 +452044,4553767,3χ2=5,26 р=0,0220,40 (0,18-0,87)GSTM1 0/0452555,6551832,72,52 (1,14-5,56)GSTP1 В/В, В/С, С/С45715,65523,6χ2=4,29 р=0,0384,17 (1,08-16,09)GSTP1
А/А, А/В, А/С453884,4555396,40,24 (0,06-0,93)

Отличительные признаки способа. Установлены новые прогностические критерии астенозооспермии, когда на выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз M1 и P1 и при выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии.

Сущность заявляемого способа прогнозирования нарушения фертильности у мужчин поясняется примерами конкретного выполнения.

Пример 1. Супружеская пара М. консультирована по поводу прогноза здоровья потомства (проспективное консультирование). Жене 24 года, здорова. Мужу 23 года, здоров, курит, имеет профессиональные вредности: контакт с окисью углерода, бензином, свинцом. В результате проведенного молекулярно-генетического обследования был определен генотип GSTM1 0/0. Сделано заключение о наличии повышенного риска развития астенозооспермии и снижении фертильности. В спермограмме: V=3,0 мл, вязкость нормальная, срок разжижения 40 мин, концентрация сперматозоидов 90 млн/мл, категория А - 45%, категория В - 25%, категория С - 5%, категория D - 25%, агглютинация отсутствует, лецитиновые зерна +, лейкоциты 0-1·10⁶. Заключение: нормозооспермия. Повторное обращение пары через год по поводу первичного бесплодия. В спермограмме: V=3,0 мл, вязкость нормальная, срок разжижения 30 мин, концентрация сперматозоидов 70 млн/мл, категория А - 20%, категория В - 25%, категория С - 30%, категория D - 25%, агглютинация отсутствует, лецитиновые зерна +, лейкоциты 0-1·10⁶. У мужа диагностирована астенозооспермия. Начато лечение.

Пример 2. Супружеская пара X. с первичным бесплодием в течение 3 лет. Жене 27 лет, имеет нарушение менструальной функции по типу недостаточности лютеиновой фазы (НЛФ) и перемежающейся ановуляции. Проходит лечение. Мужу 27 лет, работает на ткацком производстве в цехе отбеливания тканей. Имеет контакт с хлорсодержащими отбеливателями, курит. В ходе андрологического обследования воспалительный фактор исключен. Спермиологический анализ выявил выраженную астенозооспермию (V=3,0 мл, вязкость нормальная, срок разжижения 30 мин, концентрация сперматозоидов 55 млн/мл, категория А - 15%, категория В - 5%, категория С - 20%, категория D - 60%, агглютинация отсутствует, лецитиновые зерна +, лейкоциты 0-1·10⁶). Молекулярно-генетическое обследование выявило генотип GSTP1 В/В. Наследственная предрасположенность, определяющая слабость ферментативных систем детоксикации, в условиях средового прессинга может быть расценена как фактор, способствующий патозооспермии. В рамках преконцепционной профилактики даны рекомендации по ликвидации вредных привычек и исключению вредных производственных факторов. Начато лечение. Проведение генетического анализа задолго до появления астенозооспермии позволило бы вовремя принять профилактические меры по предупреждению развития нарушения фертильности.

Пример 3. Супружеская пара В. консультирована по поводу прогноза здоровья потомства. Жене 35 лет, здорова, состоит во втором браке, имеет 1 здорового ребенка от первого брака. Супруг 22 лет, здоров, брак первый, детей не имеет. В результате проведенного молекулярно-генетического обследования у мужчины выявлен генотип GSTP1 В/С. Сделано заключение о наличии повышенного риска развития астенозооспермии и снижении фертильности. Спермограмма: V=3,5 мл, вязкость нормальная, срок разжижения 30 мин, концентрация сперматозоидов 80 млн/мл, категория А - 35%, категория В - 25%, категория С - 15%, категория D - 25%, агглютинация отсутствует, лецитиновые зерна +, лейкоциты 0-1·10⁶. Заключение: нормозооспермия. Повторное обращение пары через год по поводу первичного бесплодия. В спермограмме: V=3,5 мл, вязкость нормальная, срок разжижения 30 мин, концентрация сперматозоидов 70 млн/мл, категория А - 20%, категория В - 20%, категория С - 30%, категория D - 30%, агглютинация отсутствует, лецитиновые зерна +, лейкоциты 0-1·10⁶. Заключение: астенозооспермия. Начато лечение.

Клиническая апробация способа дала следующие результаты:

При генотипировании по гену GSTM1:

ПоказательКоличествоИстинноположительный результат25Ложноположительный результат18Истинноотрицательный результат37Ложноотрицательный результат20Всего обследовано100

Точность - 62,00%

Чувствительность - 55,56%

Специфичность - 67,27%

При генотипировании по гену GSTP1:

ПоказательКоличествоИстинноположительный результат7Ложноположительный результат2Истинноотрицательный результат53Ложноотрицательный результат38Всего обследовано100

Точность - 60,00%

Чувствительность - 15,56%

Специфичность - 96,36%

При генотипировании по обоим генам:

ПоказательКоличествоИстинноположительный результат29Ложноположительный результат19Истинноотрицательный результат36Ложноотрицательный результат16Всего обследовано100

Точность - 65,00%

Чувствительность - 64,44%

Специфичность - 65,45%

Преимущества заявляемого метода:

1. Может использоваться в качестве самостоятельного или скринингового метода прогнозирования нарушения фертильности.

2. Дает возможность раннего прогнозирования астенозооспермии в начале репродуктивного периода онтогенеза, позволяя своевременно провести комплекс профилактических мероприятий.

3. Нетравматичен.

4. Требует минимального количества крови (100 мкл).

ЛИТЕРАТУРА

1. Сидоров А.Н. Роль мужского фактора при бесплодии и невынашивании беременности в супружеской паре:

Дисс...канд. мед. наук: 14.00.01. - Иваново, 1997. - С.50.

2. Горюнов В.Г., Жиборев Б.Н., Евдокимов В.В. Причины и признаки мужского бесплодия. - Рязань, 1993. - 82 с.

3. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков. // Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 1. - с.8-12.

4. Baranova H., Bothorishvilli R., Canis M. et al. Glutathine S-transferase M1 gene polymorphisms and susceptibility to endometriosis in a French population.// Mol. Hum. Reprod. - 1997. - Vol.3, № 9. - P.775-780.

5. Беспалова О.Н., Аржанова О.Н., Иващенко Т.Э., Асеев М.В., Айламазян Э.К., Баранов B.C. Генетические факторы предрасположенности к привычному невынашиванию беременности ранних сроков. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2001. - №2. - С.8-13.

6. Ivaschenko Т.Е., Sideleva O.G., Baranov V.S. Glutathione S-transferase micro and theta gene polymorphisms as new risk factors of atopic bronchial asthma. // J. Mol. Med. - 2002. - Vol.80(l). - P.39-43.

7. Trizna, Z.; Glyman, G. L.; Spitz, M. R.; Briggs, K. L.; Goepfert, H. Glutathione S-transferase genotypes as risk factors for head and neck cancer. Am. J. Surg. - 1995. - Vol.170. - P.499-501.

8. Бескоровайная Т.С. Влияние некоторых генетических факторов на нарушение репродукции человека: Дисс. канд. мед. наук: 03.00.15. - Москва, 2005. - С.34-39.

9. Бабич П.Н., Чубенко А.В., Лапач С.Н. Применение современных статистических методов в практике клинических исследований. Сообщение третье. Соотношение шансов: понятие, вычисление и интерпретация. // Украинский медицинский журнал. - 2005. - № 2(46). - C.113-119.

Изобретение относится к медицине, а именно к акушерству, гинекологии, медицинской генетике и андрологии. Для прогнозирования нарушения фертильности спермы у мужчин в виде астенозооспермии исследуют периферическую кровь. На выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз Ml и Р1. При выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С и GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии. Использование способа позволяет проводить раннее прогнозирование астенозооспермии в начале репродуктивного периода онтогенеза и соответственно своевременный комплекс профилактических мероприятий. 1 табл.

Способ прогнозирования нарушения фертильности у мужчин путем исследования периферической крови, отличающийся тем, что на выделенной из лимфоцитов ДНК амплифицируют фрагменты генов глутатион-S-трансфераз M1 и Р1 и при выявлении одного из генотипов GSTM1 0/0, GSTP1 В/В, GSTP1 В/С, GSTP1 С/С прогнозируют риск развития астенозооспермии.